JPH07250698A - 分析用試薬と分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ＮＡＤに特異的に作用し且つ安定性に優れた
６ＰＧＤＨを、グルコース６リン酸または６ホスホグル
コン酸の分析用試薬および分析法に利用する。 【効果】 グルース６リン酸または６ホスホグルコン酸
を測定する際の測定感度を２倍とすることができ、また
可視部での測定が可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、分析用試薬と分析方
法に関するものである。さらに詳しくは、この発明は、
ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド（以下、Ｎ
ＡＤと略記する）と、これに特異的に反応する新規な６
ホスホグルコン酸脱水素酵素（以下、６ＰＧＤＨと略記
する）の酵素反応を利用する分析用の試薬と、この試薬
を用いる分析方法に関するものであり、医療分野や各種
食品の成分分析等に有用である。

【０００２】

【従来の技術】従来より、医療分野や食品成分の分析等
において酵素を用いた各種物質の測定が広く用いられて
いるが、こうした測定系によく利用されているものの一
つに、分析対象となる各種物質から定量的に誘導したグ
ルコース６リン酸（以下Ｇ６Ｐと略記する）の測定が挙
げられる。Ｇ６Ｐに誘導して定量してできる物質として
は、医療分野では、心疾患や神経性疾患などの指標とな
るクレアチンキナーゼ（以下ＣＫと略記する）、膵疾患
や腎不全などの指標となるアミラーゼ、糖尿病などの指
標となるグルコース、腎機能障害などの指標となるマグ
ネシウム、カルシウム値の変動と関連し考察することに
より骨軟化症、副甲状腺機能低下などの指標となる無機
リンなどが挙げられる。このようなＧ６Ｐの測定は、以
下の反応式に示した反応により可能となる。

【０００３】

【化１】

【０００４】すなわちこの測定系は、Ｇ６ＰをＮＡＤま
たはＮＡＤリン酸（以下、ＮＡＤＰと略記する）の存在
下でグルコース６リン酸脱水素酵素（以下Ｇ６ＰＤＨと
略記する）の反応により脱水素化する際に生成するＮＡ
ＤまたはＮＡＤＰの還元型（以下、それぞれＮＡＤＨ、
ＮＡＤＰＨと略記する）の量を測定することにより可能
となる。

【０００５】また、Ｇ６ＰＤＨに６ＰＧＤＨを共役さ
せ、化１に示した反応で生成した６ホスホグルコン酸
（以下６ＰＧと略記する）を６ＰＧＤＨにより脱水素化
させることにより、Ｇ６ＰＤＨ単独の場合に比べてＮＡ
Ｄ（Ｐ）Ｈの生成量を２倍（すなわち、測定感度を２
倍）とすることもできる。この場合の反応式を示せば以
下の通りである。

【０００６】

【化２】

【０００７】

【化３】

【０００８】さらに、６ＰＧを直接測定することもで
き、例えば特開平４−９１７９８号公報には、グルコン
酸とＡＴＰ結合型カルシウムまたはマグネシウムからグ
ルコン酸キナーゼによる触媒反応により生成する６ＰＧ
を、ＮＡＤＰの存在下６ＰＧＤＨと反応させ、生成した
ＮＡＤＰＨ量を測定することにより、カルシウムまたは
マグネシウムを測定する方法が開示されている。

【０００９】一般に、このようなＧ６Ｐまたは６ＰＧ測
定の場合には、Ｇ６ＰＤＨおよび／または６ＰＧＤＨと
ＮＡＤ（Ｐ）との反応により生じたＮＡＤ（Ｐ）Ｈの３
４０ｎｍにおける吸光度を分光学的に測定するが、さら
にジアホラーゼやフェナジンメトサルフェート（以下Ｐ
ＭＳと略記する）およびその誘導体により、生成したＮ
ＡＤ（Ｐ）Ｈを基質としてニトロブルーテトラゾリウム
（以下ＮＢＴと略記する）などのテトラゾリウム塩や
２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（以下Ｄ
ＣＰＩＰと略記する）などを還元発色させ、可視部で測
定することもできる。

【００１０】この様なＧ６Ｐまたは６ＰＧを経由する各
種分析対象を６ＰＧＤＨ、または６ＰＧＤＨとＧ６ＰＤ
Ｈとを用い可視部域で高感度に測定する場合、ジアホラ
ーゼはＮＡＤＨに特異性が高く、またＰＭＳにも適用で
きるため、６ＰＧＤＨはＮＡＤに対して特異的に反応す
るものを利用することが望ましい。６ＰＧＤＨには、補
酵素として、ＮＡＤＰに特異的に作用するもの（ヨーロ
ピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(Europ
ian Journal of Biochemistry)、１巻、１７０頁（１９
６７年））、ＮＡＤとＮＡＤＰ両方に作用するもの（ア
グリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミスト
リー(Agricultural and Biological Chemistry) 、４６
巻、３９１頁（１９８２年））、ＮＡＤのみに作用する
もの（エフエムビーエス・マイクロバイオロジー・レタ
ーズ(FMBS Microbiology Letters) 、５２巻、１９９頁
（１９８８年））が知られている。このＮＡＤのみに作
用する６ＰＧＤＨはメチロバチルス・フラゲラタム（Me
thyrobacillus flagellatum ）ＫＴ１株由来のもので
ある。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記メ
チロバチルス・フラゲラタムＫＴ１株から微量に抽出、
精製することのできる６ＰＧＤＨは、ＮＡＤ特異性は高
いものの、４℃で３日間保存しただけで９０％失活して
しまうような非常に不安定なものであり、実用的ではな
かった。このため、従来は、Ｇ６Ｐまたは６ＰＧを経由
して分析対象を可視部域で高感度に測定する場合、その
分析用試薬はＮＡＤＰとこれに特異性の高い６ＧＰＤＨ
を成分とする外なく、より高精度の測定が期待できるＮ
ＡＤと６ＧＰＤＨとの組合せからなる分析用試薬は存在
しなかった。

【００１２】この発明は、以上の通りの事情に鑑みてな
されたものであり、ＮＡＤとこれに特異性の高い６ＰＧ
ＤＨを成分とする分析用試薬と、この試薬を用いた分析
方法を提供することを目的としている。

【００１３】

【課題を解決するための手段】この発明は、上記の課題
を解決するものとして、６ホスホグルコン酸またはその
誘導体で標識した分析対象、あるいは６ホスホグルコン
酸またはその誘導体を定量するための試薬組成物であっ
て、少なくとも、ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレ
オチドと、このニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオ
チドに特異的に作用する６ホスホグルコン酸脱水素酵素
とを含有する分析用試薬を提供する。

【００１４】またこの発明は、グルコース６リン酸また
はその誘導体で標識した分析対象、あるいはグルコース
６リン酸またはその誘導体を定量するための試薬組成物
であって、少なくとも、ニコチンアミド・アデニン・ジ
ヌクレオチド、このニコチンアミド・アデニン・ジヌク
レオチドに特異的に作用する６ホスホグルコン酸脱水素
酵素およびグルコース６リン酸脱水素酵素を含有する分
析用試薬をも提供する。

【００１５】さらにこの発明は、６ホスホグルコン酸ま
たはその誘導体で標識した分析対象、あるいは６ホスホ
グルコン酸またはその誘導体と、上記前者の分析用試薬
とを混合し、６ホスホグルコン酸と試薬中成分との反応
によって生じるニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオ
チド還元型を定量するか、またはこの酵素サイクリング
に伴う発色シグナルを測定することを特徴とする分析方
法、およびグルコース６リン酸またはその誘導体で標識
した分析対象、あるいはグルコース６リン酸またはその
誘導体と、上記前者の分析用試薬とを混合し、グルコー
ス６リン酸と試薬中成分との反応によって生じるニコチ
ンアミド・アデニン・ジヌクレオチド還元型を定量する
か、またはこの酵素サイクリングに伴う発色シグナルを
測定することを特徴とする分析方法を提供する。

【００１６】以下、この発明についてさらに詳しく説明
する。この発明における分析対象は、６ＰＧまたはＧ６
Ｐ、あるいはこれらの誘導体で標識した各種生体成分、
食品成分等である。また、分析対象のＧ６Ｐまたは６Ｐ
Ｇあるいはこれらの誘導体としては、Ｇ６Ｐまたは６Ｐ
Ｇ、あるいはこれらの誘導体の他、たとえばＧ６Ｐまた
は６ＰＧ、あるいはこれらの誘導体が任意の反応系から
遊離または生成される各種成分、例えばクレアチンキナ
ーゼ（ＣＫ）、アミラーゼ、グルコース、マグネシウ
ム、無機リン等も分析の対象となる。

【００１７】この発明の分析用試薬に使用する６ＰＧＤ
Ｈは、補酵素としてＮＡＤに特異的に作用するものであ
れば、その由来は特に限定されるものではないが、安定
性に優れたものが好ましい。ここでいうＮＡＤに特異的
に作用する６ＰＧＤＨとは、ＮＡＤを補酵素としたとき
の活性値を１００とするとＮＡＤＰを用いた場合１以下
を示すものである。そのような６ＰＧＤＨの産生能を有
する細菌株は、ロイコノストック・ラクティス(Leucono
stoc lactis) ＳＨＯ４７株（ＦＥＲＭ Ｐ−１３９７
０）、またはロイコノストック・ラクティス(Leuconost
oc lactis) ＳＨＯ５４株（ＦＥＲＭ Ｐ−１３９７
１）である。

【００１８】この発明の分析用試薬で使用することのあ
るＧ６ＰＤＨとしては、その由来は特に限定されるもの
ではないが、ＮＡＤＰだけでなくＮＡＤにも作用するＧ
６ＰＤＨ、例えば、ロイコノストック・メセンテロイデ
ス（Leuconostoc mesenteroides ）、シュードモナス
・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens ）、バ
チルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearoth
ermophilus）などが好ましい。

【００１９】ジアホラーゼも、その由来は特に限定され
るものではないが、安定性、保存性に富む好熱性細菌
（例えばバチラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus
stearothermophilus）など）由来のジアホラーゼが望
ましい。この発明の分析用試薬の組成は、例えばＧ６Ｐ
ＤＨ０．２〜２０Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．５〜５Ｕ／
ｍｌ、６ＰＧＤＨ０．５〜３０Ｕ／ｍｌ、好ましくは２
〜１０Ｕ／ｍｌ、ＮＡＤ０．２〜１０ｍＭ、好ましくは
０．５〜５ｍＭである。その他に通常、促進剤、賦活剤
などの添加剤なるものを含ませることができる。添加剤
としては、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウムなどの
マグネシウム塩類、各種チオール化合物、または防腐剤
としてのアジ化ナトリウムなど公知のものを支障なく使
用することができる。また、ＮＡＤ−ＮＡＤＨの酵素サ
イクリングに伴う発色シグナルを可視部で測定する場合
は、上記に加え、ジアホラーゼ０．１〜５Ｕ／ｍｌ、好
ましくは０．３〜２Ｕ／ｍｌまたはＰＭＳ０．２〜２ｍ
Ｍ、好ましくは０．５〜１ｍＭとＮＢＴなどのテトラゾ
リウム塩またはＤＣＰＩＰを適当量、ＮＢＴの場合は
０．２〜２ｍＭ、好ましくは０．５〜１ｍＭ、ＤＣＰＩ
Ｐの場合は０．０１〜０．５ｍＭ、好ましくは０．０３
〜０．１ｍＭを含有させる。また界面活性剤として、Ｔ
ｒｉｔｏｎ Ｘ−１００などの非イオン性、ＣＴＡＢな
どの陽イオン性、アシルサルコシンなどの陰イオン性の
界面活性剤が支障無く使用できる。その濃度は、０．０
１〜０．５％、好ましくは０．０５〜０．１％程度であ
る。

【００２０】この発明の分析用試薬においては、上記の
組成物をｐＨ５．５〜８．５の緩衝液に溶解するが、緩
衝液の種類としては、例えばイミダゾール緩衝液、トリ
ス緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液、グリシルグリ
シン緩衝液、ＭＥＳ緩衝液などのグッド系の緩衝液が支
障無く使用できる。この発明の分析用試薬は、上記組成
物を上記緩衝液で溶解した液状試薬、これを凍結乾燥し
た凍結乾燥品などの形状にすることができ、また、濾紙
やメンブランフィルターに吸着させるいわゆるドライケ
ミストリーにも広く適用できる。さらに、上記各酵素を
標識酵素として適当な抗体に結合させてエンザイム・イ
ムノアッセイにも適用できる。

【００２１】この発明の分析方法においては、分析対象
に予め標識したＧ６Ｐまたは６ＰＧ、あるいは種々の反
応系により分析対象となる各種物質から遊離されたＧ６
Ｐまたは６ＰＧに対して、Ｇ６ＰＤＨ、ＮＡＤおよび６
ＰＧＤＨを含む試薬組成物（６ＰＧのみの測定の場合は
Ｇ６ＰＤＨは不要）を加え（または、Ｇ６Ｐを誘導する
反応系に最初から前記組成物を共存させ）、反応によっ
て生成するＮＡＤの量を波長３４０ｎｍにおける吸光度
によって測定し、その測定値から分析対象となる各種物
質を測定できる。また、各種物質から遊離または生成さ
れたＧ６Ｐまたは６ＰＧに対し、Ｇ６ＰＤＨ、ＮＡＤ、
６ＰＧＤＨ、ジアホラーゼまたはＰＭＳ（その誘導体で
も可）およびＮＢＴなどのテトラゾリウム塩またはＤＣ
ＰＩＰを含む試薬組成物（６ＰＧのみの場合はＧ６ＰＤ
Ｈは不要）を用い、上述したのと同様に反応させること
により、可視部（ＮＢＴの場合は５５０ｎｍ、ＤＣＰＩ
Ｐの場合は６００ｎｍ）での測定値から分析対象となる
各種物質を測定できる。

【００２２】この発明の分析用試薬を用いて各種物質を
測定するには、例えばセル室が保温された分光光度計の
セルに試薬を入れ、測定温度（２０〜４５℃の間の任意
の温度）に約３分間保温し、その後、試料を添加混和し
た後、３４０ｎｍの吸光度の上昇を測定すればよい。こ
の発明の分析用試薬および方法を用いて測定することが
できる物質としては、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、グ
ルコース、マグネシウム、クレアチンキナーゼＭＢアイ
ソザイム（以下ＣＫ−ＭＢと略記する）などがあげられ
る。以下これらの物質の測定原理を説明する。 （１）クレアチンキナーゼ（ＣＫ） 従来より知られているＣＫ測定法の測定原理の一例を以
下に示す。

【００２３】

【化４】

【００２４】

【化５】

【００２５】

【化６】

【００２６】この発明によれば、化６の脱水素反応にお
いて、６ＰＧＤＨを存在させる。この発明は、前記式化
４、化５および化６からなる全反応系を１工程または多
工程で実施するいずれの方法においても用いることがで
きる。従って、６ＰＧＤＨを全反応系の最初から存在さ
せても、後から添加してもよい。このＣＫ測定法の被検
試料としては、ＣＫを含む可能性のあるものであれば特
に制限されないが、例えば、血清、尿、組織抽出液など
があげられる。 （２）グルコース 従来より知られているグルコース測定法の測定原理の一
例を以下に示す。

【００２７】

【化７】

【００２８】

【化８】

【００２９】この発明によれば、化８の脱水素反応にお
いて、６ＰＧＤＨを存在させる。この発明は、前記式化
７および化８からなる全反応系を１工程または多工程で
実施するいずれの方法においても用いることができる。
従って、６ＰＧＤＨを全反応系の最初から存在させて
も、後から添加してもよい。このグルコース測定法の被
検試料としては、グルコースを含む可能性のあるもので
あれば特に制限されないが、例えば、血清、尿、組織抽
出液などがあげられる。 （３）マグネシウム 従来より知られているマグネシウム測定法の測定原理の
一例を以下に示す。

【００３０】

【化９】

【００３１】

【化１０】

【００３２】この発明によれば、化１０の脱水素反応に
おいて、６ＰＧＤＨを存在させる。この発明は、前記式
化９および化１０からなる全反応系を１工程または多工
程で実施するいずれの方法においても用いることができ
る。従って、６ＰＧＤＨを全反応系の最初から存在させ
ても、後から添加してもよい。このマグネシウム測定法
の被検試料としては、マグネシウムを含む可能性のある
ものであれば特に制限されないが、例えば、血清、尿、
組織抽出液などがあげられる。 （４）ＣＫ−ＭＢ 従来より知られているＣＫ−ＭＢ測定法の測定原理の一
例は、試薬中に添加したクレアチンキナーゼＭＭアイソ
ザイム（以下ＣＫ−ＭＭと略記する）の阻害抗体によ
り、ＣＫ−ＭＭを不活し、残ったＣＫ−ＭＢ活性を以下
に示す反応系で測定する方法である。

【００３３】

【化１１】

【００３４】

【化１２】

【００３５】

【化１３】

【００３６】この発明によれば、前記式化１３の脱水素
反応において、６ＰＧＤＨを存在させる。この発明は、
前記式化１１、化１２および化１３からなる全反応系を
１工程または多工程で実施するいずれの方法においても
用いることができる。従って、６ＰＧＤＨを全反応系の
最初から存在させても、後から添加してもよい。このＣ
Ｋ−ＭＢ測定法の被検試料としては、ＣＫを含む可能性
のあるものであれば特に制限されないが、例えば、血
清、尿、組織抽出液などがあげられる。

【００３７】

【実施例】以下、実施例を示してこの発明をさらに詳細
かつ具体的に説明するが、この発明はこれらの例に限定
されるものではない。まず、参考例として、６ＰＧＤＨ
の取得方法を示す。参考例 以下に述べる手順で、ロイコノトスック・ラクティス
（Leuconostoc lactis）ＳＨＯ５４株からＮＡＤに特
異的に作用する６ＰＧＤＨを単離・精製した。

【００３８】グルコース３．０％（重量％を表す。以下
同様）、酵母エキス１．０％、ペプトン０．５％、クエ
ン酸三ナトリウム・二水和物０．５％、酢酸ナトリウム
０．２％、硫酸マグネシウム・七水和物０．０２％、硫
酸マンガン・四〜五水和物０．００５％、ツイン８０
０．１％（容量％）、ｐＨ６．４よりなる培地２５リッ
トルを３０リットル容のジャーファーメンターに仕込
み、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した後、ロ
イコノトスック・ラクティス（Leuconostoc lactis）
ＳＨＯ５４株（ＦＥＲＭ Ｐ−１３９７１）を接種し、
４０℃で１０時間、２００ｒｐｍで攪拌し、通気しない
条件下、４ＮのＮａＯＨでｐＨを６．４に調整しながら
培養した。遠心分離により菌体を採取して約１８０ｇの
菌体を得た。得られた菌体を凍結状態で保存した。

【００３９】次に、凍結菌体約１００ｇをＥＤＴＡおよ
び２−メルカプトエタノールを２ｍＭずつ含む２０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１Ｌに懸濁し、これにＴｒ
ｉ−ｔｏｎ Ｘ−１００を０．０１％、リゾチームを
０．２ｍｇ／ｍｌ、ＤＮａｓｅＩを０．２ｍｇ／ｍｌに
なるように添加し、２時間室温で攪拌後、遠心分離によ
り細胞片を除去し、６ＰＧＤＨを含む粗酵素液を得た。

【００４０】この粗酵素液に酢酸を加えｐＨ５．８に調
整し、予め２０ｍＭリン酸同緩衝液（ｐＨ５．７５）で
平衡化したプロシオンブルーＨ−ＢＲＤカラム（プロシ
オンブルーＨ−ＢＲＤはＩＣＩ社より購入）に通じ、１
００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で溶出した。濃
縮後、予め２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）で平衡化したＱ−セファロースＦＦカラム（ファル
マシア社製）に通じ、ＫＣｌを平衡液に加えた溶液で溶
出せしめると、ＫＣｌ濃度０．４０〜０．４５Ｍの近く
に活性画分が溶出した。この溶出画分を濃縮後、硫酸ア
ンモニウムを０．５Ｍになるように加え、予め１Ｍの硫
酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．
５）で平衡化されたオクチルセファロースカラムＣＬ−
４Ｂ（ファルマシア社製）に通じ、同緩衝液で溶出し
た。活性画分を集めて濃縮後、脱塩した。このようにし
て得られた６ＰＧＤＨは、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動で単一なバンドを与え、精製酵素標品を得ることが
できた。また、活性の収率は約５５％で、酵素１ｍｇ当
たり約１３０単位の比活性を示し、その精製度は粗酵素
液を１とすると約２５倍であった。実施例１ 参考例で得た６ＰＧＤＨを用いてグルコース測定用試薬
を調製した。バチルス・ステアロサーモフィルス由来の
グルコキナーゼ（生化学工業社製）０．８Ｕ／ｍｌ、ロ
イコノストック・メセンテロイデス由来のＧ６ＰＤＨ
（ベーリンガー・マンハイム社製）１．２Ｕ／ｍｌ、６
ＰＧＤＨ２．５Ｕ／ｍｌ、ＮＡＤ１．６ｍＭ、Ｎ−アセ
チルシステイン（ＮＡＣ）５ｍＭ、ＫＣｌ２５ｍＭ、Ｍ
ｇＣｌ₂ １０ｍＭ、ＡＴＰ２ｍＭを含むトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ７．８）８０ｍＭよりなるグルコース測定用試
薬を調製した。別に比較例１として、上記組成から６Ｐ
ＧＤＨを抜いたグルコース測定用試薬を調製した。

【００４１】次に、グルコースを精製水で溶解し２００
ｍｇ／ｄｌのグルコース溶液を調製した。上記のグルコ
ース測定用試薬３．０ｍｌを各々光路長１ｃｍのセルに
入れ、約３分間３７℃に保温後、上記グルコース溶液
０．０２ｍｌを添加して反応を開始し、反応開始から１
０分間の３４０ｎｍの吸光度変化を測定した。結果を図
１に示した。

【００４２】この図１から、６ＰＧＤＨを含有させるこ
とにより測定感度が２倍に向上することが示された。実施例２ 参考例で得た６ＰＧＤＨを用いてＣＫ測定用試薬を調製
した。バチルス・ステアロサーモフィルス由来のグルコ
キナーゼ３Ｕ／ｍｌ、ロイコノストック・メセンテロイ
デス由来のＧ６ＰＤＨ１Ｕ／ｍｌ、６ＰＧＤＨ２．５Ｕ
／ｍｌ、ＡＤＰ２ｍＭ、ＮＡＤ２ｍＭ、グルコース２０
ｍＭ、ＡＭＰ５ｍＭ、Ａｐ５Ａ（ベーリンガー・マンハ
イム社製）１０μＭ、ＮＡＣ２０ｍＭ、硫酸マグネシウ
ム１０ｍＭ、アジ化ナトリウム０．１％、ＥＤＴＡ２ｍ
Ｍ、クレアチンリン酸２５ｍＭを含むイミダゾール−酢
酸緩衝液（ｐＨ６．７）８０ｍＭより成るＣＫ測定用試
薬を調製した。別に比較例２として、上記組成より６Ｐ
ＧＤＨを抜いたＣＫ測定用試薬を調製した。

【００４３】次に、試料としてウサギ筋肉由来のＣＫ
（ベーリンガー・マンハイム社製）を生理食塩水または
市販標準血清で種々の濃度に溶かした試料を調製した。
上記で調製したＣＫ測定用試薬３．０ｍｌを各々光路長
１ｃｍのセルに入れ、約３分間３７℃に保温後、上記で
調製した各種濃度のＣＫ試料０．０６ｍｌを添加して反
応を開始し、３４０ｎｍの吸光度変化を追跡した。１分
間当たりの吸光度変化量と試料中のＣＫ活性との関係を
図２に示した。

【００４４】この図２から、実施例２の直線の傾きが比
較例２の傾きの２倍、すなわち６ＰＧＤＨを含有させる
ことにより測定感度が２倍に向上することが示された。実施例３ 参考例で得た６ＰＧＤＨを用い、マグネシウム測定用試
薬を調製した。バチルス・ステアロサーモフィルス由来
のグルコキナーゼ１Ｕ／ｍｌ、ロイコノストック・メセ
ンテロイデス由来のＧ６ＰＤＨ０．７５Ｕ／ｍｌ、６Ｐ
ＧＤＨ２．０Ｕ／ｍｌ、ＡＴＰ２．５ｍＭ、ＮＡＤ０．
６２５ｍＭ、グリコールエーテルジアミン−Ｎ，Ｎ，
Ｎ′，Ｎ′−四酢酸（以下ＧＥＤＴＡと略記する）０．
５ｍＭ、塩化カリウム１８．７５ｍＭ、イミダゾール−
塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１２５ｍＭより成るマグネシ
ウム測定用試薬を調製した。また別に５０ｍＭグルコー
ス溶液を調製した。比較例３として、上記組成より６Ｐ
ＧＤＨを抜いたマグネシウム測定用試薬を調製した。

【００４５】次に、試料として塩化マグネシウムを用い
てマグネシウムを種々の濃度で含む溶液を調製した。上
記で調製したマグネシウム測定用試薬２．４ｍｌを各々
光路長１ｃｍのセルに入れ、上記で調製した試料０．０
３ｍｌを添加し、約３分間３７℃に保温後、グルコース
溶液０．６ｍｌを添加して反応を開始し、３４０ｎｍの
吸光度変化を追跡した。１分間当たりの吸光度変化量と
試料中のマグネシウム濃度との関係を図３に示した。

【００４６】この図３から、実施例３の直線の傾きが比
較例３の傾きの２倍、すなわち６ＰＧＤＨを含有させる
ことにより測定感度が２倍に向上することが示された。実施例４ 参考例で得た６ＰＧＤＨを用い、マグネシウム測定用試
薬を調製した。バチルス・ステアロサーモフィルス由来
のグルコキナーゼ１Ｕ／ｍｌ、ロイコノストック・メセ
ンテロイデス由来のＧ６ＰＤＨ０．７５Ｕ／ｍｌ、６Ｐ
ＧＤＨ２．０Ｕ／ｍｌ、バチラス・ステアロサーモフィ
ルス由来のジアホラーゼＩ １．０Ｕ／ｍｌ、ＡＴＰ
２．５ｍＭ、ＮＡＤ０．６２５ｍＭ、ＧＥＤＴＡ０．５
ｍＭ、塩化カリウム１８．７５ｍＭ、ＮＢＴ０．５ｍ
Ｍ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．１％、イミダゾー
ル−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１２５ｍＭより成るマグ
ネシウム測定用試薬を調製した。また別に５０ｍＭグル
コース溶液を調製した。比較例４として、上記組成より
６ＰＧＤＨを抜いたマグネシウム測定用試薬を調製し
た。

【００４７】次に、試料として塩化マグネシウムを用い
てマグネシウムを種々の濃度で含む溶液を調製した。上
記で調製したＣＫ測定用試薬２．４ｍｌを各々光路長１
ｃｍのセルに入れ、上記で調製した試料０．０３ｍｌを
添加し、約３分間３７℃に保温後、グルコース溶液０．
６ｍｌを添加して反応を開始し、５５０ｎｍの吸光度変
化を追跡した。１分間当たりの吸光度変化量と試料中の
マグネシウム濃度との関係を図４に示した。

【００４８】この図４から、実施例４の直線の傾きが比
較例４の傾きの２倍、すなわち６ＰＧＤＨを含有させる
ことにより測定感度が２倍に向上することが示された。実施例５ 参考例で得た６ＰＧＤＨを用いてＣＫ−ＭＢ測定用試薬
を調製した。バチルス・ステアロサーモフィルス由来の
グルコキナーゼ３Ｕ／ｍｌ、ロイコノストック・メセン
テロイデス由来のＧ６ＰＤＨ１．５Ｕ／ｍｌ、６ＰＧＤ
Ｈ２．５Ｕ／ｍｌ、ＡＤＰ２ｍＭ、ＮＡＤ２ｍＭ、グル
コース２０ｍＭ、ＡＭＰ５ｍＭ、Ａｐ５Ａ１０μＭ、Ｎ
ＡＣ２０ｍＭ、酢酸マグネシウム１０ｍＭ、ＮＡＣ２０
ｍＭ、ＥＤＴＡ２ｍＭ、ヤギ由来のヒトＣＫ−ＭＭ阻害
抗体（ＭＥＲＣＫ社製）１０００Ｕ／ｍｌ、クレアチン
リン酸２５ｍＭを含むイミダゾール酢酸緩衝液（ｐＨ
６．７）８０ｍＭより成るＣＫ−ＭＢ測定用試薬を調製
した。別に比較例５として上記組成物より６ＰＧＤＨを
抜いたＣＫ−ＭＢ測定用試薬を調製した。

【００４９】試料としては、心筋梗塞患者の血清（ＣＫ
値２０２０Ｕ／ｌ）を用いた。上記で調製したＣＫ測定
用試料１．０ｍｌを各々光路長１ｃｍのセルに入れ、約
３分間３７℃に保温後、試料０．０４ｍｌを添加して反
応を開始し、３４０ｎｍの吸光度変化を追跡した。１分
間当たりの吸光度変化量と試料中のＣＫ−ＭＢ活性との
関係を図５に示した。

【００５０】この図５から、実施例５の直線の傾きが比
較例５の傾きの２倍、すなわち６ＰＧＤＨを含有させる
ことにより測定感度が２倍に向上することが示された。実施例６ 実施例１と同様に参考例で得た６ＰＧＤＨを用いてグル
コース測定用試薬を調製した。バチルス・ステアロサー
モフィルス由来のグルコキナーゼ０．８Ｕ／ｍｌ、ロイ
コノストック・メセンテロデス由来のＧ６ＰＤＨ１．２
Ｕ／ｍｌ、６ＰＧＤＨ２．５Ｕ／ｍｌ、ＮＡＤ１．０ｍ
Ｍ、ＮＡＤＰ１．０ｍＭ、ＮＡＣ５ｍＭ、ＫＣｌ２５ｍ
Ｍ、ＭｇＣｌ₂ １０ｍＭ、ＡＴＰ２ｍＭを含むトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ７．８）８０ｍＭよりなるグルコース測
定用試薬を調製した。これら試薬を用いて実施例１と同
様に試験したところ、図１と同様の結果を得、６ＰＧＤ
Ｈを含有させることにより測定感度が２倍に向上するこ
とが示された。また、ＭＡＤに特異的に作用する６ＰＧ
ＤＨを用いれば、試薬中にＮＡＤとＮＡＤＰを共存させ
ても測定値に影響しないことも示された。

【００５１】

【発明の効果】以上詳しく説明した通り、この発明によ
れば、ＮＡＤに特異的に作用する６ＰＧＤＨを用いるこ
とにより、臨床検査などの分野で分析対象となる各種物
質に標識したＧ６Ｐまたは６ＰＧ、あるいは各種物質か
ら誘導されるＧ６Ｐまたは６ＰＧを高感度で定量でき、
可視部でも効率よく測定することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１と比較例１の３４０ｎｍにおける吸光
度変化量を示し、●印は実施例１、○印は比較例１の結
果、△印は実施例１においてグルコース溶液に代わりに
精製水を加えたときの結果である。

【図２】実施例２と比較例２の試料中ＣＫ量（ユニット
／ｌ）に対する３４０ｎｍにおける１分間当たりの吸光
度変化量を示し、●印は実施例２、○印は比較例２の結
果である。

【図３】実施例３と比較例３の、試料中マグネシウム量
（ｍｇ／ｄｌ）に対する３４０ｎｍにおける１分間当た
りの吸光度変化量を示し、●印は実施例３、○印は比較
例３の結果である。

【図４】実施例４と比較例４の試料中マグネシウム量
（ｍｇ／ｄｌ）に対する５５０ｎｍにおける１分間当た
りの吸光度変化量を示し、●印は実施例４、○印は比較
例４の結果である。

【図５】実施例５と比較例５の試料中ＣＫ−ＭＢ量に対
する３４０ｎｍにおける１分間当たりの吸光度変化量を
示し、●印は実施例５、○印は比較例５の結果である

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 近藤 仁司 京都府宇治市宇治小桜23番地 ユニチカ株 式会社中央研究所内

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ６ホスホグルコン酸またはその誘導体で
   標識した分析対象、あるいは６ホスホグルコン酸または
   その誘導体を定量するための試薬組成物であって、少な
   くとも、ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド
   と、このニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドに
   特異的に作用する６ホスホグルコン酸脱水素酵素とを含
   有する分析用試薬。
2. 【請求項２】 グルコース６リン酸またはその誘導体で
   標識した分析対象、あるいはグルコース６リン酸または
   その誘導体を定量するための試薬組成物であって、少な
   くとも、ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド
   と、このニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドに
   特異的に反応する６ホスホグルコン酸脱水素酵素および
   グルコース６リン酸脱水素酵素とを含有する分析用試
   薬。
3. 【請求項３】 ６ホスホグルコン酸脱水素酵素は、ロイ
   コノストック・ラクティスＳＨＯ４７株（ＦＥＲＭ Ｐ
   −１３９７０）またはロイコノストック・ラクティスＳ
   ＨＯ５４株（ＦＥＲＭ Ｐ−１３９７１）から抽出、精
   製されたものである請求項１または２の分析用試薬。
4. 【請求項４】 ６ホスホグルコン酸またはその誘導体で
   標識した分析対象、あるいは６ホスホグルコン酸または
   その誘導体と、請求項１の分析用試薬とを混合し、６ホ
   スホグルコン酸と試薬中成分との反応によって生じるニ
   コチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド還元型を定量
   するか、またはこの酵素サイクリングに伴う発色シグナ
   ルを測定することを特徴とする分析方法。
5. 【請求項５】 グルコース６リン酸またはその誘導体で
   標識した分析対象、あるいはグルコース６リン酸または
   その誘導体と、請求項２の分析用試薬とを混合し、グル
   コース６リン酸と試薬中成分との反応によって生じるニ
   コチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド還元型を定量
   するか、またはこの酵素サイクリングに伴う発色シグナ
   ルを測定することを特徴とする分析方法。