DE3020646C2

DE3020646C2 -

Info

Publication number: DE3020646C2
Application number: DE3020646A
Authority: DE
Inventors: Shigeyuki Imamura; Tooru Matsumoto; Naoki Muto; Hideo Shizuoka Tagata Jp Misaki
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1979-06-06
Filing date: 1980-05-30
Publication date: 1987-08-13
Also published as: GB2051079A; CA1159779A; JPS5852632B2; FR2458583A1; DE3020646A1; NL8003236A; GB2051079B; FR2458583B1; IT8022627A0; IT1148837B; US4347323A; JPS55162987A

Description

Die Erfindung betrifft neue Glycerinkinase und ihre Herstellung (vgl. die Patentansprüche 1 und 2).

Glycerinkinase ist in der Vergangenheit als Enzym bekannt geworden, das die folgende Reaktion katalysiert.

Reaktion:
ATP + Glycerin → ADP + L-α-Glycerophosphat
(EC 2.7.1.30 ATP : Glycerinphosphattransferase, empfohlener Name: Glycerinkinase).

Die bis heute bekannten Glycerinkinasen (im folgenden wird die Glycerinkinase als GK bezeichnet) sind Enzyme aus Candida mycoderma (Biochem. Z., 329, 320 (1957), ibid., 333, 471 (1961)), Enzyme aus Escherichia coli (J. Biol. Chem., 242, 1030 (1967)) und Enzyme aus Taubenleber (Method in Enzymology, Band 5, 476 (1962), Biochem. Z., 329, 320 (1957), J. Biol. Chem., 211, 951 (1954)).

Es wurde gefunden, daß ein Streptomyces-Stamm A 2408, der aus einer Bodenprobe des Sojabohnenfelds in Kakegawa-shi Shizuoka-ken, Japan, isoliert worden ist, in seinen Zellen ein Enzym erzeugt, welches die Reaktion mit Glycerin und ATP zur Bildung von ADP und L-α-Glycerophosphat katalysiert. Elektrophoretisch wurde ein homogenes Enzym in gereinigter Form isoliert. Das Enzym gehört zur GK-Gruppe, seine physikochemischen und biochemischen Eigenschaften sind bis jetzt jedoch noch nicht bekannt und somit ist es eine neue GK.

Gegenstand der Erfindung ist Glycerinkinase, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie die folgenden Eigenschaften aufweist:

(1) Enzymwirkung: sie katalysiert mindestens die folgende Reaktion: (2) Molekulargewicht: 72000 ± 7200, bestimmt durch Sephadex G-100
(3) isoelektrischer Punkt: 4,5(4) Km-Wert:
Glycerin4,8 × 10^-5 M Dihydroxyaceton6,6 × 10^-4 M D-Glyceraldehyd3,5 × 10^-4 M ATP2 × 10^-5 M(5) Spezifizitäten für Nukleotide: ATP < CTP < ITP » GTP, UTP
(6) optimaler pH-Wert: 9 bis 10
(7) pH-Stabilität: pH 5,5 bis 10
(8) Einfluß auf Metallionen: stimuliert durch Mg⁺⁺ inhibiert durch Ca⁺⁺ und Mn⁺⁺
(9) Wärmestabilität: stabil bis zu 45°C.

Die taxonomischen Eigenschaften des Streptomyces-Stamms A 2408 sind wie folgt:

I. Morphologische Eigenschaften

Die Farbe der Lufthyphen, die gereifte Sporen tragen, ist bräunlich-grau bis gräulich-braun. Gelblich-braunes Substrat mycelium. Es bildet ein gelblich-braunes löslisches Pigment.

Beobachtungen auf einem anorganischen Stärkeagar bei 30°C während 10 Tagen sind wie folgt. Man beobachtet die gleichen morphologischen Merkmale wie auf Hafermehlagar und Glycerin/ Asparagin-Agar.

Die Lufthyphen besitzen einen Durchmesser von 0,6 bis 0,8 µm, sie sind gerade oder wellenförmig, wachsen mit einfacher Verzweigung und bilden viele Sporenketten. Die Sporenketten bilden Spiralen mit losen 3 bis 5 Spiren in Form von Haken, Schlingen oder Schlangen.

Die Form der Sporen ist kugelförmig oder oval, 0,8 bis 1,0 × 1,0 bis 1,5 µm, Oberflächen mit Stacheln.

Die Substratmycelien sind verzweigt, sie wachsen wellen förmig oder schlangenförmig, 0,5 bis 0,6 µm Durchmesser und üblicherweise kein Aufspalten der Hyphen und Tragen von Sporen.

Keine Bildung von Geiselsporen und Sporenträgern.

II. Zusammensetzung der Diaminopimelinsäure

L-Diaminopimelinsäure wird nachgewiesen.

III. Eigenschaften auf verschiedenen Medien

Die Beobachtungen erfolgten auf verschiedenen Medien bei 30°C während 20 Tagen, wie es in Tabelle I (die Farbangabe beruht auf "Color Harmony Manual", 4. Auflage 1958 (Container Corp. of America USA)) erlautert wird.

IV. Physiologische Eigenschaften

1) Wachstumstemperatur: 12 bis 45°C
2) Verflüssigung von Gelatine: positiv
3) Stärkehydrolyse: positiv
4) Magermilch: Peptonisierung positiv, Koagulation negativ
5) Bildung von melaminartigem Pigment: negativ 6) Ausnutzung der Kohlenstoffquellen:
Ausnutzen: L-Arabinose, D-Fructose, D-Glucose, i-Inosit, D-Mannit, Raffinose, L-Rhamnose, Saccharose und D-Xylose.

Wie zuvor erläutert, gehört der erfindungsgemäß eingesetzte Mikro organismusstamm A 2408 zu Streptomyces wegen seiner Eigenschaften, daß das Luftmycelium ein Sporenkettenwachstum von einen nicht-geteilten wahren Substratmycelium zeigt, dem Durchmesser des Myceliums und der Sporengröße und der L-Art der Diaminopimelinsäure. Der Stamm A 2408 besitzt die folgenden Eigenschaften. Die Farbe des Luftmyceliums ist bräunlich-grau bis gräulich-braun. Die Sporenkette ist lose 3 bis 5 aufgespulte Spiralen. Die Oberfläche der Sporen besitzt Dornen. Die Farbe des Substratmyceliums ist gelblich-braun. Bildung von gelblich-braunem löslischen Pigment. Die Ausnutzung von Zucker ist weit. Keine Bildung von melaminartigem Pigment. Diese Eigenschaften können als Streptomyces canus zugeordnet werden (Heinemann et al.) (Antibiotics and Chemotherapy, 3, 1239 bis 1242 (1953)) in International Streptomyces Project (ISP) (Inter. J. System. Bacteriol., 18 (2), 95 (1968)). Ein Vergleich mit dem erfindungsgemäßen Stamm A 2408 und Streptomyces canus ISP 5017 zeigt die Ähnlichkeit der morphologischen, Züch tungs- und physiologischen Eigenschaften.

Tabelle I

Der erfindungsgemäße Stamm A 2408 wird somit als Streptomyces canus A 2408 bezeichnet. Dieser Stamm wurde im Institute for Microbial Industry and Technology, Japan, als Hinter legungsstelle unter der FERM-Nr. 4977 hintergelegt. Diese Hinterlegung wurde in die Hinterlegung FERM BP-1202 umgewandelt.

Es wurde gefunden, daß GK, das durch Streptomyces canus A 2408 gebildet wird, ein neues Enzym ist, das die im folgenden erläuterten physikochemischen und biochemischen Eigenschaften aufweist.

GK kann als Forschungsreagenz oder diagnostisches Reagenz für den Metabolismus von Triglycerid in einem Körperfluid, wie Serum, verwendet werden.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein neues GK und ein Verfahren zu seiner Herstellung zur Verfügung zu stellen.

Die neue GK kann erzeugt werden, indem man den Stamm FERM BP-1202 in einem an sich bekannten Medium für die Enzymerzeugung kultiviert. Die Züchtung ist normalerweise eine flüssige Züchtung und eine eingetauchte Belüftungskultur ist für die industrielle Produktion geeignet. Es können übliche Nährmedien für Mikroorganismen verwendet werden.

Als Kohlenstoffquellen können assimilierbare Kohlenstoff quellen, besonders bevorzugt Glycerin, verwendet werden. Andere Kohlenstoffquellen, wie Glucose, Saccharose, Lactose, Stärke, Melassen, können ebenfalls verwendet werden. Als Stickstoffquellen können assimilierbare Stickstoff quellen, wie Maisquellwasser, Sojabohnenpulver bzw. Soja bohnenmehl, Baumwollsamenmehl, trockene Hefe, Caseinhydro lysat, Hefeextrakt, Fischmehlextrakt und Pepton, verwendet werden. Gegebenfalls können Phosphat, Sulfat und anorga nische Salze von Magnesium, Calcium, Kalium, Eisen, Mangan oder Zink verwendet werden.

Die Züchtungstemperatur kann entsprechend den Bedingungen für das Wachstum von Mikroorganismen und die Bildung von GK ausgewählt werden und sie beträgt bevorzugt 25 bis 30°C. Die Züchtungszeit hängt von den Bedingungen ab und die Züchtung sollte bei der maximalen Produktion von GK beendet werden. Sie dauert im allgemeinen 1 bis 3 Tage.

Das erfindungsgemäße Enzym kann aus Mycelien isoliert werden. Die Kulturbrühe wird zum Sammeln des gezüchteten Myceliums, das mit Ultraschall beschallt worden ist, zen trifugiert, wobei man eine überstehende Lösung erhält. Die überstehende Lösung wird unter Verwendung von Ammonium sulfat (das im folgenden als AS bezeichnet wird) oder Natriumsulfat zur Abtrennung der Verunreinigungen ausge salzt. Nachdem das überstehende Material ausgesalzt wurde, wird es zentrifugiert, wobei man einen GK enthaltenden Niederschlag erhält. Das ausgefällte GK wird weiter durch Entsalzen mit Sephadex G-25, Biogel P-2 durch eine Dialyse membran oder ein Hohlfilter gereinigt. Dann wird eine Ionenaustauschchromatographie unter Vervendung von DEAE-Cellulose durchführen. Die so erhaltene GK-Fraktion wird entsalzt und durch eine Ultrafiltrationsmenbrane, wie Amicon XM-50 konzentriert. Die entsalzte Fraktion wird einer Adsorptionschromatographie, wie unter Verwendung einer Calciumphosphatgelsäule, zur Abtrennung der Verunreinigungen unterworfen. Anschließend wird mit einem Gradienten unter Verwendung eines Phosphatpuffers eluiert. Die GK enthaltende Fraktion wird entsalzt und durch eine Ultrafiltrationsmenbran, wie Amicon XM-50, kon zentriert. Das Konzentrat wird der Gelchromatographie unter Verwendung von Biogel P-200 oder Sephadex G-150 unterworfen. Dann wird die GK-Fraktion lyophilisiert.

Das gemäß dem obigen Reinigungsverfahren erhaltene GK besitzt die folgenden physikochemischen und biochemischen Eigenschaften:

(A) Enzymassay

0,2M-Tris-HCl-Puffer (pH 9,0)0,4 ml 0,1M-Glycerin0,05 ml 10 mM ATP0,1 ml 10 mM MgCl₂0,1 ml 0,25% Nitrotetrazoliumblau0,1 ml 1% Rinderserumalbumin0,14 ml 10 mM NAD0,1 ml 0,05% Phenazinmethosulfat0,01 ml Glycerophosphatdehydrogenase (2 mg/ml, 65 U/mg)5 µl

Das obige Gemisch (1 ml) wird bei 37°C während 5 min pre inkubiert und eine GK-Lösung (50 µl) (verdünnt mit GL- Puffer (10 mM Phosphatpuffer, der 10 mM Glycerin enthält, pH 7,5)) wird zugegeben und dann wird bei 37°C während 10 min inkubiert. Die Reaktion wird beendet, indem man 0,1N-HCl zugibt, und dann wird bei 550 nm zur Bestimmung der Absorption (A_{550 nm}) analysiert.

Eine Einheit GK wird so definiert, daß sie 1 Mol Glycero- 3-phosphat pro min freisetzt.

Die Enzymaktivität wird durch die folgende Gleichung berechnet:

(B) Physikochemische und biochemische Eigenschaften

Enzymwirkung: Sie katalysiert mindestens die folgende Reaktion.

Molekulargewicht: 72000 ± 7200
72000: bestimmt durch Sephadex G-100
65000: bestimmt durch SDS-Polyacrylamid

Isoelektrischer Punkt: 4,5

Km-Wert:
Glycerin4,8 × 10^-5 M Dihydroxyaceton6,6 × 10^-4 M D-Glyceraldehyd3,5 × 10^-4 M ATP2 × 10^-5 M

Substratspezifizität:
(1) Spezifizität für Glycerin, Dihydroxyacetonphosphat und D-Glyceraldehyd:
Assayverfahren:

Reaktionsgemisch:
0,2M-Tris-HCl-Puffer (pH 9,0)0,4 ml 0,1M-Glycerin, Dihydroxyacetonphosphat
oder D-Glyceraldehyd0,05 ml 10 mM ATP0,1 ml 10 mM MgCl₂0,1 ml destilliertes Wasser0,1 ml

0,95 ml des Reaktionsgemisches werden bei 37°C während 3 min preinkubiert und die Enzymlösung (gelöst in 10 mM Phosphat puffer, pH 7,5, 0,05 ml) wird zugegeben. Dann wird bei 37°C während 10 min inkubiert. Die Reaktion wird beendet, indem man 3 min kocht. Nach dem Abkühlen auf 37°C wird die Menge an ADP analysiert. ADP wird analysiert, indem man eine ADP- Analyselösung (2,0 ml) zugibt, die das folgende Gemisch enthält:

0,1M-Phosphatpuffer (pH 7,5)0,1 ml 0,2M-Dimethylglutarat-NaOH-Puffer (pH 7,5)0,1 ml Peroxidase (0,5 mg/ml)0,1 ml 0,2% Phenol0,1 ml 0,3% 4-Aminoantipyrin0,1 ml 10 mM MnCl₂0,05 ml 10 mM Thiaminpyrophosphat0,03 ml 1 mM FAD0,01 ml 10 mM Phosphoenolpyruvat0,1 ml Pyruvatoxydase (100 U/ml)0,05 ml Pyruvatkinase (4400 U/ml)1 µl destilliertes Wasser1,26 ml

Das Reaktionsgemisch wird bei 37°C während 15 min inkubiert. Die gemessene Farbe wird bei 550 nm zur Berechnung der Sub stratspezifizität gemessen.

(2) Spezifische Aktivität für das Nukleotide:

ATP < CTP < ITP » GTP, UTP

Analyseverfahren:

Bei dem obigen Analyseverfahren (1) werden 10 mM ATP durch CTP, ITP, und UTP ersetzt und dann wird das gebildete Glycero-3-Phosphat gemessen. Wie im folgenden erläutert, können alle analysierten Nukleotide ein Substrat sein. Es wurde eine besonders hohe Spezifizität füt ATP und CTP beobachtet.

Optimaler pH: pH 9 bis 10, wie in Fig. 1 dargestellt. (In der Fig. ○ - ○ : Dimethylglutarat-NaOH-Puffer (pH 6 bis 7,5), . - .: Tris-HCl-Puffer (pH 7 bis 9), ∆ - ∆ : Phosphatpuffer (pH 6 bis 8), ▲ - ▲ : Glycin-NaOH- Puffer (pH 9 bis 10,5)).

pH-Stabilität: pH 5,5 bis 10, wie in Fig. 2 dargestellt.

Dimethylglutaratpuffer (pH 4 bis 7) und Glycin-NaOH-Puffer (pH 10 bis 10,5), die je 10 mM Glycerin enthalten, werden verwendet. Die Inkubation wird bei 37°C während 60 min durchgeführt.

Einfluß auf Metallionen und p-Chlormercuribenzoat (PCMB):

Das erfindungsgemäße GK wird durch Mg⁺⁺ aktiviert und durch Ca⁺⁺ und Mn⁺⁺ inhibiert. 7,5 × 10^-6 M PCMB inhibieren die Aktivität des erfindungsgemäßen GK vollständig.

Wärmestabilität: stabil bis zu 45°C, wie in Fig. 3 dargestellt.

Analyse: 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,8), der 10 mM Glycerin enthält. Inkubation bei 45 bis 75°C jeweils während 10 min.

Wie zuvor erläutert, gehört das erfindungsgemäße Enzym zu einer Enzymklasse, die die Reaktion Glycerin und ATP zu ADP und L-α-Glycerat katalysiert.

Ein Vergleich mit der bekannten Glycerinkinase von Candida mycoderma GK (im folgenden als C.My.-GK bezeichnet), Esche richia coli GK (im folgenden als E.Co-GK bezeichnet) und Taubenherz-GK (im folgenden als Pig.-GK bezeichnet) und der erfindungsgemäßen GK ist wie folgt.

Molekulargewicht von E.Co-GK beträgt 300000 und von C.My.- GK 250000 (Tetrameres: Molekulargewicht von 60000), wohin gegen das erfindungsgemäße GK ein Monomer mit einem Mole kulargewicht von etwa 70000 ist. Die pH-Stabilität ist pH 6,5 bis 7 für E.Co-GK, pH 4,5 bis 5,5 für Pig.-GK und pH 6,7 für C.My.-GK, hingegen pH 5,5 bis 10 für das erfindungsgemäße GK. Da Reaktionen, die ATP erfordern, zweiwertige Metallionen benötigen, erfordert das obige GK ebenfalls Mg⁺⁺. Jedoch kann Mn⁺⁺ für E.Co.GK und Pig.-GK ersetzt werden, wohingegen Mn⁺⁺ das Erfindungsgemäße GK stark inhibiert.

Außerdem unterscheiden sich die Substratspezifizitäten von einander. E.Co.-GK zeigt fast die doppelt starke Aktivität für Dihydroxyacetonphosphat, verglichen mit der von Glycerin, wohingegen das erfindungsgemäße GK eine höhere Spezifizität für Glycerin zeigt als für Dihydroxyacetonphosphat. E.Co-GK wirkt nur für ATP und das erfindungsgemäße GK für ATP und CTP, ebenfalls für ITP, GTP und UTP. Als Folge des Molekulargewichts, der pH-Stabilität, des Erfordernisses von zweiwertigen Metallionen und der Substratspezifizität läßt sich beweisen, daß die erfindungsgemäße Glycerinkinase eine neue GK ist.

Die erfindungsgemäße GK kann für diagnostisches Enzym verwendet werden.

Beispielsweise kann die erfindungsgemäße GK zur Analyse von Triglycerid und Glycerin verwendet werden, indem man mit Triglycerid und Lipoproteinlipase umsetzt, das Reak tionsgemisch mit GK und ATP unter Bildung von Glycero-3- phosphat inkubiert, das weiter mit Glycero-3-phosphatoxi dase inkubiert wird, und dann wird der verbrauchte Sauer stoff oder das freigesetzte Wasserstoffperoxid gemessen.

Das folgende Beispiel erläutert die Erfindung.

Beispiel

100 ml eines Mediums (pH 7,0), das 1,0% Pepton, 1,5% Glycerin, 0,1% K₂HPO₄, 0,05% MgSO₄ und 20% KCl enthält, wird in einen 500-ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben und bei 120°C 20 min lang sterilisiert. Es wird dann mit Streptomyces canus A 2408 FERM BP-1202 inokuliert. Anschließend wird bei 26°C während 3 Tagen gezüchtet. Die Kulturbrühe wird in ein 30-l-Kolbenfermentationsgefäß gegeben, das das gleiche Medium (20 l) enthält, und aerob bei 26°C während 40 h kultiviert (300 Upm, Belüftung 20 l/min). 2 l Kulturbrühe werden bei 4°C zum Sammeln des Myceliums zentrifugiert (15000 Upm, 10 min). Das Mycelium wird in GL-Puffer (800 ml) suspendiert und bei 0°C während 5 min durch eine Ultra schallvorrichtung (Kubota Insonator 200M) beschallt.

Die Lösung wird bei 4°C während 10 min bei 15000 Upm zentrifugiert, um überstehendes Material (760 ml) zu erhalten. Nach der Zugabe einer 5%igen Protaminlösung (23,0 ml) werden die Verunreinigungen durch Zentrifugieren bei 4°C und 5000 Upm während 10 min prezitipiert. Gesättigte Ammo niumsulfatlösung (pH 7,5, 1125 ml) wird zu dem überstehenden Material (750 ml) gegeben und dann wird bei 4°C und 15000 Upm während 10 min zum Sammeln des Prezipitats zen trifugiert. Gesättigte AS (pH 7,5, 37,2 ml) wird zu der Lösung des Prezipitats in 62 ml GL-Puffer zur Ausfällung der Verunreinigungen gegeben. Überstehendes Material (82 ml) wird durch Zentrifugieren bei 4°C und 15000 Upm während 10 min erhalten. Dann wird gesättigte AS (pH 7,5, 20,5 ml) zugegeben. Anschließend wird bei 4°C und 15000 Upm während 10 min zentrifugiert. Man erhält einen Niederschlag.

Der Niederschlag wird in GL-Puffer (11,0 ml) gelöst und die Lösung wird auf eine Säule von Sephadex G-25 (3 × 30 cm), die mit dem gleichen Puffer gepackt ist, gegeben, dann wird mit dem gleichen Puffer bei 25°C und einer Strömungs rate von 40 ml/h eluiert. Fraktionen, die Absorptionen bei 280 nm zeigen, werden gesammelt (etwa 21 ml). Diese gibt man auf eine Säule aus DEAE-Cellulose (2,2 × 17 cm), die mit GL-Puffer gepackt worden ist. Dann wird mit GL-Puffer (80 ml) (Strömungsrate 25 ml/h, 5,8 ml/Fraktion) gewaschen. Danach werden die Verunreinigungen mit GL-Puffer, der 0,1M- KCl enthält, (Strömungsrate 25 ml/h, 5,8 ml/Fraktion) eluiert. Die aktiven Fraktionen Nr. 63 bis 79 werden durch lineare Gradientenelution mit GL-Puffer, der 200 ml 0,1M- KCl enthält, und GL-Puffer, der 200 ml 0,4M-KCl enthält, eluiert (Strömungsrate 25 ml/h, pro Fraktion 5,8 ml). Das vereinigte aktive Eluat (98 ml) wird entsalzt und mit Amicon XM-50 bei 4°C während 4 h konzentriert. Man erhält eine konzentrierte Lösung (10 ml). Das Konzentrat wird auf eine Säule aus Calciumphosphatgel (2,0 × 17,2 cm), die mit GL-Puffer gepackt ist, gegeben. Dann wird mit GL- Puffer (100 ml) gewaschen und mit einem linearen Gradienten von GL-Puffer 200 ml bis 100 mM Phosphatpuffer, der 200 ml 100 mM Glycerin enthält, eluiert (Strömungsrate 25 ml/h, eine Fraktion 6 ml). Die aktiven Fraktionen 48 bis 58 werden gesammelt und die vereinigte Lösung wird mit Amicon XM-50 konzentriert. Man erhält 2 ml Konzentrat. Das Konzentrat wird auf eine Säule aus Biogel P-200 (3 × 60 cm), die mit GL-Puffer gepackt ist, gegeben. Es wird mit dem gleichen Puffer (Strömungsrate 25 ml/h, eine Fraktion 6 ml) eluiert. Die aktiven Fraktionen Nr. 17 bis 20 werden gesammelt. Sie werden vereinigt und lyophilisiert. Man erhält gereinigte GK (spezifische Aktivität: 57,6 U/mg, 16,9 mg-Protein).

Erläuterung der Zeichnungen

Fig. 1: optimale pH-Kurve für das erfindungsgemäße GK.
Fig. 2: pH-Stabilitätskurve für das erfindungsgemäße GK.
Fig. 3: Wärmestabilitätskurve für das erfindungsgemäße GK.

Claims

1. Glycerinkinase, dadurch gekennzeichnet, daß sie die folgenden Eigenschaften aufweist:

(1) Enzymwirkung: sie kalysiert mindestens die folgende Reaktion: (2) Molekulargewicht: 72000 ± 7200, bestimmt durch Sephadex G-100
(3) isoelektrischer Punkt: 4,5(4) Km-Wert:
Glycerin4,8 × 10^-5 M Dihydroxyaceton6,6 × 10^-4 M D-Glyceraldehyd3,5 × 10^-4 M ATP2 × 10^-5 M(5) Spezifizitäten für Nukleotide: ATP < CTP < ITP » GTP, UTP
(6) optimaler pH-Wert: 9 bis 10
(7) pH-Stabilität: pH 5,5 bis 10
(8) Einfluß auf Metallionen: stimuliert durch Mg⁺⁺ inhibiert durch Ca⁺⁺ und Mn⁺⁺
(9) Wärmestabilität: stabil bis zu 45°C.

2. Verfahren zur Herstellung der Glycerinkinase des Anspruchs 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces canus FERM BP-1202 in einem Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze enthaltenden Nährmedium kultiviert, die Kulturbrühe mit Ultraschell beschallt, zentrifugiert, die überstehende Lösung unter Ver wendung von Ammoniumsulfat oder Natriumsulfat zur Abtrennung der Verunreinigungen aussalzt, das ausgesalzte über stehende Material zentrifugiert, dabei einen Glycerin kinase enthaltenden Niederschlag erhält, die ausgefällte Glycerinkinase weiter durch Entsalzen mit Sephadex G-25 oder Biogel P-2 durch eine Dialysemembran oder ein Hohl filter reinigt, dann eine Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung von DEAE-Cellulose durchführt, die so erhaltene Glycerinkinase-Fraktion entsalzt und durch eine Ultrafiltrationsmembran konzentriert, durch Absorptions chromatographie Verunreinigungen abtrennt, anschließend mit einem Gradienten unter Verwendung eines Phosphatpuffers eluiert, entsalzt und durch eine Ultrafiltrations membran konzentriert, das Konzentrat der Gelchromato graphie unter Verwendung von Biogel P-200 oder Sephadex G-150 unterwirft und dann die Glycerinkinase-Fraktion lyophilisiert.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlenstoffquelle Glycerin verwendet.