JP2579319B2

JP2579319B2 - 新規なｎａｄ合成酵素およびその製造法

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Publication number: JP2579319B2
Application number: JP62191018A
Authority: JP
Inventors: 守高橋; 英生美崎; 茂行今村; 一男松浦
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1986-09-10
Filing date: 1987-07-30
Publication date: 1997-02-05
Anticipated expiration: 2012-02-05
Also published as: KR880004083A; EP0525836A3; EP0525836B1; JPS63185378A; EP0525836A2; KR950012760B1

Description

【発明の詳細な説明】「産業上の利用分野」本発明は、新規なNAD合成酵素およびその製造法に関
する。更に詳しく言えば、本発明は、少なくともMg⁺⁺イ
オンまたはMn⁺⁺イオンの存在下、下記の式（ａ）の酵素
反応を触媒し、Mg⁺⁺イオンの存在下、下記の式（ｂ）の
酵素反応を触媒せず、アンモニアおよび／またはアンモ
ニウムイオンを利用し、かつ少なくともグルタミンおよ
びアスパラギンを利用しないNAD合成酵素（以下本発明N
AD合成酵素と云うことがある）およびその製造法である。

「従来技術」従来、NAD合成酵素（NAD⁺synthetase）は、ラツト肝
臓〔J.Biol.Chem.,223,493−500（1958）〕、ブタ肝臓
〔J.Biol.Chem.,236,525〜530（1961）〕酵母〔J.Biol.
Chem.,247,4794〜4802（1972）〕、E.coli〔J.Biol.Che
m.,236,1494〜1497（1961）;J.Biol.Chem.,242,385〜39
2（1967）〕に夫々その存在が知られている。そして、
酵素分類上、の反応を触媒するNAD合成酵素（E.C.6.3.1.5）との反応を触媒するNAD合成酵素（E.C.6.8.5.1）に分類さ
れているが、両酵素ともアミノ供与体としてアンモニア
（アンモニウムイオンを含む）およびＬ−グルタミンを
基質として作用し、NAD合成酵素（E.C.6.3.1.5）につい
て、〔J.Biol.Chem.,236,1494〜1497（1961）;J.Biol.C
hem.,242 385〜392（1967）〕によると、NH₄ ⁺に対する
Km値は6.5×10^-5M,L−グルタミンに対するKm値は1.6×1
0^-2Mと報告されており、NAD合成酵素（E.C.6.3.5.1）に
ついて〔J.Biol.Chem.,247 4794〜4802（1972）;J.Bio
l.Chem.,233,493〜500（1958）〕によると、NH₄ ⁺に対す
るKm値は6.4×10³M,L−グルタミンに対するKm値は５×1
0^-3Mと報告されている。両酵素の相違はアザセリンによ
つて阻害されるか否かによつて区別されている。

従来より知られたNAD合成酵素の活性測定法は、反応
により生じたNADをアルコールデヒドロゲナーゼ（E.C.
1.1.1）で還元し、生じた還元型NADを340nmにおける吸
光度測定する方法または生じたNADを螢光法で測定する
方法が報告されている。

また、本発明者らは、先に従来のNAD合成酵素（E.C.
6.3.1.5およびE.C.6.3.5.1）を用いて被検液中のATP、
デアミド−NADおよび、NH₃GlnまたはAsnアミド供与体の
いずれか１つを測定するに当り、被検液にATP、デアミ
ド−NAD、アミド供与体およびMg⁺⁺の存在下NAD合成酵素
を作用させる主反応を行い、主反応により生じたNAD
を、NADを補酵素とする酸化還元反応系と還元型NADを補
酵素とする酸化還元反応系との組合せによる補酵素サイ
クリング反応を行い、そのサイクリング反応により消費
または生成された成分を定量することを特徴とするAT
P、デアミド−NADおよびアミド供与体のいずれか１つを
含有する被検液中の成分の測定法を報告している（特開
昭59−198995号公報）。

「発明が解決しようとする問題点」前述のように従来のNAD合成酵素は、アミノ供与体と
してＬ−グルタミンを基質として利用するものであり、
少なくともMg⁺⁺イオンまたはMn⁺⁺イオンの存在下、下記
の式（ａ）の酵素反応を触媒し、Mg⁺⁺イオンの存在下、
下記の式（ｂ）の酵素反応を触媒せず、アンモニアおよ
び／またはアンモニウムイオンを基質として利用し、か
つ少なくともグルタミンおよびアスパラギンを基質とし
て利用しないNAD合成酵素は知られていなかつた。

また、従来のNAD合成酵素は前述の若く、Ｌ−グルタ
ミンにも基質特異性を有するため、Ｌ−グルタミン共存
下でのNH₃の測定が出来ないものであつた。

「問題点を解決するための手段」本発明者らは、前述の問題点を鑑み、鋭意研究の結
果、大分県別府市田ノ湯町の温泉水から分離したバチル
ス属に属する菌株Ｈ−804株が、新規な、少なくともMg
⁺⁺イオンまたはMn⁺⁺イオンの存在下、下記の式（ａ）の
酵素反応を触媒し、Mg⁺⁺イオンの存在下、下記の式
（ｂ）の酵素反応を触媒せず、アンモニアおよび／また
はアンモニウムイオンを基質として利用し、かつ少なく
ともグルタミンおよびアスパラギンを基質として利用し
ないNAD合成酵素を産生することを見い出した。

すなわち、本発明は、少なくともMg⁺⁺イオンまたはMn
⁺⁺イオンの存在下、下記の式（ａ）の酵素反応を触媒
し、Mg⁺⁺イオンの存在下、下記の式（ｂ）の酵素反応を
触媒せず、アンモニアおよび／またはアンモニウムイオ
ンを基質として利用し、かつ少なくともグルタミンおよ
びアスパラギンを基質として利用しない下記の理化学的
性状を特徴とするNAD合成酵素（以下本発明NAD合成酵素
と云うことがある）（理化学的性状）（ａ）分子量:50,000±5000〔ピリビニールゲル（商品
名:GPC3000SWカラム；東洋曹達社製）を用いた分子篩に
よる〕（ｂ）至適pH:pH8.5〜10.0 （ｃ）pH安定性:pH7.5〜9.0（60℃、15分間処理）（ｄ）熱安定性:60℃以下（pH8.0、15分間処理）およびその製造法に関するものである。

この新規な本発明NAD合成酵素生産菌の菌学的性状は
以下の通りである。

a.形態的特徴普通寒天斜面培地を用いて、50℃で１〜３日培養して
顕微鏡観察を行なつた。

（１）形および配列；端は丸く、まつすぐ又はやや曲つた桿菌で単独又は二
連鎖を形成する。

（２）大きさ； 0.5〜1.0×1.6〜5.5μｍ（３）運動性；周毛で運動する（４）芽胞；中央又は端に近いところに形成する。大きさは0.8〜
1.0×1.0×1.5μｍで細胞は膨張する。

b.各培地における生育状態（50℃）（１）普通寒天平板培地灰白色〜淡黄灰白色で半透明であり、線状に生育し、
生育はやや弱く、可溶性色素は産生しない。

（２）普通寒天斜面培地灰白色〜淡黄灰白色で半透明であり、円形で平らな集
落を形成する。可溶性色素は産生しない。

（３）液体培地生育良好で一様に混濁し、２〜３日後一部沈澱する。

（４）BCPミルク不変である利用性テスト（Simmons培地）クエン酸塩 − マロン酸塩 − グルコン酸塩 − プロピオン酸塩 − マレイン酸塩 − コハク酸塩 − リンゴ酸塩＋利用性テスト（Christensen培地）クエン酸塩 − マロン酸塩 − グルコン酸塩＋プロピオン酸塩 − マレイン酸塩 − コハク酸塩＋リンゴ酸塩＋上記の菌学的性質から、本Ｈ−804菌株は、端の丸
い、まつすぐまたはやや曲つた桿菌で、グラム陽性、大
きさは0.5〜1.0×1.6×5.5μｍで芽胞を形成する高温性
細菌で、カタラーゼ及びオキシダーゼ産生能が弱陽性
で、非運動性、糖（グルコース）を酸化的に分解する細
菌であるとの特徴を有する。このような諸性状を有する
本菌の分類学上の位置をBergey's・Manual8版,1974,医
学細菌同定の手引き２版、1974およびAgriculture Hand
book,427,Thegenus Bacillusを参照して検討すると、
本菌は芽胞を形成し、好気条件で生育できることからバ
チルス属に属するものと判定される。そこで、バチルス
属に属する高（好）温性・耐温性の菌種として、バチル
ス・ズブチリス，バチルス・コアギユランス，バチルス
・リケニホルミス，バチルス・ブレビスおよびバチルス
・ステアロサーモフイラスが挙げられるが、本菌の最低
生育温度が30℃以上であることから、（Ａ）バチルス・
ステアロサーモフイラスおよび（Ｂ）バチルス・ブレビ
スが挙げられる。これらの性状を比較対比すると次の通
りである〔＋；陽性，−；陰性,d;菌株によつて異な
る〕。

以上の比較対比から、本菌株はバチルス・ステアロサ
ーモフイラスとよく一致しており、運動性については容
易に非運動性の株が得られることが報告されており、そ
の他の諸性状について比較検討した結果でもバチルス・
ステアロサーモフイラスとよく一致した。よつて本Ｈ−
804菌株をバチルス・ステアロサーモフイラス（Bacillu
s stearothermophilus）Ｈ−804と同定命名した。な
お、本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に「微工
研菌寄第8839号（FERMP−8839）、微工研菌寄第1408号
（FERM BP−1408）」として寄託されている。

本発明においては、バチルス属に属する本発明NAD合
成酵素生産菌としては、上記のバチルス・ステアロサー
モフイラスＨ−804はその一例であつて、この菌株に限
らず、本発明NAD合成酵素を生産する菌はすべて本発明
において使用できる。

また、本発明NAD合成酵素を産生する菌より遺伝子操
作により本発明NAD合成酵素の遺伝情報を担うDNAを分離
し、本発明NAD合成酵素非産生菌にそのDNAを組み込み、
本発明NAD合成酵素生産能を発現せしめるように変異さ
れた変異株を得ることが出来、該変異株より産生された
本発明NAD合成酵素、及び該酵素を用いた被検液中の成
分の測定法も本発明に含まれるものである。

本発明は、本発明NAD合成酵素生産菌を生産する通常
の方法で培養される。培養の形態は液体培養でも固体培
養でもよいが、工業的には深部通気撹拌培養を行うのが
望ましい。

培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられ
るものが広く使用され得る。炭素源としては同化可能な
炭素化合物であればよく、例えばブドウ糖、シヨ糖、乳
糖、麦芽糖、スターチ、デキストリン、糖蜜、廃糖蜜、
グリセリンなどが挙げられる。窒素源としては、利用可
能な窒素化合物であればよく、例えばコーン、スチー
プ、リカー、大豆粉、綿実粉、小麦グルテン、ペプト
ン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加工分解物、硫酸
アンモニウムなどが使用される。その他リン酸塩、マグ
ネシウム、カルシウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛、
鉄、マンガン、ハロゲンなどの塩類が必要に応じて使用
される。

バチルス・ステアロサーモフイラスH804においては培
養温度は、本発明NAD合成酵素生産菌が発育し、本酵素
を生産する範囲内で適宜変更し得るが、48〜70℃、特に
55〜60℃が好ましい。培養時間は培養条件によつて異な
るが、本酵素が最高力価に達する時期を見計つて適当な
時期に培養を終了すればよく、10〜20時間が好ましかつ
た。通気撹拌する場合には、200〜400r.p.mの条件下で
充分である。

このようにして得られたNAD合成酵素生産菌の培養物
から本発明NAD合成酵素を採取するのであるが、本酵素
は主にその菌体内に含有されるので、得られた培養物を
過または遠心分離などの手段により集菌し、この菌体
を超音波処理、フレンチプレス処理やガラスビーズ処理
などの機械的破壊手段やリゾチームなどの酵素的破壊手
段にて破壊し、また必要に応じてトリトンＸ−100（Tri
tonX−100:商品名）、アデカトール SO−120（商品
名）などの界面活性剤を添加してもよい。こうして得ら
れたNAD合成酵素含有液は、濃縮するか、または濃縮す
ることなく、可溶性塩類、例えば硫安などを用いて塩析
するか、親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノー
ル、アセトン、イソプロパノールなどを用いて本酵素を
沈澱させればよい。この沈澱物は、水または緩衝液に溶
解後、必要に応じて半透膜にて透析し、さらにDEAE−セ
フアデツクス、DEAE−セフアロースやDEAE−セルロース
などやカルボキシメチル−セルロース、カルボキシメチ
ル−セフアロース、カルボキシメチル−セフアデツクス
などのイオン交換樹脂を用いるクロマトグラフイーやセ
フアデツクスG200、セフアロースCL−6B、セフアクリル
Ｓ−200などの分子篩剤などのゲル過剤を用いるクロ
マトグラフイーにて精製せしめ、その後必要に応じて安
定化剤を添加し、連結乾燥などの処理により精製された
本酵素を得ることができる。

次に、本発明で得た本発明NAD合成酵素の性質につい
て述べる。

（１）分子量；約50000〔ポリビニルゲル（商品名:GP
C3000SW;東洋曹達社製）のカラム（7.5mmID×60cm）を
用い、標準蛋白質として、アルドラーゼ（ウサギ筋肉,
M.W.150,000）、牛血清アルブミン（M.W.67,000）、オ
ボアルブミン（ニワトリ卵:M.W.45,000）、シトクロム
Ｃ（ウマ心臓,M.W.13.000）を用いた分子篩による。〕（２）等電点;pH5.3付近〔等電点電気泳動用カラム
（LKB社製）、キヤリアーアンフオラインpH3.5〜10.0
（LKB社製）を用い、700V、48時間通電した後、カラム
（2.4×30cm）から2mlずつ分画し、各々の画分のpHと活
性を測定することによる。〕（３）作用；（４）基質特異性；アンモニア（アンモニウムイオン
を含む）に基質特異性を有する。また後記に示す酵素活
性測定法の反応液Ｉの25mM（NH₄）₂SO₄の代わりに、25m
MのＬ−バリン,L−ホモセリン,L−セリン,L−アラニン,
L−メチオニン,L−チロシン,L−スレオニン,L−ロイシ
ン,L−イソロイシン,L−アルギニン,L−フエニルアラニ
ン,L−ヒスチジン,L−アスパラギン,L−グルタミンをそ
れぞれ添加し、後記の酵素活性測定法に従つて活性を測
した結果、（NH₄）₂SO₄の活性を100とした場合の相対活
性は、Ｌ−バリン,L−ホモセリン,L−セリン,L−アラニ
ン,L−メチオニン,L−チロシン,L−スレオニン,L−ロイ
シン,L−イソロイシン,L−アルギニン,L−フエニルアラ
ニン,L−ヒスチジン,L−アスパラギンおよびＬ−グルタ
ミンは共に0.0である。本酵素はアンモニア（アンモニ
ウムイオンを含む）を利用し、少なくとも、Ｌ−バリ
ン,L−ホモセリン,L−セリン,L−アラニン,L−メチオニ
ン,L−チロシン,L−スレオニン,L−ロイシン,L−イソロ
イシン,L−アルギニン,L−フエニルアラニン,L−ヒスチ
ジン,L−アスパラギン,L−グルタミンを利用しない。

（５）至適pH;後記の酵素活性測定法の反応液の緩衝
液をジメチルグルタル酸−水酸化ナトリウム緩衝液（pH
5.0〜7.0）、トリス塩酸緩衝液（pH6.5〜9.0）、グリシ
ン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH8.5〜10.0）に加えて
酵素反応を行つた後、100℃10分間加熱して反応を停止
せしめ、生成したNADの量を測定した結果、第１図の通
りである。pH8.5〜10.0付近に至適pHを有する。

（６） pH安定性；本酵素を50mMのジメチルグルタル酸
−水酸化ナトリウム緩衝液（pH5.0〜7.0）、トリス塩酸
緩衝液（pH6.5〜9.0）、グリシン−水酸化ナトリウム緩
衝液（pH8.5〜10.0）に溶解し、60℃で15分間処理した
後、その残存活性を後記の酵素活性測定法に従つて測定
した結果は、第２図の通りである。pH7.5〜9.0の範囲で
安定である。

（７）熱安定性;50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）に本
酵素を溶解し、各温度で15分間加熱処理した後、その残
存活性を後記の酵素活性測定法に従つて測定した結果
は、第３図の通りである。少なくとも60℃以下では安定
である。

（８）至適温度;50℃,55℃,60℃,65℃,70℃の各温度
において後記の酵素活性測定法の反応液Ｉで10分間反応
せしめ、その後直ちに冷却し、37℃で反応液IIを加え、
後記の酵素活性測定に従つて測定した結果は、第４図の
通りである。60℃付近に至適温度を有する。

さらに、至適温度について、50mM トリス−HCl緩衝
液（pH8.0）に本酵素を溶解したものを用いて、50℃、5
5℃、60℃、65℃、70℃および75℃の各温度において後
記の酵素活性測定法（なお、後記の場合にはシグマ社製
の純度90％デアミド−NADを用いたが、本測定ではオリ
エンタル酵母社製の純度99％デアミド−NADを用いた）
の反応液Ｉで10分間反応せしめ、その後直ちに冷却し、
37℃で反応液II（なおEDTAは50mMとした。またジアホラ
ーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼは同一社製を用
いたがロットは異なる）を加え、後記の酵素活性測定法
に従って活性測定した結果、70℃の場合の活性を100％
としたときの相対活性は、50℃のときに43％、55℃のと
きに62％、60℃のときに78％、65℃のときに94％および
75℃のときに81％であり、このことから、至適温度は70
℃付近と判断された。以上のことから、本酵素の活性測
定法は、用いるデアミド−NADの純度やジアホラーゼお
よびアルコールデヒドロゲナーゼのロット差によって影
響を受け、さらにはEDTAの濃度によって影響を受けたも
のと推定され、酵素自体の性質の差異のものとは認めら
れない。

（９）活性化及び活性阻害物質；後記の酵素活性測定
法の反応Ｉに第１表に記載の金属イオンの場合は5mM、E
DTAの場合は20mM、界面活性剤の場合は0.1％濃度となる
ように添加し、酵素活性測定法に従つて活性を測定し
た。その結果は第１表の通りである。Ni⁺⁺イオンとし
て、NiCl₂（5mM）で強い阻害を受け、20mMEDTAでは全く
活性が出現しない。

また、後記の酵素活性測定法に用いる試薬の中で、Mg
⁺⁺イオンとしてMgCl₂（5mM）を含有せしめない条件下、
MnCl₂（3mM）添加せしめ、後記酵素活性測定法に準じて
活性を行つた結果、MgCl₂（5mM）添加反応液を用いる場
合と比較して、MnCl₂（3mM）添加反応液を用いた場合
は、150％の相対活性を示す。

（10）酵素活性測定法活性測定法反応液I0.3mlを小試験管にとり、37℃に加温後酵素液
50μを添加し、37℃で正確に10分間反応を行い、0.7m
lの反応液IIを添加し、反応を停止するとともにサイク
リング反応を開始した。サイクリング反応は37℃で正確
に５分間行い、0.1NHCl2.0mlを添加によりサイクリング
反応を停止後550nmにおける吸光度を測定してそのとき
の値より酵素活性を求めた。なお活性の計算式は次の式
に順じた。

△A550:検体の吸光度 △S550:標準液の吸光度（0.1mM NAD） 0.005:検体量（ml） 10:反応時間 f:稀釈倍率本発明における反応系を要約すると次の通りである。

本発明の被検液としては、少なくとも前記の反応系の
ATP、デアミド−NADおよびアンモニア（アンモニウムイ
オンも含む）のいずれか１つの被検成分を含有するもの
であればよく、例えば被検成分のうちの１つの成分を予
め含有してなる被検液や、他の酵素反応系により生成ま
たは消費された被検成分を含有する被検液が挙げられ
る。

上記の酵素反応系の好ましい例としてはATP、デアミ
ド−NAD、NH₃（アンモニウムイオンも含む）を消費また
は生成し、NAD、還元型NADなどの補酵素の関係しない酵
素反応系のもの、例えば下記の酵素反応系が例示される
が、何ら本発明の対象を限定するものではない。

（１）ATPを生成する酵素反応系クレアチンキナーゼ（E.C.2.7.3.2）還元剤；β−メルカプトエタノール、還元型グルタチオ
ン、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、ジチオスレ
イトールなど。

ピルベートキナーゼ（E.C.2.7.1.40）アセテートキナーゼ（E.C.2.7.2.1）カルバメートキナーゼ（E.C.2.7.2.2）アスパルテートキナーゼ（E.C.2.7.2.4）ホスホグリセレイトキナーゼ（E.C.2.7.2.3）アルギニンキナーゼ（E.C.2.7.3.3）（２）NH₃を放出し得る水溶性アンモニウム塩またはNH₃
を利用する酵素反応系水溶性アンモニウム塩としては、塩化アンモニウム、
アンモニア水、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、
酢酸アンモニウム、クエン酸アンモニウムなどのアンモ
ニウムイオンを放出できる無機または有機アンモニウム
塩が例示される。

ニコチンアミダーゼ（E.C.3.5.1.19）ニコチンアミド＋H₂O→ニコチン酸＋NH₃＋H⁺ グルタミル−ペプチド−グルタミナーゼ（E.C.3.5.1.
44）Ｌ−グルタミニル−ペプチド＋H₂O→Ｌ−グルタミニル
−ペプチド＋NH₃ アルギニンデアミナーゼ（E.C.3.5.3.6）Ｌ−アルギニン＋H₂O→シトサリン＋NH₃＋H⁺ グアニンデアミナーゼ（E.C.3.5.4.3）グアニン＋H₂O→キサンチン＋NH₃＋H⁺ アデノシンデアミナーゼ（E.C.3.5.4.4）アデノシン＋H₂O→イノシン＋NH₃＋H⁺ クレアチニンデアミナーゼ（E.C.3.5.4.21）クレアチニン＋H₂O→Ｎ−メチルヒダントイン＋NH₃＋H⁺ スレオニンデヒドラーゼ（E.C.4.2.1.16）Ｌ−スレオニン＋H₂O→２−オキソ酪酸＋CO₂＋NH₃＋H⁺ アスパラギン酸アンモニア−リパーゼ（E.C.4.3.1.
1）Ｌ−アスパラギン酸→フマル酸＋NH₃＋H⁺ Ｌ−メチオニンγ−リアーゼ（E.C.4.4.1.11）Ｌ−メチオニン＋H₂O→２−オキソ酪酸＋メタンチオー
ル＋NH₃＋H⁺ メチルアミノグルタミン酸メチルトランスフエラーゼ
（E.C.2.1.1.21）Ｎ−メチルグルタミン酸＋NH₃＋H⁺グルタミン酸＋メ
チルアミン（３）本酵素反応で生成したAMPの測定を特徴とする被
検液中のデアミノ−NAD,NH₃（アンモニウムイオンも含
む）の測定は例えば下記の酵素反応系が例示される。

アデニレイトキナーゼ（E.C.2.7.4.3） AMP＋ATPADP＋ADP ピルビン酸キナーゼ（E.C.2.7.1.40） ADP＋ホスホエノールピルビン酸ATP＋ピルビン酸ピルビン酸オキシダーゼ（E.C.1.2.3.3）ピルビン酸＋Pi＋O₂＋H₂Oアセチル酸＋CO₂＋H₂O₂ 生成したH₂O₂をペルオキシダーゼの存在下に測定する
ことによる被検液中のNH₃（アンモニウムイオンも含
む）デアミノ−NADの測定乳酸デヒドロゲナーゼ（E.C.1.1.1.27）ピルビン酸＋NADH＋H⁺→Ｌ−乳酸＋NAD 過剰の乳酸デヒドロゲナーゼとNADH共存下でNADHの酸
化によるA₃₄₀の減少を測定本発明においては、上記に例示した酵素反応系で消費
あるいは生成されたATP、NH₃を含有する反応系に限ら
ず、上記酵素反応系で用いた酵素の活性測定、消費され
た基質または生成された生成物を定量するための反応液
も被検液として使用し得る。

これらの酵素反応系におけるATP、NH₃の定量目的は酵
素反応における酵素の活性測定や用いられる他の成分の
いずれか１つの成分の測定のために行われるものであ
る。この酵素反応系においては、測定すべき成分以外は
試薬として一定量用いればよい。この場合における測定
されるべき被検液や試薬の量は測定すべき目的や選択す
る条件によつて適宜設定変更すればよく、特に限定され
るものではない。

さらに本発明のNAD合成酵素を用いて生成されたNADを
補酵素とする酸化還元反応系としては、例えばNADを消
費して還元型NADを生成する反応を形成するデヒドロゲ
ナーゼ（E₁）およびその基質（S₁）による反応系や、NA
DとNADPの両方を補酵素とすることのできるデヒドロゲ
ナーゼ（E₁）およびその基質（S₁）による反応系を用い
ることができる。上記のデヒドロゲナーゼは特に限定さ
れることはないが、少なくともNADを補酵素として消費
するものであればよく、かつ過剰量用いる特定の基質に
作用して還元型NADを生成すればデヒドロゲナーゼであ
ればいかなる起源の酵素であつてもよい。これらの酵素
およびその基質の例としては「酵素ハンドブツク」に記
載されている。例えば、ラクテートデヒドロゲナーゼ
（EC.1.1.1.27）およびＬ−ラクテート、グリセロール
デヒドロゲナーゼ（EC.1.1.1.6）およびグリセロール、
グリセロール−３−ホスフエートデヒドロゲナーゼ（E
C.1.1.1.8）およびグリセロール−３−ホスフエート、
グルコースデヒドロゲナーゼ（EC.1.1.47）およびグル
コース、マレートデヒドロゲナーゼ（EC.1.1.1.37）お
よびＬ−マレート、グルタメイトデヒドロゲナーゼ（E
C.1.4.1.2）およびＬ−グルタメイト、３−α−ヒドロ
キシステロイドデヒドロゲナーゼ（EC.1.1.1.50）およ
び３−α−ヒドロキシステロイドが挙げられる。

これらの酸化還元反応に使用する酵素量は、酵素力
価、基質の種類および補酵素サイクリング率によつて異
なる。基質量は、１サイクル毎に１モル比の基質を消費
してなるもので、サイクリングする補酵素より比較にな
らない程はるかに多いモル量が使用されるので、通常単
位時間当りのサイクル数および反応時間に基いて決定す
ればよい。また、その酸化還元酵素の反応速度が最大を
示すような濃度以上であればよい。通常0.1mMないし100
mMの濃度範囲で存在し得る。

還元型NADを補酵素とする反応系としては、少なくと
も還元型NADを消費してNADを生成する作用物質（E₂）お
よびその基質（S₂）の反応系が挙げられ、その作用物質
の反応系としては、少なくとも還元型NADを消費してNAD
を生成する酸化還元酵素およびその基質の反応系や、電
子伝達物質およびテトラゾリウム塩の反応系が挙げられ
る。

補酵素サイクリング反応系 NADを補酵素とする酸化還元反応系； NADHを補酵素とする転移反応系； NH₃:アンモニアの正１価のアンモニウムイオンを包含す
る。

E₁:NADおよびS₁を基質として消費して、還元型NADおよ
びP₁を生成する反応を触媒するデヒドロゲナーゼ。

E₂:還元型NADおよびS₂を消費して、NADおよびP₂を生成
する反応を触媒する作用物質。

S₁:E₁の還元型基質。

S₂:E₂の酸化型基質。

P₁:S₁の酸化生成物。

P₂:S₂の還元生成物。

NH₃を利用する場合の反応系を式で示すと以下の通り
である。

還元型NADを消費してNADを生成する酸化還元酵素とし
ては、少なくとも還元型NADを補酵素とし、過剰量用い
る特定の基質（S₂）に作用してNADおよびS₂の還元型生
成物（P₂）を生成するデヒドロゲナーゼ、または少なく
とも還元型NADを補酵素とし、チトクローム、ジスルフ
イド化合物、キノンおよびその類緑体等を受容体とする
還元型NAD:受容体酸化還元酵素であればそのいずれでも
良く、その起源も限定されることはない。これらの酵素
およびその基質または受容体の例としては、「酵素ハン
ドブツク」に記載されている。デヒドロゲナーゼおよび
その基質の例としては、ラクテートデヒドロゲナーゼ
（EC.1.1.1.27）およびピルビン酸、アルコールデヒド
ロゲナーゼ（EC.1.1.1）およびアセトアルデヒド、グリ
セロールデヒドロゲナーゼ（EC.1.1.1.6）およびジヒド
ロキシアセトンが挙げられる。またNADH:受容体酸化還
元酵素としては、チトクローム_５レダクターゼ（EC.1.
6.2.2）、ジアホラーゼ（EC.1.6.4.3）などが挙げられ
る。受容体としては、メチレン・ブルー、フラビン類、
キノン類、2,6−ジクロロフエノールインドフエノール
などが挙げられる。

還元型NAD:受容体酸化還元酵素および受容体の組合せ
は、還元型NADを補酵素としてなる酵素および電子受容
体となり得るものであれば特に限定されない。好ましい
組合せとしては、ジアホラーゼ（EC.1.6.4.3）およびテ
トラゾリウム塩、およびメチレン・ブルー、NADデヒド
ロゲナーゼ（EC.1.6.99.3）およびチトクロームＣなど
が挙げられる。使用濃度は通常0.05〜100U/mlの範囲で
存在し得る。テトラゾリウム塩の使用濃度は、テトラゾ
リウム塩および究極的に形成されるホルマザンの双方の
水溶性がむしろ限定されるが、通常は試薬1ml当り１μ
ｇから100μｇの温度範囲で存在し得る。

電子伝達物質としては、還元型NADをNADに酸化する能
力を有し、しかも補酵素サイクリング反応に悪影響を及
ぼさないような物質、例えばフエナシンメタルサルフエ
ート、メルドーラ・ブルー、ピロシアニンなどが挙げら
れる。使用濃度は、サイクリング率に応じて設定すれば
よいが、通常反応液11ml当り５μｇ〜0.5mgの濃度範囲
で存在し得る。

上記のサイクリング反応は、通常室温ないし37℃付近
の温度、好ましくは30〜37℃の温度で行われる。反応時
間は、特に限定されるものでなく、通常１分以上、好ま
しくは５分以上行なえばよい。予定された時間の終りで
反応を迅速に停止するには、酸例えば酸塩、リン酸など
を添加することにより行われる。

サイクリング反応を行つた後、このサイクリング反応
において消費または生成される部分を定量するのである
が、生成する部分としてはE₁の還元型基質（S₁）の酸化
生成物（P₁）またはE₂の酸化型基質（S₂）の還元生成物
（P₂）を対象とすればよく、消費される部分としてはE₁
の還元型基質（S₁）またはE₂の酸化型基質（S₂）を対象
とすればよく、これらのP₁、P₂、S₁、S₂のいずれか１つ
の成分の量を定量すればよい。簡単には、基質の状態で
は無色であり、生成物の状態にて呈色または螢光を呈す
る吸光波長を変化する場合の生成物の定量手段を用いる
ことである。例えばテトラゾリウム塩を基質（S₂）とし
て、生成するホルマザンを還元生成物（P₂）とせしめ
て、このホルマリンを比色定量してなるものである。さ
らにフラビン類やキノン類を基質（S₂）として用いた場
合には、それらの基質（S₂）の消費量をその特有の吸光
波長に基いて吸光度測定して定量すればよい。

上記反応において、テトラゾリウム塩から形成される
ホルマザンの沈澱の防止をたすけるために界面活性剤を
添加することが好ましい。界面活性剤としては、トリト
ンＸ−100、アデカトールSO−145などの非イオン界面活
性剤が挙げられる。使用濃度は試薬に対し、0.01〜３％
の濃度範囲で存在し得る。この界面活性剤の添加によ
り、測定値の感度の上昇とホルマザンの色素の安定化を
はかることができる。

生じたホルマザン色素の比色定量は、ホルマザンの特
異的吸光波長にて吸光度（OD）を測定すればよく、例え
ば500〜550nmの波長により吸光度を測定して、被測定物
質の定量を行うことができる。

本発明によれば、エンド・ポイント法だけでなく、レ
イト法、ドライケミカル法（フイルム法、固定化法）も
可能である。

〔発明の効果〕

本発明は、本発明NAD合成酵素を用いて被検液中のAT
P、デアミド−NADおよびアンモニアまたはアンモニウム
イオンのいずれか１つの成分の定量に利用できるもの
で、特に被検液中のアミノ酸の影響を受けることなくア
ンモニア（アンモニウムイオンも含む）の測定を可能な
らしめるものである。かつ好ましい態様としての本発明
NAD合成酵素の熱安定性において60℃まで安定であると
の耐熱性酵素である点からも前記の各種分析において有
用なものである。

〔実施例〕

次いで本発明の実施例を挙げて具体的に述べるが、本
発明はこれによつて何んら限定されるものではない。

実施例１製法 50容ジヤーにペプトン１％，グルコース0.5％,K₂HP
O₄0.05％,NaCl0.05％,MgSO₄・7H₂O0.05％を含む液体培
地（pH7.6）40を仕込み、120℃ 20分間滅菌後、上記
と同一組成の培地で予備培養したバチルス・ステアロサ
ーモフイラス（Bacillus stearothermophilus）Ｈ−804
の種菌200mlを接種し、60℃で10時間、通気量40/min,
撹拌速度150r.p.m.で通気培養した。培養後遠心分離に
て集菌し、菌体を0.1％リゾチームを含有する10mMトリ
ス塩酸緩衝液（pH8.0）500mlに分散させ、37℃で30分間
反応を行い、溶菌した。この液を5000r.p.m.10分間遠心
し、上清液450mlを得た。この上清液に硫安を添加し硫
安分画（0.5〜0.71飽和）を行い、この沈澱を10mMトリ
ス塩酸緩衝液50mlに溶解（2/U）し、この緩衝液５に
対して透析した。この透析物中に生じた不溶物を遠心分
離（15000r.p.m.,10分間）にて除去した。上清液（20
U）を10mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0）で緩衝化したDEAE
−セフアロースCL−6Bカラム（2.5×5cm）にチヤージ
し、０〜0.5M NaClの濃度勾配法にて溶出した。0.25〜
0.3M NaClで溶出される画分を集め（80ml,16.5U）アミ
コン社製セントリフローメンブランコーンCF25を用い濃
縮した後、セフアデツクスＧ−100（3.6×80cm）にて精
製を行い、その活性画分を集め、精製標品（50ml 14
U）とした。

実施例２検体中のATPの測定反応液Ｉ 50mM トリス塩酸緩衝液（pH8.0） 10mM KCl 5mM MgCI₂ 0.05％牛血清アルブミン 1mM デアミノ−NAD 50mM （NH₄）₂SO₄ 100mU 本発明NAD合成酵素1ml 反応液II 50mM トリス塩酸緩衝液（pH8.0） 10U ジアフオラーゼ（東洋醸造（株）製バチルス菌由来）３％エタノール 10U アルコールデヒドロゲナーゼ（東洋紡績製イースト菌由来） 0.025％ニトロテトラゾリウムブルー 0.1％ TritonX−100 15mM EDTA 反応液Ｉ 0.3mlを小試験管にとり、37℃に加温後0,1
0,20,30,40μＭのATP溶液をそれぞれ５μ添加し、37
℃で10分間反応した後、反応液IIを0.7ml添加し、37℃
で正確に５分間反応したのち、0.1NHCl2.0mlを加えて反
応を停止し、550nmで吸光度測定した。その結果は第５
図に示す通りで良好な直線性が得られた。

実施例３アンモニウムイオンの測定実施例２に示した反応液Ｉ中の50mM（NH₄）₂SO₄の代
わりに5mM ATPを添加した反応液に0,5,10,15,20μＭの
（NH₄）₂SO₄溶液を５μ添加し、実施例２と同様の操
作を行つた。その結果は第６図に示す通りで良好な直線
性が得られた。

実施例４クレアチニンの測定反応液Ｉ 50mM トリス塩酸緩衝液（pH8.0） 10mM KCl 5mM MgCl₂ 1mM ATP 0.05％牛血清アルブミン 1mM デアミノ−NAD 20U/ml クレアチニンデイミナーゼ（コダツク社製） 100mU/ml 本発明NAD合成酵素反応液Ｉ 0.3mlを小試験管にとり、37℃に加温後1,
2,3,4mg/dlのクレアチニン溶液を10μ添加し、実施例
２と同様の操作を行つた。その結果は第７図に示す通り
良好な直線性が得られた。

実施例５アンモニウムイオンの測定法 50mM トリス塩酸緩衝液 pH8.0 10mM KCl 5mM MgCl₂ 1mM ATP 0.05％牛血清アルブミン 1mM デアミド−NAD 100mU/ml 本発明NAD合成酵素上記反応液1mlを小試験管にとり、37℃に加温後0,25,
5.0,7.5,10.0mMの（NH₄）₂SO₄溶液をそれぞれ10μ添
加し、37℃で20分間反応した後に340nmで吸光度測定し
た。その結果は第８図に示すとおりで良好な直線が得ら
れた。

実施例６生成したAMPの測定反応液Ｉ 50mM トリス塩酸緩衝液（pH8.0） 10mM KCl 5mM MgCl₂ 1mM ATP 0.05％牛血清アルブミン 0.05％トリトンＸ−100 1mM デアミド−NAD 10U/ml ミオキナーゼ(Sigma社製バチルス菌由来) 10U/ml ピルビン酸キナーゼ（Sigma社製バチルス菌由来） 10mM ホスホエノールピルビン酸 100mU/ml 本発明NAD合成酵素反応液II 50mM リン酸緩衝液（pH8.0） 100mU/ml ピルビン酸オキシダーゼ（Sigma社製ベデイオコツカス菌由来） 100mU/ml ペルオキシダーゼ（Sigma社製） 0.2％フエノール 0.3％４−アミノアンチピリン上記反応液Ｉ 1mlを小試験管にとり、37℃に加温
後、0,0.5,1.0,1.5,2.0mMの（NH₄）₂SO₄溶液をされぞれ
10μ添加し、37℃ 30分間反応した後に反応液IIを0.
1ml添加し、37℃ 30分間反応した後に500nmで吸光度を
測定した。その結果は第９図に示すとおりで良好な直線
が得られた。

実施例７デアミド−NADの測定反応液 50mM トリス塩緩衝液（pH8.0） 10mM KCl 5mM MgCl₂ 0.05％牛血清アルブミン 50mM （NH₄）₂SO₄ 1mM ATP 100mU/ml 本発明NAD合成酵素３％エタノール 10U アルコールデヒドロゲナーゼ 0.1％ TvitonX−100 反応液1mlを小試験管にとり、37℃に加温後0,2.5,5,1
0mMのデアミド−NAD溶液をそれぞれ10μ添加し、37℃
で30分間反応した後に340nmで吸光度測定した。その結
果は第10図に示すとおりで良好な直線が得られた。

実施例８金属イオンの至適濃度反応液Ｉ 50mM トリス−HCl緩衝液 pH8.0 10mM KCl 0.05％牛血清アルブミン 2mM ATP 0.5mM デアミド−NAD 25mM （NH₄）₂SO₄ 反応液II 50mM トリス−HCl緩衝液 pH8.0 10U ジアホラーゼ1ml（東洋醸造製バチルス属生産菌由来）３％エタノール 10U アルコールデヒドロゲナーゼ 1ml（東洋紡績製イースト菌由来） 0.025％ NTB（ニトロテトラゾリウムブルー） 0.1％ TritonX−100（商品名） 10mM EDTA 反応液Ｉに、それぞれM₂Cl₂ 0.25mM,0.50mM,0.75mM,
1mM,2mM,3mM,4mM,MnCl₂ 0.25mM,0.50mM,0.75mM,1mM,2m
M,3mM,4mM添加し、それぞれ、酵素活性測定法に従つて
活性を測定し、その相対活性を、MgCl₂添加区を第11図,
MnCl₂添加区を第12図に示す。その結果、MnCl₂添加区に
おいては3mMで至適濃度を示した。

【図面の簡単な説明】第１図は本発明NAD合成酵素の至適pH曲線、第２図は同
酵素のpH安定曲線、第３図は同酵素の熱安定性曲線、第
４図は同酵素の至適温度曲線、第５図は本発明における
ATPの定量曲線、第６図は550nmの吸光度測定によるアン
モニアの定量曲線、第７図はクレアチニンの定量曲線、
第８図は340nmの吸光度測定によるアンモニアの定量曲
線、第９図は生成したAMPを測定することによるアンモ
ニアの定量曲線、第10図はデアミド−NADの定量曲線、
第11図はMgCl₂添加濃度に対する至適添加曲線、第12図
はMnCl₂添加濃度に対する至適添加曲線を示すものであ
る。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】少なくともMgイオンまたはMnイオンの存在
下、下記の式（ａ）の酵素反応を触媒し、Mgイオンの存
在下、下記の式（ｂ）の酵素反応を触媒せず、アンモニ
アおよび／またはアンモニウムイオンを基質として利用
し、かつ少なくともグルタミンおよびアスパラギンを基
質として利用しない下記の理化学的性状を特徴とするNA
D合成酵素。（理化学的性状）（ａ）分子量:50,000±5000〔ピリビニールゲル（商品
名:GPC3000SWカラム；東洋曹達社製）を用いた分子篩に
よる〕（ｂ）至適pH:pH8.5〜10.0 （ｃ）pH安定性:pH7.5〜9.0（60℃、15分間処理）（ｄ）熱安定性:60℃以下（pH8.0、15分間処理）
【請求項２】バチルス属に属し、少なくともMgイオンま
たはMnイオンの存在下、下記の式（ａ）の酵素反応を触
媒し、Mgイオンの存在下、下記の式（ｂ）の酵素反応を
触媒せず、アンモニアおよび／またはアンモニウムイオ
ンを基質として利用し、かつ少なくともグルタミンおよ
びアスパラギンを基質として利用しない下記の理化学的
性状を特徴とするNAD合成酵素生産菌を培地に培養し、
培養物より該DAD合成酵素を採取することを特徴とするD
AD合成酵素の製造法。（理化学的性状）（ａ）分子量:50,000±5000〔ピリビニールゲル（商品
名:GPC3000SWカラム；東洋曹達社製）を用いた分子篩に
よる〕（ｂ）至適pH:pH8.5〜10.0 （ｃ）pH安定性:pH7.5〜9.0（60℃、15分間処理）（ｄ）熱安定性:60℃以下（pH8.0、15分間処理）
【請求項３】バチルス属に属し、少なくともMgイオンま
たはMnイオンの存在下、下記の式（ａ）の酵素反応を触
媒し、Mgイオンの存在下、下記の式（ｂ）の酵素反応を
触媒せず、アンモニアおよび／またはアンモニウムイオ
ンを基質として利用し、かつ少なくともグルタミンおよ
びアスパラギンを基質として利用しないNAD合成酵素生
産菌が、バチルス・ステアロサーモフィラスに属する該
NAD合成酵素生産菌である特許請求の範囲第２項記載の
製造法。
【請求項４】バチルス・ステアロサーモフィラスに属す
る該NAD合成酵素生産菌が、バチルス・ステアロサーモ
フィラスＨ−804（FERMP−8839、FERM BP−1408）であ
る特許請求の範囲第３項記載の製造法。