DE3307607C2

DE3307607C2 -

Info

Publication number: DE3307607C2
Application number: DE3307607A
Authority: DE
Inventors: Hidehiko Ishikawa; Hideo Misaki; Naoki Shizuoka Jp Muto
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1982-03-02
Filing date: 1983-03-01
Publication date: 1990-12-20
Also published as: DE3307607A1; IT8319856A1; FR2522680B1; DE3348379C2; IT1161590B; KR840004161A; US4605615A; JPH0329399B2; FR2522680A1; IT8319856A0; KR870000509B1; JPS58149677A

Description

Die Erfindung betrifft (H₂O₂ bildende) L-Glutaminsäure- Oxidase, die eine Substrat-Aktivität für L-Glutaminsäure oder L-Glutamat (die nachstehend einfach als "L-Glutaminsäure" oder als "L-Glutamat" bezeichnet sind) hat und eine enzymatische Wirkung aufweist, durch die eine Reaktion katalysiert wird, bei der ein Mol α-Ketoglutarsäure, ein Mol Ammoniak und ein Mol Wasserstoffperoxid aus einem Mol L-Glutaminsäure, einem Mol Sauerstoff und einem Mol Wasser gebildet werden. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von (H₂O₂ bildender) L-Glutaminsäure-Oxidase.

Bisher kannte man als Substrat-Spezifizität für L-Glutaminsäure aufweisende Oxidase nur L-(+)-Glutamat-Oxidoreduktase. Dieses Enzym weist eine enzymatische Wirkung auf, durch die eine Reaktion katalysiert wird, bei der zwei Mole α-Ketoglutarsäure, zwei Mole Ammoniak und ein Mol Wasser aus zwei Molen L-Glutaminsäure, einem Mol Sauerstoff und einem Mol Wasser gebildet werden. (Biochim. Biophys. Acta, 368, 158- 172 (1974)).

Bekannt ist weiterhin für L-Aminosäure substratspezifische L-Aminosäure-Oxidase, die eine enzymatische Wirkung aufweist, durch die eine Reaktion katalysiert wird, bei der ein Mol α-Ketosäure, ein Mol Ammoniak und ein Mol Wasserstoffperoxid aus einem Mol Aminosäure, einem Mol Sauerstoff und einem Mol Wasser gebildet werden. (Methods in Enzymology, Vol. II, 204-211 (1955) und andere).

Die zuvor erwähnte bekannte L-(+)-Glutamat-Oxidoreduktase katalysiert die zuvor beschriebene Reaktion, bei der Wasserstoffperoxid nicht entsteht. Zwar entsteht Wasserstoffperoxid bei der vorstehend erwähnten Enzym-Reaktion, die durch die bekannten L-Aminosäure-Oxidasen katalysiert wird; jedoch ist unter den bekannten L-Aminosäure-Oxidasen bisher nicht von einem Enzym berichtet worden, das auf ein L-Glutaminsäure-Substrat zu wirken vermag. (Methods in Enzymology, Vol. II, S. 204-211 (1955)).

Es wurde nun gefunden, daß bestimmte Mikroorganismen der Gattung Streptomyces ein Enzym produzieren, das substratspezifisch auf L-Glutaminsäure wirkt im Sinne des Anspruchs 1.

So gewinnt man beispielsweise aus Streptomyces Art A7700, der aus einer Bodenprobe eines Feldes in Saku-shi, Naganoken, Japan, isoliert wurde, und aus Streptomyces Art A8063, der aus einer Bodenprobe eines Süßkartoffel-Feldes in Naganohara-cho, Azuma-gun, Gunma-ken, Japan, gewonnen wurde, das Enzym, das eine Substrat-Spezifizität für L-Gutaminsäure aufweist und eine Reaktion katalysiert, bei der ein Mol α-Ketoglutarsäure, ein Mol Ammoniak und ein Mol Wasserstoffperoxid aus einem Mol L-Glutaminsäure, einem Mol Sauerstoff und einem Mol Wasser gebildet werden. Das Enzym wurde gereinigt, und es wurde festgestellt, daß es sich um ein einzelnes Protein handelt. Dieses erfindungsgemäße Enzym wurde als (H₂O₂ bildende) L-Glutaminsäure- Oxidase bezeichnet.

Die taxonomischen Eigenschaften der für die Gewinnung des erfindungsgemäßen Enzyms eingesetzten Mikroorganismen Streptomyces Art A7700 und A8063 sind die folgenden:

(A) Streptomyces Art A7700 I. Mikroskopische Morphologie

Die morphologischen Merkmale waren nach 10- bis 15tägiger Züchtung bei 30°C auf einem Medium aus Stärke- anorganischen Salz-Agar die folgenden. Praktisch sozusagen die gleichen Merkmale wurden beim Züchten auf einem Medium aus Hafermehl-Agar und beim Züchten auf einem Medium aus Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar gefunden.

Das Substrat-Myzel ist gekrümmt, es wächst verzweigt mit einem Durchmesser von 0,5-0,6 µm und hat weder myceliales Oidium noch Sporenträger.

Das Luftmyzel, das auf dem Substrat-Myzel wächst, ist gekrümmt, wächst mit einfachen Verzweigungen, 0,6- 0,8 µm im Durchmesser, und bildet Kettensporen. Die Sporenketten sind 2- bis 3gängige Spiralen, die teilweise schleifenförmig oder verhakt angeordnet sind.

Die Sporen haben elliptische Form oder sind kurze Stäbchen; sie sind 0,6-0,8 × 0,8-1,0 µm groß und haben eine glatte Oberfläche.

Es werden weder begeißelte Sporen noch Sporangien gebildet.

II. Komposition von Diaminopimelinsäure

Bei der vollständigen Zell-Analyse wurde L-Diaminopimelinsäure gefunden; meso-Formen wurden nicht entdeckt.

III. Makroskopische Merkmale

Die Merkmale auf verschiedenen Medien, 14 Tage bei 30°C, sind in Tabelle 1 veranschaulicht.

Die Farbbestimmungen wurden anhand des "Color Harmony Manual, 4th Edition, 1958 (Container Corp. of America)" gemacht.

IV. Physiologische Eigenschaften

(1) Wachstumstemperatur: 20-40°C
(2) Sauerstoffbedarf: aerob
(3) Gelatineverflüssigung: positiv (sehr schwach)
(4) Stärkehydrolyse: positiv
(5) Magermilch:
Peptonisation: positiv (schwach)
Koagulation: negativ
(6) Melaninartige Pigmentbildung:
Tyrosin-Agar: negativ
Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar: positiv
(7) Brauchbare Kohlenstoffquellen: positiv
L-Arabinose, D-Fructose, D-Glucose, Inositol, D-Mannitol, Raffinose, L-Rhamnose, Saccharose und D-Xylose.

Tabelle 1

Wie zuvor veranschaulicht, kommen der Art A7700 die taxonomischen Merkmale, Bildung von Luftmyzel mit zahlreichen Sporenketten an einem echten Substrat-Myzel, L-Form von Diaminopimelinsäure, keine Bildung begeißelter Sporen und Sporangien, sowie aerobes Wachstum zu, und das bedingt den Schluß, daß diese Art zu der Gattung Streptomyces gehört. Diese Art wird dementsprechend als Streptomyces sp. A7700 bezeichnet und wurde am 4.12.1981 hinterlegt beim Fermentation Institut, Agency of Industrial Science and Technology, M.I.T.I., Japan, unter der Hinterlegungsnummer FERM P-6241. Diese FERM P-6241-Hinterlegung wurde von der Hinterlegungsstelle in die FERM BP-2676-Hinterlegung umgewandelt.

(B) Streptomyces Art A8063 I. Mikroskopische Morphologie

Die morphologischen Merkmale waren nach 10- bis 15tägiger Züchtung bei 30°C auf einem Medium aus Stärkeanorganisches Salz-Agar die folgenden. Praktisch sozusagen die gleichen Merkmale wurden beim Züchten auf einem Medium aus Glycerin-Asparagin-Agar, Tyrosin-Agar und Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar gefunden.

Das Substrat-Myzel ist gekrümmt, es wächst verzweigt mit einem Durchmesser von 0,5-0,6 µm und hat weder myceliale Oidien noch Sporenträger.

Das Luftmyzel, das auf dem Substrat-Myzel wächst, ist gekrümmt, wächst mit einfachen Verzweigungen, 0,6- 0,8 µm im Durchmesser groß und bildet viele Kettensporen.

Die Sporenketten sind reich an Verschlingungen, Verhakungen und Doppelspiralen und weisen einige dreifache oder mehrfache Spiralen auf.

Die Sporen sind kugelförmig, 0,6-0,8 µm im Durchmesser groß und haben dornige Oberflächen. Es werden weder begeißelte Sporen noch Sporangien gebildet.

II. Komposition von Diaminopimelinsäure

III. Makroskopische Merkmale

Die Merkmale auf verschiedenen Medien, 14 Tage bei 30°C, sind in Tabelle 2 veranschaulicht.

Die Farbbestimmungen wurden wie für Tabelle 1 angegeben durchgeführt (siehe Tabelle 2).

IV. Physiologische Eigenschaften

(1) Wachstumstemperatur: 15-43°C
(2) Sauerstoffbedarf: aerob
(3) Gelatineverflüssigung: positiv (schwach)
(4) Stärkehydrolyse: positiv
(5) Magermilch:
Koagulation: negativ
Peptonisation: positiv
(6) Melaninartige Pigmentbildung:
Tyrosin Agar-Medium und Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar-Medium: positiv
(7) Brauchbare Kohlenstoffquellen:
positiv: D-Fructose, D-Glucose, D-Mannitol, D-Rhamnose und Saccharose,
schwach positiv: L-Arabinose, Inositol, Raffinose und D-Xylose.

Wie zuvor veranschaulicht, kommen der Art A8063 die taxonomischen Merkmale, Bildung von Luftmyzel mit zahlreichen Sporenketten an einem echten Substrat-Myzel, L-Form von Diaminopimelinsäure, keine Bildung begeißelter Sporen und Sporangien, sowie aerobes Wachstum zu, und das bedingt den Schluß, daß diese Art zu der Gattung Streptomyces gehört. Diese Art wird dementsprechend als Streptomyces sp. A8063 bezeichnet und wurde am 4.12.1981 hinterlegt beim Fermentation Institut, Agency of Industrial Science and Technology, M.I.T.I., Japan, unter der Hinterlegungsnummer FERM P-6242. Diese FERM P-6242-Hinterlegung wurde von der Hinterlegungsstelle in die FERM BP-2677-Hinterlegung umgewandelt.

Tabelle 2

Das erfindungsgemäße Enzym, die (H₂O₂ bildende) L-Glutaminsäure- Oxidase, ist ein Enzym, das eine Reaktion katalysiert, bei der ein Mol α-Ketoglutarsäure, ein Mol Ammoniak und ein Mol Wasserstoffperoxid aus einem Mol L-Glutaminsäure, einem Mol Sauerstoff und einem Mol Wasser gebildet werden.

Das erfindungsgemäße (H₂O₂ bildende) Enzym L-Glutaminsäure- Oxidase weist zumindest die folgenden biochemischen Eigenschaften auf:

Substrat-Spezifizität: L-Glutaminsäure
Enzymwirkung: Es wird eine Reaktion katalysiert, bei der ein Mol Glutaminsäure, ein Mol Sauerstoff und ein Mol Wasser zu einem Mol α-Ketoglutarsäure, einem Mol Ammoniak und einem Mol Wasserstoffperoxid umgesetzt werden, gemäß der nachstehenden Formel (I)

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung der erfindungsgemäßen (H₂O₂ bildenden) L-Glutaminsäure-Oxidase ist dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces sp. FERM BP-2676 oder Streptomyces sp. FERM BP-2677 in einem Nährmedium züchtet, und die dabei gewonnene (H₂O₂ bildende) L-Glutaminsäure-Oxidase isoliert.

Die erfindungsgemäße (H₂O₂ bildende) L-Glutaminsäure-Oxidase (die nachfolgend als L-Glutaminsäure-Oxidase (H₂O₂) bezeichnet wird) läßt sich ausreichend charakterisieren als ein Enzym, das die zuvor beschriebenen Eigenschaften der Substrat- Spezifizität und der enzymatischen Wirkung aufweist, und jegliche Enzyme, die diese gleichen Charakteristiken haben, sind naturgemäß solche erfindungsgemäßen Enzyme, auch wenn sie unterschiedliche isoelektrische Punkte, Km-Werte, pH-Optima, Hitzebeständigkeits- und pH-Stabilitätswerte haben und durch Zusätze inhibiert oder aktiviert werden.

Eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Gewinnung von L-Glutaminsäure-Oxidase (H₂O₂) aus solchen dieses Enzym produzierenden Mikroorganismen der Gattung Streptomyces ist die folgende:

Die das erfindungsgemäße Enzym produzierenden Mikroorganismen der Gattung Streptomyces werden in üblicher Weise in einem für Antibiotika- oder Enzymproduktion gebräuchlichen Nährmedium gezüchtet. Man kann feste oder flüssige Kulturen einsetzen, dabei ist für die Gewinnung des Enzyms im industriellen Maßstab das Submersverfahren besonders zweckmäßig.

Die Nährstoffquellen für die Mikroorganismen sind die üblichen Medien für Mikroorganismen-Züchtung. Als Stickstoffquellen können Quellen für assimilierbaren Stickstoff, beispielsweise Maisquellwasser, Sojabohnenpulver, Pepton, verschiedene Fleischextrakte, Hefeextrakte, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid oder Aminosäuren, wie beispielsweise L-Glutaminsäure, benutzt werden. Als Kohlenstoffquellen können Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff, wie beispielsweise Saccharose, Glucose, Fructose, Melassen, Malzextrakt oder Stärkehydrolysat eingesetzt werden. Zweckmäßig kann es weiterhin sein, verschiedene anorganische Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Kaliumphosphat oder Kaliumdihydrogenphosphat, sowie die Schaumbildung verhindernde Mittel mit zu benutzen.

Die Züchtungstemperaturen können verschieden sein, je nach dem, wie sie für die Produktion der L-Glutaminsäure-Oxidase (H₂O₂) und das Mikroorganismenwachstum erforderlich sind; sie liegen üblicherweise zwischen 20 und 35°C, vorzugsweise bei etwa 26°C.

Die Züchtungsdauer ist je nach den Arbeitsbedingungen unterschiedlich und beträgt üblicherweise 50 bis 120 Stunden. Das Züchtungsverfahren sollte möglichst dann beendet werden, wenn das Maximum an Enzymproduktion erreicht ist.

Die erfindungsgemäße L-Glutaminsäure-Oxidase (H₂O₂) ist ein Endo-Enzym und ist in den Zellen eingeschlossen.

Die erfindungsgemäße L-Glutaminsäure-Oxidase (H₂O₂) läßt sich isolieren in der Weise, daß man die bei der Züchtung gebildeten Zellen von der Brühe abtrennt, den feuchten Zellkuchen in einer Pufferlösung, wie beispielsweise Phosphatpuffer, Tris-HCl-Puffer oder Dimethylglutarat-NaOH-Puffer suspendiert, dann einer Behandlung mit einer französischen Presse, Ultraschallbehandlung, Zerkleinerungsbehandlung in einer Mahlmühle oder Lysozym-Behandlung unterwirft und so eine rohe Lösung von L-Glutaminsäure-Oxidase (H₂O₂) erhält. Diese Lösung wird in für Proteine und Enzyme bekannter Weise weiter gereinigt, und es wird daraus mit für diesen Zweck bekannten Methoden die gereinigte L-Glutaminsäure-Oxidase (H₂O₂) gewonnen.

Beispielsweise kann man die Enzymlösung einer Ausfällung mit organischem Lösungsmittel unterwerfen in der Weise, daß man organisches Lösungsmittel, wie beispielsweise Aceton, Methanol, Ethanol oder Isopropanol, zusetzt, oder man kann durch Zugabe von Ammoniumsulfat aussalzen; man kann chromatographisch unter Verwendung von Ionenaustauscher, wie beispielsweise Diethylaminoethylcellulose oder Diethylaminoethyl-Sepharose reinigen, oder auch für diesen Zweck die Gelfiltrations-Chromatographie unter Verwendung von Dextran-Gel oder Polyacrylamid-Gel einsetzen. Gereinigtes pulverförmiges Enzym kann man durch Kombination von zuvor angegebenen Arbeitsweisen und zum Schluß Lyophilisierung der Enzymlösung gewinnen.

Prüfmethode und biochemische Merkmale der erfindungsgemäßen L-Glutaminsäure-Oxidase (H₂O₂) sind folgende:

(1) Prüfmethode
0,3% 4-Aminoantipyrin\|0,3 ml
Peroxidase (50 U/ml)	0,1 ml
0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,0)	0,6 ml
0,2% N,N-Dimethyl-m-toluidin	0,3 ml
0,2 M L-Glutaminsäure (pH 7,0)	1,5 ml
Destilliertes Wasser	0,2 ml
insgesamt	3,0 ml

Dieses Gemisch (3,0 ml) wurde in eine Quarzzelle bei 37°C eingefüllt, unmittelbar danach wurde die Enzymlösung (50 µl) zugegeben und eingemischt, es wurde bei der konstanten Temperatur (37°C) in einen Zellenhalter eines Spektrophotometers eingesetzt, dann wurde, nachdem 2 Minuten lang mit der Enzymlösung vermischt worden war, exakt 5 Minuten lang bebrütet, und die Absorptions-Änderung (optische Dichte ΔA₅₄₅) bei 545 nm wurde gemessen.

Die Enzym-Aktivität wurde aus der nachstehenden Gleichung berechnet.

L-Glutaminsäure-Oxidase (H₂O₂)-Aktivität (Einheit/ml) (U/ml)

(2) Substrat-Spezifizität

Die relativen Aktivitäten (%) des mittels Streptomyces sp. A7700 produzierten Enzyms L-Glutaminsäure-Oxidase (H₂O₂) (nachstehend als A7700 Enzym bezeichnet) und des mittels Streptomyces sp. A8063 produzierten Enzyms L-Glutaminsäure- Oxidase (H₂O₂) (nachstehend als A8063 Enzym bezeichnet) wurden auf verschiedenen Substraten im Vergleich mit L-Glutaminsäure gemessen.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 veranschaulicht. Beide Enzyme haben spezifische Aktivität gegenüber L-Glutaminsäure und keinerlei Aktivität gegenüber den anderen in der Tabelle veranschaulichten Aminosäuren.

(3) Enzymwirkung

Als Substrat wurde L-Glutaminsäure (0,5 µmol) verwendet. Es wurden die Menge an verbrauchtem Sauerstoff und die Mengen an gebildeter α-Ketoglutarsäure, gebildetem Ammoniak und gebildetem Wasserstoffperoxid gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 veranschaulicht.

Tabelle 3

Tabelle 4

Verbrauchter Sauerstoff wurde mittels Sauerstoff-Elektrode gemessen. Gebildete α-Ketoglutarsäure wurde mit der 2,4-Dinitrophenylhydrazin-Methode (KAGAKU NO RYOIKI, Supl. 33, S. 99-104, "Spectrophotometory on biochemistry", in japanischer Sprache) bestimmt. Ammoniak wurde mittels der Indophenol-Methode (J. Biol. Chem., 102, 499 (1933)) gemessen. Wasserstoffperoxid wurde mittels colorimetrischer Prüfmethode mit Peroxidase-4-Aminoantipyrin-Phenol bestimmt.

Beide Enzyme katalysieren eine Reaktion, bei der ein Mol α-Ketoglutarsäure, ein Mol Ammoniak und ein Mol Wasserstoffperoxid aus einem Mol L-Glutaminsäure, einem Mol Sauerstoff und einem Mol Wasser gebildet werden (Reaktion gemäß Formel (I)).

(4) Isoelektrischer Punkt

Die isoelektrischen Punkte von A7700 Enzym und A8063 Enzym wurden unter Verwendung von Träger-Ampholyt pH 3,5-6,0 mittels der isoelektrischen Ausflockungsmethode bestimmt. Der isoelektrische Punkt des Enzyms A7700 lag bei etwa pH 4,3 und der isoelektrische Punkt des Enzyms A8063 lag bei etwa pH 4,1.

(5) Km-Wert

Der Km-Wert der beiden Enzyme gegen L-Glutaminsäure lag für A7700 bei etwa 5,6 × 10^-4 M und für das Enzym A8063 bei etwa 1,1 × 10^-3 M.

(6) pH-Optimum

Für die Ermittlung des pH-Optimums der Enzyme wurden Glycin-HCl-Puffer (pH 2,5-4,5), Dimethylglutarat-NaOH- Puffer (pH 4-7), Phosphat-Puffer (pH 6-8), Tris-HCl- Puffer (pH 7-9) und Glycin-NaOH-Puffer (pH 9-9,5) eingesetzt.

Die Ergebnisse sind für das Enzym A7700 in Fig. 1 und für das Enzym A8063 in Fig. 2 veranschaulicht.

In Fig. 1 bedeuten:
⚫: Glycin-HCl-Puffer,
×: Dimethylglutarat-NaOH-Puffer
▲: Phosphat-Puffer
∎: Tris-HCl-Puffer und
⬩: Glycin-NaOH-Puffer.

In Fig. 2 bedeuten:
○: Glycin-HCl-Puffer
×: Dimethylglutarat-NaOH-Puffer
∆: Phosphat-Puffer
: Tris-HCl-Puffer und
: Glycin-NaOH-Puffer.

In den Fig. 1 und 2 sind auf der Abszisse der pH-Wert und auf der Ordinate die relative Aktivität in % abgetragen. Man erkennt, daß das pH-Optimum für beide Enzyme bei pH 5-7,5 liegt.

(7) Hitzestabilität

Die Enzyme A7700 und A8063 wurden in 20 mM Phosphat-Puffer (pH 7,0) gelöst und bei verschiedenen Temperaturen 10 Minuten lang bebrütet. Dann wurde plötzlich in Eiswasser abgekühlt, und danach wurde die verbleibende Aktivität gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 veranschaulicht.

In Fig. 3 bedeuten:
⚫: die Werte für das Enzym A7700 und
○: die Werte für das Enzym A8063.

Auf der Abszisse ist die Temperatur in °C und auf der Ordinate die verbleibende Aktivität in % abgetragen.

Beide Enzyme sind bis zu 55°C stabil und bei 70°C denaturiert.

(8) pH-Stabilität

Es wurde die pH-Stabilität der Enzyme in verschiedenen Pufferlösungen gemessen. Die für das Enzym A7700 ermittelten Werte sind in Fig. 4 und die für das Enzym A8063 ermittelten Werte sind in Fig. 5 veranschaulicht.

Die Enzyme wurden in einer Konzentration von 40 mM in jeder Pufferlösung gelöst, 60 Minuten lang bei 37°C bebrütet und dann sofort abgekühlt, und es wurden die bei dem jeweiligen pH-Wert verbleibenden Aktivitäten gemessen.

Es wurden die folgenden Pufferlösungen für die jeweiligen pH-Werte verwendet:

Glycin-HCl-Puffer (pH 2,5-4,5) als ○ in den Fig. 4 und 5 markiert,
Dimethylglutarat-NaOH-Puffer (pH 4-7,5) als ⚫ in den Fig. 4 und 5 markiert,
Phosphat-Puffer (pH 6-8) als ∆ in den Fig. 4 und 5 markiert,
Tris-HCl-Puffer (pH 7-9) als ▲ in den Fig. 4 und 5 markiert, und
Glycin-NaOH-Puffer (pH 9-9,5) als in den Fig. 4 und 5 markiert.

Es sind in den Fig. 4 und 5 jeweils auf der Abszisse der pH-Wert und auf der Ordinate die verbleibende Aktivität in % abgetragen.

Man erkennt (Fig. 4), daß das Enzym A7700 bei pH 4,5-7,5 und (Fig. 5) das Enzym A8063 bei pH 4-7,5 stabil ist.

(9) Wirkung von Metallionen

Die Wirkung von Metallionen ist in Tabelle 5 veranschaulicht. Die Werte zeigen, daß von Cu⁺⁺ verschiedene Ionen keine Wirkung auf die Enzyme haben.

(10) Wirkung von Tensiden und anderen Substanzen

Die Wirkung verschiedener Substanzen auf die Enzym-Aktivität ist in Tabelle 6 veranschaulicht. Daraus, daß EDTA keine Wirkung hat, erkennt man, daß es sich bei beiden Enzymen nicht um Metalloenzyme handelt. Desgleichen werden beide Enzyme nicht durch NaN₃ und KCN inhibiert, und sie werden nicht durch FAD und FMN in ihrer Wirkung beeinträchtigt.

Wie veranschaulicht, haben die Enzyme A7700 und A8063 substratspezifische Wirkung auf L-Glutaminsäure und katalysieren eine Reaktion, bei der ein Mol α-Ketoglutarsäure, ein Mol Ammoniak und ein Mol Wasserstoffperoxid aus einem Mol L-Glutaminsäure, einem Mol Sauerstoff und einem Mol Wasser gebildet werden. Es handelt sich um ein neues Enzym, (H₂O₂ bildende) L-Glutaminsäure-Oxidase.

Tabelle 5

Tabelle 6

Mit den folgenden Beispielen wird die vorliegende Erfindung noch näher erläutert.

Beispiel 1

Ein Medium (100 ml, pH 7,0) mit 0,5% Pepton, 0,3% Fleischextrakt, 0,1% Hefeextrakt und 0,5% Malzextrakt wurde in einem 500-ml-Erlenmeyer-Kolben 20 Minuten lang bei 120°C sterilisiert. Es wurde mit einer vier Tage alten Kultur von Streptomyces sp. A7700 beimpft, und dann wurde 4 Tage lang bei 26°C bebrütet. Die durch Abzentrifugieren erhaltene Zellkultur wurde in einem Mörser mit Quarzsand zerkleinert. Durch Zugabe von 20 mM Phosphat- Puffer (pH 7,0) wurde das Enzym extrahiert, und der Extrakt wurde gesammelt. Es wurde berechnet, daß in der Kulturbrühe 0,13 µ/ml an L-Glutaminsäure-Oxidase (H₂O₂) vorhanden waren.

Beispiel 2

Es wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde anstelle von Streptomyces sp. A7700 der Mikroorganismus Streptomyces sp. A8063 FERM P-6242 verwendet. Es wurde berechnet, daß in der Kulturbrühe 0,59 µ/ml an L-Glutaminsäure-Oxidase (H₂O₂) vorhanden waren.

Beispiel 3

Es wurden zwei 500-ml-Erlenmeyer-Kolben, in denen je 100 ml eines Mediums mit 0,5% Pepton, 0,3% Fleischextrakt, 0,1% Hefeextrakt und 0,5% Malzextrakt enthalten waren, 20 Minuten lang bei 120°C sterilisiert. Dieses Medium wurde mit Streptomyces sp. A8063 beimpft, und es wurde 3 Tage lang bei 26°C gezüchtet.

Mit diesen Anzucht-Kulturen (200 ml) wurde ein Medium (20 Lit., pH 7,0) mit 0,5% Pepton, 0,3% Fleischextrakt, 0,1% Hefeextrakt und 0,5% Malzextrakt, das sich in einem 30-Liter-Fermenter befand, und das zuvor 20 Minuten lang bei 120°C sterilisiert worden war, beimpft, und dann wurde unter Belüftung mit 20 l/Min. und Rühren mit 300 UpM 96 Stunden lang bei 26°C gezüchtet. Die Kulturbrühe wurde 5 Minuten lang mit 5000 UpM zentrifugiert, und so wurden die gezüchteten Zellen erhalten. Die Zellen wurden in 20 mM Phosphat- Puffer (3 Lit., pH 7,0) suspendiert und mit einem "Dyno-Mill" genannten Gerät vermahlen. Die zermahlenen Zellen wurden 15 Minuten lang mit 5000 UpM zentrifugiert, und es wurden 2,82 Liter (11 200 Einheiten) an überstehender Lösung erhalten.

Zu der überstehenden Lösung wurde Ammoniumsulfat zugegeben, und es wurden diejenigen Fraktionen gesammelt, die bei 0,4-0,53 Sättigung ausfielen. Der Niederschlag wurde in 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gelöst und in ein Cellophan- Tubus eingegeben und 20 Minuten lang gegen 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,0, 12 Lit.) dialysiert. Das Dialysat wurde auf eine Säule (50 × 400 m/m), die aus DEAE-Sepharose CL-6B bestand, aufgegeben, und es wurde mit einem linearen Gradienten von 0-0,7 M KCl in 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) eluiert. Die mit 0,5 M KCl eluierten Fraktionen (130 ml, 6690 Einheiten) wurden mittels Cellophan-Tubus 18 Stunden lang gegen 6 Lit. 20 mM Phosphatpuffer dialysiert. Das Dialysat wurde im Vakuum konzentriert (auf 15 ml). Das Konzentrat wurde auf eine aus Sepharose CL-6B bestehende Säule aufgegeben und mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) eluiert, und es wurde das Eluat (80 ml, 5900 Einheiten) erhalten.

Dieses Eluat wurde durch Ultrafiltration auf 8 ml konzentriert und erneut auf eine aus Sepharose CL-6B bestehende Säule aufgegeben. Dann wurde mit der gleichen, wie zuvor beschriebenen Pufferlösung eluiert, und es wurde das Eluat (60 ml, 4890 Einheiten) gewonnen. Dieses Eluat wurde lyophilisiert, und man erhielt L-Glutaminsäure-Oxidase (H₂O₂) (78,9 mg, 58,2 U/mg, 4595 Einheiten).

Beispiel 4

Ein Medium (pH 7,0, 20 Lit.) mit 0,5% Pepton, 0,3% Fleischextrakt, 0,1% Hefeextrakt und 0,5% Malzextrakt wurde in einem 30-Lit.-Rüttelfermenter eingefüllt und 20 Minuten lang bei 120°C sterilisiert. Dieses Medium wurde mit einer 3 Tage lang bebrüteten Impfkultur (200 ml) von Streptomyces sp. A7700 beimpft, und dann wurde 96 Stunden lang unter aseptischer Belüftung mit 20 Lit./Min. und Rühren mit 300 UpM submers gezüchtet. Die Kulturbrühe wurde durch 5 Minuten langes Zentrifugieren mit 5000 UpM abgetrennt, und die dabei gewonnenen Zellen wurden in 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,0, 3 Lit.) suspendiert. Danach wurde mit Hilfe des Dyno-Mill- Gerätes der Zellkuchen zerkleinert. Die zerkleinerten Zellen wurden 15 Minuten lang mit 5000 UpM zentrifugiert, und es wurde die überstehende Lösung (2,84 Lit., 2950 Einheiten) gewonnen. Dazu wurde Ammoniumsulfat gegeben, und der bei 0,47-0,61 Sättigung entstandene Niederschlag wurde gesammelt. Die Ausfällung wurde in 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gelöst und in dem Cellophan-Tubus 20 Stunden lang gegen 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) dialysiert. Das Dialysat wurde auf eine aus DEAE-Sepharose CL-6B bestehende Säule aufgegeben und durch lineare Gradient-Eluierung mit 0-0,7 M KCl in 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) eluiert. Das Eluat bei etwa 0,5 M KCl wurde gesammelt, durch Cellophan-Tubus 18 Stunden lang gegen 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) dialysiert und konzentriert. Erneut wurde das Dialysat auf eine aus Sepharose CL-6B bestehende Säule aufgegeben, und das Eluat wurde konzentriert. Die Reinigung durch Chromatographie an der Sepharose CL-6B-Säule wurde wiederholt, und dann wurde das Eluat lyophilisiert. Dabei wurde L-Gluatminsäure-Oxidase (H₂O₂) als Pulver erhalten (22,0 mg, 49,5 Einheiten/mg, 1080 Einheiten).

Claims

1. Neue L-Glutaminsäure-Oxidase, gekennzeichnet durch die folgenden biochemischen Eigenschaften:

(i) Substrat-Spezifizität: L-Glutaminsäure,
(ii) Enzym-Wirkung: Es wird eine Reaktion katalysiert, bei der ein Mol L-Glutaminsäure, ein Mol Sauerstoff und ein Mol Wasser zu einem Mol α-Ketoglutarsäure, einem Mol Ammoniak und einem Mol Wasserstoffperoxid umgesetzt werden, gemäß nachstehender Formel

2. L-Glutaminsäure-Oxidase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym

(i) einen isoelektrischen Punkt bei pH 4,3 (ermittelt mittels Träger-Ampholyt pH 3,5-6,0),
(ii) einen Km-Wert für L-Glutamat von 5,6 × 10^-4 M,
(iii) ein pH-Wirkungsoptimum bei etwa pH 5-7,5,
(iv) eine Hitzebeständigkeit bis 55°C, und
(v) eine pH-Stabilität von pH 4,5-7,5

aufweist.

3. L-Glutaminsäure-Oxidase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym

(i) einen isoelektrischen Punkt bei pH 4,1 (ermittelt mittels Träger-Ampholyt pH 3,5-6,0),
(ii) einen Km-Wert für L-Glutamat von 1,1 × 10^-3 M,
(iii) ein pH-Wirkungsoptimum bei pH 5-7,5,
(iv) eine Hitzebeständigkeit bis 55°C, und
(v) eine pH-Stabilität von pH 4-7,5

aufweist.

4. Verfahren zur Gewinnung der L-Glutaminsäure-Oxidase nach Anspruch 1 oder Anspruch 1 und 2 oder Anspruch 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces sp. FERM BP-2676 oder Streptomyces sp. FERM BP-2677 in einem Nährmedium züchtet und die gebildete L-Glutaminsäure-Oxidase isoliert.