JPH08258A - キャンディダ属に属する微生物およびそれを用いたイノシトールの製造方法 - Google Patents

キャンディダ属に属する微生物およびそれを用いたイノシトールの製造方法

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JPH08258A
JPH08258A JP17531794A JP17531794A JPH08258A JP H08258 A JPH08258 A JP H08258A JP 17531794 A JP17531794 A JP 17531794A JP 17531794 A JP17531794 A JP 17531794A JP H08258 A JPH08258 A JP H08258A
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inositol
cells
candida
genus candida
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JP17531794A
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Makoto Shirai
真 白井
Toru Yonehara
徹 米原
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Toray Industries Inc
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Abstract

(57)【要約】 【構成】イノシトールを菌体外に分泌する性質を有す
る、キャンディダ属に属する微生物およびそれを用いた
イノシトールの製造方法。 【効果】本発明の微生物を用い、本発明の発酵法および
菌体を用いた反応により、既存の方法と比較し、より経
済的なイノシトールの生産が可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】イノシトールは、高等動物におい
てビタミンの一種として重要な物質で、栄養食品、飼料
添加物、医薬品などに利用される。
【0002】
【従来の技術】従来イノシトールは、米糠、コーンステ
ィープリカーなどからの抽出(特開昭61−56142
号公報)、パン酵母を培養して製造する方法(Eur.
Pat.506289(1992))などが知られてい
る。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】米糠、コーンスティー
プリカーなどから抽出する方法は、イノシトール以外の
不純物が多く、精製が困難であり、経済的に問題があ
る。また、パン酵母を培養して製造する方法は、生産性
が低く、やはり経済的に問題があり、さらに工業的実績
もない。また、パン酵母以外にはイノシトールを菌体外
に分泌する微生物は、知られていない。
【0004】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
点を解決するため、パン酵母以外にイノシトールを生産
する潜在能力を持つ微生物を探索し、イノシトールを菌
体外に分泌する微生物を広く検討した結果、キャンディ
ダ属に属する微生物の変異株がイノシトールを菌体外に
分泌することを見い出した。通常の発酵法、すなわち、
炭素源および窒素源などを添加し、微生物が増殖しなが
ら、生産物を生成する方法で、イノシトールが菌体外に
生成蓄積されることは当然であるが、さらに通常の発酵
法とは異なり、培養によって得られた菌体または培養
物、もしくはそれらの処理物を用い、事実上微生物の増
殖が停止し、酵素反応のみが行われる条件(以後酵素法
と記す)で、炭素源からイノシトールを生成し、菌体外
に分泌することも見い出した。
【0005】すなわち、本発明は、イノシトールを菌体
外に分泌する性質を有する、キャンディダ属に属する微
生物およびそれを用いたイノシトールの製造方法であ
る。
【0006】本発明に使用する微生物は、キャンディダ
属に属する微生物であるならばいずれでもよいが、特に
本発明者らが、樹液からメタノールを唯一の炭素源とし
て利用できる微生物として単離し、本発明者らの研究室
で保存されていた、キャンディダ・ボイディニイ(Ca
ndida boidinii)TR−1(工業技術院
生命工学工業技術研究所寄託第14261号)からイノ
シトールを分泌する変異株として取得されたキャンディ
ダ・ボイディニイ(Candida boidini
i)IP−2(工業技術院生命工学工業技術研究所寄託
第14262号)であることが好ましい。イノシトール
を分泌する性質があれば、他に、薬剤に対する耐性、栄
養要求性などの性質があってもよく、イノシトールを分
泌するキャンディダ属に属する微生物はすべて本発明に
含まれるものである。
【0007】上記キャンディダ・ボイディニイ(Can
dida boidinii)TR−1およびキャンデ
ィダ・ボイディニイ(Candida boidini
i)IP−2の菌学的性質を以下に示す。
【0008】(a)培養的、形態的性質 (1)麦芽汁液体培地での培養:黄色〜クリーム色で良
好に生育し、均一の懸濁状態となる。細胞の形は長い楕
円形でわずかに湾曲しているものもある。大きさは1.
5〜3.5X7〜12 ミクロン (2)麦芽汁固体培地での培養:黄色〜クリーム色で光
沢はほとんどなく、コロニーは明瞭でよく盛り上がった
状態で、柔らかく、湿潤性である。
【0009】(3)コーンミール寒天培地によるダルモ
ー平板培養:菌糸に類似した形状に、細胞が鎖状につな
がり、枝別れも見られる。
【0010】(b)胞子形成 麦芽エキス寒天培地ほか数種の培地で胞子の形成は認め
られない。
【0011】(c)生理学的、化学分類学的性質 (1)最適生育条件pH3〜7、温度15〜37℃ (2)生成しうる条件pH2〜9、温度5〜47℃ (3)死滅温度50℃ (4)硝酸塩を資化する。
【0012】(5)ゼラチンを液化しない。
【0013】(6)エタノールを唯一炭素源としてよく
生育する。
【0014】(7)カロチノイドを生産しない。
【0015】(8)リトマスミルク反応はない。
【0016】(9)エステルを生産しない。
【0017】(10)脂肪を分割しない。
【0018】(11)酸を生産する。
【0019】(12)デンプン類似物質を生産しない。
【0020】(13)ジアゾニウムブルーB反応マイナ
ス。
【0021】(14)糖の発酵:グルコース、ラクトー
ス、マンノースをよく発酵する。デンプン、トレハロー
ス、ラフィノースをきわめて微弱に発酵する。ガラクト
ース、マルトース、サッカロース、ラフィノース、イノ
シトールを発酵しない。
【0022】(15)糖の資化:グルコース、フラクト
ース、ラクトース、マンノース、キシロース、マンニト
ールをよく資化する。ガラクトースをわずかに資化する
が、まましない場合がある。サッカロース、マルトー
ス、トレハロース、ラフィノース、デキストリン、デン
プン、イヌリン、アラビノース、ラフィノース、イノシ
トールは資化しない。
【0023】(16)炭素源の利用性 メタノール、エタノール、グリセリンをよく利用する。
ピルビン酸、フマール酸、α- ケトグルタル酸、イソプ
ロパノールを利用する。クエン酸、プロパノール、エチ
レングリコール、プロピレングリコール、エチレングリ
コール、アセトアルデヒド、グリシン、グルタミン酸、
アスパギン酸、L-アラニンをわずかに利用する。
【0024】(17)窒素源の利用性 ペプトン、硫安、塩安、硝安、硝酸ソーダ、尿素、チオ
尿素、L-グルタミン酸、グリシン、DL- アラニン、アス
パラギンを利用する。亜硝酸ソーダを利用しない。
【0025】(18)ビタミン要求性 ビオチンを要求
する。
【0026】(19)アミノ酸要求性 なし。
【0027】本件微生物は、したがって、ジャーナル・
オブ・ジェネラル・アンド・アプライド・マイクロバイ
オロジー(J.Gen.Appl.Microbio
l.)26,133−158(1980)(特に第15
2ページ)において示されるようにキャンディダ・ボイ
ディニイであると同定された。
【0028】本発明で用いられるイノシトール分泌株の
代表的なものとして、キャンディダ・ボイディニイ I
P−2株があげられる。この変異株はキャンディダ・ボ
イディニイ TR−1株(野性株)を親株として、通常
の変異処理方法によって得られたもので、イノシトール
分泌性の変異株である。
【0029】変異株の誘導は親株を紫外線照射するか、
あるいは変異誘発剤(例えばN−メチル−N’−ニトロ
−N−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホン酸
等)で処理した後、公知の方法でイノシトール分泌性の
変異株を得ることができる。例えば親株を変異誘発処理
の後、天然培地などの良好に生育する寒天培地に生育さ
せ、生育したコロニーを、あらかじめイノシトール要求
性の菌株の菌体懸濁液を広げておいた、イノシトールを
含まなく、キャンディダ・ボイディニイが生育すること
が可能でかつイノシトールが存在すればイノシトール要
求性の菌株が生育するような寒天培地へレプリカする。
数日間培養した後、イノシトール分泌性の変異株の周り
には、イノシトール要求性の菌株の生育が認められ、レ
プリカした元の寒天培地から、純粋な変異株として分離
することが可能である。
【0030】本発明の発酵法における培養方法について
説明する。イノシトール生産用の培地は、炭素源、窒素
源、無機イオンおよび必要に応じてその他の有機微量成
分を含有する通常の培地が使用できる。
【0031】炭素源としては、グルコース、フラクトー
ス、でんぷんおよびセルロースの加水分解物、糖蜜など
の糖類、フマール酸、クエン酸、コハク酸のごとき有機
酸、メタノール、エタノール、グリセロールのごときア
ルコール類などを1〜15%、窒素源として、酢酸アン
モニウムのごとき有機アンモニウム塩、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アン
モニウム、のごとき無機アンモニウム塩、アンモニアガ
ス、アンモニア水、尿素等を0.1〜4.0%、有機微
量成分としては、ビオチン等の被要求性物質が0.00
0001%〜0.1%、また必要に応じて、コーンステ
ィープリカー、ペプトン、酵母エキス等0〜5%をそれ
ぞれ適当に含有する培地が好ましく用いられる。これら
の他に、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カル
シウム、塩化ナトリウム、硫酸亜鉛、硫酸銅、硫酸第1
鉄、等が微量成分として添加されるのが好ましい。また
好ましくは消泡剤なども添加し、培養条件の安定化をは
かる。
【0032】培養は通常、好気条件で行う。培養の間、
培地のpH3〜8に、温度は20〜35℃に調節し、2
4〜96時間振とうまたは通気撹拌培養すれば好ましい
結果が得られる。
【0033】次に本発明における酵素法でのイノシトー
ルの生産方法について説明する。前記発酵法における培
地と同様に培養し、菌体を得る。この菌体をそのまま反
応に用いてもよいが、好ましくは公知の方法で原形質分
離(プラスモリシス)化処理を行う。
【0034】反応原料としては、一般にしられているイ
ノシトール生合成の前駆体である、グルコース−6−リ
ン酸あるいはさらにグルコース−6−リン酸の前駆体で
あるグルコースを使用することができる。反応はニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)、アンモニ
ウムイオン、の存在下で行なうのが好ましく、グルコー
スを前駆体とする場合には、さらにマグネシウム、アデ
ノシン−3−リン酸もしくはその前駆体を添加すること
が好ましい。なお、これらのイノシトール生合成に必要
な化合物群は、各々単独に添加してもよいが、これらを
含む天然由来の混合物をかわりに使用することも可能で
ある。また、SH基保護剤など反応を安定化するための
添加物を含んでもよい。反応の間、反応液のpH3〜8
に、温度は20〜35℃に調節し、10〜72時間振と
うまたは通気撹拌すれば好ましい結果が得られる。
【0035】培養液あるいは反応液に蓄積されたイノシ
トールは、そのまま単離精製することなく、飼料などに
用いることができる。また、培養液あるいは反応液から
イノシトールを単離採取するには公知の方法で可能であ
る。例えば、菌体を遠心分離などで除去した後、カチオ
ンおよびアニオン交換樹脂でイオン性の物質を除き、濃
縮すれば結晶を取得することができる。
【0036】
【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。
【0037】実施例1 (イノシトール分泌変異株の分離)キャンディダ・ボイ
ディニイTR−1の菌体を常法によりN−メチル−N’
−ニトロ−N−ニトロソグアニジン処理(300μg /
ml)、30℃10分)した後、この細胞を適当に希釈
し、表1に示した培地に15g /l の濃度に寒天を加え
た平板培地に塗布し、30℃で2日間培養した。一方サ
ッカロマイセス・セレビシアエATCC34893を、
表1に示した培地5mlに1白金耳植菌し、1日間30℃
で振とう培養し、生理食塩水で洗浄後、適当量を表2に
示した培地(平板培地)に塗布した。表1に示した培地
に生育してきた変異処理したキャンディダ・ボイディニ
イTR−1のコロニーを、常法によりサッカロマイセス
・セレビシアエATCC34893を塗布した表2に示
した培地(平板培地)にレプリカし、30℃で2日間培
養した。レプリカされたコロニーのまわりに、サッカロ
マイセス・セレビシアエATCC34893の生育の認
められるコロニーを確認し、元の平板培地(表1)か
ら、純粋な変異株として単離し、キャンディダ・ボイデ
ィニイIP−2を取得した。
【0038】
【表1】
【0039】
【表2】
【0040】実施例2 (発酵法によるイノシトール分泌変異株の培養およびイ
ノシトールの生産)表4に示す菌株をそれぞれ、表1に
示した培地で30℃24時間振とうして前培養した後、
あらかじめ115℃10分上記滅菌した表3に示した組
成の培地50mlを含む500ml溶三角フラスコに植え継
ぎ、180rpm 、振幅30cmの条件下で48時間培養し
た。
【0041】培養終了後、菌体、炭酸カルシウムを除去
したろ液中のイノシトール濃度を用いたバイオアッセイ
法で定量したところ、表4に示すような結果を得た。
【0042】
【表3】
【0043】
【表4】
【0044】実施例3 (酵素法によるイノシトール分泌変異株の培養およびイ
ノシトールの生産)表9および表10に示す菌株をそれ
ぞれ、表1に示した培地で30℃24時間振とうして前
培養した後、あらかじめ115℃10分上記滅菌した表
5および表6に示した組成の培地10mlを含む25mm経
の試験管に植え継ぎ、30℃24時間振とう培養した。
分離酵母菌体80g /l (乾燥重量換算)を蒸留水に分
散せしめ、45分間37℃でかつ静止状態で放置した。
しかる後に、4mol/lのD−ソルビトール水溶液を
加え、最終濃度1.5mol/lのD−ソルビトール濃
度とし、10分間37℃で静止状態で放置した。
【0045】処理菌体を用い表7および表8に示した組
成で30℃20時間振とうし反応した。反応終了後、菌
体を除去したろ液中のイノシトール濃度を用いたバイオ
アッセイ法で定量したところ、表9および表10に示す
ような結果を得た。
【0046】
【表5】
【0047】
【表6】
【0048】
【表7】
【0049】
【表8】
【0050】
【表9】
【0051】
【表10】
【0052】実施例4 実施例2での培養液1リットル分の上清をカチオン交換
樹脂ダイヤイオンSK1Bに通液し、その素通り画分を
あつめ、さらにアニオン交換樹脂ダイヤイオンPA31
6に通液し、その素通り画分をあつめ、濃縮晶析し、純
度97%以上のイノシトール結晶1g を得た。
【0053】
【発明の効果】本発明の酵母を用い、本発明の発酵法お
よび菌体を用いた反応により、既存の方法と比較し、よ
り経済的なイノシトールの生産が可能となる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:72)

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】イノシトールを菌体外に分泌する性質を有
    する、キャンディダ属に属する微生物。
  2. 【請求項2】キャンディダ属に属する微生物がキャンデ
    ィダ・ボイディニイであることを特徴とする請求項1記
    載のキャンディダ属に属する微生物。
  3. 【請求項3】イノシトールを菌体外に分泌する性質を有
    する、キャンディダ属に属する微生物を用いたイノシト
    ールの製造方法。
  4. 【請求項4】キャンディダ属に属する微生物を培養して
    培養液中にイノシトールを蓄積せしめることを特徴とす
    る、発酵法によるイノシトールの製造方法。
  5. 【請求項5】キャンディダ属に属する微生物を培養して
    培養液中にイノシトールを蓄積せしめ、該培養液からイ
    ノシトールを単離採取することを特徴とする、発酵法に
    よるイノシトールの製造方法。
  6. 【請求項6】キャンディダ属に属する微生物を培養し
    て、得られた菌体または培養物、もしくはそれらの処理
    物を用い、イノシトールを生成蓄積せしめる反応をおこ
    なうことを特徴とする、イノシトールの製造方法。
  7. 【請求項7】キャンディダ属に属する微生物を培養し
    て、得られた菌体または培養物、もしくはそれらの処理
    物を用い、イノシトールを生成蓄積せしめる反応をおこ
    ない、該反応物からイノシトールを単離採取することを
    特徴とする、イノシトールの製造方法。
JP17531794A 1994-04-19 1994-07-27 キャンディダ属に属する微生物およびそれを用いたイノシトールの製造方法 Withdrawn JPH08258A (ja)

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