JP3852991B2 - 1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、その製造法および用途 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、少なくとも下記の反応式1
【0002】
【化4】
【0003】
(式中、NADP+ は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、NADPH+H+ は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を意味する)にて表される反応を触媒する1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼおよびその製造法、さらに1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼを用いてなる1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸の測定法に関する診断用酵素およびこれを用いる分析分野に属する。
【0004】
【従来の技術】
1,5−アンヒドログルシトールはヒト髄液、血清、尿などの生体液中に存在し、糖尿病などの疾患において著しく濃度が低下することから、糖尿病の診断マーカーになることが報告されている(赤沼安夫、戸辺一之:日本内科学会誌80巻、1198〜1204頁、1991)。従来、その測定法としてはガスクロマトグラフィー法(吉岡ら、糖尿病、25巻、1115〜1118頁、1982年)、1,5−アンヒドログルシトール酸化酵素、ピラノースオキシダーゼ、L−ソルボースオキシダーゼ、D−グルコシド−3−デヒドロゲナーゼなど1,5−アンヒドログルシトールを酸化する酵素を利用する酵素法が報告されている(特開昭62−79780号公報、特開昭63−185397号公報、特開平7−67697号公報)。
【0005】
一方、例えばラット組織内の1,5−アンヒドログルシトールは、その5〜10%がリン酸化された形にて存在し、またヒト骨髄腫由来の培養細胞においてもリン酸化された形にて存在することが報告されており、ラット組織におけるリン酸化物の濃度は2〜5nmol/g(組織)として存在し(水野ら、第67回 日本生化学会大会発表抄録集p.989、1994)、推定するにリン酸化物とは1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸と判断でき、その存在意義についての究明が必要とされているが、その測定法はGC/MSによるものであり、非常に煩雑になっており、正確性に欠ける。 従来、1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸に特異的に作用して、酸化せしめる酵素は報告されていない。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】
1,5−アンヒドログルシトールがリン酸化されて形成される1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸のヒト髄液、血清、尿などの生体液中の濃度を測定することによって、糖尿病などの疾患を従来より正確に診断できる可能性がある。本発明は1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸を含有する被検液において、1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸を簡便かつ高精度に測定することのできる方法および試薬を提供することを目的とし、また生体液中の1,5−アンヒドログルシトールをリン酸化し、これを測定することにより糖尿病診断マーカーとしての1,5−アンヒドログルシトールを測定することのできる方法および試薬を提供するものである。
【0007】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意研究の結果、エシェリヒア属に属するエシェリヒア・コリDH1株(ATCC 33849)が1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸に基質特異性を有し、少なくとも下記の反応式1
【0008】
【化5】
【0009】
(式中、NADP+ は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、NADPH+H+ は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を意味する)にて表される反応を触媒する全く新規な酵素を生産することを見い出し、本酵素を1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼと命名、かつこの1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼを単離、精製し、さらに該酵素および補酵素を1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸を含有する被検液に作用せしめたことにより1、5−アンヒドログルシトール−6−リン酸を簡便かつ正確に測定する方法を見い出した。
【0010】
本発明は上記の知見に基づいて完成されたもので(1)少なくとも下記の反応式1
【0011】
【化6】
【0012】
にて表される反応を触媒する1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、(2)エシェリヒア属に属する当該反応を触媒する1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼを生産する能力を有する微生物を培養し、その培養物から1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼを採取することを特徴とする1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼの製造法、(3)1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸を含有する被検液に補酵素の存在下に当該反応を触媒する1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼを作用せしめ、次いで反応によって消費された成分または生成された成分を測定することを特徴とする被検液中1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸の測定法である。
【0013】
以下、本発明をより詳細に説明する。
まず、本発明の1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼとしては下記の反応式1
【0014】
【化7】
【0015】
で示される1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸を基質とし、例えば補酵素NADP+(以下NADPと記することもある)を消費してNADPH+H+(以下NADPHと記することもある)を生成するものであればよく、また補酵素について一般的に述べれば酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)〔以下NAD(P)と記することもある〕を消費して還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)〔以下NAD(P)Hと記することもある〕を生成するか、または酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)〔以下チオNAD(P)と記することもある〕を消費して還元型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)〔以下チオNAD(P)Hと記することもある〕を生成する1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼであればなんら限定されるものではない。
【0016】
またこの1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼ生産菌としてはエシェリヒア属に属する1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼ生産菌であれば何ら限定されるものではなく、1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼを生産する能力を有するその変異株であれば使用できるもので、好ましくはエシェリヒア・コリに属する生産菌であり、より好ましいものとしてエシェリヒア・コリDH1株(ATCC 33849)はATCCに保存され、ATCC(18th)カタログに記載されており、何人も入手可能であり、本菌株から得られた1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼが好ましい。
【0017】
次いで1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼを得るに当たって好ましくはエシェリヒア.コリDH1株(ATCC 33849)を培養するもので、この培養手段としては固体培養でも液体培養でもよいが好ましくはフラスコ、ジャー等による通気培養である。この培地としては微生物の培養に通常用いられるものが広く使用される。炭素源としてグルコース、グリセロール、ソルビトール、ラクトースなど、窒素源としては酵母エキス、肉エキス、トリプトン、ペプトンなど、無機塩としては塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム等を用いればよい。培養条件としては例えばpH6.5〜7.5、培養温度25〜37℃で目的とする酵素が最高力価となる培養時間、例えば18〜30時間にて目的とする酵素を採取すればよい。
【0018】
次いで酵素を採取するに当たっては培養液から菌体を遠心分離等によって分離し、菌体をリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等の緩衝液に懸濁した後、リゾチーム、超音波、ガラスビーズ等によって破砕して遠心分離し、可溶性画分を粗酵素液として回収する。
このようにして得られた粗製の1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼ含有液を公知の蛋白質、酵素の単離、精製手段を用いて処理することにより、精製された1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼを得ることができる。例えばアセトン、エタノールなどの有機溶媒による分別沈殿法、硫安などによる塩析法、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水クロマトグラフィー法、アフィニティクロマトグラフィー法、ゲル濾過法等の一般的な酵素精製法を適宜選択、組み合わせて精製1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼを得ることができ、適宜安定化剤例えばショ糖、グリセロール等を5〜50%程度、アミノ酸、補酵素等を0.01〜0.1%程度として単独または2種以上適宜組み合わせて加えて凍結保存してもよい。
【0019】
本発明によって得られる1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼは以下に述べる理化学的性質を有するものである。
(1)作用
補酵素としてNADP+を用いて1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸を脱水素し、組成式(C6 H11O8 P1 )の化合物とする下記の反応式1
【0020】
【化8】
【0021】
で表される反応を触媒する。
また上記反応において、1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸を25mMとして用いた場合補酵素としてNADP+に対するKm値は0.086±0.04mM、NAD+(NADと記することもある)に対するKm値は2.4±0.23mM(生成物はNADH+H+:NADHと記することもある)、チオNADP+(チオNADPと記することもある)に対するKm値は0.081±0.03mM(生成物はチオNADHP+H+:チオNADPHと記することもある)であり、さらにチオNADも補酵素として作用する。
【0022】
また、このことから、本酵素はNADPやNADなどのNAD(P)を消費してNAD(P)Hを生成するか、チオNAD(P)を消費してチオNAD(P)Hを生成するものと認められる。
(2)力価の測定法
1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼの酵素活性測定法
測定試薬
50mM CAPS−NaOH緩衝液(pH10.0)
1mM NADP(酸化型ニコチンアデニンジヌクレオチドリン酸)
5mM 1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸
(CAPS:N−Cyclohexyl−3−aminopropanesulfonic acid)
測定試薬1mlを光路長1cmのセルに入れ37℃で5分間予備加温した後、0.01mlの酵素液添加後0.5分後の波長340nmにおける吸光度(Aa)と酵素液添加後1.5分後の吸光度(Ab)を測定する。この吸光度(Aa)と(Ab)の吸光度差(Ab−Aa)より酵素活性を求める。なお、吸光度(Ab)が0.2以上になる時は酵素液を50mMのCAPS−NaOH緩衝液(pH10.0)で希釈して測定するものとする。酵素活性1単位は37℃で1分間に1μモルの還元型NADPを生成させる酵素量とし、計算式は下記の通りである。
酵素活性(U/ml)=(Ab−Aa)×16.0×酵素の希釈倍率
(3)基質特異性
上記の力価測定法において、その反応液中の1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸の代わりに、種々の基質を用いて、1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸に対する相対活性を求めた結果を表1に示す。
【0023】
【表1】
【0024】
その結果、この酵素は少なくとも1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸に基質特異性を示した。
(4)至適pH
上記の力価測定法において、pH7.0〜9.0は50mMトリス−塩酸緩衝液(□−□)、pH9.5〜10.5は50mMのCAPS−NaOH緩衝液(■−■)を用いた。至適pHは9〜10付近であり、結果を図1に示した。
【0025】
(5)pH安定性
pH4.0〜5.5はクエン酸緩衝液(○−○)、pH5.5〜7.0はビストリス−塩酸緩衝液(●−●)、pH7.0〜9.0はトリス−塩酸緩衝液(□−□)、pH9.5〜11.0はCAPS−NaOH緩衝液(■−■)を用いた。1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼ1U/mlを含有してなる50mMの各緩衝液において、50℃、30分処理でpH6〜9において安定であり、結果を図2に示した。
【0026】
(6)至適温度
上記の力価測定法において、その温度条件を変えて酵素反応を行った結果は図3に示す通りであって、その至適温度は37〜50℃であった。
(7)熱安定性
1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼ1U/mlを含有して成る50mM CAPS−NaOH緩衝液(pH9.5)を各温度に30分間放置し、ついで上記の力価測定法に従って、1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼの残存活性を測定した結果、図4に示す通りであって、酵素は45℃付近までは安定であった。
【0027】
(8)種々の物質による影響
上記の力価測定法において、種々の添加物を加えて、1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼの1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸に対する酵素活性を測定した結果を表2に示す。
【0028】
【表2】
【0029】
(9)分子量
78000±6000Da(TSKgel G3000SWXL(東ソー社製、日本国)ゲル濾過法による)
(10)等電点
4.7±0.5(キャリアアンフォライトpH3.5−pH10.0(ファルマシア・バイオテク社製、スウェーデン国)を用いる電気泳動法により測定)
(11)Km値
1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸に対するKm値 25±5mM
NADPに対するKm値 0.086±0.04mM
(12)作用機序確認試験
1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸、NADP、トリエチルアミン重炭酸緩衝液(pH10.0)、1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼを含む反応液を37℃、8時間反応せしめる。1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸の分子内に形成されたカルボニル基を2,4−ジニトロフェニルヒドラジンとHClを加えて反応せしめてヒドラゾンとして分離し、マススペクトルを測定することで生成物が組成式(C6 H11O8 P1 )で表されるものであることが確認された。
【0030】
以上のように本発明の酵素1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼはこれまでに報告がない全く新規な酵素と認められる。
本発明は上記の知見に基づき1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼと補酵素の存在下、1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸を含有する被検液に作用せしめ反応生成物を測定することによって1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸を定量することが可能であり、次にその内容を説明する。
【0031】
本発明における補酵素としては、好ましくはNADPやチオNADPが例示されるが一般的には酸化型(チオ)NAD(P)類である、例えば酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADと記することもある)、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADPと記することもある)などの酸化型NAD(P)類の他に酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(チオNADと記することもある)、酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(チオNADPと記することもある)などの酸化型チオNAD(P)類や酸化型3−アセチル−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、酸化型3−アセチル−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、酸化型デアミノ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、酸化型デアミノ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸などの酸化型NAD(P)類が包含されるが、なんらこれらに限定されるものではない。
【0032】
また本発明において、被検液中の1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸を測定するにあたって1、5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼ、酸化型(チオ)NAD(P)類の使用量としては酵素反応が円滑に進行する量であればよく、被検液中の含量、共役させる酵素反応の種類、反応時間および温度などにより適宜調整されるが、1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼの濃度は0.001〜100U/ml程度、好ましくは0.002〜10U/ml程度である。酸化型(チオ)NAD(P)類の濃度は酵素反応を行うのに十分な濃度あればよく、0.1〜50mM程度、好ましくは、1〜10mM程度である。
【0033】
測定対象となる被検液としては1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸が存在または形成された1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸を含有する生体試料が挙げられ、好ましくは例えば、血清、血漿、尿、髄液などにおける1,5−アンヒドログルシトールや1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸含有被検液が例示される。このような被検液としては通常5〜200μlを用いて上記反応系によって反応を行うもので、反応温度としては例えば15〜45℃、好ましくは20℃〜40℃の反応温度条件で行えばよく、反応時間としては1〜60分程度で行えばよい。
【0034】
本発明の方法は、酵素反応系に悪影響を及ぼさない適当な緩衝液(例えば、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、モノまたはジエタノールアミン緩衝液、グッド緩衝液等)(例えばpH8〜11、好ましくはpH9〜11)を用いて行われる。また、測定手法は特に限定されず、補酵素を定量する方法、反応生成物としてのカルボニル基を定量する方法などの手法を適宜用いることができる。
【0035】
(1)補酵素を定量する方法
本発明において用いる補酵素として例えば酸化型(チオ)NAD(P)類を用いた場合、生成される(チオ)NAD(P)H 〔以下、還元型(チオ)NAD(P)類と称する〕の生成量は種々の方法により測定することができるが、通常、簡便かつ高精度で測定することのできる吸光度測定法により行われる。測定波長は還元型(チオ)NAD(P)類の種類によって適宜選択され、好適には各還元型(チオ)NAD(P)類の極大吸収波長域の波長に基づいて行えばよく、例えば還元型NAD(還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド:NADHと記することもある)、還元型NADP(還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸:NADPHと記することもある)、還元型3−アセチル−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元型3−アセチル−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、還元型デアミノ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元型デアミノ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸などの場合には340nm付近の波長が選択され、また還元型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(チオNADHと記することもある)、還元型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(チオNADPHと記することもある)の場合は405nm付近の波長が選択される。
【0036】
また還元型(チオ)NAD(P)類の生成量の測定法として、インドニトロテトラゾニウム(INT)やニトロブルーテトラゾニウム(NBT)等のテトラゾニウム塩を用いて電子受容体としてフェナジンメトサルフェート(PMS)やジアホラーゼ(EC1.8.1.4またはEC1.6.99.)の作用によりホルマザン色素を形成せしめ、このホルマザン色素の呈色を測定する方法を用いてもよい。また、還元型(チオ)NAD(P)類の蛍光を測定してもよい。
【0037】
(2)反応生成物としてのカルボニル基を定量する方法
反応終了後、反応液に2,4−ジニトロフェニルヒドラジン飽和エタノールと0.5NのHClを加えて撹拌し、37℃、5分間加温後5NのNaOHを加えて撹拌した後、505nm付近の吸光度を測定することにより生成したカルボニル基を定量することができる。
【0038】
また、被検液中の1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸がごく微量である場合、下記の反応式2
【0039】
【化9】
【0040】
(式中、A1は酸化型チオNAD(P)類または酸化型NAD(P)類を示し、A2はA1の還元型生成物を示し、B1はA1が酸化型チオNAD(P)類のときは還元型NAD(P)を、A1が酸化型NAD(P)類のときは還元型チオNAD(P)類を示し、B2はB1の酸化型生成物を示す)で表される酵素サイクリング反応を形成せしめ、該反応によって変化するA2またはB1の量を測定することで1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸を反応時間に基づくサイクリング反応により高感度に定量することができる。なお、還元型NAD(P)は波長340nm付近、還元型チオNAD(P)は波長405nm付近での吸光度により定量することができ、この特徴に基づいてこれらを定量するものである。
【0041】
上記反応における酸化型チオNAD(P)類としては、例えばチオNAD、チオNADPが挙げられ、酸化型NAD(P)類としては、例えばNAD、NADPや酸化型3−アセチル−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、酸化型3−アセチル−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、酸化型デアミノ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、酸化型デアミノ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸などが挙げられる。
【0042】
また上記反応における還元型チオNAD(P)類としては、例えばチオNADH、チオNADPHが挙げられ、還元型NAD(P)類としては、例えばNADH、NADPHや還元型3−アセチル−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元型3−アセチル−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、還元型デアミノ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元型デアミノ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸などが挙げられる。
【0043】
この酵素サイクリングの反応においては酵素反応系に悪影響を及ぼさない適当な緩衝液(例えば、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、モノまたはジエタノールアミン緩衝液、グッド緩衝液等でpH8〜11、好ましくはpH9.5〜10.5)が用いられ、A1としては酸化型チオNAD(P)類、酸化型NAD(P)類が挙げられ、例えば酸化型チオNAD(P)の場合には0.5〜5mM、またB1としてはA1がチオNAD(P)類のときは還元型NAD(P)類を、A1がNAD(P)類のときは還元型チオNAD(P)類を選択すればよく、例えばA1が酸化型チオNAD(P)のときにはB1としては好ましくは還元型NAD(P)であり、この還元型NAD(P)量としては0.01〜5mM、好ましくは0.01〜0.1mMである。また1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼ量としては0.1〜100U/ml程度でよく、適宜KCl、MgCl2 等の無機塩を0〜100mMの濃度加えて行ってもよい。反応温度としては例えば15〜45℃、好ましくは20℃〜40℃の反応温度条件で行えばよく、反応時間としては0.5〜60分程度で行えばよい。
【0044】
さらに、適宜B2を補酵素としてB1に再生できる酸化還元酵素、例えばアルコールデヒドロゲナーゼを基質のアルコールの存在下に反応せしめる第2のサイクリング反応を適宜形成せしめてもよく、この第2のサイクリング反応はアルコールデヒドロゲナーゼに限定することなく、公知の酸化還元酵素とその基質との組み合わせにて適宜選択組み合わせし得るものである。
【0045】
また本発明における被検液中の1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸が1,5−アンヒドログルシトールから1,5−アンヒドログルシトールリン酸化酵素、例えばヘキソキナーゼ(EC2.7.1.1)の作用によって下記の反応式3
【0046】
【化10】
【0047】
のように変換されたものである場合、反応式1および反応式2で示される酵素反応系を共役させることにより生体液中の1,5−アンヒドログルシトールの量を、1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸を上記のように定量することにより測定することができる。この場合、前記反応式1または反応式2は反応式3とともに同一反応系としてもよく、また別反応系としてもよい。使用する1,5−アンヒドログルシトールリン酸化酵素は1,5−アンヒドログルシトールに作用するものであれば特に限定はされないが例えば酵母由来のヘキソキナーゼ(シグマ社製、米国)を用いることができ、その酵素量としては、0.1〜200U/ml好ましくは10〜100U/mlで、酵素反応系に悪影響を及ぼさない適当な緩衝液(例えば、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、モノまたはジエタノールアミン緩衝液、グッド緩衝液等でpH6〜11、好ましくはpH7.0〜8.5)を用い、反応温度は25〜45℃、反応時間は1〜60分間である。
【0048】
【発明の実施の形態】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【0049】
【参考例】
1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸の合成
[Ferrari,R.A. et.al(1959)Arch.Biochem.Biophys.80,372−377]記載の方法で合成した。
【0050】
【実施例1】
1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼ生産菌の培養エシェリヒア・コリDH1株(ATCC 33849)の培養
培地組成
0.5% 肉エキス
1.5% ソルビトール
1.0% トリプトン
1.5% ビール酵母エキス
上記培地成分含む液体培地(pH7.5)50mlを300ml容三角フラスコに分注したもの2本を、120℃、20分間、加熱滅菌した後、これにエシェリヒア・コリDH1株(ATCC 33849)の菌体懸濁液を各々1mlづつ移植し、攪拌させながら、30℃で15時間培養し、種培養液とした。上記培地成分と消泡剤FSアンチフォーム028(ダウコーニング・アジア社製、日本国)を0.3%含む液体培地5lを加えた10l容ジャー2基を滅菌した後に種培養液を移植し、30℃で培養液のpHを5NのNaOHで6.5以上になるよう制御して好気的に撹拌しながら24時間培養し、培養力価15mU/mlの培養液10lを得た。
【0051】
1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼの精製
得られた培養液10lを遠心分離して、得られた菌体を50mMのトリス−塩酸緩衝液(pH8.5)で1回洗浄した。洗浄菌体を50mMのトリス−塩酸緩衝液(pH8.5)に懸濁して1.2lに調整し、DYNO−MILL(Willy A.Bachofen社製、スイス国)を用いて菌体破砕を行い、菌体破砕液を得た。
【0052】
この破砕液を透析チューブを用いて50mMのトリス−塩酸緩衝液(pH8.5)20lに対して5℃で一夜透析した後、8000rpm、60分間遠心分離し、1.0l(酵素活性120U)の上清を得た。この上清を50mMのトリス−塩酸緩衝液(pH8.5)で緩衝化したDEAE−Sepharose FF(ファルマシア・バイオテク社製、スウェーデン国)1200ml(4.6×75cm)のカラムに通し、0〜0.25MのNaClのリニアグラジエントで溶出を行った。その結果、約0.15MのNaCl濃度で活性画分(75U)が溶出された。この得られた活性画分に3MとなるようにNaClを溶解し、50mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.5)、3MのNaClで平衝化されたPhenyl−Sepharose CL−4B(ファルマシア・バイオテク社製、スウェーデン国)500ml(4.6×30cm)のカラムに通し、2.5〜0MのNaClのリニアグラジエントにより溶出を行った。その結果、約1.2MのNaCl濃度で活性画分(50U)が得られた。
【0053】
この得られた活性画分を20mMトリス−塩酸(pH8.5)で、一夜透析した後、20mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.5)で緩衝化したBlue−Sepharose CL−6B(ファルマシア・バイオテク社製、スウェーデン国)50ml(1.5×30cm)のカラムに通し、0〜1MのNaCl、20%エチレングリコールのリニアグラジエントにより溶出を行った。その結果、約0.6MのNaCl、12%エチレングリコールの濃度で活性画分(30U)が溶出された。この得られた活性画分を50mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.5)で一夜透析した後、50mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.5)で緩衝化したResource Q(ファルマシア・バイオテク社製、スウェーデン国)6mlのカラムに通し、0〜0.3MのNaClのリニアグラジエントにより溶出を行った。その結果、約0.15MのNaCl濃度で活性画分(28U)が得られ、均質な酵素標品を得た。
【0054】
【実施例2】
1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸の定量
測定試薬
125mM グリシン−NaOH緩衝液(pH10.0)
2.5mM NADP
0.00625% ニトロブルーテトラゾニウム
6.25U/ml ジアホラーゼ(NADPH)(旭化成工業社製、日本国)
18.75mU/ml 1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼ
測定方法
1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸を0.2mM、0.5mM,1mM、1.5mM、2mM、3mM、4mMの水溶液に調整し、1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸サンプルを作成した。5分間、37℃で予備加温した測定試薬0.4mlに1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸サンプル0.1ml加え、37℃、5分間加温後、0.1NのHCl1mlを加えて550nmの吸光度を1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸サンプルの代わりに蒸留水を用いたものを対照に測定した。図5に示すように1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸が定量的に測定できた。
【0055】
【実施例3】
1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸の定量
測定試薬
50mM CAPS−NaOH緩衝液(pH10.5)
2mM NADP
5mU/ml 1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼ
測定方法
1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸を1mM、2mM,4mM、10mM、20mMの水溶液に調整し、1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸サンプルを作成した。5分間、37℃で予備加温した測定試薬1mlに1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸サンプル0.02ml加え、37℃、5分間加温後の340nmの吸光度を1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸サンプルの代わりに蒸留水を用いたものを対照に測定した。図6に示すように1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸が定量的に測定できた。
【0056】
【実施例4】
1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸の定量
測定試薬
50mM CAPS−NaOH緩衝液(pH10.5)
2mM NADP
5mU/ml 1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼ
測定方法
1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸を20mM、50mM,62.5mM、100mM、125mMの水溶液に調整し、1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸サンプルを作成した。5分間、37℃で予備加温した測定試薬0.5mlに1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸サンプル0.01ml加え、37℃、5分間加温後、2,4−ジニトロフェニルヒドラジン飽和エタノール0.5mlと1NのHCl0.1mlを加え更に37℃で5分間加温した後、5NのNaOHを0.5ml加えよく撹拌した後に505nmの吸光度を1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸サンプルの代わりに蒸留水を用いたものを対照に測定した。図7に示すように1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸が定量的に測定できた。
【0057】
【実施例5】
サイクリング反応を用いた1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸の定量
測定試薬
50mM CAPS−NaOH緩衝液(pH10.2)
40mM KCl
0.05mM NADPH
3mM チオ−NADP
1U/ml 1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼ
測定方法
1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸を0.1mM、0.5mM、1.25mM、2.5mMの水溶液に調整し、1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸サンプルを作成した。5分間、37℃で予備加温した測定試薬0.99mlに1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸サンプル0.01ml加え、37℃、5分間加温後の405nmの吸光度を試薬ブランクを対照に測定した。図8に示すように1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸が定量的に測定できた。
【0058】
【実施例6】
1,5−アンヒドログルシトールの定量
一次反応測定試薬
52.6mM トリス−塩酸緩衝液(pH8.0)
10.5mM ATP
10.5mM MgCl2
52.6U/ml ヘキソキナーゼ(パン酵母由来、シグマ社製、米国)
二次反応測定試薬
239mM グリシン−NaOH緩衝液(pH10.0)
4.77mM NADP
0.24% Triton X−100
0.012% ニトロブルーテトラゾニウム
11.9U/ml ジアホラーゼ(NADPH)(旭化成工業社製、日本国)
36mU/ml 1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼ
測定方法
1,5−アンヒドログルシトールを1mM、2mM、5mM、7mM、10mM、12mM、15mMの水溶液に調整し、1,5−アンヒドログルシトールサンプルを作成した。5分間、37℃で予備加温した一次反応測定試薬0.475mlに1,5−アンヒドログルシトールサンプル0.025mlを加え、37℃、5分間加温した。次いで、反応終了液に5分間、37℃で予備加温した二次反応測定試薬の0.5mlを加えて更に37℃、5分間加温後0.1NのHCl2mlを加えた後の550nmの吸光度を、1,5−アンヒドログルシトールサンプルの代わりに蒸留水を用いたものを対照として測定した。図9に示すように1,5−アンヒドログルシトールが定量的に測定できた。
【0059】
【発明の効果】
本発明によれば、新規な1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼが提供できる。また、本酵素を用いることにより従来は簡便に測定できなかった1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸を酵素法により容易に定量できる。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼの至適pHを示す。
【図2】図2は、1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼのpH安定性を示す。
【図3】図3は、1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼの至適温度を示す。
【図4】図4は、1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼの熱安定性を示す。
【図5】図5は、実施例2における検量線を、1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸濃度とΔA550nmとの関係を示す。
【図6】図6は、実施例3における検量線を、1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸濃度とΔA340nmとの関係を示す。
【図7】図7は、実施例4における検量線を、1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸濃度とΔA505nmとの関係を示す。
【図8】図8は、実施例5における検量線を、1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸濃度とΔA405nmとの関係を示す。
【図9】図9は、実施例6における検量線を、1,5−アンヒドログルシトール濃度とΔA550nmとの関係を示す。
Claims (8)
- 1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼを生産する能力を有する微生物を培養し、その培養物から請求項1記載の1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼを採取することを特徴とする1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼの製造法。
- 1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸を含有する被検液に補酵素の存在下に請求項1記載の1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸デヒドロゲナーゼを作用せしめ、次いで反応によって消費された成分または生成された成分を測定することを特徴とする被検液中の1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸の測定法。
- 1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸が、1,5−アンヒドログルシトールから変換されたものである請求項3記載の1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸の測定法。
- 被検液が、生体液である請求項3記載の1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸の測定法。
- 補酵素が、酸化型(チオ)ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)類である請求項3記載の1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸の測定法。
- 酸化型(チオ)ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(リン酸)類が、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADP+)、酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸である請求項6記載の1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸の測定法。
- 生成された成分が、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADPH+H+)、還元型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは還元型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸である請求項3記載の1,5−アンヒドログルシトール−6−リン酸の測定法。
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