DE3024915A1 - Verfahren zur gewinnung von kreatinase - Google Patents

Description

" Verfahren zur Gewinnung von Kreatinase "

Beanspruchte Priorität:

4. Juli 1979, Japan, Anmelde-Nr. 85 260/79

Kreatinase ist eine Kreatin-Amidinohydroläse mit der Systemnummer 3.5.3.3., die folgende Reaktion katalysiert:

Kreatin +

Harnstoff + Sarkosin

Bisher wurde dieses Enzym nur aus Mikroorganismen der Gattung Pseudomonas oder Flavobacterium isoliert.

Es wurde nun festgestellt, daß ein Mikroorganismus, Stamm B-0618, der zur Gattung Bacillus gehört und aus einer Bodenprobe isoliert worden ist, die einer Äuberginenfarm in Shimosasaki, Fukuchiyama, Bezirk Kyoto, Japan, entnommen worden ist, in den Zellen Kreatinase bildet, die dann erfolgreich isoliert werden kann.

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Die Eigenschaften einer Kultur des Stammes B-0618 sind nach Beobachtung mit bloßem Auge und Mikroskop in verschiedenen Kulturmedien wie folgt:

A. Kultureigenschaften

(nach der Bebrütung bei 30⁰C während 18 bis 24 Stunden):

(1) Bouillon-Schrägagar

Gutes Wachstum in Streifen, grauweiß bis hellbraun. Kaum Bildung von löslichem Pigment.

(2) Glucose-Bouillon-Schrägagar

Gutes Wachstum in Streifen, grauweiß bis hellbraun. Bildung geringer Mengen von löslichem Pigment.

(3) Bouillon-Flüssigkultur

Einheitliche Trübung, keine Häutchenbildung, aber Bildung von Niederschlag.

(4) Lackmus-MiIchkultur

Wird nach 1 bis 2 Wochen alkalisch.

(5) Bouillon-Gelatine-Lochkultur (stab culture) Wachstum nur im oberen Teil, schwache Verflüssigung in Trichterform.

B. Morpholische Eigenschaften

(1) Form und Größe der Zellen:

- Große und gerade Stäbchen mit einer Größe von

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1,0 χ 1,5 χ 2,0 - 5 μπι, mit abgerundeten Enden, im allgemeinen einzeln oder paarweise, gelegentlich kurze Ketten.

(2) Kein Polymorphismus der Zellen.

(3) Beweglichkeit:

Beweglich durch peritriche Begeißelung (kultiviert auf

Schrägagar
einem Bouillon- / bei 26°C während 18 Stunden).

(4) Sporenbildung:

Zylindrische oder ellipsoide Sporen in der Mitte oder am subterminalen Ende der Zelle. Sporangien nicht definitiv geschwollen. Größe der Sporen: 0,8 bis 1,0 χ 1,2 χ 1,6 μπι.

(5) Gram-positiver Stamm.

(6) Säurefestigkeit: negativ.

C. Physiologische Eigenschaften

Nitratreduktion -

Denitrifikation

MR-Test

VP-Test

Indol-Bildung

Hydrogensulfid-Bildung +

Stärke-Hydrolyse

Gelatine-Hydrolyse +

Casein-Hydrolyse -

Esculin-Hydrolyse -

Cellulose-Hydrolyse -

Z itronens äure-Verwertung im Simons-Kulturmedium im Christensen-Kulturmedium +

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Nitrat-Verwertung +

Ammoniumsalz-Verwertung
Ammoniak-Bildung aus Nitraten +

pH-Wachstumsbereich pH 6,4 bis 9,6

Wachstumstemperaturbereich 10 bis 42⁰C

Halogentoleranz Wachstum bis

6,0 % NaCl

Atmung aerob

O-F-Test (Hugh Leifson-Kultur) NT

O-F-Test O (Oxydation)

Da der vorliegende Stamm aus Glucose keine Säure und aus anderen Sacchariden keine oder nur geringe Mengen an Säure bildet, wird Glycerin als Kohlenhydrat verwendet, in einem Grundkulturmedium mit einem pH-Wert von 7,2 bis 7,4, das 1,0 g NH.H PO., 0,2 g KCl, 0,2 g MgSO.-7H₃O, 1,0 g gepulverten Hefeextrakt, 3,0 g Bact-Agar, 10 ml einer wäßrigen 10 %-igen BTB-Lösung und 1000 ml destilliertes Wasser enthält.

Bildung von Säure oder Gas aus Sacchariden:

L-Arabinose

Cellobiose

Dulcit

Erythrit

Fructose + (Säure)

Galactose

Glucose

Glycerin + (Säure)

Inosit

Lactose

Maltose

Mannit + (Säure)

Mannose -

Melezitose

Melibiose

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Raffinose -

L-Rhamnose -

Salicin
L-Sorbose

Sorbit

Stärke

Saccharose -

Trehalose -

Xylose -

(keine Gasbildung)

Bei diesen Versuchen werden 10g des Kohlenhydrats in das oben angegebene Kulturmedium gegeben.

Nach diesen Befunden ist der vorliegende Stamm Gram-positiv, sporenbildend, aerob, in Form von großen Stäbchen, die mit peritricher Begeißelung mobil sind, und bildet aus Glucose keine Säure. Durch Vergleich dieser Befunde mit der Beschreibung in"Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 8.Auflage, 1974, gehört dieser Stamm zur Gattung Bacillus.

Der vorliegende Stamm B-0618 wird außerdem mit Stämmen von Bacillus badius ATCC-14574 (dem bei der "American Type Culture Collection" hinterlegten Stamm), Bacillus freudenreichii ATCC-7053 (weder die hinterlegte Kultur noch der Originalstamm) und Bacillus macroides ATCC-12905 (der hinterlegte Stamm), die offenbar ähnliche Eigenschaften wie der vorliegende Stamm besitzen, verglichen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle zusammengefaßt.

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Tabelle

	Stamm B-0618	14574 7053 12905	keine Säurebildung	+
O-F-Test		keine Säurebildung	+	-
* O-F-Test	O	I O	+	-
Catalase	+	+	+	-
Oxidase	+	+	( + )	-
Urease	+	-	-	-
Gelatine-Hydrolyse	+	+	-	-
S t ärke-HydrοIys e	-	-	-	-
Esculin-Hydrolyse	( + )	-	-	-
Indol-Bildung	-	-	-	-
Schwefelwasserstoff- Bildung	+	-	-	-
Aceton-Bildung	-	-	-	+
MR-Test	-	-	+
Nitratreduktion	-	-		-
Citrat-Verwertung	+	+	-	-
.Bildung von Säuren aus Sacchariden			-	-
Arabinose	-	-	-	_
Fructose	+	-		-
Galactose	-	-	-	-
Glucose Glycerin	+	** +	-	-
Inosit	+	-	-	—
Lactose	-	-	—
Maltose	-	-
Mannit	+	—

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	Stamm B-0618	14574	7053	12905
Mannose Sorbit Saccharose Trehalose Xylose	I I I ! I	I I I I I	I I I I I	I I I I I

Hugh-Leifson-Kulturmedium

t
Säure wurde einmal gebildet, die jedoch später alkalisch wurde,

Die Produktivität der Stämme wird in einem Bouillon-Kulturmedium verglichen:

Stamm B-0618, schwaches Wachstum mit geschlechtsreifen Niederschlagen;

einheitliche Trübung mit Teilniederschlägen;

schwaches Wachstum mit geschlechtsreifen Niederschlagen;

schwaches Wachstum und einheitliche Trübung mit Teilniederschlägen.

Anhand der Ergebnisse dieser Vergleichsversuche wurde festgestellt, daß der vorliegende Stamm B-0618 sich vom Stamm Bacillus badius ATCC-14574 in der Bildung von Urease, der Bildung von Säure aus Glycerin (wobei die gebildete Säure jedoch später alkalisch wird) und in der Bildung von Säure

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aus Mannit unterscheidet. Vom Stamm Bacillus freudenreichii ATCC-7053 unterscheidet sich der vorliegende Stamm durch die Hydrolyse des Esculins und die Bildung von Säure aus Fructose, Glycerin und Mannit. Der vorliegende Stamm ähnelt diesem Stamm jedoch mehr als Bacillus badius ATCC-14574 in bezug auf Wachstum und die Urease-Bildung. Da Bacillus freudenreichii ATCC-7053 nicht die hinterlegte Kultur noch der Originalstamm ist, ist die Identifizierung des vorliegenden Stammes B-0618 schwierig; eine Entscheidung, ob dieser Stamm neu ist, ist nicht möglich. Daher wurde der vorliegende Stamm unter dem Namen Bacillus sp. B-0618 unter Nr. FERM-P 4049 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, hinterlegt.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Gewinnung von Kreatinase, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Stamm der Gattung Bacillus, insbesondere Bacillus sp. B-0618 (FERM-P 4049), in einem Medium kultiviert und daraus die Kreatinase isoliert.

Da Mikroorganismen, einschließlich des im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Stamms, durch natürlichen oder künstlichen Einfluß verändert werden können, ist im erfindungsgemäßen Verfahren jede Variante geeignet, vorausgesetzt, sie behält die Fähigkeit zur Kreatinase-Bildung.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Stamm der Gattung Bacillus in herkömmlicher Weise entweder in Flüssigkultur oder in fester Form kultiviert. Vom wirtschaftlichen Standpunkt

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aus ist es jedoch günstiger, die Zellen des Kreatinase bildenden Stammes auf ein Kulturmedium in großtechnischem Maßstab zu beimpfen und in Submerskultur unter Belüftung und Bewegung zu kultivieren.

Als Nährstoffquellen kommen alle für die herkömmliche Kultur von Mikroorganismen verwendeten Substanzen in Frage. Als Stickstoffquelle ist jede verfügbare Stickstoffverbindung geeignet, wie Maisquellwasser, Sojabohnenmehl, Pepton, verschiedene Fleischextrakte, Hefeextrakt, Ammoniumsulfat oder Ammoniumchlorid. Als Kohlenstoffquelle sind Verbindungen, wie Glucose, Melasse, Glycerin oder Stärkehydrolysate, geeignet. Gegebenenfalls kann man dem Kulturmedium Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Natriumdihydrogenphosphat oder Natriummonohydrogenphosphat, zusetzen. Vorzugsweise wird dem Kulturmedium auch Kreatin zugegeben, um die Kreatinase-Produktion während der Kultur zu erhöhen. Kreatin wird vorzugsweise in einer Menge von etwa 0,5 bis 1 % zugesetzt.

Die Bebrütungstemperatur liegt im erfindungsgemäßen Verfahren günstigerweise zwischen 26 bis 33°C. Die Bebrütungsdauer hängt von verschiedenen Bedingungen ab, im allgemeinen sind 15 bis 25 Stunden ausreichend. Die Bebrütung wird im allgemeinen dann abgebrochen, wenn die Kreatinase-Aktivität ihr Maximum erreicht. Die Zellen des Produkts enthalten dann angehäuft die Kreatinase.

Zur Gewinnung der rohen Kreatinase-Lösung durch Extraktion

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/M-

oder Eluieren wird das Kulturprodukt zum Beispiel einer Fest/Flüssigtrennung unterworfen, die abgetrennten feuchten Zellen werden entweder in einem Phosphatpuffer oder einem Tris-HCl-Puffer suspendiert. Die Kreatinase wird aus diesen Zellen in herkömmlichen Verfahren zur Enzymextraktion extrahiert, z.B. durch Lysozym, Ultraschall oder Hochdruckpresse.

Diese rohe Kreatinase-Lösung kann man in herkömmlicher Weise reinigen, z.B. durch Zugabe einer wäßrigen Protaminsulfatlösung, um die Nucleinsäuren abzutrennen, und durch fraktioniertes Ausfällen mit einem organischen Lösungsmittel, wie Aceton, Methanol, Äthanol oder Isopropanol, oder durch Aussalzen des Enzyms mit einem geeigneten Salz, wie Ammoniumsulfat. Die isolierten Niederschläge können zum Beispiel durch Elektrophorese gereinigt werden, soweit es sich um eine homogene Proteinbindung handelt. Reinigungsverfahren, die die Eigenschaften der Kreatinase ausnutzen, sind günstig.

So können die Niederschläge in einem Tris-Salzsäurepuffer gelöst und an einer ionenaustauschenden Substanz chromatographiert werden, z.B. an Diäthylaminoäthylcellulose oder Diäthylaminoäthyldextrangel oder einem Gelfiltrationsmittel, wie Dextran- oder Polyacrylamidgel. Die Reinigung kann aber auch durch Kombination dieser Verfahren durchgeführt werden. Schließlich erhält man ein reines Kreatinase-Pulver durch Trocknen des Produkts, z.B. durch Gefriertrocknen.

Fig. 1 zeigt die Abhängigkeit der Kreatinase-Aktivität vom pH-Wert.

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Fig. 2 zeigt die pH-Stabilität der Kreatinase.

Fig. 3 zeigt die thermische Stabilität der Kreatinase.

Fig. 4 zeigt die Abhängigkeit der Kreatinase-Aktivität von der Temperatur.

Die Enzymaktivität sowie die physiko-chemischen Eigenschaften der im erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen Kreatinase werden bestimmt:

1. Enzymaktivität

0,5 ml eines Reaktionsgemisches, das aus 0,05 ml 0,2m Phosphatpuffer, pH 7,5, und 0,45 ml einer 0,05m Kreatin-Lösung besteht, werden mit 10 μΐ einer Enzymlösung versetzt und 5 Minuten bei 37°C inkubiert- Durch Zugabe von 0,5 ml einer 0,0005 POIB-Lösung wird die Reaktion beendet. Das in der Reaktion gebildete Sarcosin wird mittels Sarcosin-Oxidase (EC 1.5.3.1) bestimmt: Das Reaktionsgemisch wird mit 0,5 ml einer Lösung, die 0,1 ml 0,2m Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, 0,05 ml einer 0,3-prozentigen 4-Äminoantipyrin -Lösung, 0,05 ml einer 0,2-prozentigen Phenollösung, 0,05 ml einer 0,05 g/100 ml enthaltenden Peroxidase-Lösung, 0,1 ml einer Sarcosin-Oxidase-Lösung (30 U/ml) und 0,15 ml destilliertes Wasser enthält, versetzt und 20 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach Zugabe von 1,5 ml destillierten Wassers wird die Menge an freigesetztem Wasserstoffperoxid im Reaktionsgemisch kolorimetrisch bei 500 nm bestimmt. Daraus errechnet sich die durch

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/13-

die Kreatinase gebildete Menge an Sarcosin.

Die Menge an Enzym, die nach 1 Minute bei 37⁰C aus Kreatin 1 μΜο! Sarcosin bildet, ist als eine Einheit (1 ü) definiert.

2. Reaktion

Das Enzym katalysiert die Reaktion, in der aus 1 Mol Kreatin unter Verbrauch von 1 Mol Wasser 1 Mol Harnstoff und Sarcosin entsteht.

3. pH-Optimum

Das Optimum des pH-Wertes der Kreatinase liegt bei etwa 7,5 bis 9,0 (siehe Fig. 1).

Als Puffer werden dafür Dimethylglutarat-Natriumhydroxid-Puffer, pH 5,0 bis 7,0, Phosphatpuffer, pH 6,0 bis 7,5, Tris-HCl-Puffer, pH 7,5 bis 9,0, und Glycin-Natriumhydroxid-Puffer, pH 9,0 bis 10,0, verwendet.

4. pH-Stabilität

Das Enzym wird zu jedem dieser Puffer zugesetzt, 60 Minuten bei 37°C inkubiert und die Restaktivität bestimmt. Die Kreatinase ist in einem pH-Bereich von etwa 6,0 bis 9,0 stabil (siehe Fig. 2).

5. Thermische Stabilität

Je 1 ml Kreatinase-Lösung in 0,01m Phosphatpuffer, pH 7,5, wird bei verschiedenen Temperaturen 10 Minuten inkubiert, die

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Restaktivität wird bestimmt. Die Kreatinase ist bei einer Temperatur unterhalb etwa 40⁰C stabil (siehe Fig. 3) .

6. Optimale Reaktionstemperatur

Die optimale Reaktionstemperatur der Kreatinase liegt bei etwa 40⁰C (Fig. 4).

7. Molekulargewicht

Es beträgt etwa 74 000 (bestimmt durch Gel-Filtration).

8. Isoelektrischer Punkt

Der isoelektrische Punkt der Kreatinase liegt bei etwa pH 4,9 (bestimmt durch isoelektrische Fokuselektrophorese mit einem Trägerampholyten).

Die im erfindungsgemäßen Verfahren gewonnene Kreatinase ist somit eine Kreatin-Amidino-Hydrolase mit der systematischen Nummer 3.5.3.3.. Dieses Enzym kann auf verschiedene Weisen verwendet werden, z.B. als enzymatisches Reagens für die klinische Diagnostik. So kann man die Kreatinase in Kombination mit Sarcosin-Oxidase zur Bestimmung von Kreatinin in Serum oder Urin oder allein zur Bestimmung der Kreatininase verwenden.

Das Beispiel erläutert die Erfindung.

Ausführungsbeispiel

100 ml eines Kulturmediums, pH 7,0, das aus 0,5 % Kreatin, 0,5 % löslichem Fischextrakt, 0,2 % Hefeextrakt, 0,3 % Kalium-

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Chlorid, 0,1 % Kaliumhydrogenphosphat und 0,05 % Magnesiumsulfat (MgSO.-7H₂O) besteht, werden in einem 500 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben 20 Minuten bei 120⁰C sterilisiert, dann mit Bacillus sp. B-0618, FERM-P 4049, beimpft und einen Tag bei 30⁰C bebrütet. Mit dieser Impfkultur werden in einem 30 1 fassenden Fermentator 20 1 eines Kulturmediums der angegebenen Zusammensetzung,die vorher sterilisiert worden sind, beimpft und bei einer Temperatur von 30⁰C,unter Rühren bei 200 UpM und einer Belüftung mit 20 1 steriler Luft/Minute 20 Stunden bebrütet. Die Kulturbrühe wird dann zentrifugiert, man erhält 12g Naßzellen, die mit einem 0,01m Phosphatpuffer, pH 7,5, gewaschen und dann in dem gleichen Puffer suspendiert werden, mit Lysozym (Endkonzentration 0,2 mg/ml) versetzt, bei 37°C während 30 Minuten inkubiert und schließlich bei 5000 UpM 15 Minuten zentrifugiert werden. Man erhält einen Überstand mit einer Kreatinase-Aktivität von 800 U, der mit 2,5 ml einer wäßrigen 2-prozentigen Protaminsulfatlösung versetzt und zur Entfernung der Nucleinsäuren zentrifugiert wird. Die Lösung wird mit einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung versetzt; die bei einer Ammoniumsulfatkonzentration von 50 bis 70 % ausgefallenen Fraktionen werden abgetrennt und in 20 ml 0,01m Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, gelöst. Die entstandene Lösung wird durch eine Säule (3,5 χ 30 cm), die mit vernetzten! Dextran gefüllt ist, anschließend durch eine Säule (2,0 χ 18 cm), die mit Diäthylaminoäthylcellulose gefüllt ist und mit 0,01m Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, äquilibriert worden ist, geleitet. Die Säule wird mit 0,01m Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, der 0,1m Kaliumchlorid enthält, gewaschen und mit wäßriger Kaliumchloridlösung mit

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einem Konzentrationsgradienten von 0,1 bis 0,5m eluiert. Die bei 0,3m Kaliumchlorid eluierten aktiven Fraktionen werden gewonnen, durch Ultrafiltration eingeengt, 10 Stunden gegen 0,01m Phosphatpuffer, pH 7,5, dialysiert und lyophilisiert. Das erhaltene Kreatinase-Pulver hat eine Gesamtaktivität von 220 U, einen Proteingehalt von 38 mg, eine spezifische Aktivität von 5,8 U/mg. Die Ausbeute beträgt 27,5 %.

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L e e r s e

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Claims (5)

Patentansprüche

1. Verfahren zur Gewinnung von Kreatinase, dadurch gekennzeichnet , daß man einen Stamm der Gattung Bacillus, insbesondere Bacillus sp. B-0618 (FERM-P 404 9) in einem Medium kultiviert und daraus die Kreatinase isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Kulturmedium Kreatin zusetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Kulturmedium 0,5 bis 1 % Kreatin zusetzt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in Flüssigkultur und unter Belüftung und Bewegung kultiviert.

5. Biologisch reine Kultur des Stammes Bacillus, insbesondere Bacillus .sp. B-0618 (FERM-P 4049), zur Verwendung im Verfahren nach Anspruch 1 bis 4.

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