JPH01277495A - Ｌ―チロシン及びｌ―フエニルアラニンの２，５―ジヒドロキシフエニル酢酸への生物学的変換法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ポルフィリンの蓄積か光合成及び従属栄養の両方のバク
テリア、酵母及び原虫類を含めた多くの微生物類に見ら
れることがバラセル（Ｂ　ａｓｓｅｌ）らによりＪ　、
　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　　ｌ　２３　（１）　、　
　１９７５．１１８〜１２２頁に報告されている。殊に
、プロトポルフィリン区を蓄積し、そして分泌する酵母
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ　１ｉｐｏｌｙＬｉ
ｃａ　（サツカロミコプシス・リポリティカ）有性形態
Ｃａｎｄｉｄａ　Ｉ　１ｐｏ１ｙｔｉｃａ　（カンジダ
・リポリティ力）［ここにＹａｒｒｏｗｉａ　ｌ１ｐｏ
ｌｙＬｉｃａ　（ヤロウイア・リボリテイ力）と称する
］の突然変異体が報告されている。

フミキ（Ｆ　ｕｍｉｋｉ）ら、Ａ　ｇｒｉｃ、　Ｂ　ｉ
ｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　。

４９　（３）、１９８５．８７８〜８７９頁にフェニル
酢酸から２．５−ジヒドロキシフェニル酢酸（ホモゲン
チジン酸−ＨＡ）へ転化させる能力が菌・カビ（ｆｕｎ
ｇｕｓ）に広く存在することが報告されている。アスペ
ルギルス属（Ａ　ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ペニシリウ
ム属（Ｐ　ｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）　、ジッペレラ属（
Ｇ　１ｂｂｅｒｅｌｌａ）　、フーザリウム属（Ｆ　ｕ
ｓａｒｉｕｍ）、ケカヒ属（Ｍｕｃｏｒ）　、クモノス
カヒ属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）　、ヘルミントスポリウム
属（Ｈｅ１ｍｉｎｔｏｓｐｏｒｉｕ＋ｎ）、シリンドロ
カプロン属（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｐｒｏｎ）、パン機
成（Ｎ　ｅｕｒｏｓｐｏｒａ）　、セファロスポリウム
属（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）　、ケトミジウム
属（Ｃｈａｅｔｏｍｉｄｉｕｍ）　、モルテイエレラ属
（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）、フェリナス属（Ｐ　ｈｅ
ｌｌｉｎｕｓ）　、ペリキュラリア属（ｐ　ｅｌｌｉｃ
ｕｌａｒｉａ）及びヒソクラミス属（Ｂ　ｙｓｓｏｃｈ
ｌａｍｙｓ）の菌・カビに関する実験が報告されている
。

ホモゲンチジン酸のアミド及びエステルか毛髪の酸化染
料において有用なものとして米国特許第４．４７９，８
０３号に記載されている。

米国特許第４，１８２，７２０号において、ホモゲンチ
ジン酸の先駆体であるホモゲンチジン酸ラクトンの製造
方法が開示され、ここにホモゲンチジン酸は写真染料発
色剤並びに染料及び薬の製造における中間体として価値
あるものとして特徴づけられる。

オエデイガ−（Ｏｅｄｉｇｅｒ）らによる米国特許第３
．５５１，４３８号にホモゲンチジン酸ラクトンをある
アミンと反応させて低い毒性を有する強く、そして長く
続く胆汁分泌活性（ｃｈｏｌｅｒｅＬｉｃ　ａｃｔｉｖ
ｉｔｙ）を示すホモゲンチジン酸またはそのアミン誘導
体を製造することが開示されている。

遺伝子の突然変異による生化学的ブロックは代謝中間体
の蓄積を生しさせることが公知である。

ヒトアミノ酸、特にＬ〜チロシン及びＬ−７工ニルアラ
ニン代謝における遺伝子欠損であるアルカプトン尿症は
１８５９年及び１８９１年に定義され、蓄積され、そし
て尿を暗色にする化合物はジヒドロキシフェニル酢酸と
しても知られるホモゲンチジン酸として同定された［テ
キス１−ブック・オブ・バイオケミストリー・クイズ・
クリニカル・コリレーションズ（Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏ
ｆ　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｗｉｔｈ　Ｃ１ｉｎｉ
ｃａｌ　Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ）　、５８９−５９
１頁、Ｔ、Ｍ、デブリン（Ｄ　ｅｖｌｉｎ）編、ウィリ
ー　（Ｗｉｌｅｙ）　、　　ｌ　９８２　、ニューヨー
ク］。続いての研究により食事におけるアミノ酸の不平
衡、即ち富チロンンまたは富蛋白質の食料がチロシン及
びフェニルアラニンの正常なヒト及び哺乳類の代謝も妨
害し、かくてホモゲンチジン酸の排出を生じさせること
が示された［ニューベルガー（Ｎ　ｅｕｂｅｒｇｅｒ）
ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ　、４４　、　　ｌ　９４５　
。

４３８〜４４９頁：ニューベルガー、Ａ及びウェブスタ
ー（Ｗｅｂｓｔｅｒ）　、　Ｔ、Ａ−、Ｂｉｏｃｈｅｍ
、Ｊ　、　　４±、１９４７．４４９〜４５７頁１゜ま
た微生物、殊にある菌・カビはある場合に唯一の炭素源
としてチロシン及びフェニルアラニンを同化することが
できる。また遺伝的欠損はこれらの生体中のアミノ酸径
路を乱し、そして代謝中間体の蓄積を生じさせ得る。ア
ミノ酸異化に対して確立された径路である、ホモゲンチ
ジン酸を介してチロシンまたはフェニルアラニンを消化
する菌・カビは適当な遺伝的突然変異が更に他の化合物
へのその分解を防止する場合にホモゲンチジン酸を蓄積
することが期待された。チロシン及びフェニルアラニン
代謝における欠損のために事実この現象を示し、そして
ホモゲンチジン酸を分泌する菌・カビＹａｒｒｏｗｉａ
　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａの突然変異体が単離された。こ
の突然変異株を増殖させる場合に０．５％の最適以下の
Ｄ−グルコース濃度を用いることにより酵母バイオマス
の急速な生育及び発生が可能となるが、また生育の後続
段階でのこの好適な炭素源の濃度が限定され、かくて続
いての利用並びにＬ−チロシン及びＬ−フェニルアラニ
ンのホモゲンチジン酸の生物変異（ｂｉｏｔｒａｎｓｆ
ｏｒｍａｔｉｏｎ）を促進する。

本発明は生物学的物質の、必要に応して適所で重合させ
てメラニン顔料を生成させ得るホモゲンチジン酸（２，
５−ジヒドロキシフェニル酢酸）への生物変換を包含す
る。Ｙ　ａｒｒｏｗｉａ　ｌ　１ｐｏｌｙｔｉｃａの突
然変異体ＹＢ３−１８０がＬ−チロシンまたはＬ−フェ
ニルアラニンのいずれかをホモゲンチジン酸に転化させ
る能力を有することが見い出された。この株はブダペス
ト条約（Ｂ　ｕｄａｐｅｓｔ　Ｔ　ｒｅａｔｙ）の協定
下でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（
Ａ　ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔ　ｙｐｅ　ＣｕｌｔｕｒｅＣｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ）に供託され、受託番号ＡＴＣＣ２０
８７５に指定された。細胞生育を支持するために用いる
炭素源は炭水化物例えばＤ−グルコースまたは炭水化物
例えばヘキサデカンのいずれかであり得る。この生物変
換は０．５％Ｄ−グルコース及ヒ５　ｍＭ　Ｌ−チロシ
ンまたはＬ−フェニルアラニンを有する通気された合成
培地中で少なくとも４０％の効率［アミノ酸（複数）の
ホモゲンチジン酸への転化に関して１であり、そして培
養培地中へのホモゲンチジン酸の分泌を生じさせる。

ヘキサデカンまたはＤ−グルコース養育細胞により生成
させる培養液がアルカリ性で調製される場合、アミノ酸
から誘導されるホモゲンチジン酸は迅速に、且つ非酵素
的にメラニン顔料に転化される。またホモゲンチジン酸
及びメラニン顔料はヘフＩ・ンがＬ−チロシン及びＬ−
フェニルアラニンの如きアミノ酸を含むペプチド及び蛋
白質からなるため、酵母抽出液及びアミノ酸源としての
ペプトンと一緒にＤ−グルコースを含む富培地中に生成
され得る。これらの状況下で、顔料はｐＨ調整を必要と
せずに生成される。更にまた、芳香族アミノ更にを分泌
するバチルス（Ｂ　ａｃｉｌｌｕｓ）　種−〇〜 は、これらの微生物がＹ　、１ｉｐｏｌｙｔｉｃａと共
に培養される場合に生物変換に対する基質源としても使
用し得る。かくて、Ｌ−チロシンまたはＬ−７エニルア
ラニンを分泌し、そしてＹ　、１ｉｐｏｌｙｔｉｃａと
共に培養し得る微生物をアミノ酸基質源として使用し得
る。

また本発明は結晶化に続いての酢酸エチルの添加による
Ｙ　、１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ培養培地からのホモゲンチ
ジン酸の抽出及び精製を包含する。またホモゲンチジン
酸及びその反応生成物メラニン顔料の両方の単離にイオ
ン交換クロマトグラフィーが有効である。

次の実施例に記載されるホモゲンチジン酸の製造に用い
るＹ　、１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ突然変異体ＡＴＣＣ２０
８７５はＡＴＣＣ１８９４３（ＮＲＲＬ　　ＹＢ４２３
−３）（ＹＢ４２３−３としても公知）から誘導された
ＹＢ３−１２２　（イノシトール必要性）から誘導され
た。ＡＴＣＣ２０８７５はイノシトールを有する最少培
地上にＹＢ３−１２２を平板培養する際に出現し、そし
てその直接の親株のＡＴＣＣ１８９４３（ＮＲＲＬ　　
ＹＢ４２３−３）（野性タイプ）及びＹＢ３−１２２（
イノシトール必要性）からスクリーニングする際に利用
される褐色の色調が観察される自然の突然変異体である
。突然変異体はスルホン酸エチルメタンを用いる変異誘
発によりＡＴＣＣ１８９４３から誘導された株ＹＢ３−
１２２の自然の突然変異体として誘導された。本明細書
に記載される生物変換は突然変異体ＡＴＣＣ２０８７５
がその親株とは異なって唯一の炭素源としてＬ−チロシ
ンを利用することができないことから可能である。−旦
り一グルコースが同化され、そして細胞塊を発生させる
ために用いられた場合、Ｌ−チロシンは異化される。Ｌ
−チロシン及びＬ−フェニルアラニン分解中に認められ
る中間体であるホモゲンチジン酸はこれらのアミノ酸の
消化に対する径路における生化学的ブロックの結果とし
て培養培地中に蓄積される。

培養培地中または精製されたホモゲンチジン酸を用いる
メラニン顔料製造は酸がアルカリ条件下で自発的に重合
して特徴的な褐色の色調のこの物質を生成させるために
可能である。種Ｙ　、ｌ１ｐｏｌｙｔｉｃａの菌・カビ
株の好適な調節ステータス（ｓｔａｔｕＳ）に結合する
この色調は飲料用または化粧用のカラメル色素にも使用
される際に適するメラニン顔料を生成させる。

ホモゲンチジン酸は０．５％Ｄ−グルコース及び５ｍＭ
Ｌ−チロシンまたは５ｍＭＬ−フェニルアラニンを含む
通気された所定の最少塩培地（イノシトールを補う）中
にて２８°Ｃで３〜４日間振盪培養器中でＹ　、１ｉｐ
ｏｌｙｔｉｃａ　Ａ　Ｔ　ＣＣ２０８７５を生育させる
ことにより実験室規模で製造し得る。例えば濾過または
遠心分離によるバイオマスの除去後、酸をロータリー・
エバポレータにより細胞を含まぬ培養培地中で濃縮し、
そして酢酸エチルで抽出し、その際に真空中で濃縮して
結晶を生成させることができる。入手し得るＬ−チロシ
ンの少なくとも４０％をホモゲンチジン酸に転化し、こ
のものは質量分析及び核磁気共鳴により同定した。

実施例Ｉ Ｌ−チロシンからのホモゲンチジン酸（ＨＡ）の製造 Ｙ　ａｒｒｏｗｉａ　Ｉ　１ｐｏｌｙＬｉｃａ突然変異
株ＡＴＣＣ２０８７５の培養液１．２５αをニュー・プ
ランスウイツク（Ｎ　ｅｗ　Ｂ　ｒｕｎｓｗｉｃｋ）培
養器−振盪基中にて２８°Ｃで培養され、そして２２５
ｒｐｍで回転した２、８Ｑ、入りＦ　ｅｒｕｂａｃｈフ
ラスコ中で生育させた。接種物を次の組成の液体栄養培
地２５ｍＱ中で一度生育させ、その際に栄養培富地は酵
母の如き他の微生物または牛肉の抽出液を含む未同定の
培地であり、そして合成最少培地は化学的に同定された
培地であった。

栄養富培地（未同定） 培地ＩＱ、に対して酵母抽出液１０ｇ１ペプトン２０ｇ
、Ｄ−グルコース２０ｇ１脱イオン化水１０００ｍρ 合成最少培地（同定） 培地ｌＱに対する塩ニリン酸カリウム（−塩基性）Ｉｇ
ＸＮａＣＱ　Ｏ，１ｇ、ＣａＣＬＯ８ｌ　ｇ　：ビタミ
ン：ビオチン２μｇ１パントテン酸カルシウム４００μ
ｇ１葉酸２μｇ１ニアシン４００μｇ、ｐ−アミノ安息
香酸２００μｇ、ピリドキシンＨＣ（１４００／’　ｇ
　％　　リボフラビン２００μｇ。

チアミン−ＨＣ１４００μｇ；微量成分ニホウ酸０．５
ｍｇ、Ｃｕ５Ｏａ０．０４ｍｇ、’　　ＫＩ　　Ｏ，１
ｍｇ、ＦｅＣＱ　３０−２ｇＸＭｎＳＯｔ０．４ｍｇｓ
ＮａＭｏ０４０．２ｍｇ５　ＺｎＳＯ４０，４ｍｇ；他
の添加物：　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４０，５ｇ、硫酸アンモニ
ウム５ｇ、　　ミオ−イノシトール２ｍｇ５　Ｄ−グル
コース５ｇ、脱イオン化水１０００＋＋＋（２；芳香族
アミノ酸：必要に応じて加えられるＬ−チロシンまたは
Ｌ−フェニルアラニン。

増殖後、細胞を遠心分離し、そして滅菌水で２回洗浄し
た。５ｍＭＬ−チロシンを補った合成培地を含むＦ　ｅ
ｒｎａｃｈフラスコを培養して１ｍ（２当りｌ×ＩＯ５
個の細胞の濃度を与えた。振盪−培養器中で５日間培養
後、細胞を遠心分離により除去し、上澄のｐＨ値をＨ２
ＳＯ，でｐＨ３，０に調整し、そして培養液を０．４５
μフイルター装置を用いて濾過滅菌した。透明な溶液を
分析前に０〜５°Ｃで貯蔵した。

上記により得られた培養液をロータリー・エバポレータ
により濃縮し、酢酸エチルで抽出し、そして真空中で濃
縮してホモゲンチジン酸の結晶を生成させた。定量分析
により最少塩培地に追加されたＬ−チロシンの少なくと
も４０％がホモゲンチジン酸に転化された。ホモゲンチ
ジン酸の収率は供給されたＬ−チロシンの量に比例する
ことが分った。質量分析及び核磁気共鳴による最終生成
物の定量分析は共に生成物がホモゲンチジン酸であるこ
とを示した。

Ｌ−チロシン生育細胞で得られた培養液の最終調製物は
ＮＨ，○Ｈを用いてｐＨ値を１０に調整することにより
褐色のメラニン顔料の溶液に迅速に転化することができ
た。Ｌ−フェニルアラニンで生育された細胞から得られ
た培養液を中和剤で処理した場合に同様な事が観察され
た。野性タイプのＹ　、　ｌ１ｐｏｌｙｔｉｃａＡ　Ｔ
　ＣＣｌ　８９４３及び突然変異体ＹＢ３−１２２はこ
れらのものが唯一炭素源としてＬ−チロシンで生育し得
るために同様な条件下で微量のみの（突然変異体の０．
１％より少ない）褐色色素を生成させた。

実施例２ 栄養培地中のホモゲンチジン酸を介しての製造Ｙ、　ｌ
１ｐｏｌｙｔｉｃａ突然変異株ＹＢ３−１８０を上記の
栄養培地中で生育させてホモゲンチジン酸及びメラニン
顔料を生成させた。酵母生育中に栄養培地の蛋白質成分
（ペプトン）が分解し、これによりＬ−チロシン及びＬ
−フェニルアラニンが放出された。これらの及び他のア
ミノ酸の異化によりアンモニアが放出され、これにより
約５日後に培地のｐＨ値が１１に上昇した。このｐＨ変
化により、分泌されたホモゲンチジン酸は重合して培養
培地は暗褐色に変化した。重合は通気及びアルカリ条件
に依存した。メラニン顔料はアセトン３容量で沈殿し：
培養培地の透析及び凍結乾燥後に栄養培地１１２当り少
なくとも３５ｍｇの褐色顔料を回収することができた。

この方法で製造されたメラニン顔料は実施例１に記載の
合成培地を用いて得られた物質と同し特性を有していた
。

本発明の主なる特徴及び態様は以下のとおりである。

１、培地が最適以下の菌・カビに同化され得る炭水化物
の濃度を含む、Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニンま
たはその混合物を含む栄養生長培地または合成最少培地
中て唯一の炭素径路としてのＬ−チロシン及び／または
Ｌ−フェニルアラニン上で生育し得ない株を与えるよう
に突然変異された菌・カビを、回収し得る量のホモゲン
チジン酸を製造するに適する期間及び条件下で生育させ
ることからなる、ホモゲンチジン酸の製造方法。

２、菌・カビがＹａｒｒｏｗｉａ　１ｉｐｏｌｙｔｉｃ
ａ種の酵母である、上記１に記載の方法。

３、酵母がＹ　、　１ｉｐｏｌｙＬｉｃａＡ　Ｔ　ＣＣ
２０８７５である、上記２に記載の方法。

４、Ｌ−チロシン及ヒ／またはＬ−フェニルアラニンを
これらのアミノ酸の１つまたは両方を含むポリペプチド
から適所に発生させる、上記ｌに記載の方法。

５　、　Ｙａｒｒｏｗｉａ　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａをＬ
−チロシン及び／またはＬ−フェニルアラニンを分泌し
、そして生育段階中にＹ、　ｌ１ｐｏｌｙｔｉｃａと適
合する微生物と一緒に培養する、上記２に記載の方法。

６、ホモゲンチジン酸の生成後に培地のｐＨ値を少なく
とも約１０に上昇させてホモゲンチジン酸を迅速に重合
させ、これによりメラニン顔料を生成させる、上記１に
記載の方法。

７、上記ｌに記載の方法により製造されたホモゲンチジ
ン酸。

８　、　Ｙａｒｒｏｗｉａ　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａにお
いて、該株の誘導体及び突然変異体と共にＡＴＣＣ２０
８７５の同定特性を有する該Ｙａｒｒｏｗｉａ　　１ｉ
ｐｏｌｙｔｉｃａ。

特許出願人　マイルス・インコーボレーテッド＝１５−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、培地が最適以下の菌・カビに同化され得る炭水化物
   の濃度を含む、Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニンま
   たはその混合物を含む栄養生長培地または合成最少培地
   中で唯一の炭素径路としてのＬ−チロシン及び／または
   Ｌ−フェニルアラニン上で生育し得ない株を与えるよう
   に突然変異された菌・カビを、回収し得る量のホモゲン
   チジン酸を製造するに適する期間及び条件下で生育させ
   ることからなる、ホモゲンチジン酸の製造方法。 ２、培地が最適以下の菌・カビに同化され得る炭水化物
   の濃度を含む、Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニンま
   たはその混合物を含む栄養生長培地または合成最小培地
   中で唯一の炭素径路としてのＬ−チロシン及び／または
   Ｌ−フェニルアラニン上で生育し得ない株を与えるよう
   に突然変異された菌・カビを、回収し得る量のホモゲン
   チジン酸を製造するに適する期間及び条件下で生育させ
   る方法により製造されたホモゲンチジン酸。 ３、Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにおいて、
   該株の誘導体及び突然変異体と共にＡＴＣＣ２０８７５
   の同定特性を有する該Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔ
   ｉｃａ。