DE2924470C2 - Lactatoxidase und ihre Herstellung - Google Patents

Description

2. Verfahren zur Herstellung der Lactatoxidase des Anspruchs 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Pediococcus sp. FERM BP-465, Streptococcus sp. FERM BP-466, Aerococcus viridans IFO-12 219 oder Aerococcus viridans IFO-12 317 in einem Kulturmedium züchtet und die gebildete Lactatoxidase aus dem Kulturmedium abtrennt.

Die Erfindung betrifft eine neue Lactatoxidase und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.

Lactatoxidase (L-Lactat: Sauerstoffoxidoreductase, E.C. 1.132) ist ein bekanntes Enzym, das die Reaktion von Milchsäure und Sauerstoff unter Bildung von Essigsäure, Kohlendioxid und Wasser katalysiert:

CH₃CH(OH)COOH + O₂^CH₃COOH + CO₂ + H₂O

und das in der Vergangenheit aus dem Stamm Mycobacterium phlei (E Bakman, Enzyme Handbook, Bd. 1, S. 111,1979) und Mjcobacterium avium (Nature, 170,207) erhalten worden ist

Der Erfindung liegt die Aufgabi zugrunde, eine neue Lactatoxidase zur Verfügung zu stellen, die mindestens eine Substratspezifizität für Milchsäure aufweist und die Reaktion der Gleichung (1):

L-Milchsäure + O₂- Brenztraubensäure + H₂O₂ (I)

katalysiert.

Erfindungsgemäß soll weiterhin ein Verfahren für die Herstellung der neuen Lactatoxidase jmt Verfügung gestellt werden.

Es wurde nun gefunden, daß eine neue Lactatoxidase die Reaktion von Lactat zu Pyruvat katalysiert und eine stöchiometrische Menge von Wasserstoffperoxid erzeugt. Das Enzym kann durch Züchtung von bestimmten Bakterienstämmen, die zum Genus Pediococcus, Genus Streptococcus und Genus Aerococcus gehören, erzeugt werden.
Die Erfindung betrifft eine Lactatoxidase, die durch die folgenden Eigenschaften gekennzeichnet ist:

(a) Substratspezifizität: L-Milchsäure;

(b) Enzymwirkung: sie katalysiert die folgende Reaktion (1)

so L-Milchsäure + O₂-* Brenztraubensäure + H₂O₂ (I);

(c) optimalerpH:6bis7;

(d) optimale Temperatur: 35°C;

(e) isoelektrischer Punkt: pH 4,6 ±03 (bestimmt durch Elektrophorese unter Verwendung eines Trägerampholiten) und

(f) Molekulargewicht: 80 000± 10 000 (bestimmt durch Gelfiltrationsverfahren unter Verwendung von SephadexG-150).

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der Lactatoxidase wie oben definiert, das dadurch gekennzeichnet ist. daß man Pediococcus sp. FERM BP-465, Streptococcus sp. FERM BP-466, Aerococcus viridans IFO-12 219 oder Aerococcus viridans IFO-12 317 in einem Kulturmedium züchtet und die gebildete Lactatoxidase aus dem Kulturmedium abtrennt.

Die neue erfindungsgemäße Enzymlactatoxidase besitzt wesentlich andere Eigenschaften als das obige bekannte Enzym. Sie katalysiert die folgende Reaktion (I):

CH]CH(OH)COOH + O₂ — CH₃COCOOH + H₂O₂ (I)

L-Milchsäure Brenztraubensäure

Das Enzym erfordert nicht die Zugabe von Coenzymen bei seiner Reaktion und es katalysiert direkt die Reaktion der Substratmilchsäure mit Sauerstoff durch Oxidation von 1 MoI Milchsäure zu Pyruvat und unter Bildung von 1 Mol Wasserstoffperoxid.

Die die neue Lactatoxidase liefernden Bakterienstämme der Gattungen Pediococcus und Streptococcus werden nachfolgend auch bezeichnet als Pediococcus sp. B-0667 und Streptococcus sp. B-0668. Diese Stämme wurden aus einer Bodenprobe isoliert, die in einem Rettichfeld in Ohito-cho, Tagat?, (Japan), gesainmelt wurde.

Die oben erwähnte isolierten Stämme B-0667 und B-0668 besitzen die folgenden taxonomischen Eigenschaften:

A. Beobachtungen auf verschiedenen Medien, Züchtung bei 30⁰C während 2 Tagen

Stamm B-0667 Stamm B-0668

Tryptosojabrühe

Tryptosojaagarschrägkultur

Tryptosojaagarplatte Gelatinestich

BCP-Milch(14Tg.)

Schwaches Wachstum, hcmogen trüb, später wolleartige Präzipitation

Schwaches Wachstum, schwachgelblich.

grau, kein Glanz, keine Bildung von

löslichem Pigment

Kolonie, klein und fiach

Wachstum längs des ausgestochenen

Randes, keine Geiaiineverfiüssigung

keine Änderung

B. Mikroskopische Beobachtung Schwaches Wachstum, homogen

trüb,

später wolleartige Präzipitation

Schwaches Wachstum,

schwachgelblich, grau, kein Glanz,

keine Bildung von löslichem Pigment

Kolonie, klein und flach

Wachstum läng:.des ausgestochenen

Randes, keine Geiaf üieverfiüssigung

keine Änderung

Stamm B-0667 Stamm B-0668

Motilität Sporen Gramsche Verfärbung Säurebeständigkeit, Verfleckung

C. Physiologische Eigenschaften

kugelförmig, eiförmig, Paare, 4formige oder kurze Kette 0,5-1,0x0,5—1,0 μπι kugelförmig, eiförmig,
Paare, 4formige oder
kurze Kette
0,8- 1,0x1,0- 1,2 μπι

Stamm B-0667 Stamm B-0668

Wachstumstemperatur 45° C 37° C 30⁰C 26° C 10⁰C 5° C Halogentoleranz, NaCl 10% 6,5% 50% 1,0% 0%

OF-Test Verhalten in Sauerstoff Nitratreduktion Indolbildung Hydrogensulfatbildung Gelatinehydrolyse Stärkehydrolyse Äscuünhydrolyse Acetoinbildung MR-Test Catalase Oxidase Urease (SSR) Urea.sc (Christensen)

± oder(-l-) ± oder{ + )

fermentativ fakultativ anaerob fermentativ
fakultativ anaerob

(Fortsetzung)

Stamm B-0667

Stamm B-0668

Verwendung von Zitronensäure (Christensen)
Säurebildung aus Zucker

Adonit — —

L( + )-Arabinose — —

Cellobiose + +

ίο Dulcit — —

Mesoeiylhrit — —

Fructose; + +

Fucose — —

Galactose + +

Glucose + +

Glycerin — —

Inosit — —

Inulin — —

Lactose + +

ίο Maltose + +

Mannit + +

Mannose + +

Melezitoüe — —

Melibiose + —

Raffinose + —

L( + )-Rh£imnose — —

Salicin ( + ) -

L-Sorbose — —

Sorbit — —

Stärke — —

Saccharose + +

Trehalose + +

Xylose — —

Toleranz bei 60° C für 30 M in. — +

Aus »Bergey's Manual of Determinative Bacteriology«, 8. Ausgabe, 1974, und S. T. Cowan und K. J. Steel, »Manual for the Identification of Medical Bacteria«, Cambridge Press, 1974, folgt, daß die Stämme B-0667 und B-0668, die die oben aufgeführten taxonomischen Eigenschaften aufweisen, zu dem Genus Pediococcus bzw. Genus Streptococcus gehören.
Ein Vergleich dieser Stämme mit dem Identifizierungsmanual der obigen Literaturstelle ist wie folgt:

In der Tabelle:

+ = mehr als 85% positiv. 4J-, — = mehr sils 85% negativ,

d = variiert unter den Stämmen oder Spezies.

Stamm
B-0667

Stamm
B-0668

Genus
Pediococcus

Genus Streptococcus

Wachstum bei 45" Z Toleranz bei 6O⁰C während 30 Min.
Glycerin (Säurebildung) 55 Arabinose (Säurebildung) Halogentoleranz (NaCl 10%)

d d

d d

Der Stamm B-0667 wird somit als Genus Pediococcus oder Streptococcus bezeichnet Aus dem obigen »Manual for the Identification of Medical Bacteria« und J. Gen. MicrobioL, 26, 185—197 (1961), folgt, daß die taxonomischen Eigenschaften des Stammes B-0667 fast identisch sind mit denen von Pediococcus urina-equi, jedoch unterscheiden sich die in »Bergey's Manual of Determinative Bacteriology«, 8. Ausgabe, 1974, beschriebenen Eigenschaften etwas davon. Der Stamm B-0667 wird daher als Genus Pediococcus angesehen und als Pediococcus sp. B-0667 bezeichnet

Der Stamm B-0668 ähnelt dem Genus Streptococcus anstelle des Genus Pediococcus. Aus »Manual for the Identification of Medical Bacteria« folgt, daß der Stamm B-0668 Streptococcus faecium var. durans ähnelt, doch werden kein« taxonomischen Eigenschaften in »Bergey's Manual« beschrieben und es ist daher unmöglich, einen genauen Vergleich durchzuführen. Der Stamm B-0668 wird daher als Streptococcus sp. B-0668 bezeichnet Die Stämme B-0667 und B-0668 wurden in der Dauerhinterlegungsstelle des Institute for Microbial Industry

and Technology, Agency of Industrial Science and Technology. M.I.T.I. Japan, unter den Nr. l'F.RM-P Nr. 4438
bzw. 1-"KRM-P Nr. 4439 hinterlegt und dort direkt in die Hinterlegungen I⁷ERM BP-4tö und FIiRM BP-466
umgewandelt. IFO-12 219 und ΙΙΌ-12 317 wurden in dem Institute for Fermentation, Osaka, Japan unter diesen
Nummern hinterlegt.

Pediococcussp. B-0667 = FERM P-4438 — FERM BP-465;

Streptococcus sp. B-0668 = FERM P-4439-.FERM BP-466.

Anhand der Zeichnungen wird die Erfindung näher erläutert.

F i g. 1 zeigt den optimalen pH-Wert der erfindungsgemäßen Lactase, to

F i g. 2 zeigt die optimale Temperatur der Lactatoxidase,

F i g. 3 zeigt die pH-Stabilität der Lactatoxidase,

F i g. 4 zeigt die Wärmestabilität der Lactatoxidase,

F i g. 5 zeigt das elektrophoretische Muster der Lactatoxidase,

F i g. 6 zeigt das Ergebnis bei der Bestimmung von Wasserstoffperoxid bei einem Bestätigungstest der Was- 15
serstoffperoxidbildung durch die Lactatoxidase, wobei die Standardkurve von O —O: L-Milchsäure als Substrat, · — ·: DL-Milchsäure als Substrat, und Δ — Δ: Substrat durch Wasserstoffperoxid ersetzt ist,

F i g. 7 zeigt das Ergebnis der quantitativen Analyse von Brenztraubensäure bei einem Bestätigungstest der
Brenztraubensäurebiidung durch Lactatoxidase, worin die Standardkurve O —O: L-Miicnsäuie als Suusuai, i

• — ·: DL-Milchsäure als Substrat und Δ — Δ: Substrat durch Wasserstoffperoxid ersetzt ist. 20 .1

Gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform werden Pediococcus sp. B-0667, Streptococcus sp. B-0668, ■.]

Acrococcus viridans IFO-12 219 oder Aerococcus viridans IFO-12 317 in einem üblichen Medium für die ;

Lnzymbildung gezüchtet. Die Züchtung kann unter Verwendung einer üblichen Flüssigkeitskultur durchgeführt ί

werden. Eine submerse Belüftungskultur ist zur industriellen Erzeugung bevorzugt. Für die Züchtung der
Mikroorganismen wird bevorzugt ein übliches Medium verwendet. 25 ■■;

Als Kohlenstoffquellen werden bevorzugt assimilierbare Kohlenstoffquellen, wie Glucose, Saccharose, Lactose, Maltose, Fructose, Melassen o. ä. verwendet. Als assimilierbare Stickstoffquellen werden bevorzugt Pepton, > Polypepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Caseinhydrolysat o.a. verwendet. Verschiedene anorganische Salze, : wie Phosphate, Carbonate. Sulfate, Salze von Magnesium, Calcium, Kalium, Natrium, zweiwertiges Eisen,
Mangan oder Zink können verwendet werden. 30

Die Kulturtemperatur kann innerhalb des Bereichs für das Wachstum von Mikrobenzellen und die Bildung :i

von Lactaioxidase ausgewählt werden und beträgt bevorzugt 25—37°C. Die Kulturzeit kann variiert werden,
abhängig von den Bedingungen, und sie wird beendigt, wenn die Lactatoxidaseproduktion im wesentlichen ·;';

beendigt ist. Sie beträgt normalerweise 10—40Std. J

Zur Abtrennung der Lactatoxidase aus der Kultur wird die Kulturmasse, um die Zellen zu sammeln, filtriert 35 ·, oder zentrifugiert; diese werden durch Behandlung mit mechanischen Einrichtungen oder mit Enzymen, wie %

Lysoitym, üuseinandergerissen bzw. zerstört. Sofern erforderlich, wird die Lactatoxidase durch Zugabe von |

Äthylen-diamintetraessigsäure (EDTA) und einem oberflächenaktiven Mittel, wie Triton X-IOO (Warenzeichen) %

oder Adecatol SO-120 (Warenzeichen) zur Abtrennung des Enzyms solubilisiert. Die so erhaltene Lösung aus |

Lactatoxidase wird mit oder ohne Konzentrierung weiter aufbereitet und danach wird das Enzym durch 40 ^;5 Aussalzen durch Zugabe löslicher Salze, wie Ammoniumsulfat, ausgefällt oder es wird durch Zugabe von mit I

Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln, wie Methanol, Äthanol, Aceton oder Isopropanol, ausgefällt. £

Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht werden durch Dialyse entfernt. Die Reinigung der Lactat- |_;

oxidase erfolgt bevorzugt durch Adsorptionschromatographie oder Gelfiltration. Die so erhaltene Enzymlösung S:

wird durch Vakuumkonzentration, Ultrafiltrationkonzentration und Lyophilisierung unter Bildung gepulverter 45 $i Lactaioxidase behandelt. s

Die erfindungsgemäße Lactatoxidase wird anschließend analysiert. Sie besitzt die folgenden physico-chemi- |

sehen Eigenschaften: i

1. Analyseverfahren %

Reaktionszeit (1,0 ml) |

0.2M Dimethylglutarat-NaOH-Puffer (pH 6,5) 02 ml |

03 mM L-Milchsäure 0,1 ml |

0,2% (GAQ N,N-Dimethylanilin 0,2 ml |

0,2⁰/o(G/V)4-Aminoantipyrin 0,1ml 55 f

45 U/ml Peroxidaselösung 0.1 ml a

destilliertes Wasser 03 ml I

Zu 1,0 ml des obigen Reaktionsgemisches gibt man Lactatoxidaselösung (10 μ!) und -nkubiert bei 37° C
während 10 Min. 03 ml einer 1 %igen (Gew/Vol.) Cation FB-500 (Warenzeichen) oberflächenaktives Mittel wird 60
zur Beendigung der Reaktion zugegeben. Anschließend gibt man 13 ml destilliertes Wasser zu. Die entstandene
Farbe wird durch colorimetrisches Verfahren bei 565 nm gemessen.

Eine Einheit (1 Einheit, 1 U) Enzymaktivität wird als die Aktivität definiert, die 1 μΜοΙ Wasserstoffperoxid pro
Minute erzeugt Die Aktivität wird durch die folgende Gleichung berechnet:

Enzymaktivität (U/ml) = (JA₅65/min) χ 153
worin ^5(,5 die Absorptionsänderung bei 565 nm pro Minute bedeutet.

2. Substratspezifizität

Im obigen Analysenverfahren wird die Milchsäure in dem Reaktionsgemisch durch die folgenden Substanzen zur Bestimmung der Substratspezifizität der Lactatoxidase ersetzt. Die Ergebnisse sind als relative Aktivität für 5 Milchsäure angegeben.

L-Milchsäure	100
Brenztraubensäure	0
DL-<*-Alanin	0
Bernsteinsäure	0
Maleinsäure	0
L-Ascorbinsäure	0
DL-Serin	0
Dihydroxyaceton	2,7
DL-Glvcerinsäure	0
)esitzt die Enzymlact 3.	atoxidase eine höh Enzymreaktion

Substrat Relative

Aktivität (%)

25 Das Enzym katalysiert die Oxidationsreaktion von Milchsäure und Sauerstoff unter Bildung von Brenztraubensäure und Wasserstoffperoxid.

CH₃CH(OH)COOH + O₂-CH₃COCOOH + H₂O₂
30 4. Optimaler pH

Der Einfluß des pH auf die Lactatoxidaseaktivität wird durch Analyse der Enzymaktivität an Milchsäure 40 mM Acetatpuffer (pH 4 bis 4,5), 40 mM Dimethylgutarat-NaOH-Puffer (pH 4 bis 8, 40 mM Phosphatpuffer (pH 6,3 bis 8), 40 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7 bis 9) und 40 mM Glycinpuffer (pH 9 bis 10) bestimmt. Die 35 Ergebnisse sind in F i g. 1 dargestellt, aus der folgt, daß der optimale pH-Wert 6 bis 7 beträgt.

5. Optimale Temperatur

Die Lactatoxidaseaktivität auf Milchsäure wird entsprechend dem zuvor beschriebenen Analysenverfahren 40 gemessen. Die Ergebnisse sind in F i g. 2 dargestellt, wobei die optimale Temperatur etwa 35°C beträgt.

6. Isoelektrischer Punkt

pH 4,6±0.3 (bestimmt durch Elektrophorese unter Verwendung eines Trägerampholiten).

7. Molekulargewicht

80 000 ± 10 000 (bestimmt durch Gelfiltrationsverfahren unter Verwendung von Sephadex G-150; Warenzeichen der Pharmacia Co.). 40 000 ±5000 (bestimmt durch SBS-Polyacrylamidelektrophorese).
50 Diese Werte lassen vermuten, daß das erfindungsgemäße Enzym ein Dimeres ist.

8. pH-Stabilität

Zu Lactatoxidase (5 μg Protein) gibt man 0,1 ml O₁IM Dimethylglutarat-NaOH-Puffer für pH 4 bis 7, 0,1 ml 55 0,1 M Phosphatpuffer für pH 63 bis 8 oder 0,1 ml 0,1 M Tris-HCl-Puffer für pH 7 bis 9, läßt bei 50⁰C während 10 Min. siehen und kühlt in Eis. 10 μΐ Enzymlösung werden entnommen und die Enzymaktivität wird bestimmt. Wie aus F i g. 3 folgt, ist das Enzym bei pH 6,8 bis 8,5 stabil.

9. Wärmestabilität

Die Wärmestabilität des Enzyms wird bestimmt, indem man in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0. 0,1 ml), der die Enzymlactatoxidase enthält (Enzymprotein 5 μg), bei jeder Temperatur von 0 bis 80°C während 10 Min. inkubiert und in Eis kühlt 10 μΐ Enzymlösung werden entnommen und dann wird die Lactatoxidaseaktivität entsprechend dem zuvor beschriebenen Verfahren bestimmt Wie aus F i g. 4 folgt, ist das Enzym unter 40° C stabil and 65 die Aktivität geht über 40° C schnell verloren.

29 24 47U

10. Einfluß auf verschiedene Substanzen

Der Einfluß auf verschiedene Substanzen der Enzymaktivität wird bestimmt, indem m?n die im folgenden aufgeführte Substanz zugibt. Die Zugabeoienge beträgt 10 mM für Metallsalz und EDTA, 0,1% (Gew/Vol.) für oberflächenaktives Mittel und 0,05 mM für p-Chlormercuribenzoat (PCMB), 10 μΜ für Flavinade.iindinucleotid (FAD)₁O₁I mM für Flavinmononucleotid(FMN) und Riboflavin.

Zugegebene Substanz	Relative	107,2
	Aktivität (%)	98,2
keine Zugabe	100,0	10,8
MnCl2	97,4	3,7
MgCI2	101,7	88,6
CaCI2	105,5	11. Elektrophorese
CoCI2	95,7
LiCl	95,3
FeCU	8,12
EDTA	98,0
PCMB	89,7
FAD	101,3
FMN	94,0
Riboflavin	96,4
Natriumlaurylbenzolsulfonat	21,5
Natriumdodecylsulfat	1,8
Adekatol SO-120 (Warenzeichen) 102,8
Triton X-100 (Warenzeichen)
Bridge-35 (Warenzeichen)
Cetyltetraammoniumbromid
Cation FB-500 (Warenzeichen)
Cation DT-205 (Warenzeichen)

10

20 25 30 35

Die Polyacrylamidscheiben-Elektrophorese wurden unter Verwendung von Polyacrylamid-Gel (pH 7,5) und Tris-Barbitalpuffer (pH 7,15) bei einem konstanten Strom (4 mA/gel.) durchgeführt. Wie aus F i g. 5 folgt, ist das elektrophoretisch gewonnene Gel, das durch Amidoschwarz gefärbt wurde, eine einzige dunkelblaue Bande, die die Enzymlactatoxidase als einziges Protein zeigt.

40

12. Art der Enzymwirkung

Bei dem erfindungsgemäßen Lactatoxidase-Analysenverfahren bzw. -Assayverfahren wird das folgende Reaktionsgemisch verwendet:

45

DL-Milchsäure oder L-Milchsäure 0 bis 0.4 μΜοΙ

Dimethylgutarat-NaOH-Puffer (pH 6,5) 40 μΜοΙ

4-Aminoantipyrin 300 μg

N,N-Dimethylanilin 200 μg

Peroxidase 4,5 U jo

Lactatoxidase (200 U/mg) 2 U

1,0 ml des obigen Reaktionsgemisches werden bei 37° C während !0 Min. inkubiert. Danach werden 03 ml einer 1 %igen (Gew/Vol.) Cation FB-500 (Warenzeichen)-Lösung und 1,5 ml destilliertes Wasser zugegeben. Die entstandene Farbe wird nach einem colorimetrischen Verfahren bei 565 nm bestimmt Die Standardkurve wird hergestellt, indem man Wasserstoffperoxid anstelle von Milchsäure zugibt

Wie aus F i g. 6 folgt worin O — O die L-Milchsäure, die als Substrat verwendet wurde, bedeutet · — · die D-Milchsäure, die als Substrat verwendet wurde, bedeutet und Δ — Δ das Wasserstoffperoxid, das anstelle des Substrats verwendet wird, bedeutet katalysiert die erfindungsgemäße Enzymlactatoxidase die Reaktion, bei der 1 Mol L-Milchsäure gebildet wird.

Weiterhin wird der Sauerstoffverbrauch mit einer Sauerstoffelektrode (YSI-Lösungssauerstoffmeter) gemessen und 1 MoI Sauerstoff wird bei der Oxidation von 1 Mol Milchsäure verbraucht

Brenztraubensäure wird nach dem folgenden Verfahren nachgewiesen.

1,0 ml Reaktionsgemisch, das Dimethylglutarat-NaOH-Puffer (40 μΜοΓ), Catalase (400 μg), L-Milchsäure oder DL-Milchsäure (0 bis 0,5 μΜοΙ) und Lactatoxidase (2 U) enthält wird bei 37° C während 10 Min. inkubiert Das Reaktionsgemisch wird in kochendem Wasser während 5 Min. zur Beendigung der Reaktion erhitzt Nach dem Kühlen mit Eis werden 0,1 ml 10 mM NADH₂ und 13 ml destilliertes Wasser zugegeben und dann wird das denaturierte Protein durch Zentrifugieren entfernt Die überstehende Lösung (24 ml) wird in eine Quartzzelle

gestellt, bei 37 C preinkubiert dann wird Lactatdehydrogenase (20 U, Rinderleber, Boehringer Mannheim

GmbH)-Lösung (5 mi) zugegeben, dann wird bei 37° C während 5 Min. inkubiert und nach dem colorimetrischen

Verfahren bei 340 nm gemessen. Die Standardkurve wird hergestellt, indem man Brenztraubensäure anstelle

von L-Milchsäure zugibt.
Wie aus F i g. 7 folgt, worin O — O die als Substrat verwendete Milchsäure bedeutet, · — · die als Substrat

verwendete DL-Müchsäure bedeutet, und Δ-Δ Brenztraubensäure bedeutet, wird Brenztraubensäure anstelle

des Substrats verwendet

1,0 ml des obigen Reaktionsgemisches werden bei 37° C während 10 Min. inkubiert und die so gebildete

ar-Ketosäure wird nach dem Hydrazinverfahren unter Verwendung von 2,4-Dinitrophenylhydrazin gemessen. 1
Ό Mol Λ-Ketosäure wird aus 1 Mol L-Milchsäure gebildet Die erfindungsgemäße Enzymlactatoxidase wirkt auf

L-Milchsäure und katalysiert die Reaktion, bei der 1 Mol Brenztraubensäure gebildet und 1 Mol Sauerstoff g

verbraucht wird. %

Wie zuvor erläutert wurde, wirkt die erfindungsgemäße Enzymlactatoxidase direkt auf Milchsäure zusammen |

nit Sauerstoff und erfordert kein Coenzym bei der Oxidation von L-Milchsäure und Bildung von Brenztrauben- a

säure und Wasserstoffperoxid. Die physico-chemischen Eigenschaften des erfindungsgemäßen Enzyms sowie |

der isoelektrische Punkt von pH 4,6, das Molekulargewicht von 80 000 ± 10 000 usw. zeigen die Unterschiede zu ä"

der bekannten Lactatoxidase an. Hieraus folgt daß die erfindungsgemäße Lactatoxidase ein neues Enzym ist

Bei dem obigen Pestätigungstest für die Art der Wirkung der Lactatoxidase ist die quantitative Analyse des \

freigesetzten Wasserstoffperoxids, Pyruvats und des verbrauchten Sauerstoffs ein Beispiel für die L-Milchsäure- :

analyse. ..;

Beispiel 1 ij

Vier Proben von Kulturmedium (je 100 ml, pH 7), enthaltend Glucose (2%), Pepton (1 %), Hefeextrakt (03%), "ß.

NaCl (0,2%), KH₂PO₄ (0,1%), K₂HPO₄ (0,1%), MgSO₄7H₂O (0,05%) und CaCOs (03%), werden in einem %

Erlenmeyer-Kolben bei 120°C während 20 Min. sterilisiert Jedes Medium wird mit einem Stamm von Pediococ- Ij-

cussp.B-0667,Streptococcussp. B-0668, Aerococcus viridans IFO-12219 bzw. Aerococcus viridans IFO-12317 ;]

inokuliert und dann wird bei 30°C während 15 Std. mit 300 Rpm. unter Schütteln gezüchtet Anschließend ΐ!'

werden die gezüchteten Zellen abzentrifugiert mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 6,5) gewaschen und dann wird Jj

erneut zentrifugiert Die Bakterienzellen werden gesammelt Die so erhaltenen Zellen werden in 1OmM fjj

Phosphatpuffer (10 mi, pH 8.0), enthaltend 0,02% Lysozym und 0,1% Triton X-IOO, suspendiert und dann wird #

bei 37° C während 60 Min. inkubiert Das überstehende Material, das durch Zentrifugieren erhalten wird und das Nj

Lactatoxidase enthält wird gesammelt Die Enzymaktivität des überstehenden Materials ist in der folgenden ?$

Tabelle angegeben: 'Ä

"Ii

Summ Enzymaktivität (U/ml) ν j

B-0667 0,24 ^:'·'

B-0668 OJl 1

IFO-12 219 0,42

IFO-12 317 0,43 ;

Beispiel 2 ■.

201 eines Mediums, das die gleichen Komponenten, wie in Beispiel 1 beschrieben, enthält, werden in ein ;

30-1-Fermentationsstandgefäß gegeben. Dann gibt man Disforrn BC-51Y (Warenzeichen) bis zu einer Konzen- '■.'■;

tration von 0,1% zu und sterilisiert mit Dampf. Bei 200 ml Kulturbrühe von Pediococcus sp. B-0667, auf gleiche ^:-;\ Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, gezüchtet, werden zugegeben und dann wird bei 30⁰C während 15 Std.

so gezüchtet. Die Bakterienzellen werden durch Abzentrifugieren gesammelt (etwa 400 g), in einer Lysozymlösung ':

(0,2 mg/ml, 41) wieder suspendiert, und dann wird Triton X-IOO (Warenzeichen. 4g), EDTA (3g) und IM ■■;

Phosphatpuffer (pH 8,40 ml) zugegeben. Das Gemisch wird bei 37°C während 60 Min. zur Zerstörung der Zellen ■■>',

gerührt Zu der überstehenden, beim Zentrifugieren erhaltenen Lösung (3,7 1,5200 U) gibt man 1,481 Aceton und ^!

die ausgefallenen Verunreinigungen werden abzentrifugiert. Zu der überstehenden Lösung gibt man bis zu '

65%iger Konzentration Aceton. Der beim Zentrifugieren bei 5000 Rpm während 10 Min. erhaltene Nieder- ·,]

schlag wird in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,400 ml) gelöst und der unreine Niederschlag wird durch Zentrifugie- !■

ren abgetrennt 470 ml gesättigtes Ammoniumsulfat werden zugegeben und dann wird 20 Min. gerührt. Der , j

Niederschlag, der durch Zentrifugieren bei 12 000 Rpm während 10 Min. erhalten wurde, wird in 1OmM .j

Phosphatpuffer (pH 7,100 ml) gelöst. Die Lösung wird gegenüber 10 mM Phosphatpuffer über Nacht dialysicrt ■ ■<

und durch eine Säule (2,6 κ 50 cm) aus DEAE-Cellulose, gepuffert bei pH 7, zur Absorption des Enzyms geleitet j

und ds.nn wird stufenweise eluiert mit einer lonengradientenstärke von 0,1 bis 0.6M KCI. Die Fraktionen, die bei _; ί etwa 0,5M KCl ablaufen, werden gesammelt und die enthalten die aktive Enzymfraktion (140 ml).

Zu der Lösung gibt man gesättigtes Ammoniumsulfat (185 ml) und der Niederschlag wird abzentrifugiert. Zu
der überstehenden Lösung wird gesättigte Ammoniumsulfatlösung (145 ml) gegeben und der Niederschlug wird

abzentrifugiert.

Nach dem Auflösen des Niederschlags in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0, 50 ml) und Dialyse zum Entsalzen
wird die Lösung auf eine Säule DEA E-Sephadex A-50 (Warenzeichen) (2,6 χ 50 cm), die mit 1OmM Phosphatpuffer gepuffert ist, zur Absorption des Enzyms gegeben und dann wird die Fraktion durch Gradientenclution mit

einer Ionenstärke von 0,2 bis 0.6M KCl Chromatographien. Die Fraktionen, die mit 0,5M KCl abfließen, werden
gesammelt (160 ml). Anschließend wird zur Entsalzung dialysiert und dann wird lyophilisiert. Das lyophilisierte
Pulver wir in einem Gemisch aus 1OM Phosphatpuffer (pH 7.0,5 ml) und 0,1M KCI gelöst und an einer Säule aus
Sephadex G-liiO (Warenzeichen) (24 χ 73 cm, Strömungsrate 8 ml/min, 5,2 ml/Fraktion) Chromatographien. Die
aktiven Fraktionen Nr. 27 bis 35 werden gesammelt, durch Dialyse entsalzt und lyophilisiert. Das lyophilisierte
Enzym zeigt eine einzige Bande bei der Elektrophorese, wie zuvor erläutert Das Reinigungsschema ist wie folgt:

	Gesamtprotein	Gesamtaktivit	Spezifische Aktivität
	(mg)	(U)	(U/mg)
Zellenextrakt	34 040	5 200	0,028
Acetonprecipitat	3 652	4 780	Ul
1 -Ammoniumsulfatprecipitat	2 378	4 590	133
DEAE-Cellulose	663	3 672	5,80
2-Ammoniumsulfatprecipitat	163	3 253	193
DEAE-Sephadex A-50	44,7	2 667	59,7
Sephadex G-150	13,07	2 614	200
	Hierzu 4 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Lactatoxidase, gekennzeichnetdurch folgende Eigenschaften:

(a) Substratspezifizität: L-Milchsäure;

(b) Enzymwirkung: sie katalysiert die folgende Reaktion (I)

L-Milchsäure + O₂ —► Brenztraubensäure + H₂O₂ (I);

(c) optimaler pH: 6 bis 7;

(d) optimale Temperatur: 35° C;

(e) isoelektrischer Punkt: pH 4,6 ±03 (bestimmt durch Elektrophorese unter Verwendung eines Trägerampholiten) und

(f) Molekulargewicht: 80 000±10 000 (bestimmt durch Gelfiltrationsverfahren unter Verwendung von SephadexG-150).