WO2013115012A1 - シロ‐イノシトールの製造方法 - Google Patents

シロ‐イノシトールの製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2013115012A1
WO2013115012A1 PCT/JP2013/051198 JP2013051198W WO2013115012A1 WO 2013115012 A1 WO2013115012 A1 WO 2013115012A1 JP 2013051198 W JP2013051198 W JP 2013051198W WO 2013115012 A1 WO2013115012 A1 WO 2013115012A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
inositol
gene
scyllo
inositol monophosphatase
monophosphatase
Prior art date
Application number
PCT/JP2013/051198
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
一誠 小西
晋一 今津
Original Assignee
旭化成ケミカルズ株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 旭化成ケミカルズ株式会社 filed Critical 旭化成ケミカルズ株式会社
Priority to EP13743267.0A priority Critical patent/EP2811029B1/en
Priority to JP2013556328A priority patent/JP5977264B2/ja
Priority to CN201380006347.0A priority patent/CN104245950B/zh
Priority to US14/374,385 priority patent/US9505795B2/en
Publication of WO2013115012A1 publication Critical patent/WO2013115012A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/207—Cyclohexane rings not substituted by nitrogen atoms, e.g. kasugamycins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/46—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical bound to a cyclohexyl radical, e.g. kasugamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01018—Inositol 2-dehydrogenase (1.1.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C12Y301/03025—Inositol-phosphate phosphatase (3.1.3.25)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y505/00—Intramolecular lyases (5.5)
    • C12Y505/01—Intramolecular lyases (5.5.1)
    • C12Y505/01004—Inositol-3-phosphate synthase (5.5.1.4)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Definitions

  • the present invention relates to the application of gene recombination technology in the production of scyllo-inositol.
  • the present invention relates to a transformant capable of producing scyllo-inositol from a ubiquitous raw material such as glucose by a single step, and an industrial production method of scyllo-inositol using the transformant.
  • the present invention also relates to a scyllo-inositol derivative that can be produced by the transformant, a method for producing the scyllo-inositol derivative, and a method for producing scyllo-inositol from the derivative.
  • Scyllo-inositol (cis-1,3,5-trans-2,4,6-cyclohexanehexol) is one of the optically inactive isomers of inositol and has long been found in animals and plants. It is a compound that has been released. However, in recent years, various physiological activities of scyllo-inositol have attracted attention.
  • Non-Patent Document 1 reports that scyllo-inositol has an amyloid ⁇ protein aggregation inhibitory action, which suggests the potential usefulness of scyllo-inositol in the treatment of Alzheimer's disease.
  • Patent Document 1 claims a blood glucose level-lowering agent containing scyllo-inositol as an active ingredient.
  • Non-patent Documents 2 and 3, Patent Document 2 and the like In the classical production method, scyllo-inositol was extracted from a plant body or the compound was chemically synthesized using myo-inositol as a raw material.
  • Non-patent Documents 2 and 3, Patent Document 2 and the like Non-patent Documents 2 and 3, Patent Document 2 and the like.
  • methods for producing scyllo-inositol more efficiently using natural microorganisms or microorganism-derived enzymes have been studied.
  • Patent Document 3 discloses that a microorganism belonging to the genus Agrobacterium is cultured in a medium containing myo-inositol to produce an inositol stereoisomer in the culture solution, or a microorganism or a fungus of a microorganism belonging to the genus Agrobacterium Discloses a method for producing an inositol stereoisomer by treating a body treatment product with myo-inositol.
  • myo-inositol Due to their isomerization, myo-inositol has been converted to a mixture of scyllo-inositol, chilo-inositol (as a mixture of D- and L-forms) and neo-inositol. .
  • Patent Document 4 describes Pseudomonas sp. Against myo-inositol. AB10064 strain (FERMP-18330) or Acetobacter sp. It is described that AB10253 strain (FERMP-18868) acts to convert myo-inositol into scyllo-inosose. Furthermore, an attempt was made to synthesize scyllo-inositol by reducing the scyllo-inosose produced thereby with sodium borohydride. However, in the reduction treatment, scyllo-inositol was basically converted to myo-inositol (that is, Only as a mixture with the reaction to the raw material).
  • Patent Document 5 uses myo-inositol as a raw material, myo-inositol 2-dehydrogenase (EC 1.1.1.18), which generates scyllo-inosose from myo-inositol, and stereo-selective reduction of scyllo-inosose to scyllo-inositol.
  • a method for producing scyllo-inositol is disclosed, in which myo-inositol is converted to scyllo-inositol in a mixed solution of scyllo-inositol dehydrogenase and NAD + or NADP + .
  • the conversion of myo-inositol to scyllo-inositol in this document is said to be 31% on a yield basis.
  • any of the above documents relates to a method for producing scyllo-inositol using myo-inositol as a starting material, and de novo scyllo-inositol biosynthesis, that is, scyllo-inositol directly from ubiquitous raw materials such as glucose. And does not teach how to produce in a one-step process.
  • myo-inositol is an extremely useful and valuable physiologically active substance. That is, myo-inositol is an indispensable substance for many higher animals, and thus is widely used as a component of nutritional foods, feeds, pharmaceuticals and the like. For example, myo-inositol is known to play an important role in the metabolism of fats and cholesterols, and is particularly effective for the prevention and treatment of hypercholesterolemia and the like.
  • Patent Document 6 discloses the discovery of Candida yeast that can secrete myo-inositol out of the microbial cell and its use.
  • Patent Documents 7 and 8 disclose that a mutation that imparts resistance to an antimetabolite and an antibiotic is introduced into the myo-inositol-secreting Candida yeast, respectively.
  • Patent Documents 9, 10 and 11 also introduce a mutation that imparts resistance to tertiary amine, hexachlorocyclohexane and cetyltrimethylammonium salt to Candida yeast having the ability to produce myo-inositol, respectively. It discloses improving the yield of inositol.
  • Patent Document 12 discloses that a mutation that confers resistance to 6-halogeno-6-deoxyglucose is introduced into a Candida yeast that also has the ability to produce myo-inositol.
  • Patent Document 13 also discloses introducing a mutation that confers resistance to halogenated pyruvate to Candida yeast having the ability to produce myo-inositol.
  • Patent Document 14 does not have myo-inositol secretion ability under a reasonable inference that inositol-1-phosphate synthase plays a rate-limiting reaction in a series of myo-inositol biosynthesis reactions.
  • Patent Document 15 discloses that Candida yeast was imparted with the ability to produce myo-inositol by transforming the inositol-1-phosphate synthase-encoding DNA alone. Is a product of myo-inositol production of yeast by introducing inositol-1-phosphate synthase-encoding DNA alone under the control of the promoter of the glycerol-3-phosphate dehydrogenase gene into yeast. Is disclosed.
  • JP 2003-160478 A West German Patent Publication No. 3,405,663 JP-A-9-140388 JP 2003-102492 A JP 2010-187688 A JP-A-8-00258 JP-A-8-38188 JP-A-8-89262 JP-A-9-117295 Japanese Patent Laid-Open No. 10-42860 Japanese Patent Laid-Open No. 10-42882 Japanese Patent Laid-Open No. 10-42883 JP 2000-41689 A Japanese Patent Laid-Open No. 9-220093 JP-A-10-271995
  • the first problem of the present invention relates to an industrial production method capable of producing scyllo-inositol from a cheap and ubiquitous raw material such as glucose in a single step. Furthermore, the present inventors discovered for the first time the scyllo-inositol derivative of the present invention conjugated with a saccharide in the course of the aforementioned research. The scyllo-inositol derivative showed much superior water solubility even compared to the inherent water solubility of scyllo-inositol.
  • the findings of the present invention were surprising because cellobiose (D-glucopyranosyl- ( ⁇ 1 ⁇ 4) -D-glucose) exhibits lower solubility than glucose. Therefore, the second object of the present invention is to provide a novel scyllo-inositol derivative.
  • the first aspect of the present invention is: (1) A method for producing scyllo-inositol and sylinositol derivatives, comprising the following steps: 1) a step of preparing a transformed microorganism having an inositol-1-phosphate synthase gene, an inositol monophosphatase gene, a myo-inositol dehydrogenase gene and a scyllo-inositol dehydrogenase gene; 2) contacting the microorganism with glucose or a disaccharide or polysaccharide having a glucose unit under conditions suitable for the growth and / or maintenance of the microorganism; It is the said manufacturing method containing.
  • the transformant is composed of inositol-1-phosphate synthase gene, inositol monophosphatase gene, myo-inositol dehydrogenase gene, and scyllo -The above-mentioned production method characterized in that an inositol dehydrogenase gene is expressed.
  • the scyllo-inositol derivative produced in the culture of (1) is a novel compound, and glucose and scyllo-inositol were ⁇ 1 ⁇ 4 linked in the derivative. Accordingly, one aspect of the present invention is: (2)
  • the sironositol derivative has the following structural formula: It is a manufacturing method as described in said (1) which is a compound shown by these.
  • the second aspect of the present invention is: (3)
  • the transformed microorganism has a gene recombination or mutation that induces overproduction of functional inositol monophosphatase or activation of inositol monophosphatase It is a manufacturing method of description.
  • Prokaryotic microorganisms typified by Escherichia coli are extremely attractive from the viewpoint of industrial fermentation production because of their rapid growth ability and ease of fermentation management. Also has advantages.
  • prokaryotic microbial hosts such as Escherichia coli do not have the ability to assimilate myo-inositol, which is an intermediate of the scyllo-inositol biosynthetic pathway, making it easier to apply synthetic biological techniques.
  • preferred embodiments of the present invention are: (4) The method according to any one of (1) to (3) above, wherein the transformed microorganism is derived from a microorganism that does not have myo-inositol assimilation ability; The method according to any one of (1) to (4) above, wherein the transformed microorganism is derived from a bacterium selected from the group consisting of Escherichia coli, Bacillus bacteria, Corynebacterium bacteria, and Zymomonas bacteria. .
  • inositol monophosphatase of the cell is produced by overproducing inositol monophosphatase in the cell regardless of whether the host microorganism has endogenous inositol monophosphatase activity or not. Can enhance activity.
  • Various known techniques can be applied to cause cells to overproduce inositol monophosphatase.
  • the overproduction of the inositol monophosphatase is a) introducing an exogenous inositol monophosphatase gene, b) increasing the copy number of the endogenous inositol monophosphatase gene, c) introducing a mutation into the regulatory region of the endogenous inositol monophosphatase gene, d) replacing the regulatory region of the endogenous inositol monophosphatase gene with a high expression inducible foreign regulatory region, or e) deleting the regulatory region of the endogenous inositol monophosphatase gene, (7) the production method according to any one of (3) to (5), and (7) the inositol monophosphatase overproduction introduces a foreign inositol monophosphatase gene into the transformed microorganism.
  • the production method according to (6) which is induced by including.
  • the present invention provides the following aspects: (8) Activation of the inositol monophosphatase is performed on the transformed microorganism, f) introducing a mutation into the endogenous inositol monophosphatase gene; g) replacing part or all of the endogenous inositol monophosphatase gene, h) deleting a portion of the endogenous inositol monophosphatase gene; i) reduce other proteins that reduce inositol monophosphatase activity, j) reduce the production of compounds that reduce inositol monophosphatase activity, The production method according to any one of (3) to (5), which is induced by Including.
  • the present invention also contemplates a transformant for use in the method for producing scyllo-inositol and its derivatives.
  • another aspect of the present invention is: (9) A transformed microorganism having an inositol-1-phosphate synthase gene, an inositol monophosphatase gene, a myo-inositol dehydrogenase gene, and a scyllo-inositol dehydrogenase gene.
  • Convertible microorganisms (11) The transformed microorganism according to (9) or (10) above, wherein the transformed microorganism is derived from a microorganism that does not have myo-inositol assimilation ability, (12) The transformed microorganism according to any one of (9) to (11), wherein the transformed microorganism is derived from a bacterium selected from the group consisting of Escherichia coli, Bacillus bacteria, Corynebacterium bacteria, and Zymomonas bacteria.
  • the inositol monophosphatase overproduction is caused by the transformed microorganism, a) introducing an exogenous inositol monophosphatase gene, b) increasing the copy number of the endogenous inositol monophosphatase gene, c) introducing a mutation into the regulatory region of the endogenous inositol monophosphatase gene, d) replacing the regulatory region of the endogenous inositol monophosphatase gene with a high expression inducible foreign regulatory region, or e) deleting the regulatory region of the endogenous inositol monophosphatase gene,
  • the transformed microorganism according to any one of (10) to (12), which is induced by (14)
  • the transformed microorganism according to (13) above, wherein the inositol monophosphatase overproduction is induced by introducing a foreign inositol monophosphatase gene into the transformed microorganism, and
  • a further aspect of the invention relates to novel scyllo-inositol derivatives that have been found to be produced in cultures of said transformants. That is, the present invention provides: (16) The following structural formula: Also contemplated are compounds represented by:
  • the scyllo-inositol derivative of the present invention can be degraded by an enzyme capable of catalyzing a reaction that hydrolyzes a ⁇ -glycoside bond, such as ⁇ -glucosidase (EC 3.2.1.21), and easily converts glucose and scyllo-inositol. Generate. Also, the high water solubility exhibited by the scyllo-inositol derivatives of the present invention can be advantageous in such enzymatic reactions.
  • yet another aspect of the present invention is: (17) A method for producing scyllo-inositol, characterized in that the compound of (16) is decomposed by an enzyme capable of catalyzing a reaction of hydrolyzing a ⁇ -glycoside bond to generate scyllo-inositol. Said method.
  • the present invention also provides: (18) A composition comprising sylinositol and the compound described in (16) above.
  • the efficiency of industrial scyllo-inositol production by microbial culture technology can be achieved.
  • the present invention also provides a novel scyllo-inositol derivative. Since the derivative is extremely water-soluble, it can improve the production concentration per batch in the production process, and is excellent in handling when producing a related product. In addition, industrial scyllo-inositol productivity can be improved.
  • the coding region of the INO1 gene is shown (SEQ ID NO: 1).
  • the coding region of suhB gene is shown (SEQ ID NO: 3).
  • the coding region of the iolG gene is shown (SEQ ID NO: 5).
  • the coding region of iolW gene is shown (SEQ ID NO: 7).
  • 1 is a 1 H-NMR spectrum of a scyllo-inositol derivative of the present invention. In the figure, the peak indicated by the arrow is derived from impurities.
  • 3 is a 13 C-NMR spectrum of a scyllo-inositol derivative of the present invention. An example of decomposition of the scyllo-inositol derivative of the present invention by ⁇ -glucosidase (cellobiase) is shown.
  • a first object of the present invention is to transform a transformed microorganism having an inositol-1-phosphate synthase gene, an inositol monophosphatase gene, a myoinositol dehydrogenase gene, and a scyllo-inositol dehydrogenase gene into glucose or a disaccharide having a glucose unit.
  • it is solved by fermenting in a medium containing a polysaccharide as a carbon source, or by contacting the transformant with the carbon source. That is, the transformed microorganism of the present invention has the ability to convert glucose substrate into scyllo-inositol and its derivatives by one-step fermentation by a continuous biosynthetic pathway newly constructed in the microorganism.
  • a biosynthetic pathway for converting a glucose substrate into the scyllo-inositol of the present invention (or a co-produced scyllo-inositol derivative, hereinafter collectively referred to as “the scyllo-inositol of the present invention”).
  • the scyllo-inositol of the present invention Contains a partial pathway that converts the glucose substrate to myo-inositol, an important intermediate.
  • a partial pathway for myo-inositol biosynthesis can be functioned in the microorganism by expressing the following catalytic activity.
  • Activity 1 Activity to produce glucose-6-phosphate from a suitable carbon source
  • Activity 2 Activity of converting glucose-6-phosphate to myo-inositol-1-phosphate, ie, inositol-1-phosphate synthase activity
  • Activity 3 Phosphatase using myo-inositol-1-phosphate as a substrate Activity.
  • glucose-6-phosphate which is a product of activity 1
  • glucose-6-phosphate which is a product of activity 1
  • the activity 3 as far as the present inventors know, the majority of prokaryotic host cells suitable for industrial production by conventional gene recombination techniques express endogenous inositol monophosphatase, or myo-inositol. It has general-purpose monophosphatase activity that can use 1-phosphate as a substrate.
  • inositol-1-phosphate synthase is considered to be responsible for the rate-limiting reaction in the myo-inositol biosynthesis reaction (see Patent Documents 14 and 15). Therefore, in order to construct a functional myo-inositol biosynthesis pathway in a prokaryotic microbial host, it is considered necessary and sufficient to introduce an exogenous inositol-1-phosphate synthase gene into the cell.
  • the present inventors unexpectedly transformed by introducing the exogenous inositol-1-phosphate synthase gene described above. It was found that myo-inositol production ability was greatly improved by enhancing inositol monophosphatase activity in the body. Surprisingly, as shown in the Examples below, the transformant of the present invention produced scyllo-inositol in an extremely large amount and predominantly by enhancing its inositol monophosphatase activity, while producing little myo-inositol. As well as producing substantial amounts of the scyllo-inositol derivatives of the present invention.
  • inositol monophosphatase activity of the transformed microorganism can be enhanced by overproducing inositol monophosphatase in the transformed microorganism cell.
  • overproduction of inositol monophosphatase can be induced by introducing an exogenous inositol monophosphatase gene into the transformed microorganism, but is not limited thereto.
  • the terms “foreign” to “exogenous” refer to an enzyme encoded by a gene when the host microorganism before transformation does not have the gene to be introduced according to the present invention.
  • the gene or nucleic acid sequence according to the present invention is introduced into the host Used to mean to do.
  • the following catalytic activity is imparted to the transformant of the present invention, that is, the transformed microorganism having a continuous biosynthetic pathway capable of converting the glucose substrate to scyllo-inositol (or co-produced silo-inositol derivative).
  • Activity 4 Enzymatic activity to convert myo-inositol into 2-keto-myo-inositol (myo-inosose; 2,3,4,5,6-pentahydroxycyclohexane-1-one); and
  • Activity 5 2-keto- Enzymatic activity to convert myo-inositol to scyllo-inositol.
  • Examples of the enzyme having activity 4 include myo-inositol dehydrogenase (enzyme number EC.1.1.1.18) that oxidizes myo-inositol in the presence of NAD + .
  • Examples of the enzyme having activity 5 include sylinositol dehydrogenase that oxidizes scyllo-inositol in the presence of NADP + . That is, the sylinositol dehydrogenase that can be used in the present invention can convert 2-keto-myo-inositol into scyllo-inositol, for example, in the presence of NADPH. Details of these enzymes will be described later.
  • the transformant of the present invention can be prepared using various host microbial cells.
  • using a prokaryotic microorganism as a host makes it possible to newly construct the biosynthetic pathway of scyllo-inositol of the present invention in the host cell (that is, there is no influence of the existing endogenous pathway). So it is very attractive in the application of synthetic biological techniques.
  • Illustrative prokaryotic microorganisms are: Escherichia, Pseudomonas, Bacillus, Geobacillus, Methanomonas, Methylobacillus, Methylophilus, Protaminobacter, Methylococcus, Corynebacterium, Brevibacterium, Zymomonas and Listeria.
  • Non-limiting examples of prokaryotic microorganisms suitable for industrial fermentation production include E. coli, Bacillus bacteria, Corynebacterium bacteria, Zymomonas bacteria.
  • E. coli is an example of a particularly preferred host microorganism because of its rapid growth ability and ease of fermentation management.
  • the cell line that can be used as the host cell of the present invention may be a wild type in the usual sense, or may be an auxotrophic mutant or an antibiotic-resistant mutant. Furthermore, the cell line that can be used as the host cell of the present invention may be already transformed so as to have various marker genes relating to the mutation as described above. These mutations and genes can provide useful properties for the production, maintenance, and management of the transformant of the present invention. Preferably, the production of scyllo-inositol of the present invention can be carried out conveniently by using a strain resistant to antibiotics such as chloramphenicol, ampicillin, kanamycin and tetracycline.
  • antibiotics such as chloramphenicol, ampicillin, kanamycin and tetracycline.
  • the scyllo-inositol biosynthetic pathway that the transformant of the present invention should have includes a partial pathway for converting a glucose substrate into myoinositol, which is an important intermediate.
  • inositol-1-phosphate synthase is considered to be responsible for the rate-limiting reaction in myoinositol biosynthesis, so that the transformant of the present invention has inositol-1 as the first biological activity.
  • -It is required to express phosphate synthase.
  • the exogenous inositol-1-phosphate synthase gene is usually expressed in the cells of the transformant of the present invention. Introduced as possible.
  • the inositol-1-phosphate synthase gene is known (for example, GenBank Accession Nos. AB032073, AF056325, AF071033, AF078915, AF120146, AF207640, AF284065, BC111160, L23520, U32511), and any of them can be used.
  • yeast-derived INO1 gene (SEQ ID NO: 1) is an example of the well-known inositol-1-phosphate synthase gene, and can be suitably used in the present invention.
  • the inositol-1-phosphate synthase gene that can be used for the preparation of the transformant of the present invention is not limited to those derived from yeast, and may be derived from other eukaryotic microorganisms or other organisms, or Any artificially synthesized material may be used as long as it can express substantial inositol-1-phosphate synthase activity in the host microorganism cell.
  • the inositol-1-phosphate synthase gene that can be used for the purpose of the present invention is naturally occurring as long as it can express substantial inositol-1-phosphate synthase activity in the transformed microorganism. It may have all possible mutations and artificially introduced mutations and modifications. For example, it is known that there are extra codons in various codons that code for specific amino acids. Therefore, in the present invention, alternative codons that are finally translated into the same amino acid may be used. That is, since the genetic code is degenerate, multiple codons can be used to encode a particular amino acid, so that the amino acid sequence can be encoded with any set of similar DNA oligonucleotides.
  • expression cassette means a nucleotide comprising a nucleic acid to be expressed or a nucleic acid sequence that regulates transcription and translation operably linked to a gene to be expressed.
  • the expression cassette of the present invention comprises a promoter sequence 5 ′ upstream from the coding sequence, a terminator sequence 3 ′ downstream, and optionally further normal regulatory elements, operably linked, such as
  • a nucleic acid to be expressed or a gene to be expressed is introduced into a host microorganism so that it can be expressed.
  • a promoter is defined as a DNA sequence that binds RNA polymerase to DNA and initiates RNA synthesis, whether it is a structural promoter or a regulated promoter.
  • a strong promoter is a promoter that initiates mRNA synthesis at a high frequency and is also preferably used in the production of the transformant of the present invention.
  • lac system lac system, trp system, TAC or TRC system, lambda phage major operator and promoter region, fd coat protein regulatory region, glycolytic enzymes (eg 3-phosphoglycerate kinase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydration) Elementary enzyme), glutamic acid decarboxylase A, a promoter for serine hydroxymethyltransferase, and the like can be used depending on the properties of the host cell.
  • glycolytic enzymes eg 3-phosphoglycerate kinase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydration
  • glutamic acid decarboxylase A eg 3-phosphoglycerate kinase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydration
  • glutamic acid decarboxylase A eglyceraldehyde-3-phosphate dehydration
  • promoter for serine hydroxymethyltransferase e.glyceraldehy
  • the expression cassette described above is inserted into a host microorganism by being incorporated into a vector comprising, for example, a plasmid, phage, transposon, IS element, fasmid, cosmid, or linear or circular DNA. Plasmids and phage are preferred. These vectors may be autonomously replicated in the host microorganism, or may be replicated by chromosome. Suitable plasmids are, for example, E.
  • Other usable plasmids are described in “Cloning Vectors”, Elsevier, 1985.
  • the expression cassette can be introduced into a vector by a conventional method including excision, cloning, and ligation with an appropriate restriction enzyme.
  • the second biological activity that the transformant of the present invention should have is inositol monophosphatase activity.
  • the inositol monophosphatase activity is also required to convert the glucose substrate to the intermediate myo-inositol.
  • the majority of prokaryotic host cells suitable for industrial production by conventional genetic recombination techniques either express endogenous inositol monophosphatase or be a general-purpose that can use myo-inositol-1-phosphate as a substrate. Since it has monophosphatase activity, it is often unnecessary to introduce the enzyme activity into the transformant of the present invention. Furthermore, however, it is particularly preferred that the transformants of the present invention exhibit enhanced inositol monophosphatase.
  • the scyllo-inositol-producing transformant of the present invention enhances its inositol monophosphatase activity, so that myo-inositol is almost completely produced in a large amount and predominantly. In addition to not producing, it was revealed that scyllo-inositol derivatives were produced remarkably. Accordingly, a preferred aspect of the present invention involves overproduction of inositol monophosphatase in a scyllo-inositol producing transformant.
  • the inositol monophosphatase intended in the present invention includes a phosphate monoester hydrolase activity capable of acting on a wide range of substrates in addition to those exhibiting a high substrate specificity for inositol-1-phosphate.
  • it includes proteins capable of substantially hydrolyzing inositol-1-phosphate.
  • inositol-1-monophosphatase is known as a typical inositol monophosphatase, and the gene (suhB gene) derived from many organisms is known as GenBank Accession Nos. ZP_046119988, YP_001451848, etc.
  • the use of the suhB gene derived from E. coli (SEQ ID NO: 3: AAC75586 (MG1655)) is convenient when E. coli is used as a host cell.
  • the third biological activity that the transformant of the present invention should have is myo-inositol dehydrogenase activity.
  • the enzyme converts myo-inositol into 2-keto-myo-inositol in the presence of NAD + typically by the following reaction.
  • JP-A-6-7158 discloses an enzyme derived from a genus Bacillus (EC.1.1.1.18) that can convert myo-inositol into 2-keto-myo-inositol in the presence of NAD + and The encoding nucleic acid sequence is described.
  • Patent Document 5 discloses NAD + -independent myo-inositol dehydrogenase, and the enzyme could also be used for producing the transformant of the present invention.
  • the fourth biological activity that the transformant of the present invention should have is scyllo-inositol dehydrogenase activity.
  • the enzyme typically converts scyllo-inositol to 2-keto-myo-inositol in the presence of NADP + by the following reaction, but is selective for 2-keto-myo-inositol in the presence of NADPH. Reduced to scyllo-inositol. The latter reaction is used in the transformant of the present invention.
  • Patent Document 5 discloses scyllo-inositol dehydrogenase and related amino acid sequences of Escherichia coli, Acetobacter bacteria, Bacillus bacteria, Agrobacterium bacteria, and Xanthomonas bacteria.
  • iolW gene SEQ ID NO: 7 below
  • inositol-1-phosphate synthase gene mutations, modifications and codon optimization, as well as expression cassettes, regulator sequences such as promoters and plasmids, and the description of transformation by them, are all the above inositol monophosphatase genes, Those skilled in the art will readily understand that this also applies to the myo-inositol dehydrogenase gene and the scyllo-inositol dehydrogenase gene.
  • the transformant of the present invention comprises an expression cassette comprising a nucleic acid encoding inositol-1-phosphate synthase, an expression cassette comprising a nucleic acid encoding myo-inositol dehydrogenase, and an expression comprising a nucleic acid encoding scyllo-inositol dehydrogenase It carries three expression cassettes, in which case the endogenous inositol monophosphatase gene is present in the transformant of the present invention.
  • a preferred transformant of the present invention comprises an expression cassette comprising a nucleic acid having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, an expression cassette comprising a nucleic acid having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5, and the nucleotide represented by SEQ ID NO: 7
  • An expression cassette containing a nucleic acid having a sequence is retained.
  • the above three expression cassettes may be arranged on one vector and transfected into a host microorganism.
  • a vector in which any two of these expression cassettes are arranged and a vector in which the remaining expression cassettes are arranged may be co-transfected into a host microorganism, or three vectors in which each expression cassette is arranged. May be co-transfected into the host microorganism.
  • any one or more of the three expression cassettes may be integrated into the genome of the host microorganism, and the remaining expression cassette may be present as a plasmid in the transformant.
  • Escherichia coli AKC-017 strain obtained by integrating an expression cassette containing inositol-1-phosphate synthase-encoding nucleic acid (INO1) on the chromosome, is incorporated into the Japanese Patent Evaluation Organization Deposited at the Deposit Center on October 25, 2011.
  • FERM BP-11513 including an expression cassette containing a nucleic acid encoding myo-inositol dehydrogenase and a nucleic acid encoding scyllo-inositol dehydrogenase It is also possible to transfect a plasmid with an expression cassette.
  • the transformant of the present invention preferably has an expression cassette containing a nucleic acid encoding inositol monophosphatase in addition to the above three expression cassettes. Therefore, as a more preferable transformant of the present invention, an expression cassette containing a nucleic acid having the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 1, an expression cassette containing a nucleic acid having the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 3, and shown by SEQ ID NO: 5 And a transformant carrying an expression cassette containing a nucleic acid having the nucleotide sequence shown in FIG. 7 and an expression cassette containing a nucleic acid having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7.
  • the above four expression cassettes may be arranged on one vector and transfected into a host microorganism.
  • a vector in which any two or more of these expression cassettes are arranged and a vector in which the remaining expression cassettes are arranged may be co-transfected into the host microorganism, or each expression cassette is arranged 4
  • One vector may be co-transfected into the host microorganism.
  • any one or more of the four expression cassettes may be integrated into the genome of the host microorganism, and the remaining expression cassettes may be present in the transformant as a plasmid.
  • Escherichia coli AKC-018 strain having both an expression cassette containing inositol-1-phosphate synthase-encoding nucleic acid (INO1) and an expression cassette containing a nucleic acid encoding inositol monophosphatase (suhB) on the chromosome.
  • INO1 inositol-1-phosphate synthase-encoding nucleic acid
  • suhB inositol monophosphatase
  • a nucleic acid encoding myo-inositol dehydrogenase It is also possible to transfect a plasmid with an expression cassette comprising and an expression cassette comprising a nucleic acid encoding scyllo-inositol dehydrogenase.
  • the overproduction of said inositol monophosphatase increases the copy number of the endogenous inositol monophosphatase gene; Introducing a mutation into the regulatory region of the endogenous inositol monophosphatase gene; replacing the regulatory region of the endogenous inositol monophosphatase gene with a high expression-inducible foreign regulatory region; and deleting the regulatory region of the endogenous inositol monophosphatase gene Can also be induced.
  • a construct containing an expression cassette containing an endogenous inositol monophosphatase gene or a suitable regulatory region added to the coding region of the endogenous gene is used.
  • Transforming a host microorganism to substantially increase the copy number of the inositol monophosphatase gene in the transformant compared to the original host cell, or with respect to the original host cell having an endogenous inositol monophosphatase gene Chromosome mutations, additions and deletions can be achieved by known gene recombination techniques, or can be achieved by randomly introducing mutations into the chromosome using a mutagen or the like.
  • a known SDS-PAGE analysis method or the like can be used for confirmation of overproduction of inositol monophosphatase.
  • another aspect of the present invention for enhancing inositol monophosphatase activity includes inducing activation of inositol monophosphatase in the transformant of the present invention.
  • the activity of inositol monophosphatase encoding the inositol monophosphatase gene after mutation, addition or deletion of the inositol monophosphatase gene Inositol monophosphatase with enhanced inositol monophosphatase activity can be obtained.
  • the transformant obtained as described above is cultured and maintained under conditions suitable for the growth and / or maintenance of the transformant for the production of scyllo-inositol according to the present invention.
  • Suitable media compositions, culture conditions, and culture times for transformants derived from various host microbial cells are known to those skilled in the art.
  • the medium may be a natural, semi-synthetic or synthetic medium containing one or more carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, vitamins and optionally trace elements such as trace elements or vitamins.
  • the medium used must appropriately meet the nutritional requirements of the transformed microorganism to be cultured.
  • the medium that can be used in the present invention is a disaccharide or a disaccharide having glucose or a glucose unit in order to facilitate the biosynthesis of de novo scyllo-inositol and scyllo-inositol derivatives by the transformant of the present invention.
  • Contains polysaccharides. Disaccharides or polysaccharides having a large number of glucose units are well known to those skilled in the art.
  • Non-limiting examples thereof include sucrose, maltose, lactose, starch, and cellulose.
  • a medium using these natural resources as a carbon source.
  • the medium may contain a corresponding antibiotic if the transformant expresses a useful additional trait, for example if it has a marker for resistance to antibiotics. Thereby, the risk of contamination due to various germs during fermentation is reduced.
  • a known genetic engineering technique such as introducing a foreign gene into the host microorganism can be used to obtain scyllo-inositol using these carbon sources and its It can be adapted for derivative production.
  • foreign genes include cellulase genes and amylase genes.
  • the culture may be a batch type or a continuous type. In any case, the additional carbon source or the like may be replenished at an appropriate point in the culture. Furthermore, the culture should be continued while maintaining a suitable temperature, oxygen concentration, pH and the like.
  • a suitable culture temperature for the transformant derived from a general microbial host cell is usually in the range of 15 ° C to 45 ° C, preferably 25 ° C to 37 ° C. When the host microorganism is aerobic, it is necessary to perform shaking (flask culture, etc.) and stirring / aeration (jar fermenter culture, etc.) to ensure an appropriate oxygen concentration during fermentation. Those culture conditions can be easily set by those skilled in the art.
  • the method for purifying scyllo-inositol or a derivative thereof from the above culture may be a combination of purification means known to those skilled in the art as appropriate.
  • the scyllo-inositol of the present invention is present in the culture supernatant or in the cells, and may be extracted from the cultured cells if necessary.
  • the culture can be centrifuged to separate the supernatant and the cells, and the cells can be destroyed with a surfactant, an organic solvent, an enzyme, or the like while using a homogenizer.
  • Typical methods for purifying scyllo-inositol and its derivatives from the culture supernatant and, optionally, bacterial cell extracts include deproteinization using protein precipitation by pH adjustment, etc., and adsorption of impurities using activated carbon.
  • a purification step such as removal or chromatography using an ion exchange resin or the like may be performed.
  • the solid obtained by separation by chromatography and drying the fraction may be recrystallized from, for example, a water-ethanol system.
  • some steps may be omitted or additional chromatography or recrystallization may be performed depending on the purity intended by the product.
  • the scyllo-inositol derivative related to the second problem of the present invention has a structure in which a glucose residue and a scyllo-inositol residue are bonded via a ⁇ 1 ⁇ 4 bond, and is represented by the following structural formula It is.
  • the compound is novel and can also be referred to as 1-O- ⁇ -D-glucopyranosyl-siro-inositol.
  • the scyllo-inositol derivative of the present invention can be easily decomposed by an enzyme capable of catalyzing a reaction to hydrolyze a ⁇ -glycoside bond, such as ⁇ -glucosidase (EC 3.2.121) Easily produces glucose and scyllo-inositol. Therefore, scyllo-inositol can be produced by allowing the enzyme to act on the scyllo-inositol derivative of the present invention.
  • an enzyme capable of catalyzing a reaction to hydrolyze a ⁇ -glycoside bond such as ⁇ -glucosidase (EC 3.2.121) Easily produces glucose and scyllo-inositol. Therefore, scyllo-inositol can be produced by allowing the enzyme to act on the scyllo-inositol derivative of the present invention.
  • the scyllo-inositol derivative of the present invention exhibits a water solubility of at least 4 times (25 ° C., W / V) as compared with the original scyllo-inositol, as will be described later. Therefore, since the scyllo-inositol derivative of the present invention can be produced and processed at a high concentration in an aqueous liquid, the scyllo-inositol derivative of the present invention is obtained and treated with the above enzyme to obtain scyllo- There are many advantages to producing inositol, so such a method is one of the preferred uses of the scyllo-inositol derivatives of the present invention.
  • ⁇ -glucosidase for example, water or a buffer solution (acetic acid buffer solution, phosphate buffer solution, etc.)
  • An appropriate amount of enzyme may be added to the solution of scyllo-inositol derivative, and the solution may be incubated under conditions and time appropriate for the enzyme reaction.
  • ⁇ -glucosidase that can be advantageously used for such purposes is commercially available, and any of them can be used.
  • SIGMA Cellobiase derived from Aspergillus fungi may be used.
  • the amount of the enzyme to be added may be appropriately determined based on the concentration of the scyllo-inositol derivative of the present invention in the solution while referring to the manufacturer's instructions.
  • the pH during the reaction is generally in the range of pH 4.0 to 9.0, but the point is that the pH may be set to the optimum pH of the enzyme used.
  • the temperature during the reaction may be within the optimum temperature range of the enzyme to be used, for example, about 20 to 50 ° C.
  • the reaction time may be the time when almost all of the scyllo-inositol derivative of the present invention is converted to scyllo-inositol while quantitatively tracking the degradation rate of the scyllo-inositol derivative of the present invention. Thereafter, scyllo-inositol may be separated from the reaction solution by recrystallization or the like.
  • the transformant of the present invention is cultured under conditions where a substantial amount of the scyllo-inositol derivative of the present invention is produced together with scyllo-inositol as in the examples described later, the transformant is cultured.
  • the product of scyllo-inositol can be further enhanced by treating the product with the enzyme as it is, or by subjecting the culture to a crude protein purification or activated charcoal treatment followed by enzyme treatment.
  • the scyllo-inositol derivative of the present invention is one of the potential uses of the scyllo-inositol derivative of the present invention to be used as an active ingredient or a functional ingredient of pharmaceuticals, foods, cosmetics and the like. That is, as described above, the physiological activity of scyllo-inositol has been clarified, and the scyllo-inositol derivative of the present invention is enzymatically decomposed to easily generate scyllo-inositol.
  • Example 1 Production of scyllo-inositol de novo by a transformant that does not enhance inositol monophosphatase activity
  • an expression cassette comprising a nucleic acid encoding inositol-1-phosphate synthase, a nucleic acid encoding myo-inositol dehydrogenase
  • an expression cassette containing 3 and an expression cassette containing a nucleic acid encoding scyllo-inositol dehydrogenase were prepared, and the production capacity of scyllo-inositol was investigated.
  • Inositol-1-phosphate synthase expression cassette Cell bodies are recovered from the culture solution of isolated sake spirit yeast, and genomic DNA is extracted using Nucleo Spin Tissue (product name, manufactured by MACHEREY-NAGEL) did. Using the extracted genomic DNA as a template, PCR amplification was performed with the following primers (PrimeStar Max DNA Polymerase (product name, manufactured by Takara Bio Inc.) reaction conditions: 98 ° C. 10 sec, 55 ° C. 5 sec, 72 ° C. 20 sec, 28 cycle), and the INO1 gene The coding region (SEQ ID NO: 1) was cloned.
  • the obtained ino1 coding region was inserted downstream of the promoter of the following sequence so as to allow transcription.
  • the obtained iolG coding region was inserted downstream of the promoter of SEQ ID NO: 11 so as to allow transcription. That is, a terminator sequence and the promoter sequence were inserted into the multiple cloning site of pNFP-A51.
  • the iolG coding region cloned above was ligated downstream of the introduced promoter sequence to construct pNFP-J22.
  • the constructed pNFP-J22 was transfected into Escherichia coli strain FERM P-22104 by the calcium chloride method (Sheepsha, Genetic Engineering Experiment Note, by Takaaki Tamura). High expression of myo-inositol dehydrogenase in the soluble fraction of the E. coli was confirmed by SDS-PAGE.
  • the obtained iolW coding region was inserted downstream of the promoter of SEQ ID NO: 11 so as to allow transcription. That is, a terminator sequence and the promoter sequence were inserted into the multiple cloning site of pNFP-A51.
  • the iolW coding region cloned above was ligated downstream of the introduced promoter sequence to construct pNFP-J36.
  • the constructed pNFP-J36 was transfected into Escherichia coli strain FERM P-22104 by the calcium chloride method (Sheepsha, Genetic Engineering Experiment Note, by Takaaki Tamura). High expression of scyllo-inositol dehydrogenase in the soluble fraction of the E. coli was confirmed by SDS-PAGE.
  • Plasmid for transformation pNFP-D78 was digested with SalI, blunted and dephosphorylated at the 5 ′ end.
  • the iolG expression cassette in pNFP-J22 and the iolW expression cassette in pNFP-J36 were cloned and both expression cassettes were ligated to pNFP-D78.
  • a plasmid was obtained in which the iolG expression cassette and iolW expression cassette were ligated in the forward direction with the INO1 expression cassette in pNFP-D78.
  • the obtained transformant was cultured on an LB plate containing ampicillin (100 mg / L) at 37 ° C. for 1 day to form colonies. Put 2 mL of LB medium containing ampicillin (100 mg / L) into a 15 mL test tube, inoculate the colonies from the above plate with a platinum loop, and at 37 ° C. for 3 to 5 hours, OD (600 nm) is about 0.5. Culturing was carried out at 180 rpm until this was obtained, and this was used as a preculture solution for main culture.
  • LB medium containing 2 g / L glucose and 100 mg / L ampicillin was added, and 0.6 mL of a preculture was added for main culture (shiro-inositol production test).
  • the culture conditions are as follows; culture temperature 32 ° C .; stirring 180 rpm; culture time 16.5 h.
  • the above culture broth was centrifuged at 10,000 g ⁇ 10 minutes at 4 ° C. to recover the supernatant, and the scyllo-inositol concentration of the culture supernatant was measured.
  • KS-G guard column
  • HPLC detector: RI, column temperature: 70 ° C., The flow rate: 1 mL / min
  • This result comprises three expression cassettes including an expression cassette containing a nucleic acid encoding inositol-1-phosphate synthase, an expression cassette containing a nucleic acid encoding myo-inositol dehydrogenase, and a nucleic acid encoding scyllo-inositol dehydrogenase.
  • Example 2 Production of scyllo-inositol de novo by a transformant with enhanced inositol monophosphatase activity
  • an expression cassette containing a nucleic acid encoding inositol-1-phosphate synthase, a nucleic acid encoding inositol monophosphatase A transforming microorganism of the present invention having four expression cassettes comprising an expression cassette comprising a nucleic acid encoding myo-inositol dehydrogenase, and an expression cassette comprising a nucleic acid encoding scyllo-inositol dehydrogenase, thereby producing scyllo-inositol The production capacity was examined.
  • E. coli strain W3110 (NBRC 12713) was cultured with shaking in LB medium (2 ml) at 37 ° C. After completion of the culture, the cells were collected from the culture solution, and genomic DNA was extracted using Nucleo Spin Tissue (product name, manufactured by MACHEREY-NAGEL). Using the extracted genomic DNA as a template, PCR amplification was performed with the following primers (PrimeStar Max DNA Polymerase (product name, manufactured by Takara Bio Inc.) reaction conditions: 98 ° C. 10 sec, 55 ° C. 5 sec, 72 ° C. 20 sec, 28 cycle), and the suhB gene The coding region (SEQ ID NO: 3) was cloned.
  • suhB coding region was inserted in the downstream of the promoter of the following sequence so that transcription was possible.
  • a terminator sequence and the promoter sequence of SEQ ID NO: 18 were inserted into the multicloning site of pNFP-A51.
  • the suhB coding region cloned above was ligated downstream of the introduced promoter sequence to construct pNFP-A54.
  • the constructed pNFP-A54 was transfected into Escherichia coli strain FERM P-22104 by the calcium chloride method (Yodosha, Genetic Engineering Experiment Note, by Takaaki Tamura). High expression of inositol monophosphatase in the soluble fraction of the Escherichia coli was confirmed by SDS-PAGE.
  • the iolG expression cassette in pNFP-J22 and the iolW expression cassette in pNFP-J36 prepared in Example 1 were cloned, and both expression cassettes were ligated to pNFP-G22.
  • a plasmid in which the iolG expression cassette and the iolW expression cassette were ligated in the forward direction with the INO1 expression cassette and suhB expression cassette in pNFP-G22 was obtained.
  • the obtained transformant was cultured on an LB plate containing ampicillin (100 mg / L) at 37 ° C. for 1 day to form colonies. Put 2 mL of LB medium containing ampicillin (100 mg / L) into a 15 mL test tube, inoculate the colonies from the above plate with a platinum loop, and at 37 ° C. for 3 to 5 hours, OD (600 nm) is about 0.5. Culturing was carried out at 180 rpm until this was obtained, and this was used as a preculture solution for main culture.
  • the above culture broth was centrifuged at 10,000 g ⁇ 10 minutes at 4 ° C. to recover the supernatant, and the scyllo-inositol concentration of the culture supernatant was measured.
  • KS-G guard column
  • HPLC detector: RI, column temperature: 70 ° C., The flow rate: 1 mL / min
  • KS-G guard column
  • HPLC detector: RI, column temperature: 70 ° C.
  • the flow rate: 1 mL / min was performed to determine the scyllo-inositol concentration in the culture supernatant.
  • Example 3 Isolation and structure determination of scyllo-inositol derivative
  • the structure of the collected compound was determined by the following NMR analysis. Apparatus: Avance 600 (manufactured by Bruker Biospin) Probe: Cryoprobe ( 13 C high sensitivity) Measurement temperature: 18 ° C. (All were set to 291 K (18 ° C.) in order to prevent sample deterioration and move the water signal during 1 H-NMR) Solvent:: D 2 O (ALDRICH) Internal standard: TSP 1 H observation frequency: 600.13 MHz 13 C observation frequency: 150.92 MHz
  • the measurement results and peak assignments were as follows.
  • the peak number “GH-1” indicates the 1-position hydrogen of the glucose residue.
  • “IH-1” represents the 1-position hydrogen of a scyllo-inositol residue. Others are the same.
  • Example 4 Enzymatic degradation of scyllo-inositol derivative
  • SIGMA Cellobiase
  • a ⁇ -glucosidase derived from Aspergillus fungi was degraded by Cellobiase (SIGMA), a ⁇ -glucosidase derived from Aspergillus fungi.
  • SIGMA Cellobiase
  • 100 ⁇ L of 25 U / mL Cellobiase was added to the solution, and the mixture was incubated at 40 ° C. for 20 hours (1200 rpm, Bioshaker M • BR022, TAITEC) to be reacted.
  • Example 7 As shown in FIG. 7, at 3 hours from the start of the reaction, the compound obtained in Example 3, that is, the scyllo-inositol derivative of the present invention was almost decomposed, and the corresponding amounts of glucose and scyllo-inositol were decomposed. Generated. Further, 20 hours after the start of the reaction, the scyllo-inositol derivative of the present invention was completely decomposed. From this, it was found that the scyllo-inositol derivative of the present invention is easily degraded by ⁇ -glucosidase. Also from the enzyme experiment, the correctness of the structure determination of the scyllo-inositol derivative of the present invention was confirmed.
  • the present invention can be used for industrial fermentation production of scyllo-inositol.
  • novel scyllo-inositol derivatives of the present invention are also useful for industrial production of scyllo-inositol.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

【課題】　グルコース等の安価で遍在的原料から、一段階の行程によりシロ‐イノシトールを生産し得る工業的製造方法を提供する。更に、当該製造方法により得られる新規なシロ‐イノシトール誘導体の提供である。 【解決手段】　シロ‐イノシトールが、イノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子、イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子およびシロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を保有する形質転換微生物により、グルコースから一段階で発酵生産される。当該発酵によりグルコース等の糖類と結合したシロ‐イノシトール誘導体も提供される。

Description

シロ‐イノシトールの製造方法
　本発明は、シロ‐イノシトールの製造における遺伝子組換技術の応用に関する。特に、一段階の行程によりグルコース等の遍在的原料からシロ‐イノシトールを生産し得る形質転換体、及び当該形質転換体を利用したシロ‐イノシトールの工業的製造方法に関する。また、本発明は、前記形質転換体によって生産され得るシロ‐イノシトール誘導体及びその製造方法、並びに当該誘導体からのシロ‐イノシトールの製造方法に関する。
　シロ‐イノシトール（ｓｃｙｌｌｏ‐ｉｎｏｓｉｔｏｌ；ｃｉｓ‐１，３，５‐ｔｒａｎｓ‐２，４，６‐シクロヘキサンへキソール）は、イノシトールの光学不活性異性体の一つであり、古くから動物及び植物に見出されていた化合物である。しかし、近年になり、シロ‐イノシトールが有する様々な生理活性が注目されてきている。
　例えば、非特許文献１は、シロ‐イノシトールがアミロイドβ蛋白質凝集抑制作用を有することを報告しており、当該作用は、シロ‐イノシトールのアルツハイマー病治療における潜在的有用性を示唆している。また、特許文献１は、シロ‐イノシトールを有効成分とする血糖値低下剤を特許請求している。したがって、シロ‐イノシトールを工業的に生産することの明確な必要性が存在している。
　古典的な生産方法では、シロ‐イノシトールが植物体から抽出されるか、ミオイノシトールを原料として当該化合物が化学合成されていた（非特許文献２及び３、特許文献２等）。しかし、近年になって、天然型微生物或いは微生物由来の酵素を利用して、より効率的にシロ‐イノシトールを生産する方法が検討されてきている。
　特許文献３は、アグロバクテリウム属に属する微生物を、ミオイノシトールを含有する培地で培養して培養液中にイノシトール立体異性体を生成させるか、又はアグロバクテリウム属に属する微生物の菌体または菌体処理物をミオイノシトールに作用させて、イノシトール立体異性体を生成させる方法を開示している。それらの異性体化により、ミオイノシトールが、シロ‐イノシトール、キロ‐イノシトール（ｃｈｉｒｏ‐ｉｎｏｓｉｔｏｌ：Ｄ体とＬ体の混合物として）及びネオ‐イノシトール（ｎｅｏ‐ｉｎｏｓｉｔｏｌ）の混合物に変換されたとされている。
　特許文献４には、ミオイノシトールに対してシュードモナス　ｓｐ．ＡＢ１００６４株（ＦＥＲＭＰ‐１８３３０）或いはアセトバクター　ｓｐ．ＡＢ１０２５３株（ＦＥＲＭＰ‐１８８６８）を作用させて、ミオイノシトールをシロ‐イノソース（ｓｃｙｌｌｏ‐ｉｎｏｓｏｓｅ）へと変換させることが記載されている。更に、それによって生成したシロ‐イノソースを水素化ホウ素ナトリウムで還元することで、シロ‐イノシトールを合成することが試みられたが、当該還元処理では、根本的に、シロ‐イノシトールはミオイノシトール（つまり、原料への逆行反応）との混合物としてのみ、生成された。したがって、特許文献４に記載されたシロ‐イノシトールの製造方法では、ミオイノシトールの微生物によるシロ‐イノソースへの変換と水素化ホウ素ナトリウムによる還元処理を繰り返しながら、漸次、シロ‐イノシトールの含有量を増加させていく必要があった。
　特許文献５は、ミオイノシトールを原料として用い、ミオイノシトールからシロ‐イノソースを生成するミオイノシトール２‐デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１８）と、シロ‐イノソースを立体選択的にシロ‐イノシトールに還元するシロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼと、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋を混合した溶液中で、ミオイノシトールをシロ‐イノシトールへ酵素変換反応させる、シロ‐イノシトールの製造方法を開示している。当該文献でのミオイノシトールからシロ‐イノシトールへの変換は、収量ベースで３１％であったとされる。
　従って、上記のいずれの文献も、ミオイノシトールを出発原料としてシロ‐イノシトールを生産する方法に関するものであり、ｄｅ　ｎｏｖｏのシロ‐イノシトール生合成、つまりグルコース等の遍在的原料からシロ‐イノシトールを直接的に且つ一段階行程で生産する方法を教示していない。
　殊に、そもそもミオイノシトールは、それ自体が極めて有用で且つ貴重な生理活性物質である。すなわち、ミオイノシトールは、多くの高等動物にとって必要不可欠な物質であるため、栄養食品、飼料、医薬品等の成分として広範に利用されている。例えば、ミオイノシトールは、脂肪やコレステロール類の代謝において重要な役割を担っていることが知られており、特に高コレステロール血症等の予防や治療に有効とされている。
　従って、現実的には、ミオイノシトールの工業的スケールでの製造プロセスについてさえも多くの改良が提案されている最中なのである。例えば、特許文献６は、ミオイノシトールを菌体外に分泌し得るキャンディダ属酵母の発見及びその利用を開示している。特許文献７及び８は、それぞれ、前記ミオイノシトール分泌性キャンディダ属酵母にグルコース代謝拮抗物質及び抗生物質に対する耐性を付与する突然変異を導入することを開示している。特許文献９、１０及び１１もまた、それぞれ、ミオイノシトール生産能を有するキャンディダ属酵母に対して３級アミン、ヘキサクロロシクロヘキサン及びセチルトリメチルアンモニウム塩に対する耐性を付与する突然変異を導入することで、ミオイノシトールの収率を向上させることを開示している。特許文献１２は、同じくミオイノシトール生産能を有するキャンディダ属酵母に対して６‐ハロゲノ‐６‐デオキシグルコースに対する耐性を付与する突然変異を導入することを開示している。特許文献１３も、ミオイノシトール生産能を有するキャンディダ属酵母に対してハロゲン化ピルビン酸に対する耐性を付与する突然変異を導入することを開示している。そしてその他にも、例えば、特許文献１４は、一連のミオイノシトール生合成反応においてイノシトール‐１‐リン酸合成酵素が律速反応を担うとの妥当な推論の下で、ミオイノシトール分泌能を有さないキャンディダ属酵母を前記イノシトール‐１‐リン酸合成酵素コード化ＤＮＡの単独によって形質転換することで、当該酵母に対してミオイノシトール生産能を付与できたことを開示しているし、特許文献１５は、酵母に対して、グリセロール‐３‐リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーターの制御下におかれたイノシトール‐１‐リン酸合成酵素コード化ＤＮＡを単独で導入することにより、該酵母のミオイノシトール生産性を向上させることを開示している。
　上記の事実はいずれも、ミオイノシトールの効率的且つ経済的な生産方法を確立すること自体が、今日においても、依然として重要な技術的課題である事を物語っている。従ってまた、そのように貴重で高価なミオイノシトールを原料としなければならない従来技術のシロ‐イノシトール製造方法の低効率性や不経済性は、一目瞭然である。
　更に、上記のいずれの文献も、シロ‐イノシトール誘導体、とりわけ糖類により誘導体化されたシロ‐イノシトールを開示も示唆もしていない。
特開２００３‐１６０４７８号公報 西ドイツ特許公開公報第３，４０５，６６３号公報 特開平９‐１４０３８８号公報 特開２００３‐１０２４９２号公報 特開２０１０‐１８７６８８号公報 特開平８‐００２５８号公報 特開平８‐３８１８８号公報 特開平８‐８９２６２号公報 特開平９‐１１７２９５号公報 特開平１０‐４２８６０号公報 特開平１０‐４２８８２号公報 特開平１０‐４２８８３号公報 特開２０００‐４１６８９公報 特開平９‐２２００９３号公報 特開平１０‐２７１９９５号公報
Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ．２７５、Ｎｏ．２４、ｐｐ．１８４９５～１８５０２（２０００） 薬学雑誌、８９巻、１３０２～１３０５頁（１９６９） Ｌｉｅｂｉｇｓ　Ａｎｎ．Ｃｈｅｍ．、８６６～８６８頁（１９８５）
　従って、本発明の第１の課題は、グルコース等の安価で遍在的原料から、一段階の行程によりシロ‐イノシトールを生産し得る工業的製造方法に関連する。更に、本発明者らは、前記研究の過程で、糖類と結合した本発明のシロ‐イノシトール誘導体を始めて発見した。当該シロ‐イノシトール誘導体は、シロ‐イノシトールが本来から示す水溶性に比べてさえも、格段に優れた水溶性を示した。例えば、セロビオース（Ｄ‐グルコピラノシル‐（β１→４）‐Ｄ‐グルコース）は、グルコースよりも低い溶解性を示すことから、本発明の知見は驚くべきものであった。したがって、本発明の第２の課題は、新規なシロ‐イノシトール誘導体の提供である。
　前記のように、最近のいずれの研究も、専らミオイノシトールを出発原料としてシロ‐イノシトールを酵素反応的に変換する方法に関するものであった。前記のいずれの先行文献も、宿主微生物細胞内での機能的なｄｅ　ｎｏｖｏのシロ‐イノシトール生合成系の構築、つまりグルコース等の遍在的原料からシロ‐イノシトールを直接的に且つ一段階行程で発酵生産する方法の確立に成功してはいない。
　しかしながら、本発明者らは、イノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子、イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子およびシロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を発現する形質転換体が、グルコースからシロ‐イノシトールを直接的に且つ一段階で発酵生産し得ることを見出した。更に、本発明者らは、そのような形質転換体の培養物中に新規のシロ‐イノシトール誘導体を発見した。
　従って、本発明の第１の局面は：
（１）シロ‐イノシトールおよびシロイノシトール誘導体の製造方法であって、以下の工程：
１）　イノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子、イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子およびシロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を保有する形質転換微生物を用意する工程；
２）　前記微生物の生育及び／又は維持に適した条件下で、該微生物とグルコース又はグルコース単位を有する二糖類若しくは多糖類を接触させる工程；
を含む、前記製造方法である。
　より特定的には、形質転換体を用いたシロ‐イノシトールおよびその誘導体の製造方法において、当該形質転換体が、イノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子、イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子およびシロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を発現することを特徴とする、前記製造方法である。
　前記（１）の培養物中に生産されたシロ‐イノシトール誘導体は新規化合物であり、当該誘導体ではグルコースとシロ‐イノシトールがβ１→４結合していた。従って、本発明の一態様は：
（２）前記シロイノシトール誘導体が、下記の構造式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
で示される化合物である、上記（１）に記載の製造方法である。
　更に、驚くべきことに、そのような形質転換体のイノシトールモノフォスファターゼ活性を強化することにより、シロ‐イノシトール生産能が大幅に向上した。また、予期せぬことに、当該形質転換体ではシロ‐イノシトールが優勢に生産され、ミオイノシトールの生産は僅かであった。本願の優先日以前のいずれの先行文献も、当該目的のためにイノシトールモノフォスファターゼ活性を強化することを開示も示唆もしてはいない。従って、本発明の第２の局面は：
（３）前記形質転換微生物が、機能的なイノシトールモノフォスファターゼの過剰生産又はイノシトールモノフォスファターゼの活性化を誘導する遺伝子組換又は変異を有することを特徴とする、上記（１）又は（２）に記載の製造方法である。
　大腸菌に代表される原核微生物は、その迅速な生育能力や発酵管理の容易さ故に工業的発酵生産の観点から極めて魅力的であるとともに、遺伝子組換技術の適用における実績、確立した安全性の観点からも利点を有する。また、グルコースからミオイノシトールを経てシロ‐イノシトールを生合成する経路を持たない多くの原核微生物は、遺伝子組換技術と連携した合成生物学的手法を用いることで、シロ‐イノシトール生産性を制御しやすいという利点を持つ。殊に大腸菌などの原核微生物宿主は、シロ‐イノシトール生合成経路の中間体であるミオイノシトールを資化する能力（分解能）を持たないため、合成生物学的手法の適用をいっそう容易にする。
　従って、本発明の好適な態様は：
（４）前記形質転換微生物が、ミオイノシトール資化能を有さない微生物に由来することを特徴とする、上記（１）乃至（３）のいずれかに記載の製造方法、並びに
（５）前記形質転換微生物が、大腸菌、バチルス属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ザイモモナス属細菌からなる群から選択される細菌に由来する、上記（１）乃至（４）のいずれかに記載の製造方法である。
　上記（３）の好適な態様に関して、宿主微生物が内因性イノシトールモノフォスファターゼ活性を有しているか否かに関わらず、該細胞内でイノシトールモノフォスファターゼを過剰生産させることで、該細胞のイノシトールモノフォスファターゼ活性を強化できる。様々な公知の技術を適用して細胞にイノシトールモノフォスファターゼを過剰生産させることができる。従って、本発明は以下の態様：
（６）前記イノシトールモノフォスファターゼの過剰生産が、前記形質転換微生物に対して、
　　ａ）　外来イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を導入する、
　　ｂ）　内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子のコピー数を増加させる、
　　ｃ）　内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域に変異を導入する、
　　ｄ）　内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域を高発現誘導性外来調整領域で置換する、又は
　　ｅ）　内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域を欠失させる、
ことにより誘導される、上記（３）乃至（５）のいずれかに記載の製造方法；及び
（７）前記イノシトールモノフォスファターゼの過剰生産が、前記形質転換微生物に対して外来イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を導入することにより誘導される、上記（６）に記載の製造方法、
を含む。
　また、宿主細胞が内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を有している場合は、以下の態様によっても該細胞のイノシトールモノフォスファターゼ活性を強化できる。従って、本発明は以下の態様：
（８）前記イノシトールモノフォスファターゼの活性化が、前記形質転換微生物に対して、
　　ｆ）　内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子に変異を導入する、
　　ｇ）　内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の一部又は全部を置換する、
　　ｈ）　内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の一部を欠失させる、
　　ｉ）　イノシトールモノフォスファターゼ活性を低下させる他のタンパク質を減少させる、
　　ｊ）　イノシトールモノフォスファターゼ活性を低下させる化合物の生成を減少させる、
ことにより誘導される、上記（３）乃至（５）のいずれかに記載の製造方法、
も含む。
　また、本発明は、前記シロ‐イノシトールおよびその誘導体の製造方法に用いるための形質転換体も意図する。従って、本発明の別の局面は：
（９）イノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子、イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子およびシロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を保有する形質転換微生物である。
　また、本発明の第２の局面について記載した事項及び態様は、本発明の上記（９）の形質転換体についても当てはまる。従ってそれらは、以下の：
（１０）前記形質転換微生物が、機能的なイノシトールモノフォスファターゼの過剰生産又はイノシトールモノフォスファターゼの活性化を誘導する遺伝子組換又は変異を更に有することを特徴とする、上記（９）に記載の形質転換微生物、
（１１）前記形質転換微生物が、ミオイノシトール資化能を有さない微生物に由来することを特徴とする、上記（９）又は（１０）に記載の形質転換微生物、
（１２）前記形質転換微生物が、大腸菌、バチルス属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ザイモモナス属細菌からなる群から選択される細菌に由来する、上記（９）乃至（１１）のいずれかに記載の形質転換微生物、
（１３）前記イノシトールモノフォスファターゼの過剰生産が、前記形質転換微生物に対して、
　　ａ）　外来イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を導入する、
　　ｂ）　内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子のコピー数を増加させる、
　　ｃ）　内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域に変異を導入する、
　　ｄ）　内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域を高発現誘導性外来調整領域で置換する、又は
　　ｅ）　内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域を欠失させる、
ことにより誘導されている、上記（１０）乃至（１２）のいずれかに記載の形質転換微生物、
（１４）前記イノシトールモノフォスファターゼの過剰生産が、前記形質転換微生物に対して外来イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を導入することにより誘導されている、上記（１３）に記載の形質転換微生物、及び
（１５）前記イノシトールモノフォスファターゼの活性化が、前記形質転換微生物に対して、
　　ｆ）　内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子に変異を導入する、
　　ｇ）　内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の一部又は全部を置換する、
　　ｈ）　内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の一部を欠失させる、
　　ｉ）　イノシトールモノフォスファターゼ活性を低下させる他のタンパク質を減少させる、
　　ｊ）　イノシトールモノフォスファターゼ活性を低下させる化合物の生成を減少させる、
ことにより誘導されている、上記（１０）乃至（１２）のいずれかに記載の形質転換微生物、
を含む。
　本発明の更なる局面は、前記形質転換体の培養物中に生産されることが見出された、新規シロ‐イノシトール誘導体に関連する。すなわち、本発明は：
(１６）下記の構造式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
で示される化合物も意図する。
　本発明のシロ‐イノシトール誘導体は、β‐グリコシド結合を加水分解する反応を触媒できる酵素、例えばβ‐グルコシダーゼ（ＥＣ　３．２．１．２１）によって分解され得、容易にグルコースとシロ‐イノシトールを生成する。また、本発明のシロ‐イノシトール誘導体の示す高い水溶性は、そのような酵素反応において有利であり得る。したがって、本発明の更に別のの局面は：
（１７）シロ‐イノシトールの製造方法であって、上記（１６）の化合物を、β‐グリコシド結合を加水分解する反応を触媒できる酵素により分解し、シロ‐イノシトールを生成させることを特徴とする、前記方法である。
　また、本発明は：
（１８）シロイノシトールと上記（１６）に記載の化合物を含む組成物である。
　本発明によれば、微生物培養技術による工業的シロ‐イノシトール生産の効率化が達成できる。また、本発明では、新規なシロ‐イノシトール誘導体が提供される。当該誘導体は、極めて水溶性が高いので、生産工程においてバッチあたりの生産濃度を向上させ得るし、関連する製品を製造する際のハンドリングに優れる。また、工業的なシロ‐イノシトールの生産性を向上させることができる。
ＩＮＯ１遺伝子のコード領域を示す（配列番号１）。 ｓｕｈＢ遺伝子のコード領域を示す（配列番号３）。 ｉｏｌＧ遺伝子のコード領域を示す（配列番号５）。 ｉｏｌＷ遺伝子のコード領域を示す（配列番号７）。 本発明のシロ‐イノシトール誘導体の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルである。図中、矢印で示したピークは不純物由来である。 本発明のシロ‐イノシトール誘導体の１３Ｃ－ＮＭＲスペクトルである。 本発明のシロ‐イノシトール誘導体のβ‐グルコシダーゼ（セロビアーゼ）による分解例を示す。
　本発明の第１の課題は、イノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子、イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子およびシロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を保有する形質転換微生物を、グルコース又はグルコース単位を有する二糖類若しくは多糖類を炭素源として含有する培地内で発酵させること、或いは当該形質転換体を前記炭素源と接触させることにより解決される。つまり、本発明の形質転換微生物は、当該微生物内に新たに構築された連続した生合成経路により、グルコース基質を一段階の発酵により、シロ‐イノシトールおよびその誘導体へと変換し得る能力を有する。
　典型的に、グルコース基質を本発明のシロ‐イノシトール（或いは同時生産されるシローイノシトール誘導体。以下、両者をまとめて「本発明のシロ‐イノシトール」ということもある。）へと変換する生合成経路は、グルコース基質を、重要な中間体であるミオイノシトールへと変換する部分経路を含む。
　具体的に、原核微生物宿主の場合では、次の触媒活性を発現させることで当該微生物内においてミオイノシトール生合成のための部分経路を機能させることができる。
　活性１：　適当な炭素源からグルコース‐６‐リン酸を生成させる活性；
　活性２：　グルコース‐６‐リン酸をミオイノシトール‐１‐リン酸へ変換する活性、つまり、イノシトール‐１‐リン酸合成酵素活性；及び
　活性３：　ミオイノシトール‐１‐リン酸を基質としたフォスファターゼ活性。
　但し、活性１の生成物であるグルコース‐６‐リン酸は、微生物が普遍的に生成する代謝中間体であるので、当該活性を敢て形質転換体に付与することは必須ではない。また、活性３についても、本発明者らの知る限りにおいて、従来の遺伝子組換手法による工業的生産に適する原核微生物宿主細胞の大多数は、内因性イノシトールモノフォスファターゼを発現しているか、ミオイノシトール‐１‐リン酸を基質とできる汎用モノフォスファターゼ活性を有している。
　他方、活性２について見ると、原核微生物はイノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子を有していない例が多い。また、ミオイノシトール生合成反応においてイノシトール‐１‐リン酸合成酵素が律速反応を担うと考えられている（特許文献１４及び１５参照。）。したがって、原核微生物宿主内で機能的なミオイノシトール生合成経路を構築するためには、外来性イノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子を該細胞に導入することが必要十分であると考えられる。
　しかしながら、本願と同時継続している日本国特許出願第２０１１‐２４８４３８号において、本発明者らは、予期せぬことに、上記の外来性イノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子を導入した形質転換体においてイノシトールモノフォスファターゼ活性を強化することで、ミオイノシトール生産能が大幅に向上することを見出した。更に驚くべきことに、後記実施例の通り、本発明の形質転換体は、そのイノシトールモノフォスファターゼ活性を強化することで、極めて多量且つ優勢にシロ‐イノシトールを生産し、一方ミオイノシトールを殆ど生産しないだけでなく、実質量の本発明のシロ‐イノシトール誘導体を生産することが明らかとなった。したがって、本発明の形質転換体に対しては、前記の外来性イノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子を導入することに加えて、機能的なイノシトールモノフォスファターゼの過剰生産又はイノシトールモノフォスファターゼの活性化を誘導する遺伝子組換又は変異を導入することが好ましい。
　例えば、宿主微生物が内因性イノシトールモノフォスファターゼ活性を有しているか否かに関わらず、形質転換微生物細胞内でイノシトールモノフォスファターゼを過剰生産させることで、該形質転換微生物のイノシトールモノフォスファターゼ活性を強化できる。好適には、当該形質転換微生物に対して外来性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を導入することによりイノシトールモノフォスファターゼの過剰生産を誘導し得るが、これに限定されない。なお、本明細書において、「外来」乃至「外来性」という用語は、形質転換前の宿主微生物が、本発明により導入されるべき遺伝子を有していない場合、その遺伝子によりコードされる酵素を実質的に発現しない場合、及び異なる遺伝子により当該酵素のアミノ酸配列をコードしているが、形質転換後に匹敵する内因性酵素活性を発現しない場合において、本発明に基づく遺伝子乃至核酸配列を宿主に導入することを意味するために用いられる。
　次いで、本発明の形質転換体、つまり、グルコース基質をシロ‐イノシトール（或いは同時生産されるシローイノシトール誘導体）まで変換し得る連続した生合成経路を有する形質転換微生物には、以下の触媒活性が付与される。
　活性４：ミオイノシトールを２‐ケト‐ミオ‐イノシトール（ミオ‐イノソース；２，３，４，５，６‐ペンタヒドロキシシクロヘキサン‐１‐オン）に変換する酵素活性；及び
　活性５：２‐ケト‐ミオ‐イノシトールをシロ‐イノシトールに変換する酵素活性。
　上記活性４を有する酵素としては、例えばＮＡＤ＋の存在下でミオイノシトールを酸化する、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ（酵素番号Ｅ．Ｃ．１．１．１．１８）が挙げられる。また、上記活性５を有する酵素としては、例えばＮＡＤＰ＋の存在下でシロ‐イノシトールを酸化する、シロイノシトールデヒドロゲナーゼが挙げられる。つまり、本発明に用いることができるシロイノシトールデヒドロゲナーゼは、例えばＮＡＤＰＨの存在下では、２‐ケト‐ミオ‐イノシトールをシロ‐イノシトールに変換することができる。それらの酵素の詳細は後記する。
　本発明の形質転換体は様々な宿主微生物細胞を用いて作製し得る。特に、原核微生物を宿主にすることは、当該宿主細胞内に本発明のシロ‐イノシトールの生合成経路を新たに構築（つまり、既存の内因性経路の影響がない。）することを可能にするので、合成生物学的手法の適用において極めて魅力的である。例示される原核微生物は：エッシェリシア、シュードモナス、バチルス、ゲオバチルス、メタノモナス、メチロバシラス、メチロフィリウス、プロタミノバクター、メチロコッカス、コリネバクテリウム、ブレビバクテリウム、ザイモモナスおよびリステリア属の細菌である。工業的発酵生産において好適な原核微生物の非限定的な例示は、大腸菌、バチルス属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ザイモモナス属細菌を含む。大腸菌は、その迅速な生育能力や発酵管理の容易さ故に特に好ましい宿主微生物の例である。また、本発明の宿主細胞として利用できる細胞株は、通常の意味での野生型であってよく、或いは、栄養要求性変異株、抗生物質耐性変異株であってもよい。更に、本発明の宿主細胞として利用できる細胞株は、上記のような変異に関する各種マーカー遺伝子を有するように既に形質転換されていてもよい。これらの変異や遺伝子は、本発明の形質転換体の作製・維持・管理に有益な性質を提供し得る。好ましくは、クロラムフェニコール、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン等の抗生物質に耐性を示す株を用いることにより、本発明のシロ‐イノシトール生産を簡便に行うことができる。
　前述の通り、本発明の形質転換体が有すべきシロ‐イノシトール生合成経路は、グルコース基質を、重要な中間体であるミオイノシトールへと変換するための部分経路を含む。更に、前述の通り、ミオイノシトール生合成においてイノシトール‐１‐リン酸合成酵素が律速反応を担うと考えられているので、本発明の形質転換体には、第１の生物活性として、イノシトール‐１‐リン酸合成酵素を発現することが要求される。特に、原核微生物はイノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子を有していない例が多いので、通常は、外来性イノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子が本発明の形質転換体の細胞内に発現可能に導入される。イノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子は公知であり（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏs．ＡＢ０３２０７３、ＡＦ０５６３２５、ＡＦ０７１１０３、ＡＦ０７８９１５、ＡＦ１２０１４６、ＡＦ２０７６４０、ＡＦ２８４０６５、ＢＣ１１１１６０、Ｌ２３５２０、Ｕ３２５１１）、そのいずれも使用することができる。特に、酵母由来のＩＮＯ１遺伝子（配列番号１）は、よく知られているイノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子の例であり、本発明においても好適に使用することができる。但し、本発明の形質転換体作製に利用できるイノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子は酵母由来のものに限られず、他の真核微生物やそれ以外の生物に由来するものであっても、或いは人工的に合成したものであっても、前記宿主微生物細胞内で実質的なイノシトール‐１‐リン酸合成酵素活性を発現できるものであればよい。
　したがってまた、本発明の目的に利用できるイノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子は、前記形質転換微生物内で実質的なイノシトール‐１‐リン酸合成酵素活性を発現できるものであれば、自然界で発生し得るすべての変異や、人工的に導入された変異及び修飾を有していてもよい。例えば、特定のアミノ酸をコードする種々のコドンには余分のコドン（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）が存在することが知られている。そのため本発明においても同一のアミノ酸に最終的に翻訳されることになる代替コドンを利用してよい。つまり、遺伝子コードは縮重しているので、ある特定のアミノ酸をコードするのに複数のコドンを使用でき、そのためアミノ酸配列は任意の１セットの類似のＤＮＡオリゴヌクレオチドでコードされ得る。そのセットの唯一のメンバーだけが天然型酵素の遺伝子配列に同一であるが、ミスマッチのあるＤＮＡオリゴヌクレオチドでさえ適切な緊縮条件下（例えば、３ｘＳＳＣ、６８℃でハイブリダイズし、２ｘＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ及び６８℃で洗浄）で天然型配列にハイブリダイズでき、天然型配列をコードするＤＮＡを同定、単離でき、更にそのような遺伝子も本発明において利用できる。特に、ほとんどの生物は特定のコドン（最適コドン）のサブセットを優先的に用いることが知られているので（Ｇｅｎｅ、Ｖｏｌ．１０５、ｐｐ．６１－７２、１９９１等）、宿主微生物に応じて「コドン最適化」を行うこと有用であり得る。
　しかして、本発明の形質転換体の作製においても、イノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子が「発現カセット」として宿主微生物細胞内に導入されることにより、より安定的で高レベルのイノシトール‐１‐リン酸合成酵素活性が得られることを当業者は理解するであろう。本明細書において、「発現カセット」とは、発現対象の核酸または発現対象の遺伝子に機能的に結合された転写および翻訳をレギュレートする核酸配列を含むヌクレオチドを意味する。典型的に、本発明の発現カセットは、コード配列から５’上流にプロモーター配列、３’下流にターミネーター配列、場合により更なる通常の調節エレメントを機能的に結合された状態で含み、そのような場合に、発現対象の核酸または発現対象の遺伝子が宿主微生物に発現可能に導入される。
　プロモーターは、構造性プロモーターであるか調節プロモーターであるかに拘わらず、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合させ、ＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡ配列と定義される。強いプロモーターとはｍＲＮＡ合成を高頻度で開始させるプロモーターであり、本発明の形質転換体作製においても好適に使用される。ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ又はＴＲＣ系、λファージの主要オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、解糖系酵素（例えば、３－ホスホグリセレートキナーゼ、グリセルアルデヒド‐３‐リン酸脱水素酵素）、グルタミン酸デカルボキシラーゼＡ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼに対するプロモーター等が、その宿主細胞の性質等に応じて利用可能である。プロモーターおよびターミネーター配列のほかに、他の調節エレメントの例として挙げられ得るのは、選択マーカー、増幅シグナル、複製起点などである。好適な調節配列については、例えば、”Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１８５”、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１９９０）に記載されている。
　上記で説明した発現カセットは、例えば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、ＩＳエレメント、ファスミド、コスミド、又は線状もしくは環状のＤＮＡ等から成るベクターに組み入れて、宿主微生物中に挿入される。プラスミドおよびファージが好ましい。これらのベクターは、宿主微生物中で自律複製されるものでもよいし、また染色体により複製されてもよい。好適なプラスミドは、例えば、大腸菌のｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＫＫ２２３－３、ｐＤＨＥ１９．２、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ－ＩＩＩ１１３－Ｂ１、λｇｔ１１又はｐＢｄＣＩ；桿菌のｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４又はｐＢＤ２１４；コリネバクテリウム属のｐＳＡ７７又はｐＡＪ６６７などである。これらの他にも使用可能なプラスミド等は、”Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｅｃｔｏｒｓ”、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９８５に記載されている。ベクターへの発現カセットの導入は、適当な制限酵素による切り出し、クローニング、及びライゲーションを含む慣用の方法によって可能である。
　上記ような発現カセットを有するベクターが構築された後、該ベクターを宿主微生物に導入する際に適用できる手法として、例えば、共沈、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクションなどの慣用のクローニング法およびトランスフェクション法が使用される。それらの例は、「分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｆ．　Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｐｕｂｌ．Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９９７、またはＳａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験室マニュアル」、第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９に記載されている。
　次いで、本発明の形質転換体が有すべき第２の生物活性は、イノシトールモノフォスファターゼ活性である。当該イノシトールモノフォスファターゼ活性も、グルコース基質を中間体ミオイノシトールへと変換するために要求される。しかし、前述の通り、従来の遺伝子組換手法による工業的生産に適する原核微生物宿主細胞の大多数は、内因性イノシトールモノフォスファターゼを発現しているか、ミオイノシトール‐１‐リン酸を基質とできる汎用モノフォスファターゼ活性を有しているので、本発明の形質転換体に当該酵素活性を敢て導入する必要はない場合が多い。更にしかしながら、本発明の形質転換体が強化されたイノシトールモノフォスファターゼを示すことは特に好ましい。すわなち、予期せぬことに、本発明のシロ‐イノシトール生産性形質転換体は、そのイノシトールモノフォスファターゼ活性を強化することで、極めて多量且つ優勢にシロ‐イノシトールを生産しつつミオイノシトールを殆ど生産しないだけでなく、顕著にシロ‐イノシトール誘導体を生産することが明らかとなった。したがって、本発明の好適な局面は、シロ‐イノシトール生産性形質転換体内でイノシトールモノフォスファターゼを過剰生産させることを包含する。
　本発明で意図されるイノシトールモノフォスファターゼとは、イノシトール‐１‐リン酸に対して高い基質特異性を示すものの他にも、広範な基質に対して作用し得るリン酸モノエステル加水分解酵素活性を示すことにより、イノシトール‐１‐リン酸を実質的に加水分解化できるタンパク質を含む。典型的なイノシトールモノフォスファターゼとしては、例えば、イノシトール‐１‐モノフォスファターゼが知られており、多くの生物由来の当該遺伝子（ｓｕｈＢ遺伝子）はＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏs．ＺＰ＿０４６１９９８８、ＹＰ＿００１４５１８４８等で公表されている。特に、大腸菌由来のｓｕｈＢ遺伝子（配列番号３：ＡＡＣ７５５８６（ＭＧ１６５５））の使用は、大腸菌を宿主細胞とする場合に便利である。
　本発明の形質転換体が有するべき第３の生物活性は、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ活性である。当該酵素は、典型的には以下の反応により、ＮＡＤ＋の存在下でミオイノシトールを２‐ケト‐ミオ‐イノシトールに変換する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　種々のミオイノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子が公知且つ利用可能である。例えば、特開平６－７１５８号公報には、ＮＡＤ＋の存在下でミオイノシトールを２‐ケト‐ミオ‐イノシトールに変換し得るバチルス属細菌由来の酵素（ＥＣ．１．１．１．１８）及びそのコード化核酸配列が記載されている。その他にも、特許文献５にはＮＡＤ＋非依存型ミオイノシトールデヒドロゲナーゼが開示されており、当該酵素も本発明の形質転換体作製に使用し得るであろう。特に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＮＢＲＣ１３７１９株由来のｉｏｌＧ遺伝子（下記の配列番号５）の使用は便利である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　本発明の形質転換体が有するべき第４の生物活性は、シロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼ活性である。当該酵素は、典型的には以下の反応により、ＮＡＤＰ＋の存在下でシロ‐イノシトールを２‐ケト‐ミオ‐イノシトールに変換するが、ＮＡＤＰＨの存在下で２‐ケト‐ミオ‐イノシトールを選択的にシロ‐イノシトールへと還元する。本発明の形質転換体内では、後者の反応が利用される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　種々のシロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子が公知且つ利用可能である。特許文献５には大腸菌、アセトバクター属細菌、バチルス属細菌、アグロバクテリウム属細菌、キサントモナス属細菌のシロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼ及び関連するアミノ酸配列が開示されている。特に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＮＢＲＣ１３７１９株由来のｉｏｌＷ遺伝子（下記の配列番号７）の使用は便利である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　イノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子について記載した、変異や修飾及びコドン最適化、並びに発現カセット、プロモーター等のレギュレーター配列及びプラスミド等とそれによる形質転換の説明は、全て上記のイノシトールモノフォスファターゼ遺伝子、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子及びシロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子についても当てはまることを当業者は容易に理解するであろう。したがって、本発明の形質転換体は、イノシトール‐１‐リン酸合成酵素をコードする核酸を含む発現カセット、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼをコードする核酸を含む発現カセット及びシロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼをコードする核酸を含む発現カセットの３つの発現カセットを保有し、その場合、本発明の形質転換体には内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子が存在する。好適な本発明の形質転換体は、配列番号１で示されるヌクレオチド配列を有する核酸を含む発現カセット、配列番号５で示されるヌクレオチド配列を有する核酸を含む発現カセット、及び配列番号7で示されるヌクレオチド配列を有する核酸を含む発現カセットを保有している。
　上記の３つ発現カセットは、１つのベクター上に配置されて宿主微生物にトランスフェクトされてよい。或いは、そのうちの任意の２つの発現カセットが配置されたベクターと残りの発現カセットが配置されたベクターが宿主微生物にコ‐トランスフェクトされてもよいし、各々の発現カセットが配置された３つのベクターが宿主微生物にコ‐トランスフェクトされてもよい。更に、上記３つの発現カセットのうちの任意の１つ以上が宿主微生物のゲノムに組み込まれ、残りの発現カセットはプラスミドとして当該形質転換体内に存在してよい。例えば、イノシトール‐１‐リン酸合成酵素コード化核酸（ＩＮＯ１）を含む発現カセットを染色体上に組み込んで得た大腸菌ＡＫＣ－０１７株（ＦＥＲＭ　Ｐ－２２１８０として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センターに２０１１年１０月２５日に寄託されている。国際寄託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１５１３）に対して、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼをコードする核酸を含む発現カセット及びシロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼをコードする核酸を含む発現カセットを配置したプラスミドをトランスフェクトすることも可能である。
　更に、繰り返し記載したとおり、本発明の形質転換体が強化されたイノシトールモノフォスファターゼを示すことは特に好ましい。したがって、本発明の形質転換体が、上記３つの発現カセットに加えて、イノシトールモノフォスファターゼをコードする核酸を含む発現カセットを保有することが好ましい。したがって、更に好適な本発明の形質転換体として、配列番号１で示されるヌクレオチド配列を有する核酸を含む発現カセット、配列番号３で示されるヌクレオチド配列を有する核酸を含む発現カセット、配列番号５で示されるヌクレオチド配列を有する核酸を含む発現カセット、及び配列番号7で示されるヌクレオチド配列を有する核酸を含む発現カセットを保有している形質転換体が挙げられる。
　上記の４つ発現カセットは、１つのベクター上に配置されて宿主微生物にトランスフェクトされてよい。或いは、そのうちの任意の２つ以上の発現カセットが配置されたベクターと残りの発現カセットが配置されたベクターが宿主微生物にコ‐トランスフェクトされてもよいし、各々の発現カセットが配置された４つのベクターが宿主微生物にコ‐トランスフェクトされてもよい。更に、上記４つの発現カセットのうちの任意の１つ以上が宿主微生物のゲノムに組み込まれ、残りの発現カセットはプラスミドとして当該形質転換体内に存在してよい。例えば、イノシトール‐１‐リン酸合成酵素コード化核酸（ＩＮＯ１）を含む発現カセット及びイノシトールモノフォスファターゼをコードする核酸（ｓｕｈＢ）を含む発現カセットの双方を染色体上に有する大腸菌ＡＫＣ－０１８株（ＦＥＲＭ　Ｐ－２２１８１として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センターに２０１１年１０月２５日に寄託されている。国際寄託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１５１４）に対して、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼをコードする核酸を含む発現カセット及びシロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼをコードする核酸を含む発現カセットを配置したプラスミドをトランスフェクトすることも可能である。
　更にまた、本発明の好適な形質転換体において強化されたイノシトールモノフォスファターゼ活性を誘導する方法に関連して、当該イノシトールモノフォスファターゼの過剰生産を、内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子のコピー数を増加させる；内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域に変異を導入する；内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域を高発現誘導性外来調整領域で置換する；及び内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域を欠失させることによっても誘導し得る。具体的にイノシトールモノフォスファターゼの過剰発現を達成するためには、内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を含むか、或いは当該内因性遺伝子のコード化領域に好適な調整領域を付加した発現カセットを含む構築物により前記宿主微生物を形質転換して、当該形質転換体内での当該イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子のコピー数を元の宿主細胞に比べて実質的に増加させるか、内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を有する元の宿主細胞に関して、染色体の変異、付加および欠失を公知の遺伝子組換技術により実施するか、あるいは、変異剤などを用いて染色体にランダムに変異導入を行うことで達成することができる。イノシトールモノフォスファターゼの過剰生産の確認には、公知のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析法などを用いることができる
　更に、イノシトールモノフォスファターゼ活性を強化するための本発明の別の態様は、本発明の形質転換体においてイノシトールモノフォスファターゼの活性化を誘導することを含む。その目的のために、１）内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子に変異を導入する、２）内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の一部又は全部を置換する、３）内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の一部を欠失させる、４）イノシトールモノフォスファターゼ活性を低下させる他のタンパク質を減少させる、及び／又は５）イノシトールモノフォスファターゼ活性を低下させる化合物の生成を減少させる、といった手法を例示できる。
　上記イノシトールモノフォスファターゼ活性を強化するための１）～５）の手法に関して、具体的には、イノシトールモノフォスファターゼの遺伝子に変異、付加あるいは欠失を施した後に当該遺伝子をコードするイノシトールモノフォスファターゼの活性を評価することで、イノシトールモノフォスファターゼ活性の強化されたイノシトールモノフォスファターゼを得ることができる。
　上記のようにして得られる形質転換体は、本発明のシロ‐イノシトール生産のために、前記形質転換体の生育及び／又は維持に適した条件下で培養及び維持される。各種の宿主微生物細胞に由来する形質転換体のための好適な培地組成、培養条件、培養時間は当業者に公知である。
　培地は、1つ以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン、及び場合により微量元素乃至ビタミン等の微量成分を含む天然、半合成、合成培地であってよい。しかし、使用する培地は、培養すべき形質転換微生物の栄養要求を適切に満たさなければならないことは言うまでもない。更に本発明に使用し得る培地は、本発明の形質転換体によりｄｅ　ｎｏｖｏのシロ‐イノシトール生合成及びシロ‐イノシトール誘導体の生合成を容易に進行させるために、グルコース又はグルコース単位を有する二糖類若しくは多糖類を含んでいる。数多くのグルコース単位を有する二糖類若しくは多糖類が当業者に周知である。それらの非限定的例としては、スクロース、マルトース、ラクトース、でんぷん、セルロースが挙げられる。また、それらは米ぬか、廃糖密、トウモロコシ分解液やセルロース分解液等のバイオマスに多量に含まれているので、これらの天然資源を炭素源とした培地の使用は好適である。更に培地は、形質転換体が有用な付加的形質を発現する場合、例えば抗生物質への耐性マーカーを有する場合、対応する抗生物質を含んでいてよい。それにより、発酵中の雑菌による汚染リスクが低減される。なお、セルロースなどの炭素源を宿主微生物が資化できない場合は、当該宿主微生物に外来遺伝子を導入するなどの公知の遺伝子工学的手法を施すことで、これら炭素源を使用したシロ‐イノシトールおよびその誘導体生産に適応させることができる。外来遺伝子としては、例えば、セルラーゼ遺伝子やアミラーゼ遺伝子などを挙げることができる。
　培養は、バッチ式であっても連続式であってもよい。また、いずれの場合にも、培養の適切な時点で追加の前記炭素源等を補給する形式であってもかまわない。更に、培養は、好適な温度、酸素濃度、ｐＨ等を維持しながら継続されるべきである。一般的な微生物宿主細胞に由来する形質転換体の好適な培養温度は、通常１５℃～４５℃、好ましくは２５℃～３７℃の範囲である。宿主微生物が好気性の場合、発酵中の適切な酸素濃度を確保するために振盪（フラスコ培養等）、攪拌／通気（ジャー・ファーメンター培養等）を行う必要がある。それらの培養条件は、当業者にとって容易に設定可能である。
　上記の培養物からシロ‐イノシトール或いはその誘導体を精製する方法は、当業者に公知の精製手段を、適宜、組み合わせたものであってよい。原核微生物宿主細胞の形質転換体の場合、本発明のシロ‐イノシトールは培養上清中または菌体内に存在し、よって必要であれば培養菌体からも抽出してもよい。培養菌体から抽出する場合、例えば、培養物を遠心分離して上清と菌体を分離し、ホモジナイザーを利用しつつ、界面活性剤、有機溶媒、酵素等により菌体を破壊し得る。培養上清、及び場合により菌体抽出液からもシロ‐イノシトールおよびその誘導体を精製する典型的な方法としては、ｐＨ調整等によるタンパク質沈澱を利用した除タンパク処理、活性炭を利用した不純物の吸着による除去、イオン交換樹脂等を利用したクロマトグラフィーなどの精製工程を実施することが挙げられる。更に、クロマトグラフィーで分離され画分を乾燥して得られた固体を、例えば水－エタノール系から再結晶してもよい。勿論、製品により目的とされる純度に応じて一部の工程を削除したり、或いは追加のクロマトグラフィーや再結晶等を実施したりしてもよいことは言うまでもない。
　本発明の第２の課題に関連するシロ‐イノシトール誘導体は、グルコース残基とシロ‐イノシトール残基とがβ１→４結合を介して結合した構造を有し、以下の構造式により表されるものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　上記化合物は新規であり、１－Ｏ－β－Ｄ‐グルコピラノシル‐シロ‐イノシトールとも呼称され得る。
　後記実施例のとおり、本発明のシロ‐イノシトール誘導体は、β‐グリコシド結合を加水分解する反応を触媒できる酵素、例えばβ‐グルコシダーゼ（ＥＣ　３．２．１．２１）によって容易に分解され得、容易にグルコースとシロ‐イノシトールを生成する。したがって、本発明のシロ‐イノシトール誘導体に対して当該酵素を作用させることによりシロ‐イノシトールを生産できる。
　殊に、本発明のシロ‐イノシトール誘導体は、後述のとおりに、もとのシロ‐イノシトールに比べて、少なくとも４倍以上（２５℃、Ｗ／Ｖ）の水溶性を示す。しかして、本発明のシロ‐イノシトール誘導体は、水性液中で高濃度にて生産及び処理することができるから、本発明のシロ‐イノシトール誘導体を得て、それを上記酵素処理することでシロ‐イノシトールを生産することの利点は多く、よってそのような方法は本発明のシロ‐イノシトール誘導体の好適な利用方法の一つである。
　上記のシロ‐イノシトール生産のために、本発明のシロ‐イノシトール誘導体をβ‐グルコシダーゼ等により酵素的に分解するには、例えば水や緩衝液（酢酸緩衝液、燐酸緩衝液等）による本発明のシロ‐イノシトール誘導体の溶液に対して適当量の酵素を添加し、その酵素反応に適切な条件及び時間にて、該溶液をインキュベーションすればよい。そのような目的において有利に使用できるβ‐グルコシダーゼは市販されており、そのいずれも使用できるが、例えばアスペルギルス属のカビ由来のＣｅｌｌｏｂｉａｓｅ（ＳＩＧＭＡ社）を利用すればよい。添加する酵素の量は、製造元の指示を参考にしながら、本発明のシロ‐イノシトール誘導体の溶液中の濃度等に基づいて、適宜決定すればよい。また、反応時のｐＨは、一般的にはｐＨ４．０～９．０の範囲であるが、要は、使用する酵素の至適ｐＨとすればよい。また、反応時の温度も、使用する酵素の至適温度範囲とすればよく、例えば、約２０～５０℃程度の範囲とすればよい。反応時間は、本発明のシロ‐イノシトール誘導体の分解率を定量的に追跡しつつ、ほぼ全ての本発明のシロ‐イノシトール誘導体がシロ‐イノシトールに変換された時点とすればよい。その後、反応液からシロ‐イノシトールを、再結晶等により分離すればよい。
　なお、後記実施例のように、本発明の形質転換体を、シロ‐イノシトールとともに実質量の本発明のシロ‐イノシトール誘導体が生産される条件下で培養した場合には、当該形質転換体の培養物をそのまま前記酵素で処理するか、或いは当該培養物を除タンパク処理や活性炭処理程度で粗精製した後に酵素処理することにより、シロ‐イノシトールの生産性を更に高めることができる。
　また、医薬品、食品、化粧品等の有効成分や機能性成分として用いることも、本発明のシロ‐イノシトール誘導体の潜在的な用途の一つである。つまり、前記のとおりにシロ‐イノシトールの生理活性が明らかになってきており、そして、本発明のシロ‐イノシトール誘導体は酵素的に分解されて容易にシロ‐イノシトールを生成することから、本発明のシロ‐イノシトール誘導体が生体内で酵素的に分解されてシロ‐イノシトールを産生することを期待して、本発明のシロ‐イノシトール誘導体自体を医薬品等に添加することは、極めて興味深い本発明の利用態様である。
　以上の説明を与えられた当業者は、本発明を十分に実施できる。以下、更なる説明の目的として実施例を与え、したがって、本発明は当該実施例に限定されるものではない。なお、本明細書において得に断りのない限りヌクレオチド配列は５’から３’方向に向けて記載される。
　実施例１：イノシトールモノフォスファターゼ活性を強化しない形質転換体によるシロ‐イノシトールｄｅ　ｎｏｖｏ生産
　本実施例では、イノシトール‐１‐リン酸合成酵素をコードする核酸を含む発現カセット、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼをコードする核酸を含む発現カセット及びシロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼをコードする核酸を含む３つの発現カセットを保有する本発明の形質転換微生物を作製し、それによるシロ‐イノシトールの生産能力を調べた。
　１－ａ）　イノシトール‐１‐リン酸合成酵素発現カセット
　単離した酒精酵母の培養液から菌体を回収し、Ｎｕｃｌｅｏ　Ｓｐｉｎ　Ｔｉｓｓｕｅ（製品名、ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬ社製）を使用してゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に用い、以下のプライマーによりＰＣＲ増幅し（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（製品名、タカラバイオ製）　反応条件：９８℃　１０ｓｅｃ，５５℃　５ｓｅｃ，７２℃　２０ｓｅｃ，２８ｃｙｃｌｅ）、ＩＮＯ１遺伝子のコード領域（配列番号１）をクローニングした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　次いで、得られたｉｎｏ１コード領域は下記配列のプロモーターの下流に転写可能に挿入した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　すなわち、プラスミドｐＮＦＰ－Ａ５１（ＦＥＲＭ　Ｐ－２２１８２として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センターに２０１１年１０月２５日に寄託した。国際寄託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１５１５）のマルチクローニングサイトにターミネーター配列及び前記プロモーター配列を挿入した。導入されたプロモーター配列の下流に上記でクローニングされたｉｎｏ１コード領域をライゲーションして、ｐＮＦＰ－Ｄ７８を構築した。構築したｐＮＦＰ－Ｄ７８を、塩化カルシウム法（羊土社　遺伝子工学実験ノート　上　田村隆明著、参照）により大腸菌ＡＫＣ－０１６株（ＦＥＲＭ　Ｐ－２２１０４として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに２０１１年４月２０日に寄託した。国際寄託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１５１２）にトランスフェクトした。ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより当該大腸菌の可溶性画分でのイノシトール‐１‐リン酸合成酵素の高発現を確認した。
　１－ｂ）　ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ発現カセット
　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＮＢＲＣ１３７１９）をＬＢ培地中（２ｍｌ）で３０℃にて振盪培養した。培養終了後、培養液から菌体を回収し、Ｎｕｃｌｅｏ　Ｓｐｉｎ　Ｔｉｓｓｕｅ（製品名、ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬ社製）を使用してゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に用い、以下のプライマーによりＰＣＲ増幅し（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（製品名、タカラバイオ製）　反応条件：９８℃　１０ｓｅｃ，５５℃　５ｓｅｃ，７２℃　２０ｓｅｃ，２８ｃｙｃｌｅ）、ｉｏｌＧ遺伝子のコード領域（配列番号５）をクローニングした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　得られたｉｏｌＧコード領域は配列番号１１のプロモーターの下流に転写可能に挿入した。すなわち、前記ｐＮＦＰ－Ａ５１のマルチクローニングサイトにターミネーター配列及び前記プロモーター配列を挿入した。導入されたプロモーター配列の下流に上記でクローニングされたｉｏｌＧコード領域をライゲーションして、ｐＮＦＰ－Ｊ２２を構築した。構築したｐＮＦＰ－Ｊ２２を、塩化カルシウム法（羊土社　遺伝子工学実験ノート　上　田村隆明著、参照）により大腸菌株ＦＥＲＭ　Ｐ－２２１０４にトランスフェクトした。ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより当該大腸菌の可溶性画分でのミオイノシトールデヒドロゲナーゼの高発現を確認した。
　１－ｃ）　シロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼ発現カセット
　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＮＢＲＣ１３７１９）をＬＢ培地中（２ｍｌ）で３０℃にて振盪培養した。培養終了後、培養液から菌体を回収し、Ｎｕｃｌｅｏ　Ｓｐｉｎ　Ｔｉｓｓｕｅ（製品名、ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬ社製）を使用してゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に用い、以下のプライマーによりＰＣＲ増幅し（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（製品名、タカラバイオ製）　反応条件：９８℃　１０ｓｅｃ，５５℃　５ｓｅｃ，７２℃　２０ｓｅｃ，２８ｃｙｃｌｅ）、ｉｏｌＷ遺伝子のコード領域（配列番号７）をクローニングした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　得られたｉｏｌＷコード領域は配列番号１１のプロモーターの下流に転写可能に挿入した。すなわち、前記ｐＮＦＰ－Ａ５１のマルチクローニングサイトにターミネーター配列及び前記プロモーター配列を挿入した。導入されたプロモーター配列の下流に上記でクローニングされたｉｏｌＷコード領域をライゲーションして、ｐＮＦＰ－Ｊ３６を構築した。構築したｐＮＦＰ－Ｊ３６を、塩化カルシウム法（羊土社　遺伝子工学実験ノート　上　田村隆明著、参照）により大腸菌株ＦＥＲＭ　Ｐ－２２１０４にトランスフェクトした。ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより当該大腸菌の可溶性画分でのシロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼの高発現を確認した。
　１－ｄ）　形質転換のためのプラスミドの構築
　ｐＮＦＰ－Ｄ７８をＳａｌＩで消化し、平滑末端化及び５’末端脱リン酸化した。ｐＮＦＰ－Ｊ２２中のｉｏｌＧ発現カセット及びｐＮＦＰ－Ｊ３６中のｉｏｌＷ発現カセットをクローニングして、両発現カセットをｐＮＦＰ－Ｄ７８にライゲーションした。ｐＮＦＰ－Ｄ７８中のＩＮＯ１発現カセットと順方向にｉｏｌＧ発現カセット及びｉｏｌＷ発現カセットがライゲーションしていたプラスミドを取得した。
　１－ｅ）　発現カセット含有プラスミドでトランスフェクトした形質転換体によるシロ‐イノシトール生産
　上記の手順に従って構築したプラスミドを、大腸菌ＡＫＣ－０１６株（ＦＥＲＭ　Ｐ－２２１０４として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに２０１１年４月２０日に寄託した。国際寄託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１５１２）に塩化カルシウム法（羊土社　遺伝子工学実験ノート　上　田村隆明著、参照）を用いてトランスフェクトした。
　得られた形質転換体を、アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）含有ＬＢプレート上で、３７℃、一日間培養して、コロニーを形成させた。アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢ培地２ｍＬを１５ｍＬ容の試験管に入れ、上記プレートからコロニーを白金耳で植菌し、３７℃で、３～５時間、ＯＤ（６００ｎｍ）が０．５程度になるまで１８０ｒｐｍで培養を行い、これを本培養のための前培養液とした。
　１５０ｍＬ容のフラスコに、２ｇ／Ｌのグルコースと、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地を３０ｍＬ入れ、０．６ｍＬの前培養液を添加し本培養（シロ‐イノシトール生産試験）を行った。培養条件は次のとおり；培養温度　３２℃；攪拌　１８０ｒｐｍ；培養時間１６．５ｈ。
　上記の培養液を、４℃で、１０，０００ｇ×１０分間遠心分離して上清を回収し、培養上清のシロ‐イノシトール濃度を測定した。具体的に、ＫＳ－Ｇ（ガードカラム）、Ｓｕｇａｒ　ＫＳ－８０１及びＳｕｇａｒ　ＫＳ－８０２（いずれも商品名、昭和電工株式会社製）を連結してＨＰＬＣ（検出器：ＲＩ、カラム温度：７０℃、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ）を行うことで、培養上清中のシロ‐イノシトール濃度を定量した。定量した結果、シロイノシトールが培養上清中に０．１５ｇ／Ｌ生産され、グルコースは完全消費されていることが明らかとなった。この結果は、イノシトール‐１‐リン酸合成酵素をコードする核酸を含む発現カセット、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼをコードする核酸を含む発現カセット及びシロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼをコードする核酸を含む３つの発現カセットを保有し、内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を有する（つまり、イノシトールモノフォスファターゼが強化されていない）本発明の形質転換微生物が、グルコースからシロ‐イノシトールを直接的に且つ一段階行程で生産したことを示している。
　実施例２：イノシトールモノフォスファターゼ活性を強化した形質転換体によるシロ‐イノシトールｄｅ　ｎｏｖｏ生産
　本実施例では、イノシトール‐１‐リン酸合成酵素をコードする核酸を含む発現カセット、イノシトールモノフォスファターゼをコードする核酸を含む発現カセット、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼをコードする核酸を含む発現カセット及びシロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼをコードする核酸を含む４つの発現カセットを保有する本発明の形質転換微生物を作製し、それによるシロ‐イノシトールの生産能力を調べた。
　２－a）　イノシトールモノフォスファターゼ発現カセット
　大腸菌株Ｗ３１１０（ＮＢＲＣ　１２７１３）をＬＢ培地中（２ｍｌ）で３７℃にて振盪培養した。培養終了後、培養液から菌体を回収し、Ｎｕｃｌｅｏ　Ｓｐｉｎ　Ｔｉｓｓｕｅ（製品名、ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬ社製）を使用してゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に用い、以下のプライマーによりＰＣＲ増幅し（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（製品名、タカラバイオ製）　反応条件：９８℃　１０ｓｅｃ，５５℃　５ｓｅｃ，７２℃　２０ｓｅｃ，２８ｃｙｃｌｅ）、ｓｕｈＢ遺伝子のコード領域（配列番号３）をクローニングした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　得られたｓｕｈＢコード領域は下記配列のプロモーターの下流に転写可能に挿入した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　すなわち、前記ｐＮＦＰ－Ａ５１のマルチクローニングサイトにターミネーター配列及び配列番号１８のプロモーター配列を挿入した。導入されたプロモーター配列の下流に上記でクローニングされたｓｕｈＢコード領域をライゲーションして、ｐＮＦＰ－Ａ５４を構築した。構築したｐＮＦＰ－Ａ５４を、塩化カルシウム法（羊土社　遺伝子工学実験ノート　上　田村隆明著、参照）により大腸菌株ＦＥＲＭ　Ｐ－２２１０４にトランスフェクトした。ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより当該大腸菌の可溶性画分でのイノシトールモノフォスファターゼの高発現を確認した。
　２－ｂ）　形質転換のためのプラスミドの構築
　実施例１で作製したｐＮＦＰ－Ｄ７８をＳａｌＩで消化し、平滑末端化及び５’末端脱リン酸化した。ｐＮＦＰ－Ａ５４中のｓｕｈＢ発現カセットをクローニングして、ｐＮＦＰ－Ｄ７８にライゲーションした。ｐＮＦＰ－Ｄ７８中のＩＮＯ１発現カセットと順方向にｓｕｈＢ発現カセットがライゲーションしていたｐＮＦＰ－Ｇ２２を取得した。次いで、ｐＮＦＰ－Ｇ２２をＳａｌＩで消化し、平滑末端化及び５’末端脱リン酸化した。実施例１で作製したｐＮＦＰ－Ｊ２２中のｉｏｌＧ発現カセット及びｐＮＦＰ－Ｊ３６中のｉｏｌＷ発現カセットをクローニングして、両発現カセットをｐＮＦＰ－Ｇ２２にライゲーションした。ｐＮＦＰ－Ｇ２２中のＩＮＯ１発現カセット及びｓｕｈＢ発現カセットと順方向にｉｏｌＧ発現カセット及びｉｏｌＷ発現カセットがライゲーションしていたプラスミドを取得した。
　２－ｃ）　発現カセット含有プラスミドでトランスフェクトした形質転換体によるシロ‐イノシトール生産
　上記の手順に従って構築したプラスミドを、大腸菌ＡＫＣ－０１６株（ＦＥＲＭ　Ｐ－２２１０４として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに２０１１年４月２０日に寄託した。国際寄託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１５１２）に塩化カルシウム法（羊土社　遺伝子工学実験ノート　上　田村隆明著、参照）を用いてトランスフェクトした。
　得られた形質転換体を、アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）含有ＬＢプレート上で、３７℃、一日間培養して、コロニーを形成させた。アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢ培地２ｍＬを１５ｍＬ容の試験管に入れ、上記プレートからコロニーを白金耳で植菌し、３７℃で、３～５時間、ＯＤ（６００ｎｍ）が０．５程度になるまで１８０ｒｐｍで培養を行い、これを本培養のための前培養液とした。
　１５０ｍＬ容のフラスコに、２ｇ／Ｌのグルコースと、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含む合成培地（表１）を３０ｍＬ入れ、０．６ｍＬの前培養液を添加し本培養（シロ‐イノシトール生産試験）を行った。培養条件は次のとおり；培養温度　３２℃；攪拌　１８０ｒｐｍ；培養時間１６．５ｈ。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　上記の培養液を、４℃で、１０，０００ｇ×１０分間遠心分離して上清を回収し、培養上清のシロ‐イノシトール濃度を測定した。具体的に、ＫＳ－Ｇ（ガードカラム）、Ｓｕｇａｒ　ＫＳ－８０１及びＳｕｇａｒ　ＫＳ－８０２（いずれも商品名、昭和電工株式会社製）を連結してＨＰＬＣ（検出器：ＲＩ、カラム温度：７０℃、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ）を行うことで、培養上清中のシロ‐イノシトール濃度を定量した。定量した結果、シロイノシトールが培養上清中に０．０９ｇ／Ｌ生産され、グルコースは完全消費されていることが明らかとなった。一方、本合成培地によるシロイノシトール生産条件下においては、培養時間１６．５ｈ時点で、イノシトールモノファスファターゼ活性非強化株では培養上清にシロ‐イノシトールピークが検出されなかった。
　従って、本発明の形質転換微生物においてイノシトールモノフォスファターゼ活性を強化することが有利であることが判明した。
　２－ｄ）　発現カセット含有プラスミドでトランスフェクトした形質転換体によるＪａｒ培養槽を用いたシロ‐イノシトールの生産
　上記２－ｃ）での形質転換体を、アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）含有ＬＢプレート上で、３７℃、一日間培養して、コロニーを形成させた。アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢ培地３０ｍＬを１５０ｍＬ容のフラスコに入れ、上記プレートからコロニーを白金耳で植菌し、３７℃で、３～５時間、ＯＤ（６００ｎｍ）が０．５程度になるまで１８０ｒｐｍで培養を行い、これを本培養のための前培養液とした。
　１０００ｍＬ容のＪａｒ培養装置（丸菱バイオエンジ社製）に、１ｇ／Ｌのグルコースと、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含む下記の合成培地（表２）を３００ｍＬ入れ、６ｍＬの前培養液を添加し本培養（Ｊａｒ培養装置を用いたシロ‐イノシトール生産試験）を行った。培養条件は次のとおり：培養温度　３２℃；培養ｐＨ　６．０〔下限〕；アルカリ添加　２８％（重量／容量）アンモニア水；攪拌　８５０ｒｐｍ；通気　１ｖｖｍ。原料となるグルコースフィード溶液（表３）は、培養液中のグルコース濃度が０～５ｇ／Ｌとなるように適宜添加した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　培養時間６８h後、上記の培養液を、４℃で、１０，０００ｇ×１０分間遠心分離して上清を回収し、培養上清のシロ‐イノシトール濃度を測定した。具体的に、ＫＳ－Ｇ（ガードカラム）、Ｓｕｇａｒ　ＫＳ－８０１及びＳｕｇａｒ　ＫＳ－８０２（いずれも商品名、昭和電工株式会社製）を連結してＨＰＬＣ（検出器：ＲＩ、カラム温度：７０℃、流速：１ｍＬ／ｍｉｎ）を行うことで、培養上清中のシロ‐イノシトール濃度を定量した。
　定量した結果、これまでに例のない濃度である１２．４ｇ／Ｌのシロイノシトールが培養上清中に生産されていた。一方、精製工程において問題となるミオイノシトールはほとんど培養上清に存在せず、その濃度は０．１％以下であった。
実施例３：シロ‐イノシトール誘導体の単離及び構造決定
　上記実施例２において、Ｊａｒ培養装置を用いたシロ‐イノシトール生産試験で得られた培養上清をＨＰＬＣ（カラム：Ｓｈｏｄｅｘ　Ａｓａｈｉｐａｋ　ＮＨ２Ｐ－５０　４Ｅ（商品名：昭和電工株式会社製）、移動相：水／アセトニトリル＝２５／７５、流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度４０℃、検出：ＲＩ）で更に分析したところ、１２．４ｇ／Ｌのシロイノシトールと共に、１．４ｇ／Ｌのシロイノシトール誘導体が培養上清中に生産されていた。当該シロイノシトール誘導体のピークを分取して、以下の実験に用いた。
分取した化合物を、以下のＮＭＲ分析によって構造決定した。
装置　　　　　：Ａｖａｎｃｅ６００（Ｂｒｕｋｅｒ　Ｂｉｏｓｐｉｎ社製）
プローブ　　　：クライオプローブ（１３Ｃ高感度）
測定温度　　　：１８℃（試料劣化防止と１Ｈ－ＮＭＲの際に水シグナルを移動させるため、全て２９１Ｋ（１８℃）とした。）
溶媒：　　　　：Ｄ２Ｏ（ＡＬＤＲＩＣＨ社製）
内部標準　　　：ＴＳＰ
１Ｈ観測周波数：６００．１３ＭＨｚ
１３Ｃ観測周波数：１５０．９２ＭＨｚ
　測定結果及びピークの帰属は以下のとおりであった。なお、表中、ピーク番号の「ＧＨ－１」とは、グルコース残基の１位水素であることを示す。また「ＩＨ－１」とは、シロ‐イノシトール残基の１位水素であることを示す。他も同様である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　上記の、１Ｈ－ＮＭＲ及び１３Ｃ-ＮＭＲを、それぞれ、図５及び図６に示した。また、ピークの帰属は、ＣＯＳＹ、ＣＨ－ＣＯＳＹ、ＨＭＢＣ、Ｊ分解二次元ＮＭＲにより確認した。
実施例４：シロ‐イノシトール誘導体の酵素分解
　実施例３で得られた化合物を、アスペルギルス属のカビ由来のβ‐グルコシダーゼである、Ｃｅｌｌｏｂｉａｓｅ（ＳＩＧＭＡ社）により分解した。具体的に、実施例３で得られた化合物を、４００μＬの１５０ｍＭ　Ｂｉｓ‐Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ＝７．０）に、６ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。当該溶液に、２５Ｕ／ｍＬＣｅｌｌｏｂｉａｓｅを１００μＬ加え、４０℃で２０時間までインキュベート（１２００ｒｐｍ、Ｂｉｏｓｈａｋｅｒ　Ｍ・ＢＲ０２２、ＴＡＩＴＥＣ社）して反応させた。反応０時間、３時間、２０時間目に反応液をサンプリングし、ＨＰＬＣ（カラム：Ｓｈｏｄｅｘ　Ａｓａｈｉｐａｋ　ＮＨ２Ｐ－５０　４Ｅ（商品名：昭和電工株式会社製）、移動相：水／アセトニトリル＝２５／７５、流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度４０℃、検出：ＲＩ）で反応状況を確認した。
　図７に示した結果のとおり、反応開始から３時間目には、実施例３で得られた化合物、すなわち本発明のシロ‐イノシトール誘導体がほとんど分解して、対応する量のグルコースとシロ‐イノシトールが生成した。また、反応開始から２０時間後には、本発明のシロ‐イノシトール誘導体は完全に分解していた。このことから、本発明のシロ‐イノシトール誘導体が、β‐グルコシダーゼにより容易に分解されることが判った。また、本酵素実験からも、本発明のシロ‐イノシトール誘導体の構造決定の正しさが確認された。
　本発明は、シロ‐イノシトールの工業的発酵生産に利用できる。本発明の新規なシロ‐イノシトール誘導体も、シロ‐イノシトールの工業的生産に有用である。
　本明細書で言及したプラスミド及び微生物は、それらが寄託されていると記載されている場合、いずれも、（寄託機関の名称）「ＩＰＯＤ　独立行政法人　製品評価技術基盤機構特許　微生物寄託センター（ＩＰＯＤ、ＮＩＴＥ）」；（寄託機関のあて名）「日本国　郵便番号３０５－８５６６　茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６」に寄託されている。

Claims (18)

  1. シロ‐イノシトールおよびシロイノシトール誘導体の製造方法であって、以下の工程：
    １）　イノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子、イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子およびシロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を保有する形質転換微生物を用意する工程；
    ２）　前記微生物の生育及び／又は維持に適した条件下で、該微生物とグルコース又はグルコース単位を有する二糖類若しくは多糖類を接触させる工程；
    を含む、前記製造方法。
  2. 前記シロイノシトール誘導体が、下記の構造式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    で示される化合物である、請求項１に記載の製造方法。
  3. 前記形質転換微生物が、機能的なイノシトールモノフォスファターゼの過剰生産又はイノシトールモノフォスファターゼの活性化を誘導する遺伝子組換又は変異を有することを特徴とする、請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. 前記形質転換微生物が、ミオイノシトール資化能を有さない微生物に由来することを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の製造方法。
  5. 前記形質転換微生物が、大腸菌、バチルス属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ザイモモナス属細菌からなる群から選択される細菌に由来する、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の製造方法。
  6. 前記イノシトールモノフォスファターゼの過剰生産が、前記形質転換微生物に対して、
    　　ａ）　外来イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を導入する、
    　　ｂ）　内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子のコピー数を増加させる、
    　　ｃ）　内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域に変異を導入する、
    　　ｄ）　内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域を高発現誘導性外来調整領域で置換する、又は
    　　ｅ）　内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域を欠失させる、
    ことにより誘導される、請求項３乃至５のいずれか１項に記載の製造方法。
  7. 前記イノシトールモノフォスファターゼの過剰生産が、前記形質転換微生物に対して外来イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を導入することにより誘導される、請求項６に記載の製造方法。
  8. 前記イノシトールモノフォスファターゼの活性化が、前記形質転換微生物に対して、
    　　ｆ）　内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子に変異を導入する、
    　　ｇ）　内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の一部又は全部を置換する、
    　　ｈ）　内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の一部を欠失させる、
    　　ｉ）　イノシトールモノフォスファターゼ活性を低下させる他のタンパク質を減少させる、
    　　ｊ）　イノシトールモノフォスファターゼ活性を低下させる化合物の生成を減少させる、
    ことにより誘導される、請求項３乃至５のいずれか１項に記載の製造方法。
  9. イノシトール‐１‐リン酸合成酵素遺伝子、イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子およびシロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を保有する形質転換微生物。
  10. 前記形質転換微生物が、機能的なイノシトールモノフォスファターゼの過剰生産又はイノシトールモノフォスファターゼの活性化を誘導する遺伝子組換又は変異を更に有することを特徴とする、請求項９に記載の形質転換微生物。
  11. 前記形質転換微生物が、ミオイノシトール資化能を有さない微生物に由来することを特徴とする、請求項９又は１０に記載の形質転換微生物。
  12. 前記形質転換微生物が、大腸菌、バチルス属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ザイモモナス属細菌からなる群から選択される細菌に由来する、請求項９乃至１１のいずれか１項に記載の形質転換微生物。
  13. 前記イノシトールモノフォスファターゼの過剰生産が、前記形質転換微生物に対して、
    　　ａ）　外来イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を導入する、
    　　ｂ）　内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子のコピー数を増加させる、
    　　ｃ）　内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域に変異を導入する、
    　　ｄ）　内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域を高発現誘導性外来調整領域で置換する、又は
    　　ｅ）　内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域を欠失させる、
    ことにより誘導されている、請求項１０乃至１２のいずれか１項に記載の形質転換微生物。
  14. 前記イノシトールモノフォスファターゼの過剰生産が、前記形質転換微生物に対して外来イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を導入することにより誘導されている、請求項１３に記載の形質転換微生物。
  15. 前記イノシトールモノフォスファターゼの活性化が、前記形質転換微生物に対して、
    　　ｆ）　内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子に変異を導入する、
    　　ｇ）　内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の一部又は全部を置換する、
    　　ｈ）　内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の一部を欠失させる、
    　　ｉ）　イノシトールモノフォスファターゼ活性を低下させる他のタンパク質を減少させる、
    　　ｊ）　イノシトールモノフォスファターゼ活性を低下させる化合物の生成を減少させる、
    ことにより誘導されている、請求項１０乃至１２のいずれか１項に記載の形質転換微生物。
  16. 下記の構造式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
    で示される化合物。
  17. 　シロ‐イノシトールの製造方法であって、請求項１６記載の化合物を、β‐グリコシド結合を加水分解する反応を触媒できる酵素により分解し、シロ‐イノシトールを生成させることを特徴とする、前記方法。
  18. シロイノシトールと請求項１６に記載の化合物を含む組成物。
PCT/JP2013/051198 2012-02-02 2013-01-22 シロ‐イノシトールの製造方法 WO2013115012A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP13743267.0A EP2811029B1 (en) 2012-02-02 2013-01-22 Method for producing scyllo-inositol
JP2013556328A JP5977264B2 (ja) 2012-02-02 2013-01-22 シロ‐イノシトールの製造方法
CN201380006347.0A CN104245950B (zh) 2012-02-02 2013-01-22 鲨肌醇的制造方法
US14/374,385 US9505795B2 (en) 2012-02-02 2013-01-22 Method for producing scyllo-inositol

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012020556 2012-02-02
JP2012-020556 2012-08-28
JP2012-248490 2012-11-12
JP2012248490 2012-11-12

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2013115012A1 true WO2013115012A1 (ja) 2013-08-08

Family

ID=48905054

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2013/051198 WO2013115012A1 (ja) 2012-02-02 2013-01-22 シロ‐イノシトールの製造方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US9505795B2 (ja)
EP (1) EP2811029B1 (ja)
JP (2) JP5977264B2 (ja)
CN (1) CN104245950B (ja)
TW (1) TWI506137B (ja)
WO (1) WO2013115012A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020529205A (ja) * 2017-07-31 2020-10-08 シージェイ チェイルジェダン コーポレーションＣｊ Ｃｈｅｉｌｊｅｄａｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 新規のプシコース−６−リン酸脱リン酸酵素、前記酵素を含むプシコース生産用組成物、前記酵素を利用してプシコースを製造する方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018004307A1 (ko) * 2016-06-30 2018-01-04 씨제이제일제당 (주) 고농도 마이오-이노시톨의 효소적 제조방법
CN110857444B (zh) * 2018-08-24 2022-01-25 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种鲨肌醇的制备方法

Citations (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3405663A1 (de) 1984-02-17 1985-08-22 Merck Patent Gmbh, 6100 Darmstadt Verfahren zur herstellung von scyllo-inosit
JPH067158A (ja) 1992-06-23 1994-01-18 Asahi Chem Ind Co Ltd ミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼを生産する実質上純粋な微生物
JPH08258A (ja) 1994-04-19 1996-01-09 Toray Ind Inc キャンディダ属に属する微生物およびそれを用いたイノシトールの製造方法
JPH0838188A (ja) 1994-07-27 1996-02-13 Toray Ind Inc イノシトールの製造方法およびグルコース代謝拮抗物質耐性株の取得法
JPH0889262A (ja) 1994-07-27 1996-04-09 Toray Ind Inc イノシトールの製造方法および抗生物質耐性株の取得法
JPH09117295A (ja) 1995-10-26 1997-05-06 Toray Ind Inc イノシトールの製造法と３級アミンに耐性を有する株の取得法
JPH09140388A (ja) 1995-11-17 1997-06-03 Hokko Chem Ind Co Ltd イノシトール立体異性体の製造方法
JPH09220093A (ja) 1996-02-16 1997-08-26 Toray Ind Inc イノシトール−１−リン酸合成酵素をコードするｄｎａ、それを含む組換えｄｎａ、形質転換体およびそれを用いたイノシトールの製造方法
JPH1042860A (ja) 1996-08-02 1998-02-17 Toray Ind Inc イノシトールの製造方法およびヘキサクロロシクロヘキサン耐性株の取得法
JPH1042883A (ja) 1996-08-02 1998-02-17 Toray Ind Inc イノシトールの製造方法および６−ハロゲノ−６−デオキシグルコース耐性株の取得法
JPH1042882A (ja) 1996-08-02 1998-02-17 Toray Ind Inc イノシトールの製造法とセチルトリメチルアンモニウム塩に耐性を有する株の取得法
JPH10271995A (ja) 1997-03-31 1998-10-13 Toray Ind Inc グルコース存在下で活性を持つキャンディダ属酵母のプロモーターｄｎａ、それを含む組換えｄｎａ、形質転換体およびそれを用いたイノシトールの製造方法
JP2000041689A (ja) 1998-05-25 2000-02-15 Toray Ind Inc イノシト―ルの製造方法
JP2003102492A (ja) 2001-06-25 2003-04-08 Hokko Chem Ind Co Ltd シロ−イノソースの製造法及びシロ−イノシトールの製造法
JP2003160478A (ja) 2001-11-27 2003-06-03 Hokko Chem Ind Co Ltd 血糖値低下剤
WO2005035774A1 (ja) * 2003-10-14 2005-04-21 Hokko Chemical Industry Co., Ltd. シロ−イノシトールの製造方法
JP2011248438A (ja) 2010-05-24 2011-12-08 Oki Data Corp 画像形成装置、メモリチェック方法、および、メモリチェックプログラム

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1169466A4 (en) * 1999-03-23 2005-02-23 Univ Michigan State SYNTHESIS OF 1,2,3,4-TETRAHYDROXYBENZOLE AND 1,2,3-TRIHYDROXYBENZOLENE BY MYO-INOSITOL-1-PHOSPHATE SYNTHASE AND MYO-INOSITOL-2-DEHYDROGENASE
CN100513574C (zh) 2003-10-14 2009-07-15 北兴化学工业株式会社 鲨肌醇的制备方法
US8962287B2 (en) * 2008-10-31 2015-02-24 National University Corporation Kobe University Scyllo-inositol-producing cell and scyllo-inositol production method using said cells
WO2011063304A1 (en) * 2009-11-20 2011-05-26 Opx Biotechnologies, Inc. Methods, systems, and compositions for microbial bio-production of biomolecules using syngas components, or sugars, as feedstocks

Patent Citations (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3405663A1 (de) 1984-02-17 1985-08-22 Merck Patent Gmbh, 6100 Darmstadt Verfahren zur herstellung von scyllo-inosit
JPH067158A (ja) 1992-06-23 1994-01-18 Asahi Chem Ind Co Ltd ミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼを生産する実質上純粋な微生物
JPH08258A (ja) 1994-04-19 1996-01-09 Toray Ind Inc キャンディダ属に属する微生物およびそれを用いたイノシトールの製造方法
JPH0838188A (ja) 1994-07-27 1996-02-13 Toray Ind Inc イノシトールの製造方法およびグルコース代謝拮抗物質耐性株の取得法
JPH0889262A (ja) 1994-07-27 1996-04-09 Toray Ind Inc イノシトールの製造方法および抗生物質耐性株の取得法
JPH09117295A (ja) 1995-10-26 1997-05-06 Toray Ind Inc イノシトールの製造法と３級アミンに耐性を有する株の取得法
JPH09140388A (ja) 1995-11-17 1997-06-03 Hokko Chem Ind Co Ltd イノシトール立体異性体の製造方法
JPH09220093A (ja) 1996-02-16 1997-08-26 Toray Ind Inc イノシトール−１−リン酸合成酵素をコードするｄｎａ、それを含む組換えｄｎａ、形質転換体およびそれを用いたイノシトールの製造方法
JPH1042860A (ja) 1996-08-02 1998-02-17 Toray Ind Inc イノシトールの製造方法およびヘキサクロロシクロヘキサン耐性株の取得法
JPH1042883A (ja) 1996-08-02 1998-02-17 Toray Ind Inc イノシトールの製造方法および６−ハロゲノ−６−デオキシグルコース耐性株の取得法
JPH1042882A (ja) 1996-08-02 1998-02-17 Toray Ind Inc イノシトールの製造法とセチルトリメチルアンモニウム塩に耐性を有する株の取得法
JPH10271995A (ja) 1997-03-31 1998-10-13 Toray Ind Inc グルコース存在下で活性を持つキャンディダ属酵母のプロモーターｄｎａ、それを含む組換えｄｎａ、形質転換体およびそれを用いたイノシトールの製造方法
JP2000041689A (ja) 1998-05-25 2000-02-15 Toray Ind Inc イノシト―ルの製造方法
JP2003102492A (ja) 2001-06-25 2003-04-08 Hokko Chem Ind Co Ltd シロ−イノソースの製造法及びシロ−イノシトールの製造法
JP2003160478A (ja) 2001-11-27 2003-06-03 Hokko Chem Ind Co Ltd 血糖値低下剤
WO2005035774A1 (ja) * 2003-10-14 2005-04-21 Hokko Chemical Industry Co., Ltd. シロ−イノシトールの製造方法
JP2010187688A (ja) 2003-10-14 2010-09-02 Hokko Chem Ind Co Ltd シロ−イノシトールの製造方法
JP2011248438A (ja) 2010-05-24 2011-12-08 Oki Data Corp 画像形成装置、メモリチェック方法、および、メモリチェックプログラム

Non-Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Cloning Vectors", 1985, ELSEVIER
"Gene Expression Technology: Methods in Enzymology", vol. 185, 1990, ACADEMIC PRESS
CHEN, L. ET AL.: "Cloning and expression of the inositol monophosphatase gene from Methanococcus jannaschii and characterization of the enzyme", APPL. ENVIRON. MICROBIOL., vol. 64, no. 7, July 1998 (1998-07-01), pages 2609 - 2615, XP055082148 *
F. AUSUBEL ET AL.: "Current Protocols in Molecular Biology", 1997, PUBL. WILEY INTERSCIENCE
GENE, vol. 105, 1991, pages 61 - 72
KAMANO, Y. ET AL.: "Isolation and structure of two new glucosides, 1-0-beta-D-glucopyranosyl- scyllo-inositol and 1-0-beta-D-glucopyranosyl- proto-quercitol", CHEM. PHARM. BULL., vol. 19, no. 6, 1971, pages 1113 - 1117, XP008173113 *
LIEBIGS ANN. CHEM., 1985, pages 866 - 868
SAMBROOK ET AL.: "Molecular Cloning: Laboratory Manual, 2nd ed.", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
See also references of EP2811029A4 *
THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 275, no. 24, 2000, pages 18495 - 18502
YAKUGAKU ZASSHI, vol. 89, 1969, pages 1302 - 1305
YAMAOKA, M. ET AL.: "A cell factory of Bacillus subtilis engineered for the simple bioconversion of myo-inositol to scyllo- inositol, a potential therapeutic agent for Alzheimer's disease", MICROB. CELL FACT., vol. 10, no. 69, 2011, pages 1 - 6, XP021109042 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020529205A (ja) * 2017-07-31 2020-10-08 シージェイ チェイルジェダン コーポレーションＣｊ Ｃｈｅｉｌｊｅｄａｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 新規のプシコース−６−リン酸脱リン酸酵素、前記酵素を含むプシコース生産用組成物、前記酵素を利用してプシコースを製造する方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP6110542B2 (ja) 2017-04-05
EP2811029A4 (en) 2015-07-15
US20140370549A1 (en) 2014-12-18
TW201336995A (zh) 2013-09-16
JP2016135135A (ja) 2016-07-28
JP5977264B2 (ja) 2016-08-24
US9505795B2 (en) 2016-11-29
EP2811029A1 (en) 2014-12-10
TWI506137B (zh) 2015-11-01
CN104245950A (zh) 2014-12-24
CN104245950B (zh) 2017-06-09
EP2811029B1 (en) 2018-03-21
JPWO2013115012A1 (ja) 2015-05-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5781669B2 (ja) ミオイノシトール及びミオイノシトール誘導体の製造方法
EP1865056B1 (en) Gene expression cassette and transformant, and process for production of 2-deoxy-scyllo-inosose and process for purification of 2-deoxy-scyllo-inosose using the transformant
JP6144804B2 (ja) グルカル酸の製造方法
JP6110542B2 (ja) シロ‐イノシトールの製造方法
JP2020515293A (ja) 中鎖脂肪酸誘導体の生産のための改良された活性を有するチオエステラーゼ変種
JP6576650B2 (ja) グルコースの溶出抑制方法
US20080176300A1 (en) Microbial conversion of sugar acids and means therein

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13743267

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2013556328

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14374385

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2013743267

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE