JP3045191B2 - ピルビン酸キナーゼ測定用試薬 - Google Patents
ピルビン酸キナーゼ測定用試薬Info
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Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、医学診断上、その他に
有用な、生体液中のピルビン酸キナーゼ（以下、ＰＫと
略称する。）の測定用試薬に関するものである。
有用な、生体液中のピルビン酸キナーゼ（以下、ＰＫと
略称する。）の測定用試薬に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ＰＫは、全身の筋組織及び脳に存在し、
臨床検査の領域においてＰＫ活性は、心筋梗塞などの心
疾患、筋ジストロフィーなどの筋疾患の診断に重要な項
目の一つと考えられている。ＰＫは下記反応式１の左右
両方向の反応を触媒する酵素である。
臨床検査の領域においてＰＫ活性は、心筋梗塞などの心
疾患、筋ジストロフィーなどの筋疾患の診断に重要な項
目の一つと考えられている。ＰＫは下記反応式１の左右
両方向の反応を触媒する酵素である。
【０００３】
【化１】
【０００４】従来から提案されているＰＫ活性の酵素的
測定法は、上記反応式１で生成したＡＴＰあるいはピル
ビン酸のどちらかを酵素を利用して測定するものであ
る。すなわち、生成したピルビン酸を乳酸脱水素酵素
を用いて紫外部吸収の減少速度として測定する方法、
生成したピルビン酸をピルビン酸オキシダーゼ（以下、
ＰＯＰと略称する。）とパーオキシダーゼ（以下、ＰＯ
Ｄと略称する。）の共役反応を利用して比色測定する方
法、生成したＡＴＰをヘキソキナーゼ（以下、ＨＫと
略称する。）とグルコース−６−リン酸脱水素酵素（以
下、Ｇ６ＰＤＨと略称する。）の共役反応を利用して紫
外部吸収増加速度として測定する方法（臨床化学、１８
巻、１３０〜１３５頁、１９８９年）である。さらに、
ＨＫよりもグルコースに対する特異性の高いグルコキナ
ーゼ（以下、ＧｌｃＫと略称する。）とＧ６ＰＤＨを用
いる方法が提案され、この方法はＨＫとＧ６ＰＤＨを用
いる方法に更に保存安定性と測定の正確性を付与した方
法である〔臨床化学、１９、（補冊２号）、４３ｂ、１
９９０年〕。
測定法は、上記反応式１で生成したＡＴＰあるいはピル
ビン酸のどちらかを酵素を利用して測定するものであ
る。すなわち、生成したピルビン酸を乳酸脱水素酵素
を用いて紫外部吸収の減少速度として測定する方法、
生成したピルビン酸をピルビン酸オキシダーゼ（以下、
ＰＯＰと略称する。）とパーオキシダーゼ（以下、ＰＯ
Ｄと略称する。）の共役反応を利用して比色測定する方
法、生成したＡＴＰをヘキソキナーゼ（以下、ＨＫと
略称する。）とグルコース−６−リン酸脱水素酵素（以
下、Ｇ６ＰＤＨと略称する。）の共役反応を利用して紫
外部吸収増加速度として測定する方法（臨床化学、１８
巻、１３０〜１３５頁、１９８９年）である。さらに、
ＨＫよりもグルコースに対する特異性の高いグルコキナ
ーゼ（以下、ＧｌｃＫと略称する。）とＧ６ＰＤＨを用
いる方法が提案され、この方法はＨＫとＧ６ＰＤＨを用
いる方法に更に保存安定性と測定の正確性を付与した方
法である〔臨床化学、１９、（補冊２号）、４３ｂ、１
９９０年〕。
【０００５】これらのうち、ＨＫ又はＧｌｃＫとＧ６Ｐ
ＤＨの共役反応を利用する方法は、原理的に最も優れ、
感度、再現性も良いこと、及び多数検体処理も可能なこ
とから最も有用である。
ＤＨの共役反応を利用する方法は、原理的に最も優れ、
感度、再現性も良いこと、及び多数検体処理も可能なこ
とから最も有用である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
ＨＫ又はＧｌｃＫとＧ６ＰＤＨを用いる方法によるＰＫ
測定用試薬は測定の範囲が比較的狭く、心筋梗塞や運動
後の筋疾患などで血清中ＰＫの急激な上昇がある場合
に、測定毎に希釈しないと測定できない場合がしばしば
認められていた。このため心筋梗塞などで緊急検査が要
求される場合に不適となり、また、測定の繁雑さが増
し、測定誤差の原因となっていた。
ＨＫ又はＧｌｃＫとＧ６ＰＤＨを用いる方法によるＰＫ
測定用試薬は測定の範囲が比較的狭く、心筋梗塞や運動
後の筋疾患などで血清中ＰＫの急激な上昇がある場合
に、測定毎に希釈しないと測定できない場合がしばしば
認められていた。このため心筋梗塞などで緊急検査が要
求される場合に不適となり、また、測定の繁雑さが増
し、測定誤差の原因となっていた。
【０００７】本発明は、上記の如く、高濃度にＰＫを含
む試料でも希釈せずに定量できる測定範囲を有するＰＫ
測定用試薬の提供を目的とするものである。
む試料でも希釈せずに定量できる測定範囲を有するＰＫ
測定用試薬の提供を目的とするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、このよう
な要求を満足するＰＫ測定用試薬を提供することを目的
として種々検討した結果、６−ホスホグルコノラクトナ
ーゼがＰＫ測定用試薬に含まれていることにより上記の
目的を達成し、本発明によるＰＫ測定用試薬が日常的に
使用するのに充分な性能を有する測定用試薬であること
を見い出し、本発明を完成するに到った。
な要求を満足するＰＫ測定用試薬を提供することを目的
として種々検討した結果、６−ホスホグルコノラクトナ
ーゼがＰＫ測定用試薬に含まれていることにより上記の
目的を達成し、本発明によるＰＫ測定用試薬が日常的に
使用するのに充分な性能を有する測定用試薬であること
を見い出し、本発明を完成するに到った。
【０００９】すなわち、本発明はホスホエノールピルビ
ン酸、アデニシン５'−二リン酸（以下、ＡＤＰと略称
する。）、グルコース、ＨＫ又はＧｌｃＫ、ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤと略称す
る。）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン
酸（以下、ＮＡＤＰと略称する。）、Ｇ６ＰＤＨ、マグ
ネシウム塩類を主要成分とするＰＫ測定用試薬におい
て、６−ホスホグルコノラクトナーゼが含有されている
ＰＫ測定用試薬を要旨とするものである。
ン酸、アデニシン５'−二リン酸（以下、ＡＤＰと略称
する。）、グルコース、ＨＫ又はＧｌｃＫ、ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤと略称す
る。）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン
酸（以下、ＮＡＤＰと略称する。）、Ｇ６ＰＤＨ、マグ
ネシウム塩類を主要成分とするＰＫ測定用試薬におい
て、６−ホスホグルコノラクトナーゼが含有されている
ＰＫ測定用試薬を要旨とするものである。
【００１０】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
試薬は、６−ホスホグルコノラクトナーゼ以外に、ホス
ホエノールピルビン酸、ＡＤＰ、グルコース、ＨＫ又は
ＧｌｃＫ、ＮＡＤ又はＮＡＤＰ、Ｇ６ＰＤＨ、マグネシ
ウム塩類の主要成分の他、通常の賦活剤などの添加剤及
び緩衝液が含有されている。
試薬は、６−ホスホグルコノラクトナーゼ以外に、ホス
ホエノールピルビン酸、ＡＤＰ、グルコース、ＨＫ又は
ＧｌｃＫ、ＮＡＤ又はＮＡＤＰ、Ｇ６ＰＤＨ、マグネシ
ウム塩類の主要成分の他、通常の賦活剤などの添加剤及
び緩衝液が含有されている。
【００１１】本発明においては６−ホスホグルコノラク
トナーゼを使用することが必要であるが、ここで言う６
−ホスホグルコノラクトナーゼとは国際生化学連合酵素
委員会による分類番号ＥＣ３. １. １. ３１に分類され
るもので、６−ホスホグルコノラクトンを６−ホスホグ
ルコン酸に加水分解する酵素である。その給源は特に限
定されるものではなく、動物、植物、微生物由来のもの
を支障なく使用できる。取り扱いや入手の容易さなどか
ら微生物由来のものが好ましいが、これらにはザイモモ
ナス（Zymomonas ）属、大腸菌、ロイコノストック（Le
uconostoc ）属、ラクトバチルス（Lactobacillus ）
属、シュードモナス（Pseudomonas ）属、バチルス（Ba
cillus）属など種々の起源からの酵素がある。中でも、
ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis ）やザイ
モモナス・アナエロビア（Zymomonas anaerobia ）など
ザイモモナス属細菌に属するものが好ましい。具体的に
はザイモモナス・モビリスＡＴＣＣ３１８２１株、３１
８２３株、３５０００株、３５００１株、１０９８８
株、２９１９１株、２９１２９株など挙げることができ
る。
トナーゼを使用することが必要であるが、ここで言う６
−ホスホグルコノラクトナーゼとは国際生化学連合酵素
委員会による分類番号ＥＣ３. １. １. ３１に分類され
るもので、６−ホスホグルコノラクトンを６−ホスホグ
ルコン酸に加水分解する酵素である。その給源は特に限
定されるものではなく、動物、植物、微生物由来のもの
を支障なく使用できる。取り扱いや入手の容易さなどか
ら微生物由来のものが好ましいが、これらにはザイモモ
ナス（Zymomonas ）属、大腸菌、ロイコノストック（Le
uconostoc ）属、ラクトバチルス（Lactobacillus ）
属、シュードモナス（Pseudomonas ）属、バチルス（Ba
cillus）属など種々の起源からの酵素がある。中でも、
ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis ）やザイ
モモナス・アナエロビア（Zymomonas anaerobia ）など
ザイモモナス属細菌に属するものが好ましい。具体的に
はザイモモナス・モビリスＡＴＣＣ３１８２１株、３１
８２３株、３５０００株、３５００１株、１０９８８
株、２９１９１株、２９１２９株など挙げることができ
る。
【００１２】上記したような微生物を通常用いられる培
地を用いて培養し、得られた菌体から通常用いられてい
る分離・精製方法により本発明で用いられる６−ホスホ
グルコノラクトナーゼを取得することができる。
地を用いて培養し、得られた菌体から通常用いられてい
る分離・精製方法により本発明で用いられる６−ホスホ
グルコノラクトナーゼを取得することができる。
【００１３】本発明に用いられるＨＫとしては、その給
源が限定されるものではなく、微生物由来のもの、動物
由来のものなど各種起源のものを使用することができ
る。中でもパン酵母など微生物起源のものが容易に用い
ることができる。またＨＫよりもグルコースに対して基
質特異性が高いＧｌｃＫも使用することができる。Ｇｌ
ｃＫとしても、その給源が限定されるものではなく、微
生物由来のもの、動物由来のものなど各種起源のものを
使用することができる。中でも取り扱い易さ、入手の容
易さからバチルス（Bacillus）属、サーモアクチノマイ
セス（Thermoactinomyces ）属、サーマス（Thermus ）
属、サーモミクロビウム（Thermomicrobium ）属、ザイ
モモナス（Zymomonas ）属などの微生物が好ましく、特
に好ましい微生物としては、バチルス・ステアロサーモ
フィルス（Bacillus stearothermophilus ）やザイモモ
ナス・モビリス（Zymomonas mobilis ）を挙げることが
できる。
源が限定されるものではなく、微生物由来のもの、動物
由来のものなど各種起源のものを使用することができ
る。中でもパン酵母など微生物起源のものが容易に用い
ることができる。またＨＫよりもグルコースに対して基
質特異性が高いＧｌｃＫも使用することができる。Ｇｌ
ｃＫとしても、その給源が限定されるものではなく、微
生物由来のもの、動物由来のものなど各種起源のものを
使用することができる。中でも取り扱い易さ、入手の容
易さからバチルス（Bacillus）属、サーモアクチノマイ
セス（Thermoactinomyces ）属、サーマス（Thermus ）
属、サーモミクロビウム（Thermomicrobium ）属、ザイ
モモナス（Zymomonas ）属などの微生物が好ましく、特
に好ましい微生物としては、バチルス・ステアロサーモ
フィルス（Bacillus stearothermophilus ）やザイモモ
ナス・モビリス（Zymomonas mobilis ）を挙げることが
できる。
【００１４】Ｇ６ＰＤＨについても酵母由来など微生物
起源、動物起源などその給源が限定されるものではない
が、好ましくは補酵素としてＮＡＤＰだけでなく、ＮＡ
Ｄにも作用するＧ６ＰＤＨが好ましい。中でも微生物起
源のＧ６ＰＤＨが好ましく、具体的にはロイコノストッ
ク・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）
などのロイコノストック（Leuconostoc ）属、シュード
モナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens
）などのシュードモナス（Pseudomonas ）属、ザイモ
モナス・モビリス（Zymomonas mobilis ）などのザイモ
モナス（Zymomonas ）属を挙げることができる。より好
ましくはＮＡＤＰ、ＮＡＤとも補酵素として使用でき、
かつ、安定性、保存性に富む好熱性細菌由来のＧ６ＰＤ
Ｈが望ましい。
起源、動物起源などその給源が限定されるものではない
が、好ましくは補酵素としてＮＡＤＰだけでなく、ＮＡ
Ｄにも作用するＧ６ＰＤＨが好ましい。中でも微生物起
源のＧ６ＰＤＨが好ましく、具体的にはロイコノストッ
ク・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）
などのロイコノストック（Leuconostoc ）属、シュード
モナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluorescens
）などのシュードモナス（Pseudomonas ）属、ザイモ
モナス・モビリス（Zymomonas mobilis ）などのザイモ
モナス（Zymomonas ）属を挙げることができる。より好
ましくはＮＡＤＰ、ＮＡＤとも補酵素として使用でき、
かつ、安定性、保存性に富む好熱性細菌由来のＧ６ＰＤ
Ｈが望ましい。
【００１５】マグネシウム塩類としては、例えば酢酸マ
グネシウム、硫酸マグネシウムなどの塩類を支障なく使
用できる。
グネシウム、硫酸マグネシウムなどの塩類を支障なく使
用できる。
【００１６】ＳＨ保護剤としてはＮ−アセチルシステイ
ン（以下ＮＡＣと略称する）、ジチオスレイトール、ジ
チオエリスリトール、メルカプトエタノール、チオグリ
セロール、チオグリコール酸、チオグルコース、システ
インなどを挙げることができ、中でも安定性の良さや取
り扱いの容易なＮＡＣが好ましい。防腐剤としては、例
えばアジ化ナトリウムなどの公知のものを支障なく使用
することができる。
ン（以下ＮＡＣと略称する）、ジチオスレイトール、ジ
チオエリスリトール、メルカプトエタノール、チオグリ
セロール、チオグリコール酸、チオグルコース、システ
インなどを挙げることができ、中でも安定性の良さや取
り扱いの容易なＮＡＣが好ましい。防腐剤としては、例
えばアジ化ナトリウムなどの公知のものを支障なく使用
することができる。
【００１７】安定剤としては、例えば可溶性デンプン、
メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースなどの
多糖類とその誘導体、アルブミン、γ- グロブリンなど
のタンパク質、ポリビニルアルコール、ポリエチレング
リコールなどの水溶性高分子化合物を適宜使用すること
ができる。
メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースなどの
多糖類とその誘導体、アルブミン、γ- グロブリンなど
のタンパク質、ポリビニルアルコール、ポリエチレング
リコールなどの水溶性高分子化合物を適宜使用すること
ができる。
【００１８】又、ホスホエノールピルビン酸、ＡＤＰ、
グルコース、ＮＡＤ又はＮＡＤＰについては、従来のＰ
Ｋ測定用試薬に用いられているものが同様に使用するこ
とができる。
グルコース、ＮＡＤ又はＮＡＤＰについては、従来のＰ
Ｋ測定用試薬に用いられているものが同様に使用するこ
とができる。
【００１９】本発明のＰＫ測定用試薬の各成分の濃度
は、一般には次の濃度が好ましい。例えば、ＨＫ又はＧ
ｌｃＫを０. １〜４０ユニット／ｍｌ、Ｇ６ＰＤＨを
０. １〜４０ユニット／ｍｌ、６−ホスホグルコノラク
トナーゼを０. ０１〜２０ユニット／ｍｌ、ホスホエノ
ールピルビン酸を２〜７０ｍＭ、ＡＤＰを０. １〜２０
ｍＭ、ＮＡＤ又はＮＡＤＰを０. ０５〜２０ｍＭ、グル
コースを１〜２００ｍＭ、マグネシウム塩類を０. ５〜
３０ｍＭ、ＳＨ試薬を０. １〜１００ｍＭ、アデノシン
５' −一リン酸（以下、ＡＭＰと略称する。）を０. ２
〜２０ｍＭ、ジアデノシンペンタホスフェート（以下、
Ａｐ５Ａと略称する。）を１〜１００μＭ、エチレンジ
アミン四酢酸（以下、ＥＤＴＡと略称する。）を０. １
〜２０ｍＭ、アジ化ナトリウムを０. ５〜５０ｍＭ使用
すればよい。より好ましくは、ＨＫ又はＧｌｃＫを０.
２〜２０ユニット／ｍｌ、Ｇ６ＰＤＨを０. ２〜２０ユ
ニット／ｍｌ、６−ホスホグルコノラクトナーゼを０.
０５〜１５ユニット／ｍｌ、ホスホエノールピルビン酸
を５〜４０ｍＭ、ＡＤＰを０. ２〜１０ｍＭ、ＮＡＤ又
はＮＡＤＰを０. １〜１０ｍＭ、グルコースを２〜１０
０ｍＭ、マグネシウム塩類を２〜１５ｍＭ、ＳＨ試薬を
０. ５〜５０ｍＭ、ＡＭＰを０. ５〜１５ｍＭ、Ａｐ５
Ａを２〜５０μＭ、ＥＤＴＡを０. ２〜１０ｍＭ、アジ
化ナトリウムを１〜３０ｍＭ使用すればよい。
は、一般には次の濃度が好ましい。例えば、ＨＫ又はＧ
ｌｃＫを０. １〜４０ユニット／ｍｌ、Ｇ６ＰＤＨを
０. １〜４０ユニット／ｍｌ、６−ホスホグルコノラク
トナーゼを０. ０１〜２０ユニット／ｍｌ、ホスホエノ
ールピルビン酸を２〜７０ｍＭ、ＡＤＰを０. １〜２０
ｍＭ、ＮＡＤ又はＮＡＤＰを０. ０５〜２０ｍＭ、グル
コースを１〜２００ｍＭ、マグネシウム塩類を０. ５〜
３０ｍＭ、ＳＨ試薬を０. １〜１００ｍＭ、アデノシン
５' −一リン酸（以下、ＡＭＰと略称する。）を０. ２
〜２０ｍＭ、ジアデノシンペンタホスフェート（以下、
Ａｐ５Ａと略称する。）を１〜１００μＭ、エチレンジ
アミン四酢酸（以下、ＥＤＴＡと略称する。）を０. １
〜２０ｍＭ、アジ化ナトリウムを０. ５〜５０ｍＭ使用
すればよい。より好ましくは、ＨＫ又はＧｌｃＫを０.
２〜２０ユニット／ｍｌ、Ｇ６ＰＤＨを０. ２〜２０ユ
ニット／ｍｌ、６−ホスホグルコノラクトナーゼを０.
０５〜１５ユニット／ｍｌ、ホスホエノールピルビン酸
を５〜４０ｍＭ、ＡＤＰを０. ２〜１０ｍＭ、ＮＡＤ又
はＮＡＤＰを０. １〜１０ｍＭ、グルコースを２〜１０
０ｍＭ、マグネシウム塩類を２〜１５ｍＭ、ＳＨ試薬を
０. ５〜５０ｍＭ、ＡＭＰを０. ５〜１５ｍＭ、Ａｐ５
Ａを２〜５０μＭ、ＥＤＴＡを０. ２〜１０ｍＭ、アジ
化ナトリウムを１〜３０ｍＭ使用すればよい。
【００２０】本発明の測定用試薬は、全ての成分を１つ
の試薬にした、いわゆる一試薬系でも使用できるが、自
動分析装置などの都合によっては、２つの試薬に分け
た、いわゆる二試薬系にして使用することもできる。
の試薬にした、いわゆる一試薬系でも使用できるが、自
動分析装置などの都合によっては、２つの試薬に分け
た、いわゆる二試薬系にして使用することもできる。
【００２１】本発明のＰＫ測定用試薬の測定原理は、反
応式１の右方向の反応により生成したＡＴＰを下記反応
式２、３に示すように６−ホスホグルコノラクトナーゼ
の存在下、ＧｌｃＫとＧ６ＰＤＨの共役作用を利用して
測定するものである。
応式１の右方向の反応により生成したＡＴＰを下記反応
式２、３に示すように６−ホスホグルコノラクトナーゼ
の存在下、ＧｌｃＫとＧ６ＰＤＨの共役作用を利用して
測定するものである。
【００２２】
【化２】
【００２３】
【化３】
【００２４】すなわち反応式１〜３の共役反応で生成す
るＮＡＤ（Ｐ）Ｈの３４０ｎｍにおける吸収の増加を測
定して、試料中のＰＫ活性を定量するものである。
るＮＡＤ（Ｐ）Ｈの３４０ｎｍにおける吸収の増加を測
定して、試料中のＰＫ活性を定量するものである。
【００２５】本発明のＰＫ測定用試薬を用いて、試料中
のＰＫ活性を測定するには、例えばセル室が保温された
分光光度計のセルに測定用試薬を入れ、測定温度（２０
〜４５℃の間の任意の温度）に約３分間保温し、その
後、試料を添加混和した後、３４０ｎｍの吸光度上昇を
測定すればよい。また、試料を添加した後の測定の反応
時間としては、３０秒以後で任意の時間を選択すること
ができるが、自動分析装置の場合には、その装置の測定
条件に適応する条件を設定すればよい。
のＰＫ活性を測定するには、例えばセル室が保温された
分光光度計のセルに測定用試薬を入れ、測定温度（２０
〜４５℃の間の任意の温度）に約３分間保温し、その
後、試料を添加混和した後、３４０ｎｍの吸光度上昇を
測定すればよい。また、試料を添加した後の測定の反応
時間としては、３０秒以後で任意の時間を選択すること
ができるが、自動分析装置の場合には、その装置の測定
条件に適応する条件を設定すればよい。
【００２６】
【実施例】次に本発明を実施例によって具体的に説明す
る。 実施例１、比較例１ ６−ホスホグルコノチクトナーゼをフェブス・レターズ
（FEBS Letters）１９３巻、１８５〜１８８頁、１９８
５年に記載の方法に従って培養し、単離精製した。すな
わち、１５％のグルコース、０．５％の酵母エキス、
０．０５％のリン酸一カリウム、０．０５％の硫酸マグ
ネシウムを含む溶液１リットルに１ｍｇのビオチン、２
ｍｇのパントテン酸カルシウム及び２０ｍｇの硫酸鉄ア
ンモニウム（６水和物）を加えた培地で、ザイモモナス
・モビリス（Zymomonas mobilis ）ＡＴＣＣ３１８２１
株を培養した。
る。 実施例１、比較例１ ６−ホスホグルコノチクトナーゼをフェブス・レターズ
（FEBS Letters）１９３巻、１８５〜１８８頁、１９８
５年に記載の方法に従って培養し、単離精製した。すな
わち、１５％のグルコース、０．５％の酵母エキス、
０．０５％のリン酸一カリウム、０．０５％の硫酸マグ
ネシウムを含む溶液１リットルに１ｍｇのビオチン、２
ｍｇのパントテン酸カルシウム及び２０ｍｇの硫酸鉄ア
ンモニウム（６水和物）を加えた培地で、ザイモモナス
・モビリス（Zymomonas mobilis ）ＡＴＣＣ３１８２１
株を培養した。
【００２７】培養後、集めた菌体を破砕後、グリーンＨ
Ｅ−４ＢＤ−セファロースカラムクロマトグラフィー
（グリーンＨＥ−４ＢＤは、商品名プロシオン・グリー
ンＨＥ−４ＢＤとしてＩＣＩジャパンより購入）に吸着
させ、Ｇ６Ｐを含有する緩衝液で溶出し、次いでセルロ
ファインＧＣＬ−２０００カラムクロマトグラフィー
（生化学工業より購入）を用いて精製した。
Ｅ−４ＢＤ−セファロースカラムクロマトグラフィー
（グリーンＨＥ−４ＢＤは、商品名プロシオン・グリー
ンＨＥ−４ＢＤとしてＩＣＩジャパンより購入）に吸着
させ、Ｇ６Ｐを含有する緩衝液で溶出し、次いでセルロ
ファインＧＣＬ−２０００カラムクロマトグラフィー
（生化学工業より購入）を用いて精製した。
【００２８】上記の如く精製した６−ホスホグルコノラ
クトナーゼを用いてＰＫ測定用試薬を調製した。バチル
ス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermop
hilus ）由来のＧｌｃＫ［生化学工業( 株) より購入］
３ユニット／ｍｌ、ロイコノストック・メセンテロイデ
ス（Leuconostoc mesenteroides ）由来のＧ６ＰＤＨ
［ベーリンガー・マンハイム山之内( 株) より購入］
３. ２ユニット／ｍｌ、６−ホスホグルコノラクトナー
ゼ０. ４ユニット／ｍｌ、ＡＤＰ［ベーリンガー・マン
ハイム山之内( 株) より購入］６ｍＭ、ＮＡＤＰ［ベー
リンガー・マンハイム山之内( 株) より購入］２ｍＭ、
グルコース２０ｍＭ、ＡＭＰ［ベーリンガー・マンハイ
ム山之内( 株) より購入］５ｍＭ、Ａｐ５Ａ［ベーリン
ガー・マンハイム山之内( 株) より購入］１０μＭ、Ｎ
ＡＣ２０ｍＭ、酢酸マグネシウム１２ｍＭ、酢酸カリウ
ム２４ｍＭ、アジ化ナトリウム０. １％、ＥＤＴＡ２ｍ
Ｍ、ホスホエノールピルビン酸２ｍＭを含むイミダゾー
ル−酢酸緩衝液（ｐＨ６. ７）８０ｍＭより成るＰＫ測
定用試薬を調製した（実施例１）。別に実施例１より６
−ホスホグルコノラクトナーゼを抜いたＰＫ測定用試薬
を調製した（比較例１）。
クトナーゼを用いてＰＫ測定用試薬を調製した。バチル
ス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermop
hilus ）由来のＧｌｃＫ［生化学工業( 株) より購入］
３ユニット／ｍｌ、ロイコノストック・メセンテロイデ
ス（Leuconostoc mesenteroides ）由来のＧ６ＰＤＨ
［ベーリンガー・マンハイム山之内( 株) より購入］
３. ２ユニット／ｍｌ、６−ホスホグルコノラクトナー
ゼ０. ４ユニット／ｍｌ、ＡＤＰ［ベーリンガー・マン
ハイム山之内( 株) より購入］６ｍＭ、ＮＡＤＰ［ベー
リンガー・マンハイム山之内( 株) より購入］２ｍＭ、
グルコース２０ｍＭ、ＡＭＰ［ベーリンガー・マンハイ
ム山之内( 株) より購入］５ｍＭ、Ａｐ５Ａ［ベーリン
ガー・マンハイム山之内( 株) より購入］１０μＭ、Ｎ
ＡＣ２０ｍＭ、酢酸マグネシウム１２ｍＭ、酢酸カリウ
ム２４ｍＭ、アジ化ナトリウム０. １％、ＥＤＴＡ２ｍ
Ｍ、ホスホエノールピルビン酸２ｍＭを含むイミダゾー
ル−酢酸緩衝液（ｐＨ６. ７）８０ｍＭより成るＰＫ測
定用試薬を調製した（実施例１）。別に実施例１より６
−ホスホグルコノラクトナーゼを抜いたＰＫ測定用試薬
を調製した（比較例１）。
【００２９】次に、試料としてウサギ筋肉由来のＰＫ
［ベーリンガー・マンハイム山之内(株) より購入］を
生理食塩水又は市販標準血清に溶かした試料を調製し
た。上記で調製したＰＫ測定用試薬３. ０ｍｌを光路長
１ｃｍのセルに入れ、約３分間３７℃に保温後、上記で
調製した試料０. ０６ｍｌを添加して反応を開始し、３
４０ｎｍの吸光度変化を追跡した。各種濃度のＰＫを含
む試料で同様の測定をし、１分間当りの吸光度変化量と
試料中のＰＫ活性との関係を図１に示した。この図か
ら、実施例１では１分間当りの吸光度変化量がＰＫ約３
０００ユニット／ｌまで直線的に変化しているのに対
し、比較例１では約１５００ユニット／ｌまでしか直線
的に変化していないことが判った。このように、６−ホ
スホグルコノラクトナーゼを含有させることにより測定
の範囲が大きく広がることが示された。
［ベーリンガー・マンハイム山之内(株) より購入］を
生理食塩水又は市販標準血清に溶かした試料を調製し
た。上記で調製したＰＫ測定用試薬３. ０ｍｌを光路長
１ｃｍのセルに入れ、約３分間３７℃に保温後、上記で
調製した試料０. ０６ｍｌを添加して反応を開始し、３
４０ｎｍの吸光度変化を追跡した。各種濃度のＰＫを含
む試料で同様の測定をし、１分間当りの吸光度変化量と
試料中のＰＫ活性との関係を図１に示した。この図か
ら、実施例１では１分間当りの吸光度変化量がＰＫ約３
０００ユニット／ｌまで直線的に変化しているのに対
し、比較例１では約１５００ユニット／ｌまでしか直線
的に変化していないことが判った。このように、６−ホ
スホグルコノラクトナーゼを含有させることにより測定
の範囲が大きく広がることが示された。
【００３０】実施例２ ＧｌｃＫ及びＧ６ＰＤＨをザ・バイオケミカル・ジャー
ナル（The Biochemical Journal ）２２８巻、６２７〜
６３４頁、１９８５年に記載の方法に従って培養し、そ
れぞれ単離精製した。すなわち、１５％のグルコース、
０．５％の酵母エキス、０．０５％のリン酸一カリウ
ム、０．０５％の硫酸マグネシウムを含む溶液１リット
ルに１ｍｇのビオチン、２ｍｇのパントテン酸カルシウ
ム及び２０ｍｇの硫酸鉄アンモニウム（６水和物）を加
えた培地でザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobili
s ）ＡＴＣＣ２９１９１株を培養した。
ナル（The Biochemical Journal ）２２８巻、６２７〜
６３４頁、１９８５年に記載の方法に従って培養し、そ
れぞれ単離精製した。すなわち、１５％のグルコース、
０．５％の酵母エキス、０．０５％のリン酸一カリウ
ム、０．０５％の硫酸マグネシウムを含む溶液１リット
ルに１ｍｇのビオチン、２ｍｇのパントテン酸カルシウ
ム及び２０ｍｇの硫酸鉄アンモニウム（６水和物）を加
えた培地でザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobili
s ）ＡＴＣＣ２９１９１株を培養した。
【００３１】培養後、集めた菌体を破砕後、スカーレッ
トＭＸ−Ｇ−セファロースクロマトグラフィー（スカー
レットＭＸ−Ｇは、商品名プロシオン・スカーレットＭ
Ｘ−ＧとしてＩＣＩジャパンより購入）に吸着させ、Ｇ
ｌｃＫをｐＨ上昇で、又Ｇ６ＰＤＨをＮＡＤＰ添加でそ
れぞれ溶出させ、次いで硫安分画した。さらに両酵素を
セファクリルＳ−２００クロマトグラフィーでゲル濾過
に供し、精製酵素を得た。
トＭＸ−Ｇ−セファロースクロマトグラフィー（スカー
レットＭＸ−Ｇは、商品名プロシオン・スカーレットＭ
Ｘ−ＧとしてＩＣＩジャパンより購入）に吸着させ、Ｇ
ｌｃＫをｐＨ上昇で、又Ｇ６ＰＤＨをＮＡＤＰ添加でそ
れぞれ溶出させ、次いで硫安分画した。さらに両酵素を
セファクリルＳ−２００クロマトグラフィーでゲル濾過
に供し、精製酵素を得た。
【００３２】上記の如く精製したＧｌｃＫとＧ６ＰＤＨ
を実施例１と同様の濃度で使用してＰＫ測定用試薬を調
製した（実施例２）。別に実施例２から６−ホスホグル
コノラクトナーゼを抜いた試薬を調製した（比較例
２）。これら試薬を用いて実施例１と同様の実験をした
ところ、実施例２では１分間当りの吸光度変化量が試料
中のＰＫ量約３０００ユニット／ｌまで直線関係にあっ
たが、一方比較例２では約１５００ユニット／ｌまでし
か直線関係が認められなかった。
を実施例１と同様の濃度で使用してＰＫ測定用試薬を調
製した（実施例２）。別に実施例２から６−ホスホグル
コノラクトナーゼを抜いた試薬を調製した（比較例
２）。これら試薬を用いて実施例１と同様の実験をした
ところ、実施例２では１分間当りの吸光度変化量が試料
中のＰＫ量約３０００ユニット／ｌまで直線関係にあっ
たが、一方比較例２では約１５００ユニット／ｌまでし
か直線関係が認められなかった。
【００３３】実施例３ 実施例１又は実施例２の試薬において、６−ホスホグル
コノラクトナーゼの濃度を０. ０５ユニット／ｍｌ及び
１５ユニット／ｍｌに変えた以外は実施例１又は実施例
２の試薬と同様の組成の試薬をそれぞれ２種を調製し
た。これらの試薬を用い、１分間当りの吸光度変化量と
試料中のＰＫ量との関係を調べたところ、４種の試薬と
もＰＫ約３０００ユニット／ｌまでの直線関係が認めら
れ、良好な測定の範囲を示すことが判った。
コノラクトナーゼの濃度を０. ０５ユニット／ｍｌ及び
１５ユニット／ｍｌに変えた以外は実施例１又は実施例
２の試薬と同様の組成の試薬をそれぞれ２種を調製し
た。これらの試薬を用い、１分間当りの吸光度変化量と
試料中のＰＫ量との関係を調べたところ、４種の試薬と
もＰＫ約３０００ユニット／ｌまでの直線関係が認めら
れ、良好な測定の範囲を示すことが判った。
【００３４】実施例４、比較例３ ＧｌｃＫの代わりに酵母由来のＨＫ［ベーリンガー・マ
ンハイム山之内( 株)より購入］３. ５ユニット／ｍｌ
と酵母由来Ｇ６ＰＤＨ５. ０ユニット／ｍｌを使用し、
他は実施例１及び比較例１と同様の試薬を調製した（実
施例４、比較例３）。実施例１及び比較例１と同様の実
験をしたところ、１分間当りの吸光度変化量と試料中の
ＰＫ量との直線関係が実施例４では約２５００ユニット
／ｌまで、比較例３では約１３００ユニット／ｌまで得
られた。
ンハイム山之内( 株)より購入］３. ５ユニット／ｍｌ
と酵母由来Ｇ６ＰＤＨ５. ０ユニット／ｍｌを使用し、
他は実施例１及び比較例１と同様の試薬を調製した（実
施例４、比較例３）。実施例１及び比較例１と同様の実
験をしたところ、１分間当りの吸光度変化量と試料中の
ＰＫ量との直線関係が実施例４では約２５００ユニット
／ｌまで、比較例３では約１３００ユニット／ｌまで得
られた。
【００３５】実施例５ バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearot
hermophilus ）由来ＧｌｃＫ３. ７５ユニット／ｍｌ、
ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc me
senteroides ）由来Ｇ６ＰＤＨ４. ０ユニット／ｍｌ、
実施例１で得た６−ホスホグルコノラクトナーゼ０. ５
ユニット／ｍｌ、ＡＤＰ７. ５ｍＭ、ＮＡＤＰ２. ５ｍ
Ｍ、グルコース２５ｍＭ、ＡＭＰ６. ２５ｍＭ、Ａｐ５
Ａ１２.５μＭ、ＮＡＣ２５ｍＭ、酢酸カリウム３０ｍ
Ｍ、アジ化ナトリウム０. １％、ＥＤＴＡ２. ５ｍＭを
含むイミダゾール−酢酸緩衝液（ｐＨ６. ７）１００ｍ
Ｍよりなる試薬１と、ホスホエノールピルビン酸１０ｍ
Ｍ、酢酸マグネシウム７５ｍＭからなる試薬２を調製し
た。
hermophilus ）由来ＧｌｃＫ３. ７５ユニット／ｍｌ、
ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc me
senteroides ）由来Ｇ６ＰＤＨ４. ０ユニット／ｍｌ、
実施例１で得た６−ホスホグルコノラクトナーゼ０. ５
ユニット／ｍｌ、ＡＤＰ７. ５ｍＭ、ＮＡＤＰ２. ５ｍ
Ｍ、グルコース２５ｍＭ、ＡＭＰ６. ２５ｍＭ、Ａｐ５
Ａ１２.５μＭ、ＮＡＣ２５ｍＭ、酢酸カリウム３０ｍ
Ｍ、アジ化ナトリウム０. １％、ＥＤＴＡ２. ５ｍＭを
含むイミダゾール−酢酸緩衝液（ｐＨ６. ７）１００ｍ
Ｍよりなる試薬１と、ホスホエノールピルビン酸１０ｍ
Ｍ、酢酸マグネシウム７５ｍＭからなる試薬２を調製し
た。
【００３６】上記で調製した試薬１、０. ４ｍｌを３７
℃に保温された光路長１ｃｍのセルに入れ、実施例１で
調製した試料０. ０１ｍｌを添加５分後、試薬２を添加
して約５分間にわたって３４０ｎｍの吸光度変化を追跡
した（自動分析装置日立７０５０型使用）。１分間当り
の吸光度変化量と試料中のＰＫ量とはＰＫ約３０００ユ
ニット／ｌまで直線関係にあることが判った。
℃に保温された光路長１ｃｍのセルに入れ、実施例１で
調製した試料０. ０１ｍｌを添加５分後、試薬２を添加
して約５分間にわたって３４０ｎｍの吸光度変化を追跡
した（自動分析装置日立７０５０型使用）。１分間当り
の吸光度変化量と試料中のＰＫ量とはＰＫ約３０００ユ
ニット／ｌまで直線関係にあることが判った。
【００３７】
【発明の効果】本発明のＰＫ測定用試薬は、従来のＨＫ
とＧ６ＰＤＨを共役させる方法やＧｌｃＫとＧ６ＰＤＨ
を共役させる方法の問題点であった測定の範囲を、６−
ホスホグルコノラクトナーゼ含有物を用いることにより
大幅に拡大させたものである。近年増加しつつある心筋
梗塞患者や他の筋肉疾患患者の生体液中のＰＫを日常的
に分析定量するのに充分な性能の測定用試薬となり、信
頼性の高いものとなった。このように、本発明のＰＫ測
定用試薬は臨床検査の分野に多大な寄与がはかれるもの
となった。
とＧ６ＰＤＨを共役させる方法やＧｌｃＫとＧ６ＰＤＨ
を共役させる方法の問題点であった測定の範囲を、６−
ホスホグルコノラクトナーゼ含有物を用いることにより
大幅に拡大させたものである。近年増加しつつある心筋
梗塞患者や他の筋肉疾患患者の生体液中のＰＫを日常的
に分析定量するのに充分な性能の測定用試薬となり、信
頼性の高いものとなった。このように、本発明のＰＫ測
定用試薬は臨床検査の分野に多大な寄与がはかれるもの
となった。
【図１】本発明のピルビン酸キナーゼ測定用試薬（実施
例１）及び従来の測定用試薬（比較例１）を用いたとき
の試料中のＰＫ量（ユニット／ｌ）と３４０ｎｍにおけ
る１分間当りの吸光度変化量を示す説明図である。
例１）及び従来の測定用試薬（比較例１）を用いたとき
の試料中のＰＫ量（ユニット／ｌ）と３４０ｎｍにおけ
る１分間当りの吸光度変化量を示す説明図である。
●印 実施例１ ○印 比較例１
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/25 - 1/66 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- 【請求項１】 ホスホエノールピルビン酸、アデノシン
５' −二リン酸、グルコース、ヘキソキナーゼ又はグル
コキナーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又
はニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、グル
コース−６−リン酸脱水素酵素、マグネシウム塩類を主
要成分とするピルビン酸キナーゼ測定用試薬において、
６−ホスホグルコノラクトナーゼが含有されていること
を特徴とするピルビン酸キナーゼ測定用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3075722A JP3045191B2 (ja) | 1991-03-14 | 1991-03-14 | ピルビン酸キナーゼ測定用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3075722A JP3045191B2 (ja) | 1991-03-14 | 1991-03-14 | ピルビン酸キナーゼ測定用試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04287697A JPH04287697A (ja) | 1992-10-13 |
| JP3045191B2 true JP3045191B2 (ja) | 2000-05-29 |
Family
ID=13584446
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3075722A Expired - Lifetime JP3045191B2 (ja) | 1991-03-14 | 1991-03-14 | ピルビン酸キナーゼ測定用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3045191B2 (ja) |
-
1991
- 1991-03-14 JP JP3075722A patent/JP3045191B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04287697A (ja) | 1992-10-13 |
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