JP4140929B2 - １，５ａｇまたはａｄｐの測定法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は１，５アンヒドログルシトール（１，５ＡＧ）およびＡＤＰのいずれか一成分を含有する被検液に、１，５ＡＧおよびＡＤＰのいずれか残りの成分および下記反応を触媒する酵素蛋白を作用させ、反応によって生成される１，５アンヒドログルシトール６リン酸（１，５ＡＧ６Ｐ）またはＡＭＰを定量することを特徴とする１，５ＡＧまたはＡＤＰの定量法に関し、血清、血漿、尿、髄液などの被検液中の１，５ＡＧまたは遊離または形成されたＡＤＰを簡便かつ正確に測定する臨床検査分野に関するものである。
【０００２】
【化２】
【０００３】
【従来の技術】
１，５ＡＧはヒト髄液、血漿、血清、尿中などに存在し、ある種の疾患、特に糖尿病において血漿中の量が低下するすることが報告されている化合物であり（日本内科学会誌８０巻、１１９８−１２０４、１９９１）、近年、糖尿病診断マーカーとして使用されている物質である。
【０００４】
従来、生体試料中の１，５ＡＧを測定する方法としてはガスクロマトグラフィー法（糖尿病、２５巻、１１１５−１１１８、１９８２）、ピラノースオキシダーゼを用いて測定する方法（特開昭６３−１８５３９７号公報、米国特許第４９９４３７７号明細書、ＥＰ公開２６１５９１号公報）、グルコキナーゼまたはヘキソキナーゼを用いて測定する方法（特開平８−１０７７９６号公報）などが知られていた。しかしながら、ガスクロマトグラフィー法は被検液の前処理として１，５ＡＧのラベル化が必要である上、測定に長時間を要し、多数の検体を同時に測定することが困難であり、しかも分析機器の維持、管理に高度の技術を必要とするなどの欠点があり、実際の臨床に応用するには不便であった。またピラノースオキシダーゼを用いた１，５ＡＧの測定法はピラノースオキシダーゼが基質としてピラノース類に広く作用するため１，５ＡＧを正確に測定することができなかった。また１，５ＡＧをリン酸化する酵素としてヘキソキナーゼ、グルコキナーゼが知られていたがヘキソキナーゼおよびグルコキナーゼがグルコースに対して高い特異性を示し、１，５ＡＧに対する作用が低く、その測定に大量の酵素を用いる必要があり、現実的な測定とはいえなかった。
【０００５】
また、ＡＤＰの測定は、例えばＡＴＰおよび基質の存在下にキナーゼによって基質のリン酸化体およびＡＤＰを形成する反応を触媒する酵素（キナーゼ）の反応が関与する酵素活性の測定や基質の定量に有用であることが知られている。
この基質とキナーゼの関係としては、例えばクレアチン、ＡＴＰ／クレアチンキナーゼ（ＥＣ２．７．３．２）であり、グリセロール、ＡＴＰ／グリセロキナーゼ（ＥＣ２．７．１．３０）であり、コリン、ＡＴＰ／コリンキナーゼ（ＥＣ２．７．１．３２）であり、ピルビン酸、ＡＴＰ／ピルビン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．１．４０）であり、酢酸、ＡＴＰ／酢酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．１）などが挙げられ、これらの反応にて形成されるＡＤＰを測定対象とするものである。さらに、例えばグリセロール、ＡＴＰ／グリセロキナーゼの場合に、このグリセロールはトリグリセリド、ジグリセリドやモノグリセリドにリパーゼや膵リパーゼを作用せしめて遊離されたグリセロールでもよく、またホスファチジルグリセロールにホスフォリパーゼＤを作用せしめて遊離されたグリセロールでもよく、生体内成分の生化学検査項目としてのトリグリセリド定量の目的、トリグリセリドやジグリセリドを基質とした膵リパーゼ活性測定の目的や羊水中のホスファチジルグリセロール定量の目的が挙げられる。
【０００６】
さらに他のＡＤＰの測定としては、下記の基質／酵素の関係において基質の測定または酵素活性測定が挙げられ、例えば尿素、ＡＴＰ／ウレアアミドヒドロラーゼ（ＥＣ３．５．１．４５）による形成されるＡＤＰの測定（例えばまた、尿素としては、遊離尿素やクレアチン／クレアチンアミドヒドロラーゼ（ＥＣ３．５．３．３）の反応にて形成される尿素でもよく、さらにクレアチンとしてはクレアチニン／クレアチニンアミドヒドロラーゼ（ＥＣ３．５．２．１０）の反応にて形成されるクレアチンでもよい）、Ｎ−メチルヒダントイン、ＡＴＰ／Ｎ−メチルヒダントイナーゼ（ＥＣ３．５．２．１４）による形成されるＡＤＰの測定（例えばまた、Ｎ−メチルヒダントインとしてはクレアチニン／クレアチニンデイミナーゼ（ＥＣ３．５．４．２１）の反応にて形成されるものが例示される）、Ｌ−グルタミン酸、アンモニア、ＡＴＰ／グルタミンシンセターゼ（ＥＣ６．３．１．２）による形成されるＡＤＰの測定（例えばまた、アンモニアとしては、遊離アンモニアや尿素／ウレアーゼ（ＥＣ３．５．１．５）の反応にて形成されるものが例示される）、Ｌ−アスパラギン酸、α−ケトグルタル酸、アンモニア、ＡＴＰ／アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＯＴ）、グルタミンシンセターゼによる形成されるＡＤＰの測定に基づくＧＯＴ活性測定、Ｌ−アラニン、α−ケトグルタル酸、アンモニア、ＡＴＰ／アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＧＰＴ）、グルタミンシンセターゼによる形成されるＡＤＰの測定に基づくＧＰＴ活性測定などが挙げられる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
まず、本発明者らは１，５ＡＧに対して特異的に作用する酵素を広く微生物からスクリーニングしたところ、超高度好熱菌ピロコッカス・フリオサス・ＤＳＭ３６３８菌株の菌体内に存在する酵素蛋白であるＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ（ＡＤＰ−ＨＫ）がＡＤＰの存在下１，５ＡＧをリン酸化して１，５ＡＧ６Ｐを形成する反応を触媒することを初めて発見し、１，５ＡＧの測定においてＡＤＰの存在下に該酵素蛋白を作用させるか、ＡＤＰの測定において１，５ＡＧの存在下に該酵素蛋白を作用させることにより１，５ＡＧ６ＰおよびＡＭＰを形成し、この１，５ＡＧ６ＰまたはＡＭＰを定量することにより１，５ＡＧまたはＡＤＰが簡便かつ正確に測定できることを見出した。さらに、本発明者らは、エッシェリヒア・コリＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）株の菌体内に存在する１，５アンヒドログルシトール６リン酸デヒドロゲナーゼが補酵素の存在下に１，５ＡＧ６Ｐを基質として還元型補酵素を形成する反応を触媒することを見出し、好適には１，５ＡＧまたはＡＤＰの測定において生成された還元型補酵素を測定することにより達成できることを見出した。
【０００８】
即ち、本発明は１，５ＡＧおよびＡＤＰのいずれか一成分を含有する被検液に、１，５ＡＧおよびＡＤＰのいずれか残りの成分および下記反応を触媒する酵素蛋白を作用させ、反応によって生成される１，５ＡＧ６ＰまたはＡＭＰを定量してなる１，５ＡＧまたはＡＤＰを簡便かつ高精度に測定することのできる新規な方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【化３】
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は上記知見に基づいて完成されたもので、１，５ＡＧおよびＡＤＰのいずれか一成分を含有する被検液に、１，５ＡＧおよびＡＤＰのいずれか残りの成分および下記反応を触媒する酵素蛋白を作用させ、反応によって生成される１，５ＡＧ６ＰまたはＡＭＰを定量することを特徴とする１，５ＡＧまたはＡＤＰの測定法である。
【００１１】
【化４】
【００１２】
より好ましくは、本発明は、生成される１，５ＡＧ６Ｐの定量において、１，５アンヒドログルシトール６リン酸デヒドロゲナーゼおよび補酵素を作用せしめ、次いで反応によって消費された成分または生成された成分を測定することを特徴とする１，５ＡＧまたはＡＤＰの測定法である。
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００１３】
本発明に用いられる下記反応を触媒する酵素蛋白としては１，５ＡＧを基質とし、ＡＤＰを消費して１，５ＡＧ６ＰおよびＡＭＰを生成する酵素蛋白であれば何ら限定されるものではなく、例えば超高度好熱菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ・ｆｕｒｉｏｓｕｓ・ＤＳＭ３６３８菌株由来ＡＤＰ−ＨＫを用いればよい。超高度好熱菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ・ｆｕｒｉｏｓｕｓ・ＤＳＭ３６３８菌株はドイッチェ・ザンムルグ・フォン・マイクロオルガニスメン・ウント・チェルクツルレンＧｍｂＨ（ＤＳＭ）に基準培養物として寄託され、ＤＳＭカタログ（１９９３）に記載されており、何人も入手可能である。
【００１４】
ＡＤＰ−ＨＫ生産菌の培養方法は例えば後述の培地を用いて、培養温度は菌の生育する温度範囲で行えばよく、例えば７０〜１１０℃、好ましくは８５〜１０５℃である。また、培養時間は目的とする酵素が最高力価となる培養時間、例えば１〜３日にて目的とする酵素を採取すればよい。
生成された１，５ＡＧ６Ｐの定量に用いられる１，５アンヒドログルシトール６リン酸デヒドロゲナーゼ（１，５ＡＧ６ＰＤＨ）としてはエッシェリヒア・コリＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）株の菌体内に存在する１，５ＡＧ６ＰＤＨを用いて測定すればよい。１，５ＡＧ６ＰＤＨは下記反応式
【００１５】
【化５】
【００１６】
で示される通り１，５ＡＧ６Ｐを基質とし、例えば補酵素として酸化型（チオ）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）〔酸化型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）〕類を消費して還元型（チオ）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）〔還元型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）〕類を生成する１，５ＡＧ６ＰＤＨであればなんら限定されるものではない。またこの１，５ＡＧ６ＰＤＨ生産菌としてはエシェリヒア属に属する１，５ＡＧ６ＰＤＨ生産菌であれば何ら限定されるものではなく，１，５ＡＧ６ＰＤＨを生産する能力を有するその変異株であってもよい。好ましくはエシェリヒア・コリ属に属する生産菌が考えられ、より好ましいものとしてエシェリヒア・コリ・ＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）はＡＴＣＣに保存され、ＡＴＣＣ（１８ｔｈ）カタログに記載されており、何人も入手可能であり本菌株から得られた１，５ＡＧ６ＰＤＨが好ましい。
【００１７】
次いで１，５ＡＧ６ＰＤＨを得るに当たって好ましくはエシェリヒア・コリ・ＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）を培養するものでこの培養手段としては固体培養でも液体培養でもよいが好ましくはフラスコ、ジャー等による通気培養である。この培地としては微生物の培養に通常用いられるものが広く使用される。炭素源としてグルコース、グリセロール、ソルビトール、ラクトースなど、窒素源としては酵母エキス、肉エキス、トリプトン、ペプトンなど、無機塩としては塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウムなどを用いればよい。培養条件としては例えばｐＨ６．５〜７．５、培養温度は２５〜３７℃で目的とする酵素が最高力価となる培養時間、例えば１８〜３０時間にて目的となる酵素を採取すればよい。
【００１８】
ＡＤＰ−ＨＫまたは１，５ＡＧ６ＰＤＨは主としてその菌体内に含有、蓄積されており、その菌体内から抽出すればよい。ＡＤＰ−ＨＫまたは１，５ＡＧ６ＰＤＨの抽出法を例示すれば培養液から菌体を遠心分離などによって分離し、菌体をリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液などの緩衝液に懸濁した後、リゾチーム、超音波、ガラスビーズなどによって破砕して遠心分離し、可溶性画分を粗酵素液として回収する。このようにして得られた粗製のＡＤＰ−ＨＫまたは１，５ＡＧ６ＰＤＨ含有液を公知の蛋白質、酵素の単離、精製手段を用いて処理することにより、精製されたＡＤＰ−ＨＫまたは１，５ＡＧ６ＰＤＨを得ることができる。例えばアセトンまたはエタノールなどの有機溶媒による分別沈殿法、硫酸アンモニウムなどによる塩析法、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法、ゲルろ過法などの一般的な酵素精製法を適宜選択、組み合わせて精製ＡＤＰ−ＨＫまたは１，５ＡＧ６ＰＤＨを得ることができ、適宜安定化剤例えばショ糖、グリセロールなどを５〜５０％程度、アミノ酸、補酵素などを０．０１〜０．１％程度加えて凍結保存または凍結乾燥させてもよい。
【００１９】
上記ＡＤＰ−ＨＫが触媒する酵素反応に使用するマグネシウムイオンの代わりにマンガンイオンを放出し得るイオン放出性塩類を用いればよく、その塩類としては塩化物、硫酸化物などが包含され、好適には塩化マグネシウム、塩化マンガンが挙げられるが、なんらこれらに限定されるものではない。
上記１，５ＡＧ６ＰＤＨが触媒する酵素反応に使用される補酵素としての酸化型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）類には酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型ＮＡＤ）、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型ＮＡＤＰ）、酸化型３−アセチルニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型３−アセチルＮＡＤ）、酸化型３−アセチルニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型３−アセチルＮＡＤＰ）の酸化型３−アセチルＮＡＤ（Ｐ）、酸化型デアミノニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型デアミノＮＡＤ）、酸化型デアミノニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型デアミノＮＡＤＰ）の酸化型デアミノＮＡＤ（Ｐ）（これらを含めて以下、酸化型ＮＡＤ（Ｐ）ということもある）の他に酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型チオＮＡＤ）、酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型チオＮＡＤＰ）の酸化型チオＮＡＤ（Ｐ）などが包含されるが、なんらこれらに限定されるものではない。
【００２０】
本発明における１，５ＡＧの測定の場合、ＡＤＰ−ＨＫ、１，５ＡＧ６ＰＤＨ、ＡＤＰ、酸化型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）類およびマグネシウムイオンまたはマンガンイオンの使用量としては酵素反応が円滑に進行する量であればよく、被検液中１，５ＡＧの含量、反応時間および温度などにより適宜調整されるが、ＡＤＰ−ＨＫおよび１，５ＡＧ６ＰＤＨの濃度は例えば０．１〜５００Ｕ／ｍｌ程度、好ましくは１〜１００Ｕ／ｍｌ程度である。ＡＤＰや酸化型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）類の濃度は酵素反応を行うのに十分な濃度あればよく、ＡＤＰの濃度は例えば０．１〜１００ｍＭ程度、好ましくは０．５ｍＭ〜２０ｍＭ程度である。酸化型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）類は例えば０．５〜５０ｍＭ程度、好ましくは、１〜１０ｍＭ程度とされ、マグネシウムイオンまたはマンガンイオンの濃度としては例えば０．１〜 ５０ｍＭ程度、好ましくは０．５〜１０ｍＭ程度である。
【００２１】
また、ＡＤＰを測定する場合には、上記の試薬としてＡＤＰを用いる代わりに１，５ＡＧを使用すればよく、１，５ＡＧの濃度としては酵素反応を行うのに十分な濃度として用いればよく、その濃度は例えば０．１〜１００ｍＭ程度、好ましくは０．５ｍＭ〜２０ｍＭ程度である。
本発明の方法は、酵素反応系に悪影響を及ぼさない適当な緩衝液（例えば、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、モノまたはジエタノールアミン緩衝液、グッド緩衝液等）を用いて行われる。
【００２２】
また、測定手法は特に限定されず、エンドポイント法、レートアッセイ法などの手法を適宜用いることができる。測定対象となる被検液としては、例えば、血清、血漿、尿、髄液などが例示される。
このような被検液としては通常、例えば３〜２００μｌを用いて上記反応系によって反応を行うもので、反応温度としては例えば１５〜４５℃、好ましくは２０℃〜４０℃の反応温度条件で行えばよく、また、反応時間はエンドポイント法では、例えば１〜６０分間、好ましくは１〜１０分間、レートアッセイ法では反応が直線的に行われている時間内、好ましくは、２〜３分間を計って測定する。
【００２３】
まず、反応によって生成されたＡＭＰは、簡便には、例えば通常の液体クロマトグラフィー法で測定すればよい。
また酸化型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）類から形成された還元型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）類の生成量は種々の方法により測定することができるが、通常、簡便かつ高精度で測定することのできる吸光度測定法により行われる。測定波長は還元型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）類の種類によって適宜選択され、還元型ＮＡＤ（Ｐ）、還元型３−アセチルＮＡＤ（Ｐ）、還元型デアミノＮＡＤ（Ｐ）などの場合には３４０ｎｍ付近、還元型チオＮＡＤ（Ｐ）の場合は４０５ｎｍ付近の波長が選択される。また還元型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）類の生成量の測定法として、インドニトロテトラゾニウム（ＩＮＴ）やニトロブルーテトラゾニウム（ＮＴＢ）等のテトラゾニウム塩を用いて電子受容体としてフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）やジアホラーゼ（ＥＣ １．６．４．３）の作用によりホルマザン色素を形成せしめ、このホルマザン色素の呈色を測定する方法を用いてもよい。また、還元型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）類の蛍光を測定してもよい。
【００２４】
また、被検液中の１，５−ＡＧがごく微量でそのリン酸化生成物（１，５ＡＧ６Ｐ）も極微量である場合、下記反応式
【００２５】
【化６】
【００２６】
【化７】
【００２７】
（式中Ａ１は酸化型チオＮＡＤ（Ｐ）または酸化型ＮＡＤ（Ｐ）のいずれか１種を示し、Ａ２はＡ１の還元生成物を示し、Ｂ１はＡ１が酸化型チオＮＡＤ（Ｐ）のときは還元型ＮＡＤ（Ｐ）を、Ａ１が酸化型ＮＡＤ（Ｐ）のときは還元型チオＮＡＤ（Ｐ）を示し、Ｂ２はＢ１の酸化型生成物を示す。）
に示す原理にていわゆる酵素サイクリング反応を形成せしめ、該反応によって変化するＡ２またはＢ１の量を測定することで１，５ＡＧを高感度に定量することができる。なお、還元型ＮＡＤ（Ｐ）は波長３４０ｎｍ付近、還元型チオＮＡＤ（Ｐ）は波長４０５ｎｍ付近での吸光度により定量することができ、この特徴に基づいてこれらを定量するものである。
【００２８】
この酵素サイクリング反応においては酵素反応系に悪影響を及ぼさない適当な緩衝液、例えばトリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、モノまたはジエタノールアミン緩衝液、グッド緩衝液などで例えばｐＨ８〜１１、好ましくは９．５〜１０．５が用いられる、還元型ＮＡＤ（Ｐ）量は例えば０．０１〜０．１ｍＭ、酸化型チオＮＡＤ（Ｐ）量は例えば０．５〜５ｍＭ、１，５ＡＧ６ＰＤＨ量は例えば０．１〜１００Ｕ／ｍｌ程度で適宜ＫＣｌ、ＭｇＣｌ2 などの無機塩を例えば０〜１００ｍＭの濃度加えて行ってもよい。反応温度としては例えば５〜４５℃、好ましくは２０〜４０℃の反応温度条件で行えばよく、反応時間しては例えば０．５〜６０分程度で行えばよい。
【００２９】
また、被検液中にグルコースが共存するする場合は１，５ＡＧに対して作用せずグルコースに特異性を有する酵素を用いてグルコースを消去した後に１，５ＡＧの測定を行うことが好ましい。具体的に説明すると、
１、グルコースオキシダーゼまたはグルコースオキシダーゼおよびカタラーゼ
２、グルコースデヒドロゲナーゼ
３、ヘキソキナーゼ
４、グルコキナーゼ
などが挙げられ、好適にはグルコースオキシダーゼおよびカタラーゼを用いた消去方法がよい。消去反応を効率よく行うためにムタロターゼを添加してもよい。添加する酵素量としては例えば０．１〜５００Ｕ／ｍｌ、好ましくは１〜１００Ｕ／ｍｌである。また、上記酵素の反応生成物を消費する酵素をさらに添加してもよい。
【００３０】
【発明の実施の形態】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３１】
【参考例１】
＜ＡＤＰ−ＨＫの酵素活性測定法＞
測定試薬
５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
２０ｍＭ グルコース
２ｍＭ ＡＤＰ
２ｍＭ ＭｇＣｌ2
５Ｕ／ｍｌ グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）
０．０２５％ ＮＢＴ
１ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ
１％ トリトンＸ−１００
５Ｕ／ｍｌ ジアホラーゼ（ＮＡＤＰＨ）
測定試薬１ｍｌを３７℃で１分間予備加温した後、０．０２ｍｌの酵素液を添加して１０分間反応させる。反応後、０．１Ｎ塩酸を２ｍｌ添加して反応を停止させ、５分以内に層長１．０ｃｍのセルを用いて、波長５５０ｎｍにおける吸光度を測定する（Ａｓ）。また盲検として酵素液のかわりに蒸留水０．０２ｍｌを用いて同一の操作を行って吸光度を測定する（Ａｂ）、この酵素使用の吸光度（Ａｓ）と盲検の吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａｓ−Ａｂ）より酵素活性を求める。酵素活性１単位は３７℃で１分間に１μモルの還元型ＮＡＤＰを生成させる酵素量とし、計算式は下記の通りである。
酵素活性（Ｕ／ｍｌ）＝（Ａｓ−Ａｂ）×０．７９５×酵素の希釈倍率
＜ＡＤＰ−ＨＫの取得＞
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ・ｆｕｒｉｏｓｕｓ・ＤＳＭ３６３８の培養
培地組成
０．１％ 酵母エキス
０．５％ トリプトン
０．７２％ マルトース
２．３９％ ＮａＣｌ
０．４％ Ｎａ2 ＳＯ4
０．０７％ ＫＣｌ
０．０２％ ＮａＨＣＯ3
０．０１％ ＫＢｒ
０．０３％ Ｈ3ＢＯ4
１．０８％ ＭｇＣｌ2
０．１５％ ＣａＣｌ2
０．００２５％ ＳｒＣｌ2
０．０２５％ ＮＨ4 Ｃｌ
０．０１４％ Ｋ2 ＨＰＯ4
０．１％ ＣＨ3 ＣＯＯＮａ
０．００１５％ Ｎ（ＣＯＯＨ）3
０．０００５％ ＭｎＳＯ4
０．００１４％ ＦｅＳＯ4
０．０００２％ ＮｉＣｌ2
０．０００１％ ＣｏＳＯ4
０．０００１％ ＺｎＳＯ4
０．００００１％ ＣｕＳＯ4
０．０００００１％ Ｎａ2 Ｗｏ4
０．０００００１％ Ｎａ2 Ｍｏ4
０．１％ システイン塩酸塩
上記培地成分を含む液体培地（ｐＨ７）５００ｍｌを５００ｍｌ溶三角フラスコ１０本に分注し、１２０℃、２０分間、加熱滅菌した後、これにＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ・ｆｕｒｉｏｓｕｓ・ＤＳＭ３６３８株の菌体懸濁液１０ｍｌを移植し、攪拌させながら、９５℃で２０時間培養し、種培養液とした。上記培地成分を含む液体培地２００ｌ／３００ｌタンクを滅菌した後、種培養液を移植し、攪拌させながら、９５℃で１５時間培養し、５ｍＵ／ｍｌの培養液２００ｌを得た。＜ＡＤＰ−ＨＫの精製＞
得られた培養液２００ｌを遠心分離して、得られた菌体を０．９％のＮａＣｌを含む２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で１回洗浄した。洗浄菌体を２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁して２ｌに調整し、クボタ社製の超音波破砕機（ＩＮＳＯＮＡＴＯＲ ２０１Ｍ）を用いて１８０Ｗ、３０分間処理して、菌体破砕液を得た。
【００３２】
この破砕液を８０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離し、１．８ｌ（酵素活性９８０Ｕ）の上清を得た。この上清を透析チューブを用いて１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）８ｌに対して５℃で一夜透析した後、１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で緩衝化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ファルマシア社製）２００ｍｌ（２．６×３８ｃｍ）のカラムに通し、０〜１モルのＮａＣｌのリニアグラジエントで溶出を行った。その結果、０．０８〜０．１モルのＮａＣｌ濃度で活性画分（９５０Ｕ）が溶出された。
【００３３】
この得られた活性画分に４ＭとなるようにＮａＣｌを溶解し、４ＭのＮａＣｌで緩衝化されたＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ファルマシア社製）２００ｍｌ（２．６×３８ｃｍ）のカラムに通し、４〜０ＭのＮａＣｌのリニアグラジエントにより溶出を行った。その結果、０．０２から０．０７モルのＮａＣｌ濃度で活性画分（９００Ｕ）が得られた。この得られた活性画分を１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）８ｌに５℃、一夜透析した後、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で緩衝化したヒドロキシアパタイト（ペンタックス社製）１００ｍｌ（２．６×１９ｃｍ）のカラムに通し、０〜０．５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）のリニアグラジエントにより溶出を行った。その結果、０．０２〜０．０３Ｍのリン酸緩衝液濃度で活性画分（８５０Ｕ）が溶出された。この酵素液を凍結乾燥して５ｍｇの酵素粉末（１７０Ｕ／ｍｇ）を得た。
【００３４】
ＡＤＰ−ＨＫの理化学的性質は以下の通りであった。
＜ＡＤＰ−ＨＫの理化学的性質＞
（１）酵素作用
基質としてグルコースを用いた酵素作用を以下に示す。
【００３５】
【化８】
【００３６】
（２）基質特異性
基質特異性を表１に示す。
【００３７】
【表１】
【００３８】
（３）分子量
トーソー社製ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷXL（０．７５×３０ｃｍ）を用いたゲル濾過法により測定したＡＤＰ−ＨＫの分子量は１０００００±５０００であった。
（４）至適ｐＨはｐＨ６．０〜７．０（リン酸緩衝液）であった。
【００３９】
（５）至適温度は８０〜１００℃であることから高度好熱性酵素と認められた。
【００４０】
【参考例２】
＜１，５ＡＧ６ＰＤＨ生産菌の培養＞
エシェリヒア・コリ・ＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）の培養
培地組成
０．５％ 肉エキス
１．５％ ソルビトール
１．０％ トリプトン
１．５％ ビール酵母エキス
上記培地成分を含む液体培地（ｐＨ７．５）５０ｍｌを３００ｍｌ容三角フラスコ２本に分注し、１２０℃、２０分間、加熱滅菌した後、これにエシェリヒア．コリＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）の菌体懸濁液１ｍｌを移植し、攪拌させながら、３０℃で１５時間培養し、種培養液とした。上記培地成分と消泡剤ＦＳアンチフォーム０２８（ダウコーニング社製）を０．３％含む液体培地５ｌを１０ｌ容ジャー２ヶにおいて滅菌した後に種培養液を移植し、３７℃で培養液のｐＨを５Ｎ ＮａＯＨで６．５以上になるよう制御して好気的に撹拌しながら２４時間培養し、培養力価１５ｍＵ／ｍｌの培養液１０ｌを得た。
＜１，５ＡＧ６ＰＤＨの精製＞
得られた培養液１０ｌを遠心分離して、得られた菌体を５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で１回洗浄した。洗浄菌体を５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に懸濁して１．２ｌに調整し、ＤＹＮＯ−ＭＩＬＬ（Ｗｉｌｌｙ・Ａ．Ｂａｃｈｏｆｅｎ社製）を用いて菌体破砕を行い、菌体破砕液を得た。
【００４１】
この破砕液を透析チューブを用いて５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）２０ｌに対して５℃で一夜透析した後、８０００ｒｐｍ、６０分間遠心分離し、１．０ｌ（酵素活性１２０Ｕ）の上清を得た。この上清を５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で緩衝化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ・ＦＦ（ファルマシア社製）１２００ｍｌ（２．６×３８ｃｍ）のカラムに通し、０〜０．２５ＭのＮａＣｌのリニアグラジエントで溶出を行った。その結果、約０．１５ＭのＮａＣｌ濃度で活性画分（７５Ｕ）が溶出された。この得られた活性画分に３ＭとなるようにＮａＣｌを溶解し、５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５），３Ｍ ＮａＣｌで平衝化されたＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ・ＣＬ４Ｂ（ファルマシア社製）５００ｍｌ（２．６×３８ｃｍ）のカラムに通し、２．５〜０ＭのＮａＣｌのリニアグラジエントにより溶出を行った。
【００４２】
その結果、約１．２ＭのＮａＣｌ濃度で活性画分（５０Ｕ）が得られた。この得られた活性画分を２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．５）で、一夜透析した後、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で緩衝化したＢｌｕｅ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ファルマシア社製）５０ｍｌ（２．６×１９ｃｍ）のカラムに通し、０〜１ＭのＮａＣｌ、２０％エチレングリコールのリニアグラジエントにより溶出を行った。その結果、約０．６ＭのＮａＣｌ、１２％エチレングリコールの濃度で活性画分（３０Ｕ）が溶出された。この得られた活性画分を５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で一夜透析した後、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で緩衝化したＲｅｓｏｕｒｃｅ・Ｑ（ファルマシア社製）６ｍｌのカラムに通し、０〜０．３ＭのＮａＣｌのリニアグラジエントにより溶出を行った。その結果、約０．１５ＭのＮａＣｌ濃度で活性画分（２８Ｕ）が得られ、均質な酵素標品を得た。
＜１，５ＡＧ６ＰＤＨの理化学的性質＞
（１）作用
１，５ＡＧ６Ｐを補酵素の存在下脱水素し、組成式（Ｃ6 Ｈ11Ｏ8 Ｐ1 ）の化合物とする下記の反応式
【００４３】
【化９】
【００４４】
で表される反応を触媒する。
また上記反応において、１，５ＡＧ６Ｐを２５ｍＭとして用いた場合、補酵素としての酸化型ＮＡＤＰに対するＫｍ値は０．０９ｍＭであり、酸化型ＮＡＤに対するＫｍ値は２．４ｍＭであり、酸化型チオＮＡＤＰに対するＫｍ値は０．０８ｍＭであり、さらに酸化型チオＮＡＤも補酵素として作用する。
（２）力価の測定法
１，５ＡＧ６ＰＤＨの酵素活性測定法
測定試薬
５０ｍＭ ＣＡＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）
１ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ
５ｍＭ １，５ＡＧ６Ｐ
（ＣＡＰＳ：Ｎ−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕ−ｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）
測定試薬１ｍｌを光路長１ｃｍのセルに入れ３７℃で５分間予備加温した後、０．０１ｍｌの酵素液添加後０．５分後の波長３４０ｎｍにおける吸光度（Ａａ）と酵素液添加後１．５分後の吸光度（Ａｂ）を測定する。この吸光度（Ａａ）と（Ａｂ）の吸光度差（Ａｂ−Ａａ）より酵素活性を求める。なお、吸光度（Ａｂ）が０．２以上になる時は酵素液を５０ｍＭ ＣＡＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）で希釈して測定するものとする。酵素活性１単位は３７℃で１分間に１μモルの還元型ＮＡＤＰを生成させる酵素量とし、計算式は下記の通りである。
酵素活性（Ｕ／ｍｌ）＝（Ａｂ−Ａａ）×１６．０×酵素の希釈倍率
（３）基質特異性
上記力価測定法を利用して、その反応液中の１，５ＡＧ６Ｐの代わりに、種々の基質を用いて、１，５ＡＧ６Ｐに対する相対活性を求めた結果を表２に示す。
【００４５】
【表２】
【００４６】
その結果、この酵素は少なくとも１，５ＡＧ６Ｐに基質特異性を示した。
（３）至適ｐＨ
ｐＨ７．０〜９．０は５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（□−□）、ｐＨ９．５〜１０．５は５０ｍＭのＣＡＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（■−■）を用いた。至適ｐＨは９〜１０付近であり、結果を図１に示した。
【００４７】
（４）ｐＨ安定性
ｐＨ４．０〜５．５はクエン酸緩衝液（○−○）、ｐＨ５．５〜７．０はビストリス塩酸緩衝液（●−●）、ｐＨ７．０〜９．０はトリス塩酸緩衝液（□−□）、ｐＨ９．５〜１１．０はＣＡＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（■−■）を用いた。５０℃、３０分処理でｐＨ６〜９において安定であり、結果を図２に示した。
【００４８】
（５）至適温度
上記の力価測定法における測定法を利用して、その温度条件を変えて酵素反応を行った結果は図３に示す通りであって、その至適温度は３７〜５０℃であった。
（６）熱安定性
１，５ＡＧ６ＰＤＨを１Ｕ／ｍｌを含有して成る５０ｍＭ ＣＡＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．５）を各温度に３０分間放置し、ついで上記の力価測定法に従って、１，５ＡＧ６ＰＤＨの残存活性を測定した結果、図４に示す通りであって、酵素は４５℃付近までは安定であった。
【００４９】
（７）種々の物質による影響
上記の力価測定法において、種々の添加物を加えて、１，５ＡＧ６ＰＤＨの１，５ＡＧ６Ｐに対する酵素活性を測定した結果を表３に示す。
【００５０】
【表３】
【００５１】
（８）分子量
７８０００±６０００（ＴＳＫｇｅｌ・Ｇ３０００ＳＷＸＬ（東ソー製）ゲル濾過法による）
（９）等電点
４．７±０．５（キャリアアンフォライトｐＨ３．５−ｐＨ１０（ファルマシア製）を用いる電気泳動法により測定）
（１０）Ｋｍ値
１，５ＡＧ６Ｐに対するＫｍ値：２５ｍＭ
（１１）作用機序確認試験
１，５ＡＧ６Ｐ、（酸化型）ＮＡＤＰ、トリエチルアミン重炭酸緩衝液（ｐＨ１０．０）、１，５ＡＧ６ＰＤＨを含む反応液を３７℃、８時間反応せしめる。１，５ＡＧ６Ｐに生成したカルボニル基を２，４−ジニトロフェニルヒドラジンとＨＣｌを加えて反応せしめヒドラゾンとして分離し、マススペクトルを測定することで生成物が組成式（Ｃ6 Ｈ11Ｏ8 Ｐ1 ）で表されるものであることが確認された。
【００５２】
【実施例１】
＜マグネシウムイオンを用いたときの１，５ＡＧの定量＞
測定試薬１
５２．６ｍＭ トリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
１０．５ｍＭ ＡＤＰ
１０．５ｍＭ ＭｇＣｌ2
１０Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
測定試薬２
２３９ｍＭ グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）
４．７７ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ
０．２４ｍＭ トリトンＸ−１００
０．０１２％ ＮＴＢ
１１．９Ｕ／ｍｌ ジアホラーゼ（ＮＡＤＰＨ）
３６ｍＵ／ｍｌ １，５ＡＧ６ＰＤＨ
測定方法
１，５ＡＧを１ｍＭ，２ｍＭ，５ｍＭ，７ｍＭ，１０ｍＭの水溶液に調製し、１，５ＡＧサンプルを作製した。測定試薬１を０．４７５ｍｌに１，５ＡＧサンプル０．０２５ｍｌを加え、３７℃、５分間加温後、測定試薬２を０．５ｍｌ加えて更に３７℃、５分間加温後、０．１ＮのＨＣｌ２ｍｌを加えて、反応停止後、５５０ｎｍの吸光度を１，５ＡＧサンプルの代わりに蒸留水を用いたものを対象に測定した。図５に示す通り、１，５ＡＧが定量的に測定できた。
【００５３】
【実施例２】
＜マンガンイオンを用いたときの１，５ＡＧの定量＞
測定試薬１
５２．６ｍＭ トリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
１０．５ｍＭ ＡＤＰ
１０．５ｍＭ ＭｎＣｌ2
１０Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
測定試薬２
２３９ｍＭ グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）
４．７７ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ
０．２４ｍＭ トリトンＸ−１００
０．０１２％ ＮＴＢ
１１．９Ｕ／ｍｌ ジアホラーゼ（ＮＡＤＰＨ）
３６ｍＵ／ｍｌ １，５ＡＧ６ＰＤＨ
測定方法
１，５ＡＧを１．２ｍＭ，２．４ｍＭ，６ｍＭ，８．４ｍＭ，１２ｍＭの水溶液に調製し、１，５ＡＧサンプルを作製した。測定試薬１を０．４７５ｍｌに１，５ＡＧサンプル０．０２５ｍｌを加え、３７℃、５分間加温後、測定試薬２を０．５ｍｌ加えて更に３７℃、５分間加温後、０．１ＮのＨＣｌ２ｍｌを加えて、反応停止後、５５０ｎｍの吸光度を１，５ＡＧサンプルの代わりに蒸留水を用いたものを対象に測定した。図６に示す通り、１，５ＡＧが定量的に測定できた。
【００５４】
【実施例３】
＜サイクリング反応を用いた１，５ＡＧの測定＞
測定試薬
５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）
２ｍＭ ＡＤＰ
２ｍＭ ＭｇＣｌ2
５Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
４０ｍＭ ＫＣｌ
０．０５ｍＭ 還元型ＮＡＤＰ
３ｍＭ 酸化型チオＮＡＤＰ
１Ｕ／ｍｌ １，５ＡＧ６ＰＤＨ
測定方法
１，５ＡＧを０．１ｍＭ、０．５ｍＭ，１．２５ｍＭ、２．５ｍＭの水溶液に調製し、１，５ＡＧサンプルを作製した。測定試薬０．９９ｍｌに１，５ＡＧサンプル０．０１ｍｌを加え、３７℃、５分間加温後、の４０５ｎｍの吸光度を試薬ブランクを対照に測定した。図７に示す通り、１，５ＡＧが定量的に測定できた。
【００５５】
【実施例４】
＜グルコースの消去系を組み合わせた１，５ＡＧの測定＞
測定試薬１
５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ６．５）
１００Ｕ／ｍｌ グルコースオキシダーゼ
５０Ｕ／ｍｌ カタラーゼ
測定試薬２
２００ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）
４ｍＭ ＡＤＰ
５０ｍＵ／ｍｌ １，５ＡＧ６ＰＤＨ
２ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ
４ｍＭ ＭｇＣｌ2
１０Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
１０Ｕ／ｍｌ ジアホラーゼ（ＮＡＤＰＨ）
０．０５％ ＮＴＢ
２．０％ トリトンＸ−１００
測定法
グルコース２ｍＭを含む、１，５ＡＧを１ｍＭ，２ｍＭ，５ｍＭ，７ｍＭ，１０ｍＭの水溶液に調製し、１，５ＡＧのサンプルを作製した。測定試薬１の０．５ｍｌに１，５ＡＧサンプル０．０２５ｍｌを加え、３７℃、５分間加温後、測定試薬２を０．５ｍｌ加えて更に３７℃、５分間加温後、０．１ＮのＨＣｌ２ｍｌを加えて、反応停止後、５５０ｎｍの吸光度を１，５ＡＧサンプルの代わりに、蒸留水を用いたものを対照に測定した。図８に示す通り、１，５ＡＧが定量的に測定できた。
【００５６】
【実施例５】
＜マグネシウムイオンを用いたときのＡＤＰの定量＞
測定試薬１
５２．６ｍＭ トリスー塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）
２０ｍＭ １，５ＡＧ
１０．５ｍＭ ＭｇＣｌ2
２０Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
測定試薬２
２３９ｍＭ グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）
４．７７ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ
０．２４ｍＭ トリトンＸ−１００
０．０１２％ ＮＴＢ
１１．９Ｕ／ｍｌ ジアホラーゼ（ＮＡＤＰＨ）
３６ｍＵ／ｍｌ １，５ＡＧ６ＰＤＨ
測定方法
ＡＤＰを１ｍＭ，２ｍＭ，５ｍＭ，７ｍＭ，１０ｍＭの水溶液に調製し、１，５ＡＧサンプルを作製した。測定試薬１を０．４７５ｍｌにＡＤＰサンプル０．０２５ｍｌを加え、３７℃、５分間加温後、測定試薬２を０．５ｍｌ加えて更に３７℃、５分間加温後、０．１ＮのＨＣｌ２ｍｌを加えて、反応停止後、５５０ｎｍの吸光度をＡＤＰサンプルの代わりに蒸留水を用いたものを対象に測定した。図９に示す通り、ＡＤＰが定量的に測定できた。
【００５７】
【参考例３】
＜マグネシウムイオンを用いた時のグルコースの定量＞
測定試薬
５０ｍＭ トリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
２ｍＭ ＡＤＰ
１０Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ
１ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ
２ｍＭ ＭｇＣｌ2
１０Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
測定方法
グルコースを０．４ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、４ｍＭの水溶液に調整し、グルコースサンプルを作成した。測定試薬１ｍｌにグルコースサンプル０．０５ｍｌ加え、３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を試薬ブランクを対照に測定した。図１０に示すようにグルコースが定量的に測定できた。
【００５８】
【参考例４】
＜マンガンイオンを用いたときのグルコースの定量＞
測定試薬
５０ｍＭ トリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
２ｍＭ ＡＤＰ
１０Ｕ／ｍｌ グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ
１ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ
２ｍＭ ＭｎＣｌ2
１０Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
測定方法
グルコースを０．４８ｍＭ，１．２ｍＭ，２．４ｍＭ，４．８ｍＭの水溶液に調製し、グルコースサンプルを作製した。測定試薬１ｍｌにグルコースサンプル０．０５ｍｌを加え、３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を試薬ブランクを対照に測定した。図１１に示す通り、グルコースが定量的に測定できた。
【００５９】
【発明の効果】
本発明の測定方法では、１，５ＡＧまたはＡＤＰの新規な測定法を提供でき、本発明によれば、生体試料中の１，５ＡＧまたはＡＤＰを簡便にして高精度で測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明に用いる１，５ＡＧ６ＰＤＨの至適ｐＨを示す。
【図２】図２は、本発明に用いる１，５ＡＧ６ＰＤＨのｐＨ安定性を示す。
【図３】図３は、本発明に用いる１，５ＡＧ６ＰＤＨの至適温度を示す。
【図４】図４は、本発明に用いる１，５ＡＧ６ＰＤＨの熱安定性を示す。
【図５】図５は、本発明によってマグネシウムイオンを用いたときの１，５ＡＧ測定の検量線を示す。
【図６】図６は、本発明によってマンガンイオンを用いたときの１，５ＡＧ測定の検量線を示す。
【図７】図７は、本発明によってサイクリング反応を用いたときの１，５ＡＧ測定の検量線を示す。
【図８】図８は、本発明によってグルコースの消去系を用いたときの１，５ＡＧ測定の検量線を示す。
【図９】図９は、本発明によってマグネシウムイオンを用いたときのＡＤＰ測定の検量線を示す。
【図１０】図１０は、本発明によってマグネシウムイオンを用いたときのグルコース測定の検量線を示す。
【図１１】図１１は、本発明によってマンガンイオンを用いたときのグルコース測定の検量線を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は１，５アンヒドログルシトール（１，５ＡＧ）およびＡＤＰのいずれか一成分を含有する被検液に、１，５ＡＧおよびＡＤＰのいずれか残りの成分および下記反応を触媒する酵素蛋白を作用させ、反応によって生成される１，５アンヒドログルシトール６リン酸（１，５ＡＧ６Ｐ）またはＡＭＰを定量することを特徴とする１，５ＡＧまたはＡＤＰの定量法に関し、血清、血漿、尿、髄液などの被検液中の１，５ＡＧまたは遊離または形成されたＡＤＰを簡便かつ正確に測定する臨床検査分野に関するものである。
【０００２】
【化２】
【０００３】
【従来の技術】
１，５ＡＧはヒト髄液、血漿、血清、尿中などに存在し、ある種の疾患、特に糖尿病において血漿中の量が低下するすることが報告されている化合物であり（日本内科学会誌８０巻、１１９８−１２０４、１９９１）、近年、糖尿病診断マーカーとして使用されている物質である。
【０００４】
従来、生体試料中の１，５ＡＧを測定する方法としてはガスクロマトグラフィー法（糖尿病、２５巻、１１１５−１１１８、１９８２）、ピラノースオキシダーゼを用いて測定する方法（特開昭６３−１８５３９７号公報、米国特許第４９９４３７７号明細書、ＥＰ公開２６１５９１号公報）、グルコキナーゼまたはヘキソキナーゼを用いて測定する方法（特開平８−１０７７９６号公報）などが知られていた。しかしながら、ガスクロマトグラフィー法は被検液の前処理として１，５ＡＧのラベル化が必要である上、測定に長時間を要し、多数の検体を同時に測定することが困難であり、しかも分析機器の維持、管理に高度の技術を必要とするなどの欠点があり、実際の臨床に応用するには不便であった。またピラノースオキシダーゼを用いた１，５ＡＧの測定法はピラノースオキシダーゼが基質としてピラノース類に広く作用するため１，５ＡＧを正確に測定することができなかった。また１，５ＡＧをリン酸化する酵素としてヘキソキナーゼ、グルコキナーゼが知られていたがヘキソキナーゼおよびグルコキナーゼがグルコースに対して高い特異性を示し、１，５ＡＧに対する作用が低く、その測定に大量の酵素を用いる必要があり、現実的な測定とはいえなかった。
【０００５】
また、ＡＤＰの測定は、例えばＡＴＰおよび基質の存在下にキナーゼによって基質のリン酸化体およびＡＤＰを形成する反応を触媒する酵素（キナーゼ）の反応が関与する酵素活性の測定や基質の定量に有用であることが知られている。
この基質とキナーゼの関係としては、例えばクレアチン、ＡＴＰ／クレアチンキナーゼ（ＥＣ２．７．３．２）であり、グリセロール、ＡＴＰ／グリセロキナーゼ（ＥＣ２．７．１．３０）であり、コリン、ＡＴＰ／コリンキナーゼ（ＥＣ２．７．１．３２）であり、ピルビン酸、ＡＴＰ／ピルビン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．１．４０）であり、酢酸、ＡＴＰ／酢酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．１）などが挙げられ、これらの反応にて形成されるＡＤＰを測定対象とするものである。さらに、例えばグリセロール、ＡＴＰ／グリセロキナーゼの場合に、このグリセロールはトリグリセリド、ジグリセリドやモノグリセリドにリパーゼや膵リパーゼを作用せしめて遊離されたグリセロールでもよく、またホスファチジルグリセロールにホスフォリパーゼＤを作用せしめて遊離されたグリセロールでもよく、生体内成分の生化学検査項目としてのトリグリセリド定量の目的、トリグリセリドやジグリセリドを基質とした膵リパーゼ活性測定の目的や羊水中のホスファチジルグリセロール定量の目的が挙げられる。
【０００６】
さらに他のＡＤＰの測定としては、下記の基質／酵素の関係において基質の測定または酵素活性測定が挙げられ、例えば尿素、ＡＴＰ／ウレアアミドヒドロラーゼ（ＥＣ３．５．１．４５）による形成されるＡＤＰの測定（例えばまた、尿素としては、遊離尿素やクレアチン／クレアチンアミドヒドロラーゼ（ＥＣ３．５．３．３）の反応にて形成される尿素でもよく、さらにクレアチンとしてはクレアチニン／クレアチニンアミドヒドロラーゼ（ＥＣ３．５．２．１０）の反応にて形成されるクレアチンでもよい）、Ｎ−メチルヒダントイン、ＡＴＰ／Ｎ−メチルヒダントイナーゼ（ＥＣ３．５．２．１４）による形成されるＡＤＰの測定（例えばまた、Ｎ−メチルヒダントインとしてはクレアチニン／クレアチニンデイミナーゼ（ＥＣ３．５．４．２１）の反応にて形成されるものが例示される）、Ｌ−グルタミン酸、アンモニア、ＡＴＰ／グルタミンシンセターゼ（ＥＣ６．３．１．２）による形成されるＡＤＰの測定（例えばまた、アンモニアとしては、遊離アンモニアや尿素／ウレアーゼ（ＥＣ３．５．１．５）の反応にて形成されるものが例示される）、Ｌ−アスパラギン酸、α−ケトグルタル酸、アンモニア、ＡＴＰ／アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＯＴ）、グルタミンシンセターゼによる形成されるＡＤＰの測定に基づくＧＯＴ活性測定、Ｌ−アラニン、α−ケトグルタル酸、アンモニア、ＡＴＰ／アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＧＰＴ）、グルタミンシンセターゼによる形成されるＡＤＰの測定に基づくＧＰＴ活性測定などが挙げられる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
まず、本発明者らは１，５ＡＧに対して特異的に作用する酵素を広く微生物からスクリーニングしたところ、超高度好熱菌ピロコッカス・フリオサス・ＤＳＭ３６３８菌株の菌体内に存在する酵素蛋白であるＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ（ＡＤＰ−ＨＫ）がＡＤＰの存在下１，５ＡＧをリン酸化して１，５ＡＧ６Ｐを形成する反応を触媒することを初めて発見し、１，５ＡＧの測定においてＡＤＰの存在下に該酵素蛋白を作用させるか、ＡＤＰの測定において１，５ＡＧの存在下に該酵素蛋白を作用させることにより１，５ＡＧ６ＰおよびＡＭＰを形成し、この１，５ＡＧ６ＰまたはＡＭＰを定量することにより１，５ＡＧまたはＡＤＰが簡便かつ正確に測定できることを見出した。さらに、本発明者らは、エッシェリヒア・コリＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）株の菌体内に存在する１，５アンヒドログルシトール６リン酸デヒドロゲナーゼが補酵素の存在下に１，５ＡＧ６Ｐを基質として還元型補酵素を形成する反応を触媒することを見出し、好適には１，５ＡＧまたはＡＤＰの測定において生成された還元型補酵素を測定することにより達成できることを見出した。
【０００８】
即ち、本発明は１，５ＡＧおよびＡＤＰのいずれか一成分を含有する被検液に、１，５ＡＧおよびＡＤＰのいずれか残りの成分および下記反応を触媒する酵素蛋白を作用させ、反応によって生成される１，５ＡＧ６ＰまたはＡＭＰを定量してなる１，５ＡＧまたはＡＤＰを簡便かつ高精度に測定することのできる新規な方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【化３】
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は上記知見に基づいて完成されたもので、１，５ＡＧおよびＡＤＰのいずれか一成分を含有する被検液に、１，５ＡＧおよびＡＤＰのいずれか残りの成分および下記反応を触媒する酵素蛋白を作用させ、反応によって生成される１，５ＡＧ６ＰまたはＡＭＰを定量することを特徴とする１，５ＡＧまたはＡＤＰの測定法である。
【００１１】
【化４】
【００１２】
より好ましくは、本発明は、生成される１，５ＡＧ６Ｐの定量において、１，５アンヒドログルシトール６リン酸デヒドロゲナーゼおよび補酵素を作用せしめ、次いで反応によって消費された成分または生成された成分を測定することを特徴とする１，５ＡＧまたはＡＤＰの測定法である。
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００１３】
本発明に用いられる下記反応を触媒する酵素蛋白としては１，５ＡＧを基質とし、ＡＤＰを消費して１，５ＡＧ６ＰおよびＡＭＰを生成する酵素蛋白であれば何ら限定されるものではなく、例えば超高度好熱菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ・ｆｕｒｉｏｓｕｓ・ＤＳＭ３６３８菌株由来ＡＤＰ−ＨＫを用いればよい。超高度好熱菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ・ｆｕｒｉｏｓｕｓ・ＤＳＭ３６３８菌株はドイッチェ・ザンムルグ・フォン・マイクロオルガニスメン・ウント・チェルクツルレンＧｍｂＨ（ＤＳＭ）に基準培養物として寄託され、ＤＳＭカタログ（１９９３）に記載されており、何人も入手可能である。
【００１４】
ＡＤＰ−ＨＫ生産菌の培養方法は例えば後述の培地を用いて、培養温度は菌の生育する温度範囲で行えばよく、例えば７０〜１１０℃、好ましくは８５〜１０５℃である。また、培養時間は目的とする酵素が最高力価となる培養時間、例えば１〜３日にて目的とする酵素を採取すればよい。
生成された１，５ＡＧ６Ｐの定量に用いられる１，５アンヒドログルシトール６リン酸デヒドロゲナーゼ（１，５ＡＧ６ＰＤＨ）としてはエッシェリヒア・コリＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）株の菌体内に存在する１，５ＡＧ６ＰＤＨを用いて測定すればよい。１，５ＡＧ６ＰＤＨは下記反応式
【００１５】
【化５】
【００１６】
で示される通り１，５ＡＧ６Ｐを基質とし、例えば補酵素として酸化型（チオ）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）〔酸化型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）〕類を消費して還元型（チオ）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）〔還元型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）〕類を生成する１，５ＡＧ６ＰＤＨであればなんら限定されるものではない。またこの１，５ＡＧ６ＰＤＨ生産菌としてはエシェリヒア属に属する１，５ＡＧ６ＰＤＨ生産菌であれば何ら限定されるものではなく，１，５ＡＧ６ＰＤＨを生産する能力を有するその変異株であってもよい。好ましくはエシェリヒア・コリ属に属する生産菌が考えられ、より好ましいものとしてエシェリヒア・コリ・ＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）はＡＴＣＣに保存され、ＡＴＣＣ（１８ｔｈ）カタログに記載されており、何人も入手可能であり本菌株から得られた１，５ＡＧ６ＰＤＨが好ましい。
【００１７】
次いで１，５ＡＧ６ＰＤＨを得るに当たって好ましくはエシェリヒア・コリ・ＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）を培養するものでこの培養手段としては固体培養でも液体培養でもよいが好ましくはフラスコ、ジャー等による通気培養である。この培地としては微生物の培養に通常用いられるものが広く使用される。炭素源としてグルコース、グリセロール、ソルビトール、ラクトースなど、窒素源としては酵母エキス、肉エキス、トリプトン、ペプトンなど、無機塩としては塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウムなどを用いればよい。培養条件としては例えばｐＨ６．５〜７．５、培養温度は２５〜３７℃で目的とする酵素が最高力価となる培養時間、例えば１８〜３０時間にて目的となる酵素を採取すればよい。
【００１８】
ＡＤＰ−ＨＫまたは１，５ＡＧ６ＰＤＨは主としてその菌体内に含有、蓄積されており、その菌体内から抽出すればよい。ＡＤＰ−ＨＫまたは１，５ＡＧ６ＰＤＨの抽出法を例示すれば培養液から菌体を遠心分離などによって分離し、菌体をリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液などの緩衝液に懸濁した後、リゾチーム、超音波、ガラスビーズなどによって破砕して遠心分離し、可溶性画分を粗酵素液として回収する。このようにして得られた粗製のＡＤＰ−ＨＫまたは１，５ＡＧ６ＰＤＨ含有液を公知の蛋白質、酵素の単離、精製手段を用いて処理することにより、精製されたＡＤＰ−ＨＫまたは１，５ＡＧ６ＰＤＨを得ることができる。例えばアセトンまたはエタノールなどの有機溶媒による分別沈殿法、硫酸アンモニウムなどによる塩析法、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法、ゲルろ過法などの一般的な酵素精製法を適宜選択、組み合わせて精製ＡＤＰ−ＨＫまたは１，５ＡＧ６ＰＤＨを得ることができ、適宜安定化剤例えばショ糖、グリセロールなどを５〜５０％程度、アミノ酸、補酵素などを０．０１〜０．１％程度加えて凍結保存または凍結乾燥させてもよい。
【００１９】
上記ＡＤＰ−ＨＫが触媒する酵素反応に使用するマグネシウムイオンの代わりにマンガンイオンを放出し得るイオン放出性塩類を用いればよく、その塩類としては塩化物、硫酸化物などが包含され、好適には塩化マグネシウム、塩化マンガンが挙げられるが、なんらこれらに限定されるものではない。
上記１，５ＡＧ６ＰＤＨが触媒する酵素反応に使用される補酵素としての酸化型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）類には酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型ＮＡＤ）、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型ＮＡＤＰ）、酸化型３−アセチルニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型３−アセチルＮＡＤ）、酸化型３−アセチルニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型３−アセチルＮＡＤＰ）の酸化型３−アセチルＮＡＤ（Ｐ）、酸化型デアミノニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型デアミノＮＡＤ）、酸化型デアミノニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型デアミノＮＡＤＰ）の酸化型デアミノＮＡＤ（Ｐ）（これらを含めて以下、酸化型ＮＡＤ（Ｐ）ということもある）の他に酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化型チオＮＡＤ）、酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化型チオＮＡＤＰ）の酸化型チオＮＡＤ（Ｐ）などが包含されるが、なんらこれらに限定されるものではない。
【００２０】
本発明における１，５ＡＧの測定の場合、ＡＤＰ−ＨＫ、１，５ＡＧ６ＰＤＨ、ＡＤＰ、酸化型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）類およびマグネシウムイオンまたはマンガンイオンの使用量としては酵素反応が円滑に進行する量であればよく、被検液中１，５ＡＧの含量、反応時間および温度などにより適宜調整されるが、ＡＤＰ−ＨＫおよび１，５ＡＧ６ＰＤＨの濃度は例えば０．１〜５００Ｕ／ｍｌ程度、好ましくは１〜１００Ｕ／ｍｌ程度である。ＡＤＰや酸化型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）類の濃度は酵素反応を行うのに十分な濃度あればよく、ＡＤＰの濃度は例えば０．１〜１００ｍＭ程度、好ましくは０．５ｍＭ〜２０ｍＭ程度である。酸化型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）類は例えば０．５〜５０ｍＭ程度、好ましくは、１〜１０ｍＭ程度とされ、マグネシウムイオンまたはマンガンイオンの濃度としては例えば０．１〜 ５０ｍＭ程度、好ましくは０．５〜１０ｍＭ程度である。
【００２１】
また、ＡＤＰを測定する場合には、上記の試薬としてＡＤＰを用いる代わりに１，５ＡＧを使用すればよく、１，５ＡＧの濃度としては酵素反応を行うのに十分な濃度として用いればよく、その濃度は例えば０．１〜１００ｍＭ程度、好ましくは０．５ｍＭ〜２０ｍＭ程度である。
本発明の方法は、酵素反応系に悪影響を及ぼさない適当な緩衝液（例えば、トリス−塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、モノまたはジエタノールアミン緩衝液、グッド緩衝液等）を用いて行われる。
【００２２】
また、測定手法は特に限定されず、エンドポイント法、レートアッセイ法などの手法を適宜用いることができる。測定対象となる被検液としては、例えば、血清、血漿、尿、髄液などが例示される。
このような被検液としては通常、例えば３〜２００μｌを用いて上記反応系によって反応を行うもので、反応温度としては例えば１５〜４５℃、好ましくは２０℃〜４０℃の反応温度条件で行えばよく、また、反応時間はエンドポイント法では、例えば１〜６０分間、好ましくは１〜１０分間、レートアッセイ法では反応が直線的に行われている時間内、好ましくは、２〜３分間を計って測定する。
【００２３】
まず、反応によって生成されたＡＭＰは、簡便には、例えば通常の液体クロマトグラフィー法で測定すればよい。
また酸化型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）類から形成された還元型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）類の生成量は種々の方法により測定することができるが、通常、簡便かつ高精度で測定することのできる吸光度測定法により行われる。測定波長は還元型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）類の種類によって適宜選択され、還元型ＮＡＤ（Ｐ）、還元型３−アセチルＮＡＤ（Ｐ）、還元型デアミノＮＡＤ（Ｐ）などの場合には３４０ｎｍ付近、還元型チオＮＡＤ（Ｐ）の場合は４０５ｎｍ付近の波長が選択される。また還元型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）類の生成量の測定法として、インドニトロテトラゾニウム（ＩＮＴ）やニトロブルーテトラゾニウム（ＮＴＢ）等のテトラゾニウム塩を用いて電子受容体としてフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）やジアホラーゼ（ＥＣ １．６．４．３）の作用によりホルマザン色素を形成せしめ、このホルマザン色素の呈色を測定する方法を用いてもよい。また、還元型（チオ）ＮＡＤ（Ｐ）類の蛍光を測定してもよい。
【００２４】
また、被検液中の１，５−ＡＧがごく微量でそのリン酸化生成物（１，５ＡＧ６Ｐ）も極微量である場合、下記反応式
【００２５】
【化６】
【００２６】
【化７】
【００２７】
（式中Ａ１は酸化型チオＮＡＤ（Ｐ）または酸化型ＮＡＤ（Ｐ）のいずれか１種を示し、Ａ２はＡ１の還元生成物を示し、Ｂ１はＡ１が酸化型チオＮＡＤ（Ｐ）のときは還元型ＮＡＤ（Ｐ）を、Ａ１が酸化型ＮＡＤ（Ｐ）のときは還元型チオＮＡＤ（Ｐ）を示し、Ｂ２はＢ１の酸化型生成物を示す。）
に示す原理にていわゆる酵素サイクリング反応を形成せしめ、該反応によって変化するＡ２またはＢ１の量を測定することで１，５ＡＧを高感度に定量することができる。なお、還元型ＮＡＤ（Ｐ）は波長３４０ｎｍ付近、還元型チオＮＡＤ（Ｐ）は波長４０５ｎｍ付近での吸光度により定量することができ、この特徴に基づいてこれらを定量するものである。
【００２８】
この酵素サイクリング反応においては酵素反応系に悪影響を及ぼさない適当な緩衝液、例えばトリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、モノまたはジエタノールアミン緩衝液、グッド緩衝液などで例えばｐＨ８〜１１、好ましくは９．５〜１０．５が用いられる、還元型ＮＡＤ（Ｐ）量は例えば０．０１〜０．１ｍＭ、酸化型チオＮＡＤ（Ｐ）量は例えば０．５〜５ｍＭ、１，５ＡＧ６ＰＤＨ量は例えば０．１〜１００Ｕ／ｍｌ程度で適宜ＫＣｌ、ＭｇＣｌ2 などの無機塩を例えば０〜１００ｍＭの濃度加えて行ってもよい。反応温度としては例えば５〜４５℃、好ましくは２０〜４０℃の反応温度条件で行えばよく、反応時間しては例えば０．５〜６０分程度で行えばよい。
【００２９】
また、被検液中にグルコースが共存するする場合は１，５ＡＧに対して作用せずグルコースに特異性を有する酵素を用いてグルコースを消去した後に１，５ＡＧの測定を行うことが好ましい。具体的に説明すると、
１、グルコースオキシダーゼまたはグルコースオキシダーゼおよびカタラーゼ
２、グルコースデヒドロゲナーゼ
３、ヘキソキナーゼ
４、グルコキナーゼ
などが挙げられ、好適にはグルコースオキシダーゼおよびカタラーゼを用いた消去方法がよい。消去反応を効率よく行うためにムタロターゼを添加してもよい。添加する酵素量としては例えば０．１〜５００Ｕ／ｍｌ、好ましくは１〜１００Ｕ／ｍｌである。また、上記酵素の反応生成物を消費する酵素をさらに添加してもよい。
【００３０】
【発明の実施の形態】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３１】
【参考例１】
＜ＡＤＰ−ＨＫの酵素活性測定法＞
測定試薬
５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
２０ｍＭ グルコース
２ｍＭ ＡＤＰ
２ｍＭ ＭｇＣｌ2
５Ｕ／ｍｌ グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）
０．０２５％ ＮＢＴ
１ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ
１％ トリトンＸ−１００
５Ｕ／ｍｌ ジアホラーゼ（ＮＡＤＰＨ）
測定試薬１ｍｌを３７℃で１分間予備加温した後、０．０２ｍｌの酵素液を添加して１０分間反応させる。反応後、０．１Ｎ塩酸を２ｍｌ添加して反応を停止させ、５分以内に層長１．０ｃｍのセルを用いて、波長５５０ｎｍにおける吸光度を測定する（Ａｓ）。また盲検として酵素液のかわりに蒸留水０．０２ｍｌを用いて同一の操作を行って吸光度を測定する（Ａｂ）、この酵素使用の吸光度（Ａｓ）と盲検の吸光度（Ａｂ）の吸光度差（Ａｓ−Ａｂ）より酵素活性を求める。酵素活性１単位は３７℃で１分間に１μモルの還元型ＮＡＤＰを生成させる酵素量とし、計算式は下記の通りである。
酵素活性（Ｕ／ｍｌ）＝（Ａｓ−Ａｂ）×０．７９５×酵素の希釈倍率
＜ＡＤＰ−ＨＫの取得＞
Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ・ｆｕｒｉｏｓｕｓ・ＤＳＭ３６３８の培養
培地組成
０．１％ 酵母エキス
０．５％ トリプトン
０．７２％ マルトース
２．３９％ ＮａＣｌ
０．４％ Ｎａ2 ＳＯ4
０．０７％ ＫＣｌ
０．０２％ ＮａＨＣＯ3
０．０１％ ＫＢｒ
０．０３％ Ｈ3ＢＯ4
１．０８％ ＭｇＣｌ2
０．１５％ ＣａＣｌ2
０．００２５％ ＳｒＣｌ2
０．０２５％ ＮＨ4 Ｃｌ
０．０１４％ Ｋ2 ＨＰＯ4
０．１％ ＣＨ3 ＣＯＯＮａ
０．００１５％ Ｎ（ＣＯＯＨ）3
０．０００５％ ＭｎＳＯ4
０．００１４％ ＦｅＳＯ4
０．０００２％ ＮｉＣｌ2
０．０００１％ ＣｏＳＯ4
０．０００１％ ＺｎＳＯ4
０．００００１％ ＣｕＳＯ4
０．０００００１％ Ｎａ2 Ｗｏ4
０．０００００１％ Ｎａ2 Ｍｏ4
０．１％ システイン塩酸塩
上記培地成分を含む液体培地（ｐＨ７）５００ｍｌを５００ｍｌ溶三角フラスコ１０本に分注し、１２０℃、２０分間、加熱滅菌した後、これにＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ・ｆｕｒｉｏｓｕｓ・ＤＳＭ３６３８株の菌体懸濁液１０ｍｌを移植し、攪拌させながら、９５℃で２０時間培養し、種培養液とした。上記培地成分を含む液体培地２００ｌ／３００ｌタンクを滅菌した後、種培養液を移植し、攪拌させながら、９５℃で１５時間培養し、５ｍＵ／ｍｌの培養液２００ｌを得た。＜ＡＤＰ−ＨＫの精製＞
得られた培養液２００ｌを遠心分離して、得られた菌体を０．９％のＮａＣｌを含む２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で１回洗浄した。洗浄菌体を２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁して２ｌに調整し、クボタ社製の超音波破砕機（ＩＮＳＯＮＡＴＯＲ ２０１Ｍ）を用いて１８０Ｗ、３０分間処理して、菌体破砕液を得た。
【００３２】
この破砕液を８０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離し、１．８ｌ（酵素活性９８０Ｕ）の上清を得た。この上清を透析チューブを用いて１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）８ｌに対して５℃で一夜透析した後、１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で緩衝化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ファルマシア社製）２００ｍｌ（２．６×３８ｃｍ）のカラムに通し、０〜１モルのＮａＣｌのリニアグラジエントで溶出を行った。その結果、０．０８〜０．１モルのＮａＣｌ濃度で活性画分（９５０Ｕ）が溶出された。
【００３３】
この得られた活性画分に４ＭとなるようにＮａＣｌを溶解し、４ＭのＮａＣｌで緩衝化されたＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ファルマシア社製）２００ｍｌ（２．６×３８ｃｍ）のカラムに通し、４〜０ＭのＮａＣｌのリニアグラジエントにより溶出を行った。その結果、０．０２から０．０７モルのＮａＣｌ濃度で活性画分（９００Ｕ）が得られた。この得られた活性画分を１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．５）８ｌに５℃、一夜透析した後、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で緩衝化したヒドロキシアパタイト（ペンタックス社製）１００ｍｌ（２．６×１９ｃｍ）のカラムに通し、０〜０．５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）のリニアグラジエントにより溶出を行った。その結果、０．０２〜０．０３Ｍのリン酸緩衝液濃度で活性画分（８５０Ｕ）が溶出された。この酵素液を凍結乾燥して５ｍｇの酵素粉末（１７０Ｕ／ｍｇ）を得た。
【００３４】
ＡＤＰ−ＨＫの理化学的性質は以下の通りであった。
＜ＡＤＰ−ＨＫの理化学的性質＞
（１）酵素作用
基質としてグルコースを用いた酵素作用を以下に示す。
【００３５】
【化８】
【００３６】
（２）基質特異性
基質特異性を表１に示す。
【００３７】
【表１】
【００３８】
（３）分子量
トーソー社製ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷXL（０．７５×３０ｃｍ）を用いたゲル濾過法により測定したＡＤＰ−ＨＫの分子量は１０００００±５０００であった。
（４）至適ｐＨはｐＨ６．０〜７．０（リン酸緩衝液）であった。
【００３９】
（５）至適温度は８０〜１００℃であることから高度好熱性酵素と認められた。
【００４０】
【参考例２】
＜１，５ＡＧ６ＰＤＨ生産菌の培養＞
エシェリヒア・コリ・ＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）の培養
培地組成
０．５％ 肉エキス
１．５％ ソルビトール
１．０％ トリプトン
１．５％ ビール酵母エキス
上記培地成分を含む液体培地（ｐＨ７．５）５０ｍｌを３００ｍｌ容三角フラスコ２本に分注し、１２０℃、２０分間、加熱滅菌した後、これにエシェリヒア．コリＤＨ１（ＡＴＣＣ３３８４９）の菌体懸濁液１ｍｌを移植し、攪拌させながら、３０℃で１５時間培養し、種培養液とした。上記培地成分と消泡剤ＦＳアンチフォーム０２８（ダウコーニング社製）を０．３％含む液体培地５ｌを１０ｌ容ジャー２ヶにおいて滅菌した後に種培養液を移植し、３７℃で培養液のｐＨを５Ｎ ＮａＯＨで６．５以上になるよう制御して好気的に撹拌しながら２４時間培養し、培養力価１５ｍＵ／ｍｌの培養液１０ｌを得た。
＜１，５ＡＧ６ＰＤＨの精製＞
得られた培養液１０ｌを遠心分離して、得られた菌体を５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で１回洗浄した。洗浄菌体を５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に懸濁して１．２ｌに調整し、ＤＹＮＯ−ＭＩＬＬ（Ｗｉｌｌｙ・Ａ．Ｂａｃｈｏｆｅｎ社製）を用いて菌体破砕を行い、菌体破砕液を得た。
【００４１】
この破砕液を透析チューブを用いて５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）２０ｌに対して５℃で一夜透析した後、８０００ｒｐｍ、６０分間遠心分離し、１．０ｌ（酵素活性１２０Ｕ）の上清を得た。この上清を５０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で緩衝化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ・ＦＦ（ファルマシア社製）１２００ｍｌ（２．６×３８ｃｍ）のカラムに通し、０〜０．２５ＭのＮａＣｌのリニアグラジエントで溶出を行った。その結果、約０．１５ＭのＮａＣｌ濃度で活性画分（７５Ｕ）が溶出された。この得られた活性画分に３ＭとなるようにＮａＣｌを溶解し、５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５），３Ｍ ＮａＣｌで平衝化されたＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ・ＣＬ４Ｂ（ファルマシア社製）５００ｍｌ（２．６×３８ｃｍ）のカラムに通し、２．５〜０ＭのＮａＣｌのリニアグラジエントにより溶出を行った。
【００４２】
その結果、約１．２ＭのＮａＣｌ濃度で活性画分（５０Ｕ）が得られた。この得られた活性画分を２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８．５）で、一夜透析した後、２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で緩衝化したＢｌｕｅ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ファルマシア社製）５０ｍｌ（２．６×１９ｃｍ）のカラムに通し、０〜１ＭのＮａＣｌ、２０％エチレングリコールのリニアグラジエントにより溶出を行った。その結果、約０．６ＭのＮａＣｌ、１２％エチレングリコールの濃度で活性画分（３０Ｕ）が溶出された。この得られた活性画分を５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で一夜透析した後、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で緩衝化したＲｅｓｏｕｒｃｅ・Ｑ（ファルマシア社製）６ｍｌのカラムに通し、０〜０．３ＭのＮａＣｌのリニアグラジエントにより溶出を行った。その結果、約０．１５ＭのＮａＣｌ濃度で活性画分（２８Ｕ）が得られ、均質な酵素標品を得た。
＜１，５ＡＧ６ＰＤＨの理化学的性質＞
（１）作用
１，５ＡＧ６Ｐを補酵素の存在下脱水素し、組成式（Ｃ6 Ｈ11Ｏ8 Ｐ1 ）の化合物とする下記の反応式
【００４３】
【化９】
【００４４】
で表される反応を触媒する。
また上記反応において、１，５ＡＧ６Ｐを２５ｍＭとして用いた場合、補酵素としての酸化型ＮＡＤＰに対するＫｍ値は０．０９ｍＭであり、酸化型ＮＡＤに対するＫｍ値は２．４ｍＭであり、酸化型チオＮＡＤＰに対するＫｍ値は０．０８ｍＭであり、さらに酸化型チオＮＡＤも補酵素として作用する。
（２）力価の測定法
１，５ＡＧ６ＰＤＨの酵素活性測定法
測定試薬
５０ｍＭ ＣＡＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）
１ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ
５ｍＭ １，５ＡＧ６Ｐ
（ＣＡＰＳ：Ｎ−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕ−ｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）
測定試薬１ｍｌを光路長１ｃｍのセルに入れ３７℃で５分間予備加温した後、０．０１ｍｌの酵素液添加後０．５分後の波長３４０ｎｍにおける吸光度（Ａａ）と酵素液添加後１．５分後の吸光度（Ａｂ）を測定する。この吸光度（Ａａ）と（Ａｂ）の吸光度差（Ａｂ−Ａａ）より酵素活性を求める。なお、吸光度（Ａｂ）が０．２以上になる時は酵素液を５０ｍＭ ＣＡＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）で希釈して測定するものとする。酵素活性１単位は３７℃で１分間に１μモルの還元型ＮＡＤＰを生成させる酵素量とし、計算式は下記の通りである。
酵素活性（Ｕ／ｍｌ）＝（Ａｂ−Ａａ）×１６．０×酵素の希釈倍率
（３）基質特異性
上記力価測定法を利用して、その反応液中の１，５ＡＧ６Ｐの代わりに、種々の基質を用いて、１，５ＡＧ６Ｐに対する相対活性を求めた結果を表２に示す。
【００４５】
【表２】
【００４６】
その結果、この酵素は少なくとも１，５ＡＧ６Ｐに基質特異性を示した。
（３）至適ｐＨ
ｐＨ７．０〜９．０は５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（□−□）、ｐＨ９．５〜１０．５は５０ｍＭのＣＡＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（■−■）を用いた。至適ｐＨは９〜１０付近であり、結果を図１に示した。
【００４７】
（４）ｐＨ安定性
ｐＨ４．０〜５．５はクエン酸緩衝液（○−○）、ｐＨ５．５〜７．０はビストリス塩酸緩衝液（●−●）、ｐＨ７．０〜９．０はトリス塩酸緩衝液（□−□）、ｐＨ９．５〜１１．０はＣＡＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（■−■）を用いた。５０℃、３０分処理でｐＨ６〜９において安定であり、結果を図２に示した。
【００４８】
（５）至適温度
上記の力価測定法における測定法を利用して、その温度条件を変えて酵素反応を行った結果は図３に示す通りであって、その至適温度は３７〜５０℃であった。
（６）熱安定性
１，５ＡＧ６ＰＤＨを１Ｕ／ｍｌを含有して成る５０ｍＭ ＣＡＰＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．５）を各温度に３０分間放置し、ついで上記の力価測定法に従って、１，５ＡＧ６ＰＤＨの残存活性を測定した結果、図４に示す通りであって、酵素は４５℃付近までは安定であった。
【００４９】
（７）種々の物質による影響
上記の力価測定法において、種々の添加物を加えて、１，５ＡＧ６ＰＤＨの１，５ＡＧ６Ｐに対する酵素活性を測定した結果を表３に示す。
【００５０】
【表３】
【００５１】
（８）分子量
７８０００±６０００（ＴＳＫｇｅｌ・Ｇ３０００ＳＷＸＬ（東ソー製）ゲル濾過法による）
（９）等電点
４．７±０．５（キャリアアンフォライトｐＨ３．５−ｐＨ１０（ファルマシア製）を用いる電気泳動法により測定）
（１０）Ｋｍ値
１，５ＡＧ６Ｐに対するＫｍ値：２５ｍＭ
（１１）作用機序確認試験
１，５ＡＧ６Ｐ、（酸化型）ＮＡＤＰ、トリエチルアミン重炭酸緩衝液（ｐＨ１０．０）、１，５ＡＧ６ＰＤＨを含む反応液を３７℃、８時間反応せしめる。１，５ＡＧ６Ｐに生成したカルボニル基を２，４−ジニトロフェニルヒドラジンとＨＣｌを加えて反応せしめヒドラゾンとして分離し、マススペクトルを測定することで生成物が組成式（Ｃ6 Ｈ11Ｏ8 Ｐ1 ）で表されるものであることが確認された。
【００５２】
【実施例１】
＜マグネシウムイオンを用いたときの１，５ＡＧの定量＞
測定試薬１
５２．６ｍＭ トリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
１０．５ｍＭ ＡＤＰ
１０．５ｍＭ ＭｇＣｌ2
１０Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
測定試薬２
２３９ｍＭ グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）
４．７７ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ
０．２４ｍＭ トリトンＸ−１００
０．０１２％ ＮＴＢ
１１．９Ｕ／ｍｌ ジアホラーゼ（ＮＡＤＰＨ）
３６ｍＵ／ｍｌ １，５ＡＧ６ＰＤＨ
測定方法
１，５ＡＧを１ｍＭ，２ｍＭ，５ｍＭ，７ｍＭ，１０ｍＭの水溶液に調製し、１，５ＡＧサンプルを作製した。測定試薬１を０．４７５ｍｌに１，５ＡＧサンプル０．０２５ｍｌを加え、３７℃、５分間加温後、測定試薬２を０．５ｍｌ加えて更に３７℃、５分間加温後、０．１ＮのＨＣｌ２ｍｌを加えて、反応停止後、５５０ｎｍの吸光度を１，５ＡＧサンプルの代わりに蒸留水を用いたものを対象に測定した。図５に示す通り、１，５ＡＧが定量的に測定できた。
【００５３】
【実施例２】
＜マンガンイオンを用いたときの１，５ＡＧの定量＞
測定試薬１
５２．６ｍＭ トリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
１０．５ｍＭ ＡＤＰ
１０．５ｍＭ ＭｎＣｌ2
１０Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
測定試薬２
２３９ｍＭ グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）
４．７７ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ
０．２４ｍＭ トリトンＸ−１００
０．０１２％ ＮＴＢ
１１．９Ｕ／ｍｌ ジアホラーゼ（ＮＡＤＰＨ）
３６ｍＵ／ｍｌ １，５ＡＧ６ＰＤＨ
測定方法
１，５ＡＧを１．２ｍＭ，２．４ｍＭ，６ｍＭ，８．４ｍＭ，１２ｍＭの水溶液に調製し、１，５ＡＧサンプルを作製した。測定試薬１を０．４７５ｍｌに１，５ＡＧサンプル０．０２５ｍｌを加え、３７℃、５分間加温後、測定試薬２を０．５ｍｌ加えて更に３７℃、５分間加温後、０．１ＮのＨＣｌ２ｍｌを加えて、反応停止後、５５０ｎｍの吸光度を１，５ＡＧサンプルの代わりに蒸留水を用いたものを対象に測定した。図６に示す通り、１，５ＡＧが定量的に測定できた。
【００５４】
【実施例３】
＜サイクリング反応を用いた１，５ＡＧの測定＞
測定試薬
５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）
２ｍＭ ＡＤＰ
２ｍＭ ＭｇＣｌ2
５Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
４０ｍＭ ＫＣｌ
０．０５ｍＭ 還元型ＮＡＤＰ
３ｍＭ 酸化型チオＮＡＤＰ
１Ｕ／ｍｌ １，５ＡＧ６ＰＤＨ
測定方法
１，５ＡＧを０．１ｍＭ、０．５ｍＭ，１．２５ｍＭ、２．５ｍＭの水溶液に調製し、１，５ＡＧサンプルを作製した。測定試薬０．９９ｍｌに１，５ＡＧサンプル０．０１ｍｌを加え、３７℃、５分間加温後、の４０５ｎｍの吸光度を試薬ブランクを対照に測定した。図７に示す通り、１，５ＡＧが定量的に測定できた。
【００５５】
【実施例４】
＜グルコースの消去系を組み合わせた１，５ＡＧの測定＞
測定試薬１
５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ６．５）
１００Ｕ／ｍｌ グルコースオキシダーゼ
５０Ｕ／ｍｌ カタラーゼ
測定試薬２
２００ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）
４ｍＭ ＡＤＰ
５０ｍＵ／ｍｌ １，５ＡＧ６ＰＤＨ
２ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ
４ｍＭ ＭｇＣｌ2
１０Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
１０Ｕ／ｍｌ ジアホラーゼ（ＮＡＤＰＨ）
０．０５％ ＮＴＢ
２．０％ トリトンＸ−１００
測定法
グルコース２ｍＭを含む、１，５ＡＧを１ｍＭ，２ｍＭ，５ｍＭ，７ｍＭ，１０ｍＭの水溶液に調製し、１，５ＡＧのサンプルを作製した。測定試薬１の０．５ｍｌに１，５ＡＧサンプル０．０２５ｍｌを加え、３７℃、５分間加温後、測定試薬２を０．５ｍｌ加えて更に３７℃、５分間加温後、０．１ＮのＨＣｌ２ｍｌを加えて、反応停止後、５５０ｎｍの吸光度を１，５ＡＧサンプルの代わりに、蒸留水を用いたものを対照に測定した。図８に示す通り、１，５ＡＧが定量的に測定できた。
【００５６】
【実施例５】
＜マグネシウムイオンを用いたときのＡＤＰの定量＞
測定試薬１
５２．６ｍＭ トリスー塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）
２０ｍＭ １，５ＡＧ
１０．５ｍＭ ＭｇＣｌ2
２０Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
測定試薬２
２３９ｍＭ グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）
４．７７ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ
０．２４ｍＭ トリトンＸ−１００
０．０１２％ ＮＴＢ
１１．９Ｕ／ｍｌ ジアホラーゼ（ＮＡＤＰＨ）
３６ｍＵ／ｍｌ １，５ＡＧ６ＰＤＨ
測定方法
ＡＤＰを１ｍＭ，２ｍＭ，５ｍＭ，７ｍＭ，１０ｍＭの水溶液に調製し、１，５ＡＧサンプルを作製した。測定試薬１を０．４７５ｍｌにＡＤＰサンプル０．０２５ｍｌを加え、３７℃、５分間加温後、測定試薬２を０．５ｍｌ加えて更に３７℃、５分間加温後、０．１ＮのＨＣｌ２ｍｌを加えて、反応停止後、５５０ｎｍの吸光度をＡＤＰサンプルの代わりに蒸留水を用いたものを対象に測定した。図９に示す通り、ＡＤＰが定量的に測定できた。
【００５７】
【参考例３】
＜マグネシウムイオンを用いた時のグルコースの定量＞
測定試薬
５０ｍＭ トリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
２ｍＭ ＡＤＰ
１０Ｕ／ｍｌ Ｇ６ＰＤＨ
１ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ
２ｍＭ ＭｇＣｌ2
１０Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
測定方法
グルコースを０．４ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、４ｍＭの水溶液に調整し、グルコースサンプルを作成した。測定試薬１ｍｌにグルコースサンプル０．０５ｍｌ加え、３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を試薬ブランクを対照に測定した。図１０に示すようにグルコースが定量的に測定できた。
【００５８】
【参考例４】
＜マンガンイオンを用いたときのグルコースの定量＞
測定試薬
５０ｍＭ トリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）
２ｍＭ ＡＤＰ
１０Ｕ／ｍｌ グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ
１ｍＭ 酸化型ＮＡＤＰ
２ｍＭ ＭｎＣｌ2
１０Ｕ／ｍｌ ＡＤＰ−ＨＫ
測定方法
グルコースを０．４８ｍＭ，１．２ｍＭ，２．４ｍＭ，４．８ｍＭの水溶液に調製し、グルコースサンプルを作製した。測定試薬１ｍｌにグルコースサンプル０．０５ｍｌを加え、３７℃、５分間加温後の３４０ｎｍの吸光度を試薬ブランクを対照に測定した。図１１に示す通り、グルコースが定量的に測定できた。
【００５９】
【発明の効果】
本発明の測定方法では、１，５ＡＧまたはＡＤＰの新規な測定法を提供でき、本発明によれば、生体試料中の１，５ＡＧまたはＡＤＰを簡便にして高精度で測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明に用いる１，５ＡＧ６ＰＤＨの至適ｐＨを示す。
【図２】図２は、本発明に用いる１，５ＡＧ６ＰＤＨのｐＨ安定性を示す。
【図３】図３は、本発明に用いる１，５ＡＧ６ＰＤＨの至適温度を示す。
【図４】図４は、本発明に用いる１，５ＡＧ６ＰＤＨの熱安定性を示す。
【図５】図５は、本発明によってマグネシウムイオンを用いたときの１，５ＡＧ測定の検量線を示す。
【図６】図６は、本発明によってマンガンイオンを用いたときの１，５ＡＧ測定の検量線を示す。
【図７】図７は、本発明によってサイクリング反応を用いたときの１，５ＡＧ測定の検量線を示す。
【図８】図８は、本発明によってグルコースの消去系を用いたときの１，５ＡＧ測定の検量線を示す。
【図９】図９は、本発明によってマグネシウムイオンを用いたときのＡＤＰ測定の検量線を示す。
【図１０】図１０は、本発明によってマグネシウムイオンを用いたときのグルコース測定の検量線を示す。
【図１１】図１１は、本発明によってマンガンイオンを用いたときのグルコース測定の検量線を示す。
Claims (4)
- １，５アンヒドログルシトールおよびＡＤＰのいずれか一成分を含有する血清、血漿、尿、髄液由来の被検液に、１，５アンヒドログルシトールおよびＡＤＰのいずれか残りの成分および下記反応を触媒するピロコッカス・フリオサス由来のＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼを２０〜４０℃で作用させ、反応によって生成される１，５アンヒドログルシトール６リン酸に１，５アンヒドログルシトール６リン酸デヒドロゲナーゼおよび酸化型（チオ）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）類を作用せしめ、次いで反応によって消費された酸化型（チオ）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）類または生成された還元型（チオ）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）類を測定、または液体クロマトグラフィーを用いてＡＭＰを定量することを特徴とする１，５アンヒドログルシトールまたはＡＤＰの測定法。
- 酸化型（チオ）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）類が、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）または酸化型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）である請求項１記載の測定法。
- 還元型（チオ）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）類が、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）または還元型チオニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）である請求項２記載の測定法。
- ピロコッカス・フリオサス由来ＡＤＰ依存性ヘキソキナーゼ、１，５アンヒドログルシトール６リン酸デヒドロゲナーゼ、マグネシウムイオンおよび酸化型（チオ）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）類を含有することを特徴とする血清、血漿、又は尿由来の被検液中の１，５アンヒドログルシトールの測定用組成物。
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