DE3789181T2

DE3789181T2 - Eine neue NAD-Synthetase benutzende Testmethode und Verfahren zur Herstellung des Enzyms.

Info

Publication number: DE3789181T2
Application number: DE3789181T
Authority: DE
Inventors: Shigeyuki Imamura; Kazuo Matsuura; Hideo Misaki; Mamoru Takahashi
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1986-09-10
Filing date: 1987-09-10
Publication date: 1994-06-01
Anticipated expiration: 2007-09-11
Also published as: DE3752238D1; EP0260137B1; EP0260137A3; DE3789181D1; DE3752238T2; US4921786A; EP0260137A2

Description

Die Erfindung betrifft eine NAD-Synthetase, ein Verfahren zu deren Produktion und einen Mikroorganismus, der bei dem Verfahren verwendet werden kann.
Insbesondere betrifft die Erfindung eine NAD-Synthetase (nachstehend manchmal als erfindungsgemäße NAD-Synthetase bezeichnet), die mindestens die nachstehend definierte Reaktion (a) in Gegenwart von Mg&spplus;&spplus;- oder Mn&spplus;&spplus;-Ionen katalysiert und die die nachstehend definierte Reaktion (b) in Gegenwart von Mg&spplus;&spplus;-Ionen nicht katalysiert, Ammoniak einschließlich Ammoniumionen verwertet und Glutamin und Asparagin nicht verwertet, ein Verfahren zu deren Produktion und ein Verfahren zur Untersuchung einer Probe auf ATP, Desamido-NAD und Ammoniak einschließlich Ammoniak in der Form eines Ammoniumions durch Inkubieren der Probe mit der erfindungsgemäßen NAD-Synthetase.
(a) ATP + Desamido-NAD + NH&sub3; AMP + PPi + NAD
(b) ATP + Desamido-NAD + L-Gln + H&sub2;O AMP + PPi + NAD + L-Glu
NAD-Synthetasen kommen bekanntlich in Rattenleber [J. Biol. Chem. 233, 493-500 (1958)], Schweineleber [ebda., 236, 525- 530 (1961)], Hefe [ebda., 247, 4794-4802 (1972)] und E. Coli [ebda., 236, 1494-1497 (1961) und 242, 385-392 (1967)] vor.
Diese NAD-Synthetasen werden klassifiziert als NAD-Synthetasen (EC 6.3.1.5), die die Reaktion:
ATP + Desamido-NAD + NH&sub3; AMP + PPi + NAD
katalysiert, und als NAD-Synthetase (EC 6.3.5.1), die die Reaktion:
ATP + Desamido-NAD + L-Gln + H&sub2;O AMP + PPi + NAD + L-Glu
katalysiert.
Diese NAD-Synthetasen verwerten NH&sub3; oder ein Amid von L-Gln und werden durch ihre Hemmwirkung auf Azaserin unterschieden.
Die Km-Werte der NAD-Synthetase (EC 6.3.1.5) betragen 6,5 · 10&supmin;&sup5; M (NH&spplus;&sub4;) und 1,6 · 10&supmin;² M (L-Gln) [J. Biol. Chem. 1494- 1497 (1961), ebda., 242, 385-392 (1967)], und die Km-Werte der NAD-Synthetase (EC 6.3.5.1) betragen 6,4 · 10&supmin;&sup8; M (NH&spplus;&sub4;) und 5 · 10&supmin;&sup8; M (L-Gln) [J. Biol. Chem. 247, 4794-4802 (1982), ebda. 233, 493-500 (1958)].
Ein Assayverfahren für die NAD-Synthetase wurde beschrieben, in dem das erzeugte NAD durch Alkoholdehydrogenase (EC 1.1.1) reduziert wird und die Absorption des erzeugten und reduzierten NADs (nachstehend als NADH bezeichnet) spektrophotometrisch bei 340 nm gemessen wird oder die Menge an erzeugtem NAD fluorimetrisch gemessen wird.
Die Erfinder beschrieben ein Assayverfahren auf eine Komponente in einer Probe, wobei die Komponente ATP, Desamido- NAD oder ein Amiddonor, wie NH&sub3;, L-Glutamin oder L-Asparagin, ist, bei dem man als Hauptreaktionsstufe die Probe mit der bekannten NAD-Synthetase (EC 6.3.1.5 oder EC 6.3.5.1) in Gegenwart von ATP, Desamido-NAD, einem Amiddonor und Mg&spplus;&spplus; inkubiert, wodurch NAD erzeugt wird, eine Coenzym-Cyclisierungsreaktion durch Kombination des Oxidations-Reduktions-Reaktionssystems mit dem Coenzym NAD und des Oxidations-Reduktions-Reaktionssystems mit dem Coenzym "reduziertes NAD" durchführt und die Menge einer in der Cyclisierungsreaktion erzeugten oder verbrauchten Komponente mißt (JP-A-59-198995).
Wie erklärt verwertet die bekannte NAD-Synthetase das Amiddonorsubstrat L-Glutamin. Eine NAD-Synthetase, die mindestens die vorstehend definierten Reaktionen (a) in Gegenwart von Mg&spplus;&spplus;- oder Mn&spplus;&spplus;-Ionen katalysiert und die vorstehend definierte Reaktion (b) in Gegenwart von Mg&spplus;&spplus;-Ionen nicht katalysiert, Ammoniak einschließlich Ammoniumionen verwertet und Glutamin und Asparagin nicht verwertet, ist nicht bekannt. Ferner besitzt die bekannte NAD-Synthetase eine Substratspezifität für L-Glutamin, und so kann NH&sub3; in Gegenwart von L-Glutamin nicht gemessen werden.
Es wurde gefunden, daß Bacillus sp. H-804, isoliert aus einer Bodenprobe aus einer Heißwasserquelle bei Tanoyu-machi, Beppu-shi, Oita-ken, Japan, die erfindungsgemäße NAD-Synthetase produziert.
Die Erfindung betrifft eine NAD-Synthetase mit folgenden Eigenschaften:
(1) Wirkung:
sie katalysiert mindestens in Gegenwart von Mg&spplus;&spplus;- oder Mn&spplus;&spplus;-Ionen die Reaktion (a):
(a) ATP + Desamido-NAD + NH&sub3; AMP + PPi + NAD
und katalysiert nicht in Gegenwart von Mg&spplus;&spplus; -Ionen die Reaktion (b):
(b) ATP + Desamido-NAD + L-Gln + H&sub2;O AMP + PPi + NAD + L-Glu

(2) Substratspezifität:

sie verwertet Ammoniak einschließlich Ammoniak in Form von Ammoniumionen als Substrat, aber verwertet nicht Glutamin oder Asparagin als Substrat;
(3) pH-Optimum: pH 8,5-10,0;
(4) pH-Stabilität: pH 7,5-9,0 (bei 60ºC, 15 min);
(5) Temperatur-Optimum: etwa 60ºC;
(6) Hitzestabilität: unter 60ºC (bei pH 8,0, 15 min);
(7) isoelektrischer Punkt: etwa pH 5,3; und
(8) Molekulargewicht: 50.000 ± 5.000 (Molekülsieb unter Verwendung eines Polyvinylgels)
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Produktion einer vorstehend definierten NAD-Synthetase, bei dem man Bacillus stearothermophilus H-804 (FERM BP-1408) oder eine Mutante davon mit der Fähigkeit, die NAD-Synthetase zu produzieren, züchtet und diese produzierte NAD-Synthetase isoliert.
Die Erfindung betrifft weiterhin Bacillus stearothermophilus H-804 (FERM BP-1408) oder eine Mutante davon, mit der Fähigkeit zur Produktion der vorstehend definierten NAD- Synthetase.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Kultur von Bacillus stearothermophilus H-804 (FERM BP-1408) oder eine Mutante davon, mit der Fähigkeit zur Produktion der vorstehend definierten NAD-Synthetase in einem Kulturmedium, umfassend eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff, eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff und Mineralsalze, das frei von anderen Mikroorganismen ist.
Die Zeichnungen erläutern verschiedene Eigenschaften des Gegenstands der Erfindung und sind in den Beispielen und dem Absatz, der die Eigenschaften der erfindungsgemäßen NAD-Synthetase beschreibt, näher erläutert. Doch wird nachstehend eine kurze Erklärung der Figuren angegeben.
Fig. 1: pH-Optimum der NAD-Synthetase;
Fig. 2: pH-Stabilität der NAD-Synthetase;
Fig. 3: Hitzestabilität der NAD-Synthetase;
Fig. 4: Temperatur-Optimum der NAD-Synthetase.
Die taxonomischen Eigenschaften des Stammes H-804, der die erfindungsgemäße NAD-Synthetase produziert, sind wie folgt

A. Morphologische Eigenschaften:

Beobachtet unter einem Mikroskop auf einem Nähragar-Schrägmedium bei 50ºC bei 1- bis 3tägiger Züchtung.
1. Form und Anordnung: runde Kanten, gerade oder leicht gekrümmte Stäbchen, einzelne oder binäre Ketten.
2. Größe: 0,5 bis 1,0 · 1,6 bis 5,5 um.
3. Beweglichkeit: beweglich durch peritriche Flagellen.
4. Sporen: zentrale oder subterminale Formen, 0,8 bis 1,0 · 1,0 bis 1,5 um, aufquellende Sporangien.

B. Wachstum auf verschiedenen Medien (bei 50ºC):

1. Nähragarplatte: gräuliche bis blaß gelblich-weiße und semitransparente Kolonien, lineares Wachstum, schwaches Wachstum. Keine Bildung eines löslichen Pigments.
2. Schrägnähragar: gräuliche bis blaß-gelbliche und semitransparente, runde glatte Kolonien. Keine Bildung eines löslichen Pigments.
3. Bouillonagar: gleichförmig trüb, gutes Wachstum. Nach 2 bis 3 Tagen Präzipitatbildung
4. BCP-Milch: keine Veränderungen

C. Physiologische Eigenschaften (+: positiv, -: negativ):

Gram-Färbung +
KOH-Reaktion -
Säurefeste Färbung -
Verkapselung -
anaerobes Wachstum -
Katalasebildung + (schwach)
Oxidasebildung + (schwach)
Ureasebildung
(SSR-Medium) -
(Chris.-Medium) -
Lecithinasebildung kein Wachstum
Gelatinehydrolyse +
Stärkehydrolyse +
Caseinhydrolyse +
Äsculinhydrolyse +
Argininhydrolyse -
Cellulosehydrolyse -
Indolbildung -
H&sub2;O&sub2;-Bildung + (Bleiacetatpapier)
Acetoninbildung -
MR-Test -
Nitratreduktion -
Wachstum auf Medium
ohne NaCl-Zusatz +
Wachstum auf Medium
mit 0,1% NaCl-Zusatz +
Wachstum auf Medium
mit 0,25% NaCl-Zusatz +
Wachstum bei 65ºC +
Wachstum bei 50ºC +
Wachstum bei 37ºC -
Wachstum bei pH 9,0 -
Wachstum bei pH 8,0 +
Wachstum bei pH 5,6 +
Wachstum bei pH 4,8 -
Säurebildung aus Zucker* (keine Gasbildung):
Adonit - D-Mannose +
L(+)Arabinose + Melezitose +
Cellobiose + Melibiose +
Dulcit - Raffinose +
meso-Erythrit - Rhamnose -
D-Fructose - D-Ribose +
Fucose - Salicin -
D-Galactose + L-Sorbose -
D-Glucose + Sorbit -
Glycerin + Stärke +
Inosit - Saccharose +
Inulin - Trehalose +
Lactose + D-Xylose
Maltose -
D-Mannit
OF-Test (Hugh-Leifson-Medium) NT (keine Änderung)
OF-Test (modifiziert)** O (Oxidation)
* Grundmedium: (mit Zucker versetztes Ammoniummedium) (ASS)
(NH&sub4;)&sub2;HPO&sub4; 1,0 g KCl 0,2 g
MgSO&sub4; · 7H&sub2;O 0,2 g Hefeex. 1,0 g
Agarose 3,0 g BTB 0,02 g
Destilliertes Wasser 1000 ml pH 7,0
** modifiziertes Medium: Zusatz von 10,0 g Glucose zu Grundmedium Verwertungstest Simmons-Medium Christensen-Medium Citrat Malonat Gluconat Propionat Maleinat Succinat Malat
Gemäß den vorstehenden taxonomischen Eigenschaften ist der Stamm H-804 ein Bacterium mit den Eigenschaften: runde Kanten, gerade oder leicht gekrümmte Stäbchen, Gram-positiv, Sporenbildung in einer Größe von 0,5 bis 1,0 · 1,6 bis 5,5 um, thermophiles Bacterium, schwache Katalase- und Oxidasebildung, keine Beweglichkeit und oxidativer Abbau von Zukker (Glucose). Unter Vergleich dieser taxonomischen Eigenschaften mit "Bergey's Manual", 8. Aufl., 1974, "Manual of Medicinal Bacteriology", 2. Aufl., 1974 und "Agriculture Handbook", S. 427, "The genus Bacillus", ist der erfindungsgemäße Stamm durch Sporenbildung und aerobes Wachstum gekennzeichnet und gehört zur Gattung Bacillus. Zu den Stämmen der Gattung Bacillus, die thermophil und thermotolerant sind, gehören (a) Bacillus subtilis, (b) Bacillus coaqulans, (c) Bacillus liqueniformis, (d) Bacillus brevis und (e) Bacillus stearothermophilus. Der erfindungsgemäße Stamm kann bei über 30ºC wachsen und ist daher entweder (A) Bacillus stearothermophilus oder (B) Bacillus brevis. Der Vergleich dieser Stämme ist wie folgt: [+: positiv, -: negativ, d: Unterschied in den Stämmen] Größe Breite Länge Gram-Färbung (Entfärbung) unbestimmt Sporenbildung Quellen der Sporen Beweglichkeit Katalase-Bildung anaerobes Wachstum Acetoin-Bildung Wachstumstemperatur Wachstum bei pH 5,7 Wachstum auf Medium mit einem Zusatz von 5% NaCl Säurebildung aus Zucker Glucose Arabinose Xylose Mannit Gasbildung aus Zucker Stärkehydrolyse Citratverwertung Nitratreduktion Indolbildung Caseinhydrolyse
Die Eigenschaften des erfindungsgemäßen Stammes sind denen von Bacillus stearothermophilus ziemlich ähnlich, und es wird berichtet, daß ein nicht-beweglicher Stamm leicht erhalten werden kann. Ein Vergleich der anderen Eigenschaften legt eine Identifizierung des erfindungsgemäßen Stammes als Bacillus stearothermophilus nahe. So wird der erfindungsgemäße Stamm als Bacillus stearothermophilus H-804 bezeichnet. Der Stamm wurde bei dem Fermentation Research Institute unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-1408 hinterlegt.
Bei der vorliegenden Erfindung ist der vorstehende Stamm ein Beispiel für NAD-Synthetase produzierende Mikroorganismen der Gattung Bacillus, aber jeder beliebige Stamm, der der Gattung Bacillus angehört und der die erfindungsgemäße NAD-Synthetase produziert, kann verwendet werden.
Eine künstliche Mutante kann durch Isolieren der DNA, die den genetischen Code der erfindungsgemäßen NAD-Synthetase trägt, aus den erfindungsgemäßen NAD-Synthetase produzierenden Mikroorganismen durch die rekombinante DNA-Technologie, Clonieren der DNA in einen anderen Mikroorganismus, der die erfindungsgemäße NAD-Synthetase nicht produziert, und Expression der die erfindungsgemäße NAD-Synthetase produzierenden Aktivität hergestellt werden. Ein von einer solchen Mutante produziertes Enzym und ein Assayverfahren unter Verwendung des Enzyms fallen unter den Umfang der vorliegenden Erfindung.
Der NAD-Synthetase produzierende Mikroorganismus der Gattung Bacillus kann in einem herkömmlichen Medium für die Enzymproduktion gezüchtet werden. Die Züchtung wird in einer flüssigen oder festen Kultur durchgeführt. Eine submerse Belüftungskultur ist für die industrielle Produktion bevorzugt.
Die Nährquellen des Mediums können zweckmäßigerweise Medien für die Mikroorganismen-Züchtung sein. Die Kohlenstoffquellen sind assimilierbare Kohlenstoffverbindungen, beispielsweise Glucose, Saccharose, Lactose, Maltose, Stärke, Dextrin, Melassen oder Glycerin. Die Stickstoffquellen sind assimilierbare Stickstoffquellen, wie Maisquellwasser, Sojabohnenpulver, Baumwollsaatpulver, Weizenkleber, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt oder Caseinhydrolysat. Salze, wie Magnesium-, Kalium-, Natrium-, Zink-, Eisen- oder Mangansalze und Phosphate oder Halogenide können verwendet werden.
Die Züchtungstemperatur für Bacillus stearothermophilus H- 804 kann entsprechend seinem Wachstum und der Enzymproduktion ausgewählt werden. Die Temperatur beträgt beispielsweise von 48 bis 70ºC, bevorzugt von 55 bis 60ºC. Die Züchtungszeit kann je nach den Kulturbedingungen variiert werden und beträgt im allgemeinen von 10 bis 20 Stunden. Die Züchtung sollte natürlicherweise bei der maximalen Enzymproduktion gestoppt werden. Das Rühren zur Belüftung beträgt üblicherweise von 200 bis 400 UpM.
Da das Enzym ein Endoenzym ist, werden die gezüchteten Zellen durch Filtration oder Zentrifugation gewonnen und die gewonnenen Zellen mechanisch durch Ultraschall aufgebrochen. Eine Behandlung mit einer French Presse oder Glaskugeln oder ein enzymatischer Abbau durch Lysozym, gegebenenfalls unter Zusatz von grenzflächenaktiven Mitteln, wie Triton X-100 (Warenzeichen) oder Adekatol SO-120 (Warenzeichen), können durchgeführt werden.
Die Enzymlösung wird mit oder ohne Einengen durch Zugabe löslicher Salze, wie Ammoniumsulfat, ausgesalzt oder mit einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel, wie Methanol, Ethanol, Aceton oder Isopropanol behandelt, um das Enzym auszufällen. Das Präzipitat wird in Wasser oder einer Pufferlösung aufgelöst, gegebenenfalls dialysiert und über ein Ionenaustauscherharz, wie DEAE-Sephadex, DEAE-Sepharose, Carboxymethylcellulose, Carboxymethyl-Sepharose oder Carboxymethyl-Sephadex oder durch Gelfiltration unter Verwendung eines Molekularsiebs, wie Sephadex G-200, Sephadex CL-6B oder Sephacryl S-200 (Warenzeichen), chromatographiert. Gegebenenfalls können Stabilisatoren zugesetzt werden, und es wird lyophilisiert, um ein gereinigtes Enzym zu erhalten.
Die biochemischen Eigenschaften der vorstehenden NAD-Synthetase sind wie folgt:

(1) Molekulargewicht:

etwa 50.000 [Gelfiltration durch ein Polyvinylgel (Warenzeichen GPC 3.000 SW: Toyo Soda Co.), unter Verwendung einer Säule (7,5 mm ID · 60 cm). Standardproteine: Aldolase (Kaninchenmuskel, MG 150.000), Rinderserumalbumin (MG 67.000), Ovalbumin (Ei: MG 45.000) und Cytochrom C (Pferdefleisch MG 13.000)].

(2) Isoelektrischer Punkt:

etwa pH 5,3 (Elektrophorese unter Verwendung eines Träger- Ampholits und einer Säule (24 · 30 cm LKB Co.), 700 V, 48 h, wobei alle 2 cm geschnitten wurde, Messung des pH-Werts und der Aktivität)

(3) Aktivität:

ATP + Desamido-NAD + NH&sub3; ATP + PPi + NAD

(4) Substratspezifität:

NH&sub3; einschließlich Ammoniumionen.
In jedem beliebigen nachstehend beschriebenen Testverfahren auf die Enzymaktivität kann 25 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; durch L-Valin, L-Homoserin, L-Serin, L-Alanin, L-Methionin, L-Tyrosin, L- Threonin, L-Leucin, L-Isoleucin, L-Arginin, L-Phenylalanin, L-Histidin, L-Asparagin oder L-Glutamin ersetzt werden und die Enzymaktivität gemessen werden. Die relative Aktivität des Enzyms gegenüber diesen Aminosäuren beträgt 0,0, wenn sie gegenüber (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; als 100 angenommen wird. Daher kann das erfindungsgemäße Enzym nur Ammoniak, einschließlich Ammoniumionen, verwerten und verwertet nicht mindestens die vorstehend erwähnten Aminosäuren.

(5) pH-Optimum:

Das nachstehend unter dem Assayverfahren auf die Enzymaktivität identifizierte Reaktionsmedium I wird mit Dimethylglutarat-NaOH-Puffer (pH 5,0 bis 7,0), Tris-HCl-Puffer (pH 6,5 bis 9,0) und Glycin-NaOH-Puffer (pH 8,5 bis 10,0) vermischt. Die Enzymaktivität wird nach Stoppen der Enzymreaktion durch 10-minütiges Erhitzen auf 100ºC gemessen. Wie in Fig. 1 gezeigt, beträgt das pH-Optimum 8,5 bis 10,0.

(6) pH-Stabilität:

Das Enzym wird in 50 mM Dimethylglutarat-NaOH-Puffer (pH 5,0 bis 7,0), Tris-HCl-Puffer (pH 6,5 bis 9,0) oder Glycin- NaOH-Puffer (pH 8,5 bis 10,0) aufgelöst, und die Lösung wird 15 Minuten lang bei 60ºC inkubiert. Die verbleibende Enzymaktivität wird in einem Assay gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 gezeigt; das Enzym ist bei einem pH-Wert von 7,5 bis 9,0 stabil.

(7) Hitzestabilität:

Das Enzym, das in 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) aufgelöst ist, wird jeweils 15 Minuten lang bei verschiedenen Temperaturen gehalten, und die Restenzymaktivität wird gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt; das Enzym ist mindestens unter 60ºC stabil.

(8) Temperatur-Optimum:

Das Enzym wird mit dem nachstehend definierten Reaktionsmedium I vermischt, 10 Minuten lang bei Temperaturen von 50ºC, 55ºC, 60ºC, 65ºC und 70ºC inkubiert, anschließend sofort abgekühlt. Das Reaktionsmedium II wird bei 37ºC zugesetzt, und die Enzymaktivität wird gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 gezeigt; das Temperatur-Optimum beträgt etwa 60ºC.

(9) Wirkung von Enzymaktivatoren und -inhibitoren:

In dem Enzymaktivitätsassay wird jedes Metallion (5 mM), EDTA (20 mM) oder jedes grenzflächenaktive Mittel (0,1%) gemäß Tabelle 1 separat dem Reaktionsmedium I zugesetzt, und die Enzymaktivität wird gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Das Enzym wird durch das Ni-Ion (NiCl&sub2;, 5 mM) gehemmt, und in EDTA (20 mM) wird keine Aktivität beobachtet.
Ferner wird MgCl&sub2; (5 mM) durch MnCl&sub2; (3 mM) in dem in dem nachstehend definierten Enzymassayverfahren identifizierten Reagens ersetzt. Die Enzymaktivität wird auf 150% in Gegenwart von MnCl&sub2; (3 mM) im Vergleich zu MgCl&sub2; (5 mM) erhöht. Tabelle 1 Konzentration relative Aktivität Kein Zusatz* Fortsetzung Tabelle 1 Desocycholat * MgCl&sub2; (5 mM) wird zugesetzt. Die anderen Reaktionen werden mit Mg&supmin;&supmin; und jedem Additiv durchgeführt.

(10) Assayverfahren auf die Enzymaktivität:

Enzymaktivitätsassay:

Reaktionsmedium I

50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0
1 mM KCl
5 mM MgCl&sub2;
0,05% Rinderserumalbumin
2 mM ATP
0,5 mM Desamido-NAD
25 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;

Reaktionsmedium II

50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0
10 E Diaphorase (Toyo Jozo Co. aus der Gattung Bacillus)
3% Ethanol
10 E Alkoholdehydrogenase/ml (Toyo Jozo, Hefe)
0,025% NTB (Nitrotetrazoliumblau)
0,1% Triton X-100
10 mM EDTA
Das Reaktionsmedium I (0,3 ml) in einem Reagensglas wird bei 37ºC vorinkubiert, und die Enzymlösung (5 ul) wird zugesetzt. Das Gemisch wird dann exakt 10 Minuten lang bei 37ºC inkubiert.
Das Reaktionsmedium II (0,8 ml) wird zugesetzt, um die Reaktion zu stoppen und um gleichzeitig die Cyclisierungsreaktion bei 37ºC für exakt 5 Minuten zu starten. Nach Stoppen der Cyclisierungsreaktion durch Zugabe von 0,1N HCl (2,0 ml) wird die Absorption bei 550 nm gemessen, um die Enzymaktivität zu berechnen. Die Enzymaktivität wird nach der folgenden Gleichung berechnet:
NAD-Synthetase-Aktivität (mE/ml) =
ΔA&sub5;&sub5;&sub0;/ΔS&sub5;&sub5;&sub0;/ · 1,0/0,005 · f/10
worin ΔA: Absorption der Probe,
ΔS: Absorption einer Standardlösung (0,1 mM NAD)
0,005: Probenvolumen (ml)
10: Reaktionszeit
f: Verdünnungsverhältnis bedeutet.
Eine Testprobe, die mit der erfindungsgemäßen NAD-Synthetase gemessen werden kann, kann eine Probe sein, die mindestens ATP, Desamido-NAD oder Ammoniak, einschließlich Ammoniumionen, enthält, beispielsweise eine Probe, die zuvor irgendeine der Komponenten enthält, oder eine Probe, die erzeugte oder verbrauchte Komponenten enthält.
Ein bevorzugtes Beispiel des Enzymreaktionssystems ist ein Reaktionssystem, das ATP, Desamido-NAD oder NH&sub3;, einschließlich Ammoniumionen, ohne die Coenzyme NAD und NADH, verbraucht oder erzeugt.
Nicht nur das Reaktionsgemisch, das ATP oder NH&sub3;, das in dem enzymatischen Reaktionssystem verbraucht oder erzeugt wird, enthält, sondern auch das Reaktionsgemisch zur Messung der Enzymaktivität, das in dem enzymatischen Reaktionssystem verwendet wird, das verbrauchte Substrat oder das erzeugte Produkt können als Testprobe verwendet werden.
In diesen enzymatischen Reaktionssystemen wird ATP oder NH&sub3; gemessen, um die Enzymaktivität in der enzymatischen Reaktion zu bestimmen oder die Menge jeder beliebigen Komponente davon zu messen. Eine Substanz, die sich von den Testkomponenten unterscheidet, wird in einer konstanten Geschwindigkeit als Reagens zugesetzt. Die Menge der Probe oder des Reagenses kann je nach den Zielsetzungen und Bedingungen variiert werden.
Das Assayverfahren, bei dem die NAD-Synthetase verwendet wird, kann die Form beispielsweise eines Endpunktassayverfahrens, eines Geschwindigkeitsassayverfahrens oder eines trocken-chemischen Verfahrens (Filmverfahren oder immobilisierter Feststoff) annehmen.
Das Verfahren ist zur Bestimmung irgendeiner Substanz von ATP, Desamido-NAD oder Ammoniak, einschließlich Ammoniak in Form von Ammoniumionen, nützlich. Ammoniak, einschließlich Ammoniumionen, kann ohne Beeinträchtigung der Aminosäuren in einer Probe bestimmt werden. Ferner ist die erfindungsgemäße NAD-Synthetase hitzestabil. Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung näher.

Beispiel 1

Ein Flüssigmedium (pH 7,6, 40 l), bestehend aus 1% Pepton, 0,5% Glucose, 0,05% NaCl und 0,05% MgSO&sub4;·7H&sub2;O in einem 50l- Großfermenter wurde 20 Minuten lang bei 120ºC sterilisiert. Ein vorher gezüchtetes Bacillus stearothermophilus H-804 Saatkulturmedium der gleichen Zusammensetzung (200 ml) wurde darein inokuliert, und das Gemisch wurde 10 Stunden lang unter Belüftung mit 40 l/min und einer Rührgeschwindigkeit von 150 UpM bei 60ºC gezüchtet. Nach der Züchtung wurden die Zellen durch Zentrifugation gewonnen, in 10 mM Tris-HCl (pH 8,0 500 ml), enthaltend 0,1% Lysozym, suspendiert, und das Medium wurde 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert, um die Zellen zu lysieren. Die lysierte Lösung wurde bei 5.000 UpM 10 Minuten lang zentrifugiert, um eine Überstandslösung (450 ml) zu erhalten. Ammoniumsulfat wurde zugesetzt, um die Lösung zu fraktionieren (Sättigung 0,5 bis 0,71) und das so erhaltene Präzipitat, das in 10 mM Tris- HCl-Puffer (50 ml, 21 E) aufgelöst war, wurde gegen den gleichen Puffer (51) dialysiert. Die präzipitierten unlöslichen Rückstände wurden durch Zentrifugation entfernt (15.000 UpM, 10 min). Die überstehende Lösung (20 E) wurde auf eine DEAE-Sepharose CL-6B-Säule (2,5 · 5 cm), die mit 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) gepuffert war, geladen und mit einem Gradienten von 0 bis 0,5 M NaCl eluiert. Die mit 0,25 bis 0,3 M NaCl eluierten Fraktionen, wurden gesammelt (80 ml, 16,5 E). Es wurde durch Ultrafiltration unter Verwendung einer CF-25-Membran (Amicon Co. centriflow membrane cone) konzentriert, mit Sephadex G-100 (3,6 · 80 cm) chromatographiert, und die aktiven Fraktionen wurden gesammelt, um die gereinigte Lösung (5 ml, 14 E) zu erhalten.

Claims

1. NAD-Synthetase mit den folgenden Eigenschaften:

(1) Wirkung:

katalysiert mindestens in Gegenwart von Mg&spplus;&spplus;-Ionen oder Mn&spplus;&spplus;-Ionen die Reaktion (a):

(a) ATP + Desamido-NAD + NH&sub3; AMP + PPi + NAD

und katalysiert in Gegenwart von Mg&spplus;&spplus;-Ionen nicht die Reaktion (b):

(b) ATP + Desamido-NAD + L-Gln + H&sub2;O AMP + PPi + NAD + L-Glu.

(2) Substratspezifität:

verwertet Ammoniak, einschließlich Ammoniak in Form eines Ammoniumions, als Substrat, aber verwertet nicht Glutamin oder Asparagin als Substrat.

(3) pH-Optimum:

pH 8,5- 10,0.

(4) pH-Stabilität:

pH 7,5-9,0 (bei 60ºC, 15 min).

(5) Temperaturoptimum:

etwa 60ºC.

(6) Hitzestabilität:

unter 60ºC (bei pH 8,0, 15 min).

(7) isoelektrischer Punkt:

etwa pH 5,3; und

(8) Molekulargewicht:

50000 ± 5000 (Molekülsieb unter Verwendung eines Polyvinylgels).

2. NAD-Synthetase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Bacillus stearothermophilus H-804 (FERM BP-1408) erhältlich ist.

3. Verfahren zur Herstellung einer NAD-Synthetase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Bacillus stearothermophilus H-804 (FERM BP-1408) oder eine Mutante davon mit der Fähigkeit, die NAD-Synthetase zu produzieren, züchtet und die so produzierte NAD-Synthetase isoliert.

4. Bacillus stearothermophilus H-804 (FERM BP-1408) oder eine Mutante davon mit der Fähigkeit zur Produktion der NAD-Synthetase nach Anspruch 1.

5. Bacillus stearothermophilus H-804 (FERM BP-1408)-Kultur oder eine Mutante davon mit der Fähigkeit zur Produktion der NAD-Synthetase nach Anspruch 1 in einem Kulturmedium, umfassend eine Quelle von assimilierbarem Kohlenstoff, eine Quelle von assimilierbarem Stickstoff und Mineralsalze, das frei von anderen Mikroorganismen ist.