JP3045191B2 - ピルビン酸キナーゼ測定用試薬 - Google Patents

ピルビン酸キナーゼ測定用試薬

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JP3045191B2 JP3075722A JP7572291A JP3045191B2 JP 3045191 B2 JP3045191 B2 JP 3045191B2 JP 3075722 A JP3075722 A JP 3075722A JP 7572291 A JP7572291 A JP 7572291A JP 3045191 B2 JP3045191 B2 JP 3045191B2
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Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、医学診断上、その他に
有用な、生体液中のピルビン酸キナーゼ(以下、PKと
略称する。)の測定用試薬に関するものである。
【0002】
【従来の技術】PKは、全身の筋組織及び脳に存在し、
臨床検査の領域においてPK活性は、心筋梗塞などの心
疾患、筋ジストロフィーなどの筋疾患の診断に重要な項
目の一つと考えられている。PKは下記反応式1の左右
両方向の反応を触媒する酵素である。
【0003】
【化1】
【0004】従来から提案されているPK活性の酵素的
測定法は、上記反応式1で生成したATPあるいはピル
ビン酸のどちらかを酵素を利用して測定するものであ
る。すなわち、生成したピルビン酸を乳酸脱水素酵素
を用いて紫外部吸収の減少速度として測定する方法、
生成したピルビン酸をピルビン酸オキシダーゼ(以下、
POPと略称する。)とパーオキシダーゼ(以下、PO
Dと略称する。)の共役反応を利用して比色測定する方
法、生成したATPをヘキソキナーゼ(以下、HKと
略称する。)とグルコース−6−リン酸脱水素酵素(以
下、G6PDHと略称する。)の共役反応を利用して紫
外部吸収増加速度として測定する方法(臨床化学、18
巻、130〜135頁、1989年)である。さらに、
HKよりもグルコースに対する特異性の高いグルコキナ
ーゼ(以下、GlcKと略称する。)とG6PDHを用
いる方法が提案され、この方法はHKとG6PDHを用
いる方法に更に保存安定性と測定の正確性を付与した方
法である〔臨床化学、19、(補冊2号)、43b、1
990年〕。
【0005】これらのうち、HK又はGlcKとG6P
DHの共役反応を利用する方法は、原理的に最も優れ、
感度、再現性も良いこと、及び多数検体処理も可能なこ
とから最も有用である。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
HK又はGlcKとG6PDHを用いる方法によるPK
測定用試薬は測定の範囲が比較的狭く、心筋梗塞や運動
後の筋疾患などで血清中PKの急激な上昇がある場合
に、測定毎に希釈しないと測定できない場合がしばしば
認められていた。このため心筋梗塞などで緊急検査が要
求される場合に不適となり、また、測定の繁雑さが増
し、測定誤差の原因となっていた。
【0007】本発明は、上記の如く、高濃度にPKを含
む試料でも希釈せずに定量できる測定範囲を有するPK
測定用試薬の提供を目的とするものである。
【0008】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、このよう
な要求を満足するPK測定用試薬を提供することを目的
として種々検討した結果、6−ホスホグルコノラクトナ
ーゼがPK測定用試薬に含まれていることにより上記の
目的を達成し、本発明によるPK測定用試薬が日常的に
使用するのに充分な性能を有する測定用試薬であること
を見い出し、本発明を完成するに到った。
【0009】すなわち、本発明はホスホエノールピルビ
ン酸、アデニシン5'−二リン酸(以下、ADPと略称
する。)、グルコース、HK又はGlcK、ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド(以下、NADと略称す
る。)又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン
酸(以下、NADPと略称する。)、G6PDH、マグ
ネシウム塩類を主要成分とするPK測定用試薬におい
て、6−ホスホグルコノラクトナーゼが含有されている
PK測定用試薬を要旨とするものである。
【0010】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
試薬は、6−ホスホグルコノラクトナーゼ以外に、ホス
ホエノールピルビン酸、ADP、グルコース、HK又は
GlcK、NAD又はNADP、G6PDH、マグネシ
ウム塩類の主要成分の他、通常の賦活剤などの添加剤及
び緩衝液が含有されている。
【0011】本発明においては6−ホスホグルコノラク
トナーゼを使用することが必要であるが、ここで言う6
−ホスホグルコノラクトナーゼとは国際生化学連合酵素
委員会による分類番号EC3. 1. 1. 31に分類され
るもので、6−ホスホグルコノラクトンを6−ホスホグ
ルコン酸に加水分解する酵素である。その給源は特に限
定されるものではなく、動物、植物、微生物由来のもの
を支障なく使用できる。取り扱いや入手の容易さなどか
ら微生物由来のものが好ましいが、これらにはザイモモ
ナス(Zymomonas )属、大腸菌、ロイコノストック(Le
uconostoc )属、ラクトバチルス(Lactobacillus )
属、シュードモナス(Pseudomonas )属、バチルス(Ba
cillus)属など種々の起源からの酵素がある。中でも、
ザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis )やザイ
モモナス・アナエロビア(Zymomonas anaerobia )など
ザイモモナス属細菌に属するものが好ましい。具体的に
はザイモモナス・モビリスATCC31821株、31
823株、35000株、35001株、10988
株、29191株、29129株など挙げることができ
る。
【0012】上記したような微生物を通常用いられる培
地を用いて培養し、得られた菌体から通常用いられてい
る分離・精製方法により本発明で用いられる6−ホスホ
グルコノラクトナーゼを取得することができる。
【0013】本発明に用いられるHKとしては、その給
源が限定されるものではなく、微生物由来のもの、動物
由来のものなど各種起源のものを使用することができ
る。中でもパン酵母など微生物起源のものが容易に用い
ることができる。またHKよりもグルコースに対して基
質特異性が高いGlcKも使用することができる。Gl
cKとしても、その給源が限定されるものではなく、微
生物由来のもの、動物由来のものなど各種起源のものを
使用することができる。中でも取り扱い易さ、入手の容
易さからバチルス(Bacillus)属、サーモアクチノマイ
セス(Thermoactinomyces )属、サーマス(Thermus )
属、サーモミクロビウム(Thermomicrobium )属、ザイ
モモナス(Zymomonas )属などの微生物が好ましく、特
に好ましい微生物としては、バチルス・ステアロサーモ
フィルス(Bacillus stearothermophilus )やザイモモ
ナス・モビリス(Zymomonas mobilis )を挙げることが
できる。
【0014】G6PDHについても酵母由来など微生物
起源、動物起源などその給源が限定されるものではない
が、好ましくは補酵素としてNADPだけでなく、NA
Dにも作用するG6PDHが好ましい。中でも微生物起
源のG6PDHが好ましく、具体的にはロイコノストッ
ク・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)
などのロイコノストック(Leuconostoc )属、シュード
モナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens
)などのシュードモナス(Pseudomonas )属、ザイモ
モナス・モビリス(Zymomonas mobilis )などのザイモ
モナス(Zymomonas )属を挙げることができる。より好
ましくはNADP、NADとも補酵素として使用でき、
かつ、安定性、保存性に富む好熱性細菌由来のG6PD
Hが望ましい。
【0015】マグネシウム塩類としては、例えば酢酸マ
グネシウム、硫酸マグネシウムなどの塩類を支障なく使
用できる。
【0016】SH保護剤としてはN−アセチルシステイ
ン(以下NACと略称する)、ジチオスレイトール、ジ
チオエリスリトール、メルカプトエタノール、チオグリ
セロール、チオグリコール酸、チオグルコース、システ
インなどを挙げることができ、中でも安定性の良さや取
り扱いの容易なNACが好ましい。防腐剤としては、例
えばアジ化ナトリウムなどの公知のものを支障なく使用
することができる。
【0017】安定剤としては、例えば可溶性デンプン、
メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースなどの
多糖類とその誘導体、アルブミン、γ- グロブリンなど
のタンパク質、ポリビニルアルコール、ポリエチレング
リコールなどの水溶性高分子化合物を適宜使用すること
ができる。
【0018】又、ホスホエノールピルビン酸、ADP、
グルコース、NAD又はNADPについては、従来のP
K測定用試薬に用いられているものが同様に使用するこ
とができる。
【0019】本発明のPK測定用試薬の各成分の濃度
は、一般には次の濃度が好ましい。例えば、HK又はG
lcKを0. 1〜40ユニット/ml、G6PDHを
0. 1〜40ユニット/ml、6−ホスホグルコノラク
トナーゼを0. 01〜20ユニット/ml、ホスホエノ
ールピルビン酸を2〜70mM、ADPを0. 1〜20
mM、NAD又はNADPを0. 05〜20mM、グル
コースを1〜200mM、マグネシウム塩類を0. 5〜
30mM、SH試薬を0. 1〜100mM、アデノシン
5' −一リン酸(以下、AMPと略称する。)を0. 2
〜20mM、ジアデノシンペンタホスフェート(以下、
Ap5Aと略称する。)を1〜100μM、エチレンジ
アミン四酢酸(以下、EDTAと略称する。)を0. 1
〜20mM、アジ化ナトリウムを0. 5〜50mM使用
すればよい。より好ましくは、HK又はGlcKを0.
2〜20ユニット/ml、G6PDHを0. 2〜20ユ
ニット/ml、6−ホスホグルコノラクトナーゼを0.
05〜15ユニット/ml、ホスホエノールピルビン酸
を5〜40mM、ADPを0. 2〜10mM、NAD又
はNADPを0. 1〜10mM、グルコースを2〜10
0mM、マグネシウム塩類を2〜15mM、SH試薬を
0. 5〜50mM、AMPを0. 5〜15mM、Ap5
Aを2〜50μM、EDTAを0. 2〜10mM、アジ
化ナトリウムを1〜30mM使用すればよい。
【0020】本発明の測定用試薬は、全ての成分を1つ
の試薬にした、いわゆる一試薬系でも使用できるが、自
動分析装置などの都合によっては、2つの試薬に分け
た、いわゆる二試薬系にして使用することもできる。
【0021】本発明のPK測定用試薬の測定原理は、反
応式1の右方向の反応により生成したATPを下記反応
式2、3に示すように6−ホスホグルコノラクトナーゼ
の存在下、GlcKとG6PDHの共役作用を利用して
測定するものである。
【0022】
【化2】
【0023】
【化3】
【0024】すなわち反応式1〜3の共役反応で生成す
るNAD(P)Hの340nmにおける吸収の増加を測
定して、試料中のPK活性を定量するものである。
【0025】本発明のPK測定用試薬を用いて、試料中
のPK活性を測定するには、例えばセル室が保温された
分光光度計のセルに測定用試薬を入れ、測定温度(20
〜45℃の間の任意の温度)に約3分間保温し、その
後、試料を添加混和した後、340nmの吸光度上昇を
測定すればよい。また、試料を添加した後の測定の反応
時間としては、30秒以後で任意の時間を選択すること
ができるが、自動分析装置の場合には、その装置の測定
条件に適応する条件を設定すればよい。
【0026】
【実施例】次に本発明を実施例によって具体的に説明す
る。 実施例1、比較例1 6−ホスホグルコノチクトナーゼをフェブス・レターズ
(FEBS Letters)193巻、185〜188頁、198
5年に記載の方法に従って培養し、単離精製した。すな
わち、15%のグルコース、0.5%の酵母エキス、
0.05%のリン酸一カリウム、0.05%の硫酸マグ
ネシウムを含む溶液1リットルに1mgのビオチン、2
mgのパントテン酸カルシウム及び20mgの硫酸鉄ア
ンモニウム(6水和物)を加えた培地で、ザイモモナス
・モビリス(Zymomonas mobilis )ATCC31821
株を培養した。
【0027】培養後、集めた菌体を破砕後、グリーンH
E−4BD−セファロースカラムクロマトグラフィー
(グリーンHE−4BDは、商品名プロシオン・グリー
ンHE−4BDとしてICIジャパンより購入)に吸着
させ、G6Pを含有する緩衝液で溶出し、次いでセルロ
ファインGCL−2000カラムクロマトグラフィー
(生化学工業より購入)を用いて精製した。
【0028】上記の如く精製した6−ホスホグルコノラ
クトナーゼを用いてPK測定用試薬を調製した。バチル
ス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermop
hilus )由来のGlcK[生化学工業( 株) より購入]
3ユニット/ml、ロイコノストック・メセンテロイデ
ス(Leuconostoc mesenteroides )由来のG6PDH
[ベーリンガー・マンハイム山之内( 株) より購入]
3. 2ユニット/ml、6−ホスホグルコノラクトナー
ゼ0. 4ユニット/ml、ADP[ベーリンガー・マン
ハイム山之内( 株) より購入]6mM、NADP[ベー
リンガー・マンハイム山之内( 株) より購入]2mM、
グルコース20mM、AMP[ベーリンガー・マンハイ
ム山之内( 株) より購入]5mM、Ap5A[ベーリン
ガー・マンハイム山之内( 株) より購入]10μM、N
AC20mM、酢酸マグネシウム12mM、酢酸カリウ
ム24mM、アジ化ナトリウム0. 1%、EDTA2m
M、ホスホエノールピルビン酸2mMを含むイミダゾー
ル−酢酸緩衝液(pH6. 7)80mMより成るPK測
定用試薬を調製した(実施例1)。別に実施例1より6
−ホスホグルコノラクトナーゼを抜いたPK測定用試薬
を調製した(比較例1)。
【0029】次に、試料としてウサギ筋肉由来のPK
[ベーリンガー・マンハイム山之内(株) より購入]を
生理食塩水又は市販標準血清に溶かした試料を調製し
た。上記で調製したPK測定用試薬3. 0mlを光路長
1cmのセルに入れ、約3分間37℃に保温後、上記で
調製した試料0. 06mlを添加して反応を開始し、3
40nmの吸光度変化を追跡した。各種濃度のPKを含
む試料で同様の測定をし、1分間当りの吸光度変化量と
試料中のPK活性との関係を図1に示した。この図か
ら、実施例1では1分間当りの吸光度変化量がPK約3
000ユニット/lまで直線的に変化しているのに対
し、比較例1では約1500ユニット/lまでしか直線
的に変化していないことが判った。このように、6−ホ
スホグルコノラクトナーゼを含有させることにより測定
の範囲が大きく広がることが示された。
【0030】実施例2 GlcK及びG6PDHをザ・バイオケミカル・ジャー
ナル(The Biochemical Journal )228巻、627〜
634頁、1985年に記載の方法に従って培養し、そ
れぞれ単離精製した。すなわち、15%のグルコース、
0.5%の酵母エキス、0.05%のリン酸一カリウ
ム、0.05%の硫酸マグネシウムを含む溶液1リット
ルに1mgのビオチン、2mgのパントテン酸カルシウ
ム及び20mgの硫酸鉄アンモニウム(6水和物)を加
えた培地でザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobili
s )ATCC29191株を培養した。
【0031】培養後、集めた菌体を破砕後、スカーレッ
トMX−G−セファロースクロマトグラフィー(スカー
レットMX−Gは、商品名プロシオン・スカーレットM
X−GとしてICIジャパンより購入)に吸着させ、G
lcKをpH上昇で、又G6PDHをNADP添加でそ
れぞれ溶出させ、次いで硫安分画した。さらに両酵素を
セファクリルS−200クロマトグラフィーでゲル濾過
に供し、精製酵素を得た。
【0032】上記の如く精製したGlcKとG6PDH
を実施例1と同様の濃度で使用してPK測定用試薬を調
製した(実施例2)。別に実施例2から6−ホスホグル
コノラクトナーゼを抜いた試薬を調製した(比較例
2)。これら試薬を用いて実施例1と同様の実験をした
ところ、実施例2では1分間当りの吸光度変化量が試料
中のPK量約3000ユニット/lまで直線関係にあっ
たが、一方比較例2では約1500ユニット/lまでし
か直線関係が認められなかった。
【0033】実施例3 実施例1又は実施例2の試薬において、6−ホスホグル
コノラクトナーゼの濃度を0. 05ユニット/ml及び
15ユニット/mlに変えた以外は実施例1又は実施例
2の試薬と同様の組成の試薬をそれぞれ2種を調製し
た。これらの試薬を用い、1分間当りの吸光度変化量と
試料中のPK量との関係を調べたところ、4種の試薬と
もPK約3000ユニット/lまでの直線関係が認めら
れ、良好な測定の範囲を示すことが判った。
【0034】実施例4、比較例3 GlcKの代わりに酵母由来のHK[ベーリンガー・マ
ンハイム山之内( 株)より購入]3. 5ユニット/ml
と酵母由来G6PDH5. 0ユニット/mlを使用し、
他は実施例1及び比較例1と同様の試薬を調製した(実
施例4、比較例3)。実施例1及び比較例1と同様の実
験をしたところ、1分間当りの吸光度変化量と試料中の
PK量との直線関係が実施例4では約2500ユニット
/lまで、比較例3では約1300ユニット/lまで得
られた。
【0035】実施例5 バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearot
hermophilus )由来GlcK3. 75ユニット/ml、
ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc me
senteroides )由来G6PDH4. 0ユニット/ml、
実施例1で得た6−ホスホグルコノラクトナーゼ0. 5
ユニット/ml、ADP7. 5mM、NADP2. 5m
M、グルコース25mM、AMP6. 25mM、Ap5
A12.5μM、NAC25mM、酢酸カリウム30m
M、アジ化ナトリウム0. 1%、EDTA2. 5mMを
含むイミダゾール−酢酸緩衝液(pH6. 7)100m
Mよりなる試薬1と、ホスホエノールピルビン酸10m
M、酢酸マグネシウム75mMからなる試薬2を調製し
た。
【0036】上記で調製した試薬1、0. 4mlを37
℃に保温された光路長1cmのセルに入れ、実施例1で
調製した試料0. 01mlを添加5分後、試薬2を添加
して約5分間にわたって340nmの吸光度変化を追跡
した(自動分析装置日立7050型使用)。1分間当り
の吸光度変化量と試料中のPK量とはPK約3000ユ
ニット/lまで直線関係にあることが判った。
【0037】
【発明の効果】本発明のPK測定用試薬は、従来のHK
とG6PDHを共役させる方法やGlcKとG6PDH
を共役させる方法の問題点であった測定の範囲を、6−
ホスホグルコノラクトナーゼ含有物を用いることにより
大幅に拡大させたものである。近年増加しつつある心筋
梗塞患者や他の筋肉疾患患者の生体液中のPKを日常的
に分析定量するのに充分な性能の測定用試薬となり、信
頼性の高いものとなった。このように、本発明のPK測
定用試薬は臨床検査の分野に多大な寄与がはかれるもの
となった。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明のピルビン酸キナーゼ測定用試薬(実施
例1)及び従来の測定用試薬(比較例1)を用いたとき
の試料中のPK量(ユニット/l)と340nmにおけ
る1分間当りの吸光度変化量を示す説明図である。
【符号の説明】
●印 実施例1 ○印 比較例1
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) C12Q 1/25 - 1/66 BIOSIS(DIALOG) MEDLINE(STN) WPI(DIALOG)

Claims (1)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 ホスホエノールピルビン酸、アデノシン
    5' −二リン酸、グルコース、ヘキソキナーゼ又はグル
    コキナーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又
    はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、グル
    コース−6−リン酸脱水素酵素、マグネシウム塩類を主
    要成分とするピルビン酸キナーゼ測定用試薬において、
    6−ホスホグルコノラクトナーゼが含有されていること
    を特徴とするピルビン酸キナーゼ測定用試薬。
JP3075722A 1991-03-14 1991-03-14 ピルビン酸キナーゼ測定用試薬 Expired - Lifetime JP3045191B2 (ja)

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