JP2020515293A - 中鎖脂肪酸誘導体の生産のための改良された活性を有するチオエステラーゼ変種 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、2017年4月3日に出願された米国仮特許出願USSN 62/481,078の恩典を主張する。
本開示は、中鎖長脂肪酸および脂肪酸誘導体の生産に有用な分子ツールに関する。したがって、本開示は、微生物に、中鎖長脂肪酸および脂肪酸誘導体に対する耐性を付与する遺伝子に関する。本開示は、さらに、例えば、8炭素および10炭素の脂肪酸および脂肪酸誘導体を含む、中鎖脂肪酸誘導体の生産のための改良された活性および/または選択性を有する新規な操作チオエステラーゼ変種ならびにそれをコードするポリヌクレオチドに関する。したがって、本開示は、操作チオエステラーゼ変種およびそれをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞、ならびに関係する細胞培養物にも関する。さらに、操作チオエステラーゼ変種および生物学的に生産された中鎖脂肪酸誘導体の組成物を発現している宿主細胞を採用することにより中鎖脂肪酸誘導体を生産する方法が、包含される。
中鎖脂肪酸(MCFA)由来産物を生産することに大きな関心がもたれている。中鎖脂肪酸および中鎖脂肪酸誘導体は、工業に、例えば、バイオ燃料、潤滑剤およびグリース、金属加工液、コーティング剤および接着剤、化粧品およびパーソナルケア製品、香料、食品栄養学、医薬品、プラスチックおよびゴムならびに化学工業のための他の供給原料として、数多く応用されている。
本開示の一局面は、中鎖脂肪酸誘導体の生産のための改良された活性を有する操作チオエステラーゼ変種を提供する。したがって、一態様では、本開示は、中鎖脂肪酸誘導体の生産のための改良された活性を有する操作チオエステラーゼ変種を提供する。一態様では、操作チオエステラーゼ変種が、C8脂肪酸誘導体の生産のための改良された活性を有する、請求項1記載の操作チオエステラーゼ変種。一態様では、操作チオエステラーゼ変種は、SEQ ID NO:1と少なくとも90%の配列同一性、ならびに3、4、6、14、15、17、22、37、44、45、50、54、56、64、67、73、76、91、99、102、110、111、114、129、132、137、158、162、165、176、178、185、186、196、197、198、203、213、217、225、227、236、244、254、256、258、278、282、292、297、298、299、300、301、302、316、321、および322からなる群より選択されるアミノ酸位置に少なくとも1つの置換変異を有するアミノ酸配列を有する。操作チオエステラーゼの一態様では、少なくとも1つの置換変異は、(a)アミノ酸位置3のリジン;(b)アミノ酸位置4のメチオニン;(c)アミノ酸位置6のアルギニン;(d)アミノ酸位置14のグリシンまたはアルギニン;(e)アミノ酸位置15のロイシンまたはトリプトファン;(f)アミノ酸位置17のアラニンまたはシステイン;(g)アミノ酸位置22のアルギニン;(h)アミノ酸位置37のプロリン;(i)アミノ酸位置44のグリシンまたはイソロイシン;(j)位置45のセリン;(k)アミノ酸位置50のトリプトファン;(l)アミノ酸位置54のアルギニン;(m)アミノ酸位置56のリジンまたはシステイン;(n)アミノ酸位置64のアルギニンまたはプロリン;(o)アミノ酸位置67のロイシン;(p)位置73のバリン;(q)アミノ酸位置76のフェニルアラニンまたはロイシンまたはチロシン;(r)アミノ酸位置91のメチオニン;(s)アミノ酸位置99のリジンまたはプロリン;(t)アミノ酸位置102のイソロイシン;(u)アミノ酸位置110のロイシン;(v)位置111のトレオニン;(w)位置114のリジン;(x)アミノ酸位置129のバリン;(y)アミノ酸位置132のトリプトファン;(z)アミノ酸位置137のシステイン;(aa)アミノ酸位置158のグルタミン;(bb)アミノ酸位置162のグルタミン酸;(cc)アミノ酸位置176のバリン;(dd)アミノ酸位置178のプロリン;(ee)アミノ酸位置185のアラニン;(ff)アミノ酸位置186のグリシン;(gg)アミノ酸位置196のバリン;(hh)アミノ酸位置197のアスパラギン;(ii)アミノ酸位置198のトリプトファン;(jj)アミノ酸位置203のアルギニン;(kk)アミノ酸位置213のヒスチジンまたはアルギニン;(ll)アミノ酸位置217のアルギニン;(mm)アミノ酸位置225のロイシン;(nn)アミノ酸位置227のグリシン;(oo)アミノ酸位置236のトレオニン;(pp)アミノ酸位置244のメチオニンまたはアルギニン;(qq)アミノ酸位置254のグリシン;(rr)アミノ酸位置256のシステインまたはアルギニン;(ss)アミノ酸位置258のトレオニンまたはバリン;(tt)アミノ酸位置278のリジンまたはバリン;(uu)アミノ酸位置282のセリンまたはバリン;(vv)アミノ酸位置292のフェニルアラニン;(ww)アミノ酸位置297のトレオニンまたはアスパラギン酸またはバリン;(xx)アミノ酸位置298のバリンまたはシステイン;(yy)アミノ酸位置299のロイシン;(zz)アミノ酸位置300のリジンまたはトリプトファンまたはロイシン;(aaa)アミノ酸位置301のシステイン;(bbb)アミノ酸位置302のトレオニン;(ccc)アミノ酸位置316のアルギニン;(ddd)アミノ酸位置321のアルギニン;および(eee)アミノ酸位置322のリジンからなる群より選択されるメンバーである。
定義
要素を説明する状況で本明細書および添付の特許請求の範囲に使用される「1つの(a)」および「1つの(an)」および「その(the)」ならびに類似の指示物などの単数につく冠詞は、本明細書に特に示されないかぎり、または文脈によってはっきりと否定されないかぎり、単数および複数の両方を含むと解釈されるべきである。したがって、例えば、「1つの宿主細胞」への言及は、2つ以上のこのような宿主細胞を含み、「1つの核酸配列」への言及は、1つまたは複数の核酸配列を含み、「1つの酵素」への言及は、1つまたは複数の酵素を含み、他についても同様である。
上記のように、中鎖脂肪酸(MCFA)誘導体および中鎖脂肪酸(MCFA)由来産物に非常に大きな関心が寄せられている。MCFAは、その多数の好都合な特性が評価されている。実際に、MCFAは、例えば、界面活性剤、接着剤、乳化剤、食用油、香味料、芳香剤、モノマー、ポリマー、天然物農薬および抗菌薬などの、再生可能成分および生分解性成分として使用されている。
A. 一般的な方法
本開示は、組換え遺伝学の分野における常用の技法を利用する。分子生物学および遺伝学における一般的な方法および用語を開示している基礎的なテキストには、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press 4th edition (Cold Spring Harbor, N.Y. 2012); Current Protocols in Molecular Biology Volumes 1-3, John Wiley & Sons, Inc. (1994-1998)およびSupplements 1-115 (1987-2016)が挙げられる。本開示は、生化学の分野における常用の技法も利用する。生化学における一般的な方法および用語を開示している基礎的なテキストには、例えば、Lehninger Principles of Biochemistry sixth edition, David L. Nelson and Michael M. Cox eds. W.H. Freeman (2012)が挙げられる。本開示は、工業発酵における常用の技法も利用する。発酵における一般的な方法および用語を開示している基礎的なテキストには、例えば、Principles of Fermentation Technology, 3rd Edition by Peter F. Stanbury, Allan Whitaker and Stephen J. Hall. Butterworth-Heinemann (2016); Fermentation Microbiology and Biotechnology, 2nd Edition, E. M. T. El-Mansi, C. F. A. Bryce, Arnold L. Demain and A.R. Allman eds. CRC Press (2007)が挙げられる。本開示は、有機化学の分野における常用の技法も利用する。有機化学における一般的な方法および用語を開示している基礎的なテキストには、例えば、 Practical Synthetic Organic Chemistry: Reactions, Principles, and Techniques, Stephane Caron ed., John Wiley and Sons Inc. (2011); The Synthetic Organic Chemist's Companion, Michael C. Pirrung, John Wiley and Sons Inc. (2007); Organic Chemistry, 9th Edition - Francis Carey and Robert Giuliano, McGraw Hill (2013)が挙げられる。
1. 全般
チオエステラーゼまたはチオールエステルヒドロラーゼは、チオエステルの、酸およびチオールへの加水分解を触媒する。チオエステラーゼ(TE)は、異なる基質に対するその活性に基づきEC 3.1.2.1からEC 3.1.2.27に分類され、多くが未分類(EC 3.1.2.-)のままである(例えば、Cantu, D.C., et al. (2010) Protein Science 19:1281-1295を参照されたい)。TEは、多様な供給源から得ることができる。例示的なTEには、植物TE(例えば、Voelker and Davies, J. Bact., Vol., 176, No. 23, pp. 7320-27, 1994、米国特許第5,667,997号、および同第5,455,167号を参照されたい)、細菌TE(例えば、米国特許第9,175,234号を参照されたい);シアノバクテリアTE、ならびに藻類、哺乳動物、昆虫、および真菌起源が挙げられる。
例示的な態様では、中鎖脂肪酸誘導体の生産のための改良された活性を有する操作TE変種が、操作TE変種を含む細菌株(すなわち、試験株)によって生産される中鎖脂肪酸誘導体(例えば、遊離脂肪酸(FFA)、脂肪酸エチルエステル、FAEE、脂肪アルコール(FALC)、脂肪アルコール酢酸エステル(FACe)など)を測定すること、およびこれらの中鎖脂肪酸誘導体を、対照TEを含むことを除き試験株と同質遺伝子的である適切な対照試験株によって生産される中鎖脂肪酸誘導体(例えば、FFA、FAEE、FALC、FACEなど)の測定値と比較することによって同定される。
操作TE変種は、当技術分野において公知の任意の方法によって調製することができる(例えば、Current Protocols in Molecular Biology、前記を参照されたい)。したがって、例示的な態様では、操作TE変種をコードするポリヌクレオチド配列を調製するために変異誘発が使用され、次に中鎖脂肪酸誘導体の生産のための改良された活性について操作TE変種をスクリーニングすることができる。他の例示的な態様では、次に中鎖脂肪酸誘導体の生産のための改良された活性についてスクリーニングすることができる操作TE変種をコードするポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列の化学合成によって調製される(例えば、M.H. Caruthers et al. (1987) Methods in Enzymology Volume 154, Pages 287-313; Beaucage, S.L. and Iyer, R.P. (1992) Tetrahedron 48(12):2223-2311を参照されたい)。
本開示を考慮して、当業者は、本明細書において考えられる態様のいずれかが、開示される操作TE変種をコードする1つまたは複数の核酸配列の導入を介して遺伝子修飾することができる任意の宿主細胞または微生物を用いて実施され得ると認識している。したがって、本明細書開示の組換え微生物は、宿主細胞として機能し、かつ中鎖脂肪酸誘導体の生産のための改良された活性を有する操作TE変種ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを、宿主細胞における操作TE変種ポリペプチドの発現を容易にする、機能的に連結される調節配列と一緒に含む1つまたは複数のポリヌクレオチド配列を含む。
当技術分野において公知の任意の方法を使用して宿主細胞を操作して、脂肪酸誘導体および/もしくは脂肪酸誘導体組成物または他の化合物を生産することができる。例示的な方法は、変異体もしくは操作TE変種をコードするポリヌクレオチド配列および/または本明細書開示の他の脂肪酸誘導体生合成経路ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクター、例えば、発現ベクターの使用を含む。当業者は、多種多様なウイルスおよび非ウイルスベクターを本明細書開示の方法に使用できることを認識している。
例示的な態様では、操作TE変種ポリペプチドの活性は、組換え宿主細胞を培養することおよび組換え宿主細胞によって生産される、例えば、脂肪酸誘導体組成物(例えば、中鎖脂肪エステル、中鎖脂肪アルコール、中鎖脂肪アルデヒドなど)または他の化合物の特徴を測定することによって決定される。例示的な態様では、脂肪酸誘導体または他の化合物の組成、力価、収率および/または生産性が分析される。
組換え宿主細胞により中鎖脂肪酸誘導体の生産を増加させるための戦略は、例えば、生産宿主におけるネイティブな脂肪酸生合成遺伝子の過剰発現および/または同じもしくは異なる生物由来の異種脂肪酸生合成遺伝子の発現によって、脂肪酸生合成経路を経由する流動を増加させることを含む。
上述のように、中鎖脂肪酸誘導体の生産のための改良された活性を有する操作TE変種を含む組換え宿主細胞は、操作TE変種を含まない適切な対照宿主細胞、例えば、対照TE(SEQ ID NO:1など)を有する同質遺伝子的対照宿主細胞と比較して、増加した量の中鎖脂肪酸を生産する。
いくつかの例示的な態様では、中鎖脂肪酸誘導体の生産のための改良された活性を有する操作TE変種に加えて、組換え宿主細胞は、カルボン酸レダクターゼ(「CAR」)活性をさらに含むことで、組換え宿主細胞は、脂肪アルデヒドおよび脂肪アルコールを合成する。例えば、9,340,801を参照されたい。
いくつかの例示的な態様では、中鎖脂肪酸誘導体の生産のための改良された活性を有する操作TE変種を含み、脂肪アルデヒドを生産する組換え宿主細胞(例えば、本明細書上記に開示のもの)は、脂肪アルデヒドを脂肪アミンに変換するアミノトランスフェラーゼまたはアミンデヒドロゲナーゼ活性を有する異種生合成酵素を含むようにさらに改変される(例えば、PCT公報番号WO2015/085271を参照されたい)。
いくつかの例示的な態様では、中鎖脂肪酸誘導体の生産のための改良された活性を有する操作TE変種に加えて、組換え宿主細胞が、脂肪アルコール生合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含むことで、脂肪アルコールが組換え宿主細胞によって生産される。したがって、例示的な態様では、中鎖脂肪アルコールを含む、例えば、オクタノールを含む組成物は、炭素源の存在下で中鎖脂肪酸誘導体の生産のための改良された活性を有する操作TE変種および脂肪アルコール生合成酵素を発現するために有効な条件で組換え宿主細胞を培養することによって生産される。
いくつかの態様では、細胞において生産された、またはいくつかの態様では細胞に供給された脂肪アルコールは、組換え細胞によってさらに加工されて脂肪アルコール酢酸エステル(FACE)を提供する。例示的な態様では、アルコールO-アセチルトランスフェラーゼ(EC 2.8.1.14)酵素は、脂肪アルコールを脂肪アルコール酢酸エステル(FACE)に加工する。例えば、Gabriel M Rodriguez, et al. (2014) Nature Chemical Biology 10、259-265; Jyun-Liang Lin and Ian Wheeldon (2014) PLoS One. 2014; 9(8): PMCID: PMC4122449を参照されたい。
いくつかの態様では、中鎖脂肪酸誘導体の生産のための改良された活性を有する操作TE変種に加えて、組換え宿主細胞が、脂肪エステル生合成活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含むことで、中鎖脂肪エステルが、組換え宿主細胞によって生産される。
いくつかの態様では、中鎖脂肪酸誘導体の生産のための改良された活性を有する操作TE変種に加えて、組換え宿主細胞は、脂肪アルデヒド生合成活性を有するポリペプチド、例えば、アシル-ACPレダクターゼポリペプチド(EC 6.4.1.2)を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および炭化水素生合成活性を有するポリペプチド、例えば、デカルボニラーゼ(EC 4.1.99.5)、酸化デホルミラーゼ、または脂肪酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含み、したがって、組換え宿主細胞は、炭化水素の増強した生産を示す(例えば、米国特許出願公開第2011/0124071号を参照されたい)。したがって、例示的な態様では、中鎖脂肪酸誘導体の生産のための改良された活性を有する操作TE変種を含む組換え宿主細胞は、炭化水素、例えば、アルカンまたはアルケン(例えば、末端オレフィンもしくは内部オレフィン)またはケトンを生産する。
いくつかの態様では、中鎖脂肪酸誘導体の生産のための改良された活性を有する操作TE変種に加えて、組換え宿主細胞は、ω-ヒドロキシラーゼ活性(EC 1.14.15.3)を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。例示的な態様では、修飾ω-ヒドロキシラーゼは、修飾チトクロムP450モノオキシゲナーゼ(P450)酵素活性を有し、炭化水素鎖のw位のヒドロキシル化をインビボで効率的に触媒する。したがって、組換え微生物は、発酵ブロス中で再生可能な供給原料由来の炭素源の存在下で増殖したとき、中鎖オメガ-ヒドロキシル化(ω-ヒドロキシル化)脂肪酸誘導体をインビボで生産する(例えば、PCT出願公開WO2014/201474を参照されたい)。
本明細書に使用される発酵は、組換え宿主細胞による、有機物の標的物質への変換を広く表す。例えば、これは、炭素源を含む培地中での組換え宿主細胞の培養物を増やすことによる、組換え宿主細胞による炭素源の、例えば、中鎖脂肪酸、中鎖脂肪酸エステル、中鎖脂肪アルコール、中鎖脂肪アルコール酢酸エステルなどの脂肪酸誘導体への変換を含む。例えば、脂肪酸、脂肪エステル、脂肪アルコール、脂肪アルコール酢酸エステルなどの標的物質の生産に許容的な条件は、宿主細胞に脂肪酸誘導体組成物などの所望の産物を生産させる任意の条件である。適切な条件には、例えば、典型的な発酵条件が挙げられる。例えば、Principles of Fermentation Technology, 3rd Edition (2016)、前記; Fermentation Microbiology and Biotechnology, 2nd Edition, (2007)、前記を参照されたい。
上述のような組換え宿主細胞を利用して生産される、本明細書開示の中鎖脂肪酸誘導体を含む生物産物、例えば、組成物は、典型的には、当技術分野において公知の方法により発酵ブロスから単離される。例示的な態様では、組換え宿主細胞を利用して生産される本明細書開示の中鎖脂肪酸誘導体を含む組成物は、上に記載されており、重力沈降、遠心分離、またはデカンテーションにより発酵ブロスから単離される。
上に詳細に記載される組換え宿主細胞を利用して生産される生物産物、例えば、中鎖脂肪酸および中鎖脂肪酸誘導体を含む組成物は、再生可能な供給源(例えば、再生可能な供給原料から得られる単純炭素源)から生産され、このことから、新しい物質組成物である。これらの新しい生物産物は、デュアルカーボン-同位体フィンガープリンティングまたは14C年代決定に基づき石油化学炭素由来の有機化合物と識別することができる。追加的に、特定起源の生物起源炭素(例えば、グルコース vs. グリセロール)を、当技術分野において公知のデュアルカーボン-同位体フィンガープリンティングによって決定することができる(例えば、米国特許第7,169,588号、WO2016/011430A1なども参照されたい)。
以下の実施例は、中鎖長脂肪酸誘導体化合物に対する化学修飾が、中鎖脂肪酸誘導体化合物に対する微生物が経験する毒性を、未修飾の中鎖長脂肪酸誘導体化合物の存在下で成長させたときの微生物が経験する毒性と比べて減少させることを例証する。
以下の実施例は、中鎖脂肪酸誘導体化合物の毒性が分配係数(LogP)に相関していることを例証する。
以下の実施例は、毒性の中鎖脂肪族化合物から、それらのより毒性の低い誘導体への変換を触媒する新規生化学経路の発現が、微生物を、毒性の化合物に通じる経路に耐容性にすることができ、かつ、微生物がその誘導体を高レベルで生産できることを例証する。
図3に、酢酸オクチルの存在が細胞を1-オクタノール毒性から保護することができるかどうかを試験するように設計された実験の結果を示す。図3から明らかなように、0.5グラム/リットル(g/L)の濃度の1-オクタノールに5時間曝露した後、大腸菌細胞の生存率は完全に失われた。しかしながら、興味深いことに、50g/L(大腸菌細胞に非毒性の濃度)の酢酸オクチルも加えた場合、細胞生存率は、細胞を0.5g/Lの濃度の1-オクタノールに曝露したときも、さらには1g/Lの濃度の1-オクタノールに曝露したときであっても、対照レベルの100%で維持された。細胞を10g/Lの濃度の1-オクタノール(1-オクタノールに対して観察されたMICを優に超える)に曝露したとき、生存率は、20%未満減少した。
上で考察して示した通り、微生物による中鎖(C6〜C10)脂肪アルコールの生産は、それらの毒性によって制限される。これらの中鎖脂肪酸誘導体化合物に対する耐容性を増加させる遺伝メカニズムおよび生化学メカニズムを同定するために、多大な労力が注がれてきた(例えば、Lennen and Pflefer, 2013; Royce et al., 2015; Tan, et al., 2016; Tan, et al., 2017を参照のこと)。しかしながら、これまでのところ、商業用力価(例えば、約10g/l〜200g/lの間の濃度またはより高い濃度)の生産を可能にする解決策は見いだされていない。
中鎖脂肪アルコールと同様に、中鎖遊離脂肪酸は、微生物細胞に毒性である(例えば、図1を参照のこと)。ここで、本発明者等は、遊離脂肪酸を脂肪酸メチルエステル(FAME)または脂肪酸エチルエステル(FAEE)などのより毒性の低いアルキルエステルへ変換する能力を備えた細胞を提供することによって、そのような化合物の生産を大きく改善することができることを示す。
以下の実施例は、単一のアミノ酸置換を含有し、かつ、中鎖長脂肪酸誘導体の生産について改善された活性および/または選択性を有する、操作チオエステラーゼ変種を例証する。
大腸菌における最適な翻訳のためにSEQ ID NO:1のポリペプチドをコードする遺伝子を合成し、これはSEQ ID NO:60の通り示される。この遺伝子を、カナマイシンに対する耐性を付与するpACYC系プラスミド(Genbank Accession X06403)に、その遺伝子がイソプロピルチオガラクトシド(IPTG)の存在下で誘導されるPtrcプロモーター(例えば、Camsund et al. Journal of Biological Engineering 2014, 8:4を参照のこと)の転写制御下となるようにクローニングした。得られたプラスミドpIR.108(図8)を、染色体から遺伝子EntDを過剰発現するように操作されており(例えば、国際特許出願公報WO2010062480を参照のこと)かつ上記実施例3に記載され遊離脂肪酸(FFA)から脂肪アルコール酢酸エステル(FACE)への生化学変換に一緒に影響を及ぼす遺伝子carB、alrAおよびaftA1を発現するPtrc制御オペロンを保有している、MG1655に由来する大腸菌に形質転換した。
下記の“操作TE変種の相対性能の定量化”のHTPスクリーニングにおけるFAS力価(mg/L)の範囲は、各株において操作されたアルキルチオエステルに対するフラックスのレベルに依存する。
表7に記載の操作TEを発現する株を各々、中鎖脂肪酸の生産に影響を及ぼすその固有の操作TEをコードする遺伝子ならびに中鎖脂肪酸から中鎖脂肪アルコール酢酸エステルへの変換に影響を及ぼすCarB、AlrAおよびAft1をコードする遺伝子の発現をもたらす条件下で成長させた。得られた脂肪酸由来産物を抽出し、定量化し、次いで、同じ条件下で成長させたSEQ ID NO:1(表6)を発現する対照評価株1によって生産される脂肪酸誘導体産物と比較した。成長に関するおよび得られた脂肪酸誘導体の分析に関する詳細な方法を以下に記載する。
操作TE変種各々の性能を定量化するために、変種を発現する細胞の培養物を、下記の通り、TE、CarB、AlrAおよびAtf1の発現を支援する条件下で成長させ、得られた脂肪酸誘導体を抽出し、水素炎イオン化型検出器を備えたガスクロマトグラフィー(GC/FID)によって定量化した。
酢酸ブチル400μL(内部分析標準として500mg/L ウンデカノールを含有する)を各ウェルに加え、プレートを熱密封し、2000rpmで15分間振盪し、室温にて4500rpmで10分間遠心分離し、そして、上部有機層100μLを、N,O-ビス(トリメチルシリル)トリフルオロアセトアミド(BSTFA)100uLを含有する96ウェルプレートに移した(例えば、Stalling DL, et al. Biochemical and Biophysical Research Communications. 1968 May 23;31(4):616-22を参照のこと)。プレートを密封し、水素炎イオン化型検出器を備えたガスクロマトグラフィー(GC-FID)によって評価した。
中鎖脂肪酸誘導体の生産について改善された活性を有する新しいTEを生み出す複数のアミノ酸置換を含有するようにTE変種を操作した。変種は、ネイティブチオエステラーゼ酵素(SEQ ID NO:1)に対しておよび単一アミノ酸置換を有する操作TE変種に対して、改善された活性および選択性を有していた(実施例4、表7)。
以下の実施例は、表面電荷の増加および中鎖長脂肪酸誘導体の生産について改善された活性を有する操作TE変種を例証する。三次元モデリングを使用して、中鎖脂肪酸誘導体の生産について改善された活性を有するチオエステラーゼ変種/変異体を操作した。
タンパク質データバンク(PDB)は、生体高分子の構造データの唯一のワールドワイドアーカイブである(Berman, H.M. et al, Nucl. Acids Res. (2000) 28 (1): 235-242を参照のこと)。PDBタンパク質データバンクは、ワールドワイドウェブ上のrcsb.org/pdb/home/home.doで利用可能である。PDBデータバンクを使用して、チオエステラーゼの3つの解明されたx線結晶構造を同定した。特に、同定されたチオエステラーゼの3つの解明された構造は、(1)タンパク質データバンク同定番号(PDB ID:2ESS)を有するバクテロイデス シータイオタオミクロン(Bacteroides thetaiotaomicron)由来のアシル-ACPチオエステラーゼ、(2)ラクトバシラス プランタルム(Lactobacillus plantarum)由来のオレオイルチオエステラーゼ(PDB ID:2OWN)、および(3)スピロソーマ リングアレ(Spirosoma linguale)由来のアシル-ACPチオエステラーゼ(PDB ID: 4GAK)であった。全体がSEQ ID NO:1に対して約25%の配列同一性を示すこれらの構造を、テンプレートとして使用した。
PDBにおいて同定されたチオエステラーゼの3つの解明された3D構造(2ESS、2OWNおよび4GAK)およびそれらの配列を、ワールドワイドウェブ上のprodata.swmed.edu/promals3d/promals3d.phpで利用可能なPROMALS3D多重配列および構造整列サーバー(例えば、J.Pei and N.V.Grishin (2007) Bioinformatics. 23(7): 802-808; J. Pei et al., (2008) Nucl. Acids Res. 36 (7): 2295-2300を参照のこと)で整列させた。2ESS、2OWNおよび4GAKの配列および構造を整列させた後、SEQ ID NO:1の問い合わせ配列を、MMFFTバージョン7を使用して既存の構造に基づく配列整列に整列させた(例えば、Katoh, K., et al. (2013) Mol. Biol. Evol. Apr; 30(4): 772-780を参照のこと)。ソフトウェアは、ワールドワイドウェブ上のmafft.cbrc.jp/alignment/softwareで利用可能である。PDBにおいて同定されたSEQ ID NO:1およびアシル-ACPチオエステラーゼ(2ESS、2OWNおよび4GAK)の整列を図9に示す。
MODELLERソフトウェア(例えば、B. Webb, A. Sali. Comparative Protein Structure Modeling Using Modeller. Current Protocols in Bioinformatics, John Wiley & Sons, Inc., 5.6.1-5.6.32, 2014を参照のこと)によって、3つのテンプレート2ESS、2OWNおよび4GAK全てならびに上記の工程2に記載した構造に基づく整列を使用して、アミノ酸37〜310のホモロジーモデルを構築した。さらなる構造精密化をMODELLER内蔵精密化モードによって実施した。VTFM最適化およびMD精密化モジュールを用いて全てのデフォルトパラメーターで精密化を実施した。MODELLERソフトウェアおよびダウンロードに関する情報は、ワールドワイドウェブ上のsalilab.org/modellerで利用可能である。
図9に示されるように、これらの実験において使用されるSEQ ID NO:1チオエステラーゼは、テンプレートx線結晶構造に含まれないN末端残基およびC末端残基(N末端にある36アミノ酸およびC末端にある18アミノ酸)を有する。したがって、これらの部分に対するホモロジーに基づくモデルを構築するための適切なテンプレートがない。したがって、N末端とC末端の両方に対するアブイニシオモデル(例えば、J. Lee et al., (2009) Ab Initio Protein Structure Prediction pgs. 3-25 In: From Protein Structure to Function with Bioinformatics, D.J. Rigden (ed.) Springerを参照のこと)を、ROBETTAサーバー(例えば、Kim, D.E., et al. (2004) Nucleic Acids Res. Jul 1; 32(Web Server issue):W526-W531を参照のこと;ワールドワイドウェブ上のrobetta.orgで利用可能)によって構築した。
3つのテンプレートを使用したMODELLERソフトウェアを使用して完全長モデルを作成した:主要部分ホモロジーモデル、N末端アブイニシオモデルおよびC末端アブイニシオモデル。
上記のSEQ ID NO:4についての3D構造モデルに基づき、SEQ ID NO:4の表面に負電荷を与えるように12のアスパラギン酸(D)およびグルタミン酸(E)残基をモデル化した。次いで、実施例4および5に記載の通り、これらの12残基の様々な正の置換から負の置換を有する操作TE変種をコードする遺伝子を合成し、対照TE(SEQ ID NO:4)と比較して改善された中鎖長脂肪酸誘導体の生産について評価した。
上記の通り3-Dモデリングによって同定されたチオエステラーゼ表面電荷を増加させると予測され、改善された中鎖長脂肪酸誘導体の生産をもたらしたアミノ酸置換(表7)を、中鎖脂肪酸誘導体の生産についての活性がその対応する対照に対して改善された(実施例6、表7)、SEQ ID NO:15を有する操作TE変種と組み合わせた。
以下の実施例は、N末端の短縮、溶解性の増加および中鎖長脂肪酸誘導体の生産について改善された活性を有する、操作TE変種を例証する。
SEQ ID NO:49のアミノ酸2とアミノ酸40との間に欠失を有する操作TE変種をコードする遺伝子を合成し、中コピー数のpACYC系発現プラスミド(Gen Bank Accession X06403)中のPtrcプロモーターの制御下にクローニングした。次いで、これらのプラスミドを大腸菌に形質転換し、対照TE(SEQ ID NO:49)の発現を指令するプラスミドを担持する同一株と比較して溶解性が増加されたTE変種の発現を指令するそれらの能力を評価した。アミノ酸2とアミノ酸40との間に短縮を有する操作TE変種を発現する株と対照TE(SEQ ID NO:49)を発現する株との間の唯一の違いは、発現されるTEの配列であった。対照および短縮型TEを発現する得られた株を各々、実施例4に記載の通り、96ウェルプレート中、TEをコードする遺伝子の発現をもたらす条件下で成長させた。遠心分離によって細胞を収集し、25mM NaCl、5mM EDTAおよび1mg/mLのリゾチームを含有する50mM Tris-HCl(pH7.8)50μLに再懸濁した。試料を25℃、1500rpmでインキュベートした。20分後、1mg/mLのDNase I溶液10μlおよび1M MgSO4 10μLを各試料に加えた。次いで、試料を1500rpmでさらに20分間振盪した。得られた全細胞溶解物(WCL)を4500rpmで10分間遠心分離し、不溶性画分(ペレット)と可溶性画分(上清)を分離した。
不十分に可溶性の中鎖長TEの溶解性の増加は、細胞中に存在するより活性な中鎖長TEをもたらし、ひいては、中鎖脂肪酸の生産の増加をもたらすはずである。
以下の実施例は、中鎖脂肪酸誘導体の生産について改善された活性を有する遺伝子改変された微生物を使用して脂肪酸誘導体を生産するために使用できるプロセスを例証する。このプロセスによって生産される脂肪酸誘導体の組成は、中鎖脂肪酸、中鎖脂肪アルコール、中鎖脂肪アルコール酢酸エステル(FACE)、中鎖脂肪酸メチルエステル(FAME)、中鎖脂肪酸エチルエステル(FAEE)、さらには他の中鎖脂肪酸エステルも含むが、これらに限定されない。
選択された操作された大腸菌株の凍結細胞バンクバイアルを使用して、適切な抗生物質を含有する125mLのバッフル付き振盪フラスコ中のLB培地20mLに植菌した。この振盪フラスコを、オービタルシェーカー内32℃でおよそ6時間インキュベートし、次いで、培地(1% v/v)1.25mLを、500mLのバッフル付きエルレンマイヤー振盪フラスコ中の、最小一晩シード培地(2g/L NH4Cl、0.5g/L NaCl、0.3g/L KH2PO4、1mM MgSO4、0.1mM CaCl2、20g/L グルコース、1mL/Lの微量ミネラル溶液(2g/LのZnCl2・4H2O、2g/LのCaCl2・6H2O、2g/LのNa2MoO4・2H2O、1.9g/LのCuSO4・5H2O、0.5g/LのH3BO3、および10mL/Lの濃HCl)、10mg/Lのクエン酸第二鉄、100mMのBis-Tris緩衝液(pH 7.0)、および適切な抗生物質)125mLに移し、振盪器上にて32℃で一晩インキュベートした。
上記の一晩シード培養物75mL(5% v/v)を使用して、最初は滅菌済みバイオリアクター発酵培地1.5Lを含有する、5LのBiostat Aplusバイオリアクター(Sartorius BBI)に植菌した。この培地は、2g/LのKH2PO4、0.5g/Lの(NH4)2SO4、2.2g/LのMgSO4七水和物、10g/Lの滅菌濾過グルコース、80mg/L クエン酸第二鉄、1mL/Lの先に記載した微量ミネラル溶液、0.25mL/Lのビタミン溶液(0.42g/Lのリボフラビン、5.4g/Lのパントテン酸、6g/Lのナイアシン、1.4g/Lのピリドキシン、0.06g/Lのビオチン、および0.04g/Lの葉酸)、1g/L NaCl、1g/L クエン酸、140mg/L CaCl2二水和物、10mg/L ZnCl2、および適切な抗生物質から構成した。28% w/vアンモニア水を使用して培養物のpHを6.9〜7.2の間に、具体的な生成物に応じて培養温度を33〜35℃に、通気速度を0.75lpm(0.5 v/v/m)に、そして、DOコントローラーおよび酸素補給に連結された撹拌ループを利用して溶存酸素分圧を30%飽和に維持した。シリコーンエマルジョン系消泡剤(Dow Corning 1430)の自動添加によって、泡の形成を制御した。
発酵ブロスの試料中に存在する脂肪酸誘導体を抽出し、従来のGC-FIDを使用して単回実行で分離した。この目的のために、均一な発酵ブロス試料の各々0.5mLを、15mLのファルコンチューブに分割した。試料の質量を記録し、内部標準(C11 FAMEまたはC9/C11/C15 FALC)が500ppmの酢酸ブチル5.0mLをブロスに加えて、10倍抽出を達成した。試料を2500rpmで30分間機械的に振盪し、4500rpmにて25℃で10分間遠心分離した。抽出物50μl(上部層)をGCバイアルに移し、50uLのBSTFA w/10% TCMSで誘導体化し、続いて、約15秒間ボルテックスした。次いで、Agilent DB1カラム10m×180μm×0.2μmを使用した従来のGC-FIDシステムに試料を流し、抽出された試料中に存在する全ての脂肪酸誘導体を分離した。各脂肪酸誘導体の濃度をg/Kgで報告する。
以下の実施例は、中鎖脂肪酸誘導体の生産について改善された活性を有する遺伝子改変された微生物を使用して中鎖脂肪アルコール酢酸エステルを生産するために使用することができるプロセスを例証する。このプロセスによって生産される脂肪酸誘導体の組成は、6〜12個の炭素のアシル鎖を有する、中鎖脂肪酸、中鎖脂肪アルコールおよび中鎖脂肪アルコール酢酸エステル(FACE)を含み得る。5Lのバイオリアクター内での中鎖脂肪アルコール酢酸エステルの生産を実施例8に記載の通り実施した。
以下の実施例は、脂肪酸誘導体を生産する能力が改善された遺伝子改変された微生物を使用して中鎖脂肪アルコールを生産するために使用することができるプロセスを例証する。このプロセスによって生産される脂肪酸誘導体の組成は、6〜12個の炭素のアシル鎖を有する脂肪酸、脂肪アルデヒドおよび脂肪アルコールを含み得る。5Lのバイオリアクター内での中鎖脂肪アルコールの生産を、実施例8に記載の通り、染色体から遺伝子EntDを過剰発現するように操作されておりかつ中鎖チオエステラーゼならびに遊離脂肪酸(FFA)から脂肪アルコール(FALC)への生化学変換のための遺伝子carBおよびalrAを発現するオペロンを含有する大腸菌株を使用して実施した。チオエステラーゼをコードする遺伝子、carBおよびalrAは全て、約7時間の経過発酵時間でバイオリアクターへイソプロピルチオガラクトシド(IPTG)を添加することによって活性化された誘導性(Ptrc)プロモーターの転写制御下にあった。中鎖脂肪アルコールは、大腸菌に対して非常に有毒であり、それ故、5Lのバイオリアクター内での生産の間のこれらの化合物の蓄積は、阻止濃度(1g/L未満、実施例3を参照のこと)に達した後すぐに成長および生産を停止させた。
以下の実施例は、中鎖脂肪酸誘導体の生産について改善された活性を有するチオエステラーゼ変種を含む遺伝子改変された微生物を使用して中鎖脂肪酸アルキルエステルを生産するためのプロセスを例証する。このプロセスによって生産される脂肪酸誘導体の組成は、6〜12個の炭素のアシル鎖を有する、中鎖脂肪酸、中鎖脂肪酸メチルエステル(FAME)および/または中鎖脂肪酸エチルエステル(FAEE)を含み得る。
以下の実施例は、中鎖脂肪酸誘導体の生産について改善された活性を有するチオエステラーゼを含む遺伝子改変された微生物を使用した中鎖脂肪酸の生産のためのプロセスを例証する。このプロセスによって生産される脂肪酸の組成は、6〜12個の炭素のアシル鎖を有する中鎖脂肪酸を含む。この実施例では、5Lのバイオリアクター内での中鎖脂肪酸の生産を、実施例8に記載の通り、約13時間の経過発酵時間でバイオリアクターへイソプロピルチオガラクトシド(IPTG)を添加することによって活性化される誘導性(Ptrc)プロモーターの転写制御下、中鎖チオエステラーゼを過剰発現するように操作された大腸菌株を使用して実施した。中鎖脂肪酸は、大腸菌に対して非常に有毒であり、それ故、5Lのバイオリアクター内での生産の間のこれらの化合物の蓄積は、阻止濃度(5g/L未満、実施例3を参照のこと)に達した後すぐに成長および生産を停止させた。
[本発明1001]
中鎖脂肪酸誘導体の生産のための改良された活性を有する、操作チオエステラーゼ変種。
[本発明1002]
C8脂肪酸誘導体の生産のための改良された活性を有する、本発明1001の操作チオエステラーゼ変種。
[本発明1003]
SEQ ID NO:1と少なくとも90%の配列同一性、ならびに3、4、6、14、15、17、22、37、44、45、50、54、56、64、67、73、76、91、99、102、110、111、114、129、132、137、158、162、165、176、178、185、186、196、197、198、203、213、217、225、227、236、244、254、256、258、278、282、292、297、298、299、300、301、302、316、321、および322からなる群より選択されるアミノ酸位置に少なくとも1つの置換変異を有するアミノ酸配列を有する、本発明1001の操作チオエステラーゼ変種。
[本発明1004]
少なくとも1つの置換変異が、(a)アミノ酸位置3のリジン;(b)アミノ酸位置4のメチオニン;(c)アミノ酸位置6のアルギニン;(d)アミノ酸位置14のグリシンまたはアルギニン;(e)アミノ酸位置15のロイシンまたはトリプトファン;(f)アミノ酸位置17のアラニンまたはシステイン;(g)アミノ酸位置22のアルギニン;(h)アミノ酸位置37のプロリン;(i)アミノ酸位置44のグリシンまたはイソロイシン;(j)位置45のセリン;(k)アミノ酸位置50のトリプトファン;(l)アミノ酸位置54のアルギニン;(m)アミノ酸位置56のリジンまたはシステイン;(n)アミノ酸位置64のアルギニンまたはプロリン;(o)アミノ酸位置67のロイシン;(p)位置73のバリン;(q)アミノ酸位置76のフェニルアラニンまたはロイシンまたはチロシン;(r)アミノ酸位置91のメチオニン;(s)アミノ酸位置99のリジンまたはプロリン;(t)アミノ酸位置102のイソロイシン;(u)アミノ酸位置110のロイシン;(v)位置111のトレオニン;(w)位置114のリジン;(x)アミノ酸位置129のバリン;(y)アミノ酸位置132のトリプトファン;(z)アミノ酸位置137のシステイン;(aa)アミノ酸位置158のグルタミン;(bb)アミノ酸位置162のグルタミン酸;(cc)アミノ酸位置176のバリン;(dd)アミノ酸位置178のプロリン;(ee)アミノ酸位置185のアラニン;(ff)アミノ酸位置186のグリシン;(gg)アミノ酸位置196のバリン;(hh)アミノ酸位置197のアスパラギン;(ii)アミノ酸位置198のトリプトファン;(jj)アミノ酸位置203のアルギニン;(kk)アミノ酸位置213のヒスチジンまたはアルギニン;(ll)アミノ酸位置217のアルギニン;(mm)アミノ酸位置225のロイシン;(nn)アミノ酸位置227のグリシン;(oo)アミノ酸位置236のトレオニン;(pp)アミノ酸位置244のメチオニンまたはアルギニン;(qq)アミノ酸位置254のグリシン;(rr)アミノ酸位置256のシステインまたはアルギニン;(ss)アミノ酸位置258のトレオニンまたはバリン;(tt)アミノ酸位置278のリジンまたはバリン;(uu)アミノ酸位置282のセリンまたはバリン;(vv)アミノ酸位置292のフェニルアラニン;(ww)アミノ酸位置297のトレオニンまたはアスパラギン酸またはバリン;(xx)アミノ酸位置298のバリンまたはシステイン;(yy)アミノ酸位置299のロイシン;(zz)アミノ酸位置300のリジンまたはトリプトファンまたはロイシン;(aaa)アミノ酸位置301のシステイン;(bbb)アミノ酸位置302のトレオニン;(ccc)アミノ酸位置316のアルギニン;(ddd)アミノ酸位置321のアルギニン;および(eee)アミノ酸位置322のリジンからなる群より選択されるメンバーである、本発明1003の操作チオエステラーゼ変種。
[本発明1005]
変種チオエステラーゼが、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58およびSEQ ID NO:59からなる群より選択されるメンバーである、本発明1004の操作チオエステラーゼ変種。
[本発明1006]
SEQ ID NO:1を有するチオエステラーゼと比較して、全体として増加した実効正電荷を有する、本発明1005の操作チオエステラーゼ変種。
[本発明1007]
SEQ ID NO:4を有する変種チオエステラーゼと比較して、全体として増加した実効正電荷を有する、本発明1006の操作チオエステラーゼ変種。
[本発明1008]
SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、およびSEQ ID NO:46からなる群より選択されるメンバーである、本発明1007の操作チオエステラーゼ変種。
[本発明1009]
SEQ ID NO:15と比較して、増加した表面正電荷を有する、本発明1006の操作チオエステラーゼ変種。
[本発明1010]
SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50およびSEQ ID NO:51からなる群より選択されるメンバーである、本発明1009の操作チオエステラーゼ変種。
[本発明1011]
改良された溶解性を有する、本発明1005の操作チオエステラーゼ変種。
[本発明1012]
SEQ ID NO:49と比較して、改良された溶解性を有する、本発明1011の操作チオエステラーゼ変種。
[本発明1013]
SEQ ID NO:49のアミノ酸2〜40に短縮型変異を有する、本発明1012の操作チオエステラーゼ変種。
[本発明1014]
SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58およびSEQ ID NO:59からなる群より選択されるメンバーである、本発明1016の操作チオエステラーゼ変種。
[本発明1015]
変種チオエステラーゼが、C10脂肪酸誘導体の生産のための改良された活性を有する、本発明1001の変種チオエステラーゼ酵素。
[本発明1016]
第1の脂肪酸誘導体を第2の脂肪酸誘導体に変換する生化学経路をコードする1つまたは複数の異種遺伝子を含む組換え宿主細胞であって、
第2の脂肪酸誘導体が、第1の脂肪酸誘導体よりも高い最小阻止濃度(MIC)を有し、
第2の脂肪酸誘導体の存在が、第1の脂肪酸誘導体のMICを増加させる、組換え宿主細胞。
[本発明1017]
生化学経路が、
a. カルボン酸レダクターゼ、
b. カルボン酸レダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ、
c. カルボン酸レダクターゼおよびアルコール-O-アセチルトランスフェラーゼ、
d. カルボン酸レダクターゼ、およびアルコールデヒドロゲナーゼ、およびアルコールO-アセチルトランスフェラーゼ、
e. エステルシンターゼ、
f. エステルシンターゼおよび脂肪酸アシルCoAシンセターゼ、
g. アシルCoAレダクターゼ、
h. アシルCoAレダクターゼおよびアシルCoAシンセターゼ、
i. アシルCoAレダクターゼおよびアルコールO-アセチルトランスフェラーゼ、
j. アシルCoAレダクターゼ、アルコールO-アセチルトランスフェラーゼ、およびアシルCoAシンセターゼ、
k. O-メチルトランスフェラーゼ、
l. アシルACPレダクターゼ、
m. アシルACPレダクターゼおよびアルデヒドデカルボニラーゼ、
n. アシルACPレダクターゼおよびアルデヒド酸化的デホルミラーゼ、
o. アシルACPレダクターゼおよびアルコールO-アセチルトランスフェラーゼ、
p. アシルACPレダクターゼ、アルコール-O-アセチルトランスフェラーゼ、およびアルコールデヒドロゲナーゼ、
q. OleAタンパク質、
r. OleA、OleC、およびOleDタンパク質、
s. OleAタンパク質および脂肪酸アシルCoAシンセターゼ、または
t. OleA、OleC、およびOleDタンパク質ならびに脂肪酸アシルCoAシンセターゼ
のうちの1つを含む、本発明1016の組換え宿主細胞。
[本発明1018]
第1の脂肪酸誘導体が、脂肪酸であり、第2の脂肪酸誘導体が、脂肪酸アルキルエステルであり、
生化学経路が、エステルシンターゼおよび脂肪酸アシル-CoAシンセターゼを含む、
本発明1017の組換え宿主細胞。
[本発明1019]
脂肪酸アルキルエステルが、脂肪酸メチルエステルまたは脂肪酸エチルエステルである、
本発明1018の組換え宿主細胞。
[本発明1020]
第1の脂肪酸誘導体が、脂肪アルコールであり、第2の脂肪酸誘導体が、脂肪アルコール酢酸エステルであり、
生化学経路が、カルボン酸レダクターゼおよびアルコール-O-アセチルトランスフェラーゼを含む、
本発明1017の組換え宿主細胞。
[本発明1021]
第1の脂肪酸誘導体および第2の脂肪酸誘導体が、中鎖脂肪酸誘導体である、
本発明1016の組換え宿主細胞。
[本発明1021]
操作チオエステラーゼ変種をさらに含む、
本発明1016の組換え宿主細胞。
[本発明1022]
操作チオエステラーゼ変種が、SEQ ID NO:1と少なくとも90%の配列同一性、ならびに3、4、6、14、15、17、22、37、44、45、50、54、56、64、67、73、76、91、99、102、110、111、114、129、132、137、158、162、165、176、178、185、186、196、197、198、203、213、217、225、227、236、244、254、256、258、278、282、292、297、298、299、300、301、302、316、321、および322からなる群より選択されるアミノ酸位置に少なくとも1つの置換変異を有するアミノ酸配列を有する変種チオエステラーゼからなる群より選択されるメンバーである、
本発明1023の組換え宿主細胞。
[本発明1023]
少なくとも1つの置換変異が、(a)アミノ酸位置3のリジン;(b)アミノ酸位置4のメチオニン;(c)アミノ酸位置6のアルギニン;(d)アミノ酸位置14のグリシンまたはアルギニン;(e)アミノ酸位置15のロイシンまたはトリプトファン;(f)アミノ酸位置17のアラニンまたはシステイン;(g)アミノ酸位置22のアルギニン;(h)アミノ酸位置37のプロリン;(i)アミノ酸位置44のグリシンまたはイソロイシン;(j)位置45のセリン;(k)アミノ酸位置50のトリプトファン;(l)アミノ酸位置54のアルギニン;(m)アミノ酸位置56のリジンまたはシステイン;(n)アミノ酸位置64のアルギニンまたはプロリン;(o)アミノ酸位置67のロイシン;(p)位置73のバリン;(q)アミノ酸位置76のフェニルアラニンまたはロイシンまたはチロシン;(r)アミノ酸位置91のメチオニン;(s)アミノ酸位置99のリジンまたはプロリン;(t)アミノ酸位置102のイソロイシン;(u)アミノ酸位置110のロイシン;(v)位置111のトレオニン;(w)位置114のリジン;(x)アミノ酸位置129のバリン;(y)アミノ酸位置132のトリプトファン;(z)アミノ酸位置137のシステイン;(aa)アミノ酸位置158のグルタミン;(bb)アミノ酸位置162のグルタミン酸;(cc)アミノ酸位置176のバリン;(dd)アミノ酸位置178のプロリン;(ee)アミノ酸位置185のアラニン;(ff)アミノ酸位置186のグリシン;(gg)アミノ酸位置196のバリン;(hh)アミノ酸位置197のアスパラギン;(ii)アミノ酸位置198のトリプトファン;(jj)アミノ酸位置203のアルギニン;(kk)アミノ酸位置213のヒスチジンまたはアルギニン;(ll)アミノ酸位置217のアルギニン;(mm)アミノ酸位置225のロイシン;(nn)アミノ酸位置227のグリシン;(oo)アミノ酸位置236のトレオニン;(pp)アミノ酸位置244のメチオニンまたはアルギニン;(qq)アミノ酸位置254のグリシン;(rr)アミノ酸位置256のシステインまたはアルギニン;(ss)アミノ酸位置258のトレオニンまたはバリン;(tt)アミノ酸位置278のリジンまたはバリン;(uu)アミノ酸位置282のセリンまたはバリン;(vv)アミノ酸位置292のフェニルアラニン;(ww)アミノ酸位置297のトレオニンまたはアスパラギン酸またはバリン;(xx)アミノ酸位置298のバリンまたはシステイン;(yy)アミノ酸位置299のロイシン;(zz)アミノ酸位置300のリジンまたはトリプトファンまたはロイシン;(aaa)アミノ酸位置301のシステイン;(bbb)アミノ酸位置302のトレオニン;(ccc)アミノ酸位置316のアルギニン;(ddd)アミノ酸位置321のアルギニン;および(eee)アミノ酸位置322のリジンからなる群より選択されるメンバーである、本発明1022の組換え細胞。
[本発明1024]
操作チオエステラーゼ変種が、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58およびSEQ ID NO:59からなる群より選択されるメンバーである、本発明1023の組換え宿主細胞。
[本発明1025]
操作チオエステラーゼ変種が、SEQ ID NO:1と比較して、増加した表面正電荷を有する、本発明1024の組換え宿主細胞。
[本発明1026]
操作チオエステラーゼ変種が、SEQ ID NO:4と比較して、増加した表面正電荷を有する、本発明1025の組換え宿主細胞。
[本発明1027]
操作チオエステラーゼ変種が、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、およびSEQ ID NO:46からなる群より選択されるメンバーである、本発明1026の組換え宿主細胞。
[本発明1028]
操作チオエステラーゼ変種が、SEQ ID NO:15と比較して、増加した表面正電荷を有する、本発明1025の組換え宿主細胞。
[本発明1029]
操作チオエステラーゼ変種が、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50およびSEQ ID NO:51からなる群より選択されるメンバーである、本発明1028の組換え宿主細胞。
[本発明1030]
操作チオエステラーゼ変種が、改良された溶解性を有する、本発明1024の組換え宿主細胞。
[本発明1031]
操作チオエステラーゼ変種が、SEQ ID NO:49と比較して、改良された溶解性を有する、本発明1030の組換え宿主細胞。
[本発明1032]
操作チオエステラーゼ変種が、SEQ ID NO:49のアミノ酸2〜40に短縮型変異を有する、本発明1031の組換え宿主細胞。
[本発明1033]
操作チオエステラーゼ変種が、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58およびSEQ ID NO:59からなる群より選択されるメンバーである、本発明1032の組換え宿主細胞。
[本発明1034]
操作チオエステラーゼ変種を含む組換え宿主細胞を炭素源の存在下で中鎖脂肪酸誘導体の生産に適した条件で培養する工程を含む、中鎖脂肪酸誘導体を商業的力価で生産するための方法であって、
組換え宿主細胞が、第1の脂肪酸誘導体を第2の脂肪酸誘導体に変換する生化学経路をコードする1つまたは複数の異種遺伝子を含み、
第2の脂肪酸誘導体が、第1の脂肪酸誘導体よりも高い最小阻止濃度(MIC)を有し、
第2の脂肪酸誘導体の存在が、第1の脂肪酸誘導体のMICを増加させる、
方法。
[本発明1035]
第1の脂肪酸誘導体が、中鎖脂肪酸であり、第2の脂肪酸誘導体が、中鎖脂肪酸アルキルエステルであり、
生化学経路が、エステルシンターゼおよび脂肪酸アシル-CoAシンセターゼを含む、
本発明1034の方法。
[本発明1036]
脂肪酸アルキルエステルが、中鎖脂肪酸メチルエステルまたは中鎖脂肪酸エチルエステルである、
本発明1035の方法。
[本発明1037]
第1の脂肪酸誘導体が、中鎖脂肪アルコールであり、第2の脂肪酸誘導体が、中鎖脂肪アルコール酢酸エステルであり、
生化学経路が、カルボン酸レダクターゼおよびアルコール-O-アセチルトランスフェラーゼを含む、
本発明1035の方法。
[本発明1038]
操作チオエステラーゼ変種が、SEQ ID NO:1と少なくとも90%の配列同一性、ならびに3、4、6、14、15、17、22、37、44、45、50、54、56、64、67、73、76、91、99、102、110、111、114、129、132、137、158、162、165、176、178、185、186、196、197、198、203、213、217、225、227、236、244、254、256、258、278、282、292、297、298、299、300、301、302、316、321、および322からなる群より選択されるアミノ酸位置に少なくとも1つの置換変異を有するアミノ酸配列を有する、本発明1034の方法。
[本発明1039]
少なくとも1つの置換変異が、(a)アミノ酸位置3のリジン;(b)アミノ酸位置4のメチオニン;(c)アミノ酸位置6のアルギニン;(d)アミノ酸位置14のグリシンまたはアルギニン;(e)アミノ酸位置15のロイシンまたはトリプトファン;(f)アミノ酸位置17のアラニンまたはシステイン;(g)アミノ酸位置22のアルギニン;(h)アミノ酸位置37のプロリン;(i)アミノ酸位置44のグリシンまたはイソロイシン;(j)位置45のセリン;(k)アミノ酸位置50のトリプトファン;(l)アミノ酸位置54のアルギニン;(m)アミノ酸位置56のリジンまたはシステイン;(n)アミノ酸位置64のアルギニンまたはプロリン;(o)アミノ酸位置67のロイシン;(p)位置73のバリン;(q)アミノ酸位置76のフェニルアラニンまたはロイシンまたはチロシン;(r)アミノ酸位置91のメチオニン;(s)アミノ酸位置99のリジンまたはプロリン;(t)アミノ酸位置102のイソロイシン;(u)アミノ酸位置110のロイシン;(v)位置111のトレオニン;(w)位置114のリジン;(x)アミノ酸位置129のバリン;(y)アミノ酸位置132のトリプトファン;(z)アミノ酸位置137のシステイン;(aa)アミノ酸位置158のグルタミン;(bb)アミノ酸位置162のグルタミン酸;(cc)アミノ酸位置176のバリン;(dd)アミノ酸位置178のプロリン;(ee)アミノ酸位置185のアラニン;(ff)アミノ酸位置186のグリシン;(gg)アミノ酸位置196のバリン;(hh)アミノ酸位置197のアスパラギン;(ii)アミノ酸位置198のトリプトファン;(jj)アミノ酸位置203のアルギニン;(kk)アミノ酸位置213のヒスチジンまたはアルギニン;(ll)アミノ酸位置217のアルギニン;(mm)アミノ酸位置225のロイシン;(nn)アミノ酸位置227のグリシン;(oo)アミノ酸位置236のトレオニン;(pp)アミノ酸位置244のメチオニンまたはアルギニン;(qq)アミノ酸位置254のグリシン;(rr)アミノ酸位置256のシステインまたはアルギニン;(ss)アミノ酸位置258のトレオニンまたはバリン;(tt)アミノ酸位置278のリジンまたはバリン;(uu)アミノ酸位置282のセリンまたはバリン;(vv)アミノ酸位置292のフェニルアラニン;(ww)アミノ酸位置297のトレオニンまたはアスパラギン酸またはバリン;(xx)アミノ酸位置298のバリンまたはシステイン;(yy)アミノ酸位置299のロイシン;(zz)アミノ酸位置300のリジンまたはトリプトファンまたはロイシン;(aaa)アミノ酸位置301のシステイン;(bbb)アミノ酸位置302のトレオニン;(ccc)アミノ酸位置316のアルギニン;(ddd)アミノ酸位置321のアルギニン;および(eee)アミノ酸位置322のリジンからなる群より選択されるメンバーである、本発明1036の方法。
[本発明1038]
操作チオエステラーゼ変種が、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58およびSEQ ID NO:59からなる群より選択されるメンバーである、
本発明1037の方法。
[本発明1039]
操作チオエステラーゼ変種が、SEQ ID NO:1と比較して、増加した表面正電荷を有する、
本発明1038の方法。
[本発明1040]
操作チオエステラーゼ変種が、SEQ ID NO:4と比較して、増加した表面正電荷を有する、
本発明1039の方法。
[本発明1041]
操作チオエステラーゼ変種が、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、およびSEQ ID NO:46からなる群より選択されるメンバーである、本発明1040の方法。
[本発明1042]
操作チオエステラーゼ変種が、SEQ ID NO:15と比較して、増加した表面正電荷を有する、本発明1039の方法。
[本発明1043]
操作チオエステラーゼ変種が、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50およびSEQ ID NO:51からなる群より選択されるメンバーである、本発明1042の方法。
[本発明1044]
操作チオエステラーゼ変種が、改良された溶解性を有する、本発明1038の方法。
[本発明1045]
操作チオエステラーゼ変種が、SEQ ID NO:49と比較して、改良された溶解性を有する、本発明1044の方法。
[本発明1046]
操作チオエステラーゼ変種が、SEQ ID NO:49のアミノ酸2〜40に短縮型変異を有する、本発明1045の方法。
[本発明1047]
操作チオエステラーゼ変種が、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58およびSEQ ID NO:59からなる群より選択されるメンバーである、本発明1046の方法。
[本発明1048]
少なくとも3.6の、C8脂肪酸誘導体のC10脂肪酸誘導体に対する比(C8/C10)を有する、中鎖脂肪酸誘導体の組成物。
[本発明1049]
C8脂肪酸誘導体のC10脂肪酸誘導体に対する比が、7.7である、本発明1048の組成物。
Claims (52)
- 中鎖脂肪酸誘導体の生産のための改良された活性を有する、操作チオエステラーゼ変種。
- C8脂肪酸誘導体の生産のための改良された活性を有する、請求項1記載の操作チオエステラーゼ変種。
- SEQ ID NO:1と少なくとも90%の配列同一性、ならびに3、4、6、14、15、17、22、37、44、45、50、54、56、64、67、73、76、91、99、102、110、111、114、129、132、137、158、162、165、176、178、185、186、196、197、198、203、213、217、225、227、236、244、254、256、258、278、282、292、297、298、299、300、301、302、316、321、および322からなる群より選択されるアミノ酸位置に少なくとも1つの置換変異を有するアミノ酸配列を有する、請求項1記載の操作チオエステラーゼ変種。
- 少なくとも1つの置換変異が、(a)アミノ酸位置3のリジン;(b)アミノ酸位置4のメチオニン;(c)アミノ酸位置6のアルギニン;(d)アミノ酸位置14のグリシンまたはアルギニン;(e)アミノ酸位置15のロイシンまたはトリプトファン;(f)アミノ酸位置17のアラニンまたはシステイン;(g)アミノ酸位置22のアルギニン;(h)アミノ酸位置37のプロリン;(i)アミノ酸位置44のグリシンまたはイソロイシン;(j)位置45のセリン;(k)アミノ酸位置50のトリプトファン;(l)アミノ酸位置54のアルギニン;(m)アミノ酸位置56のリジンまたはシステイン;(n)アミノ酸位置64のアルギニンまたはプロリン;(o)アミノ酸位置67のロイシン;(p)位置73のバリン;(q)アミノ酸位置76のフェニルアラニンまたはロイシンまたはチロシン;(r)アミノ酸位置91のメチオニン;(s)アミノ酸位置99のリジンまたはプロリン;(t)アミノ酸位置102のイソロイシン;(u)アミノ酸位置110のロイシン;(v)位置111のトレオニン;(w)位置114のリジン;(x)アミノ酸位置129のバリン;(y)アミノ酸位置132のトリプトファン;(z)アミノ酸位置137のシステイン;(aa)アミノ酸位置158のグルタミン;(bb)アミノ酸位置162のグルタミン酸;(cc)アミノ酸位置176のバリン;(dd)アミノ酸位置178のプロリン;(ee)アミノ酸位置185のアラニン;(ff)アミノ酸位置186のグリシン;(gg)アミノ酸位置196のバリン;(hh)アミノ酸位置197のアスパラギン;(ii)アミノ酸位置198のトリプトファン;(jj)アミノ酸位置203のアルギニン;(kk)アミノ酸位置213のヒスチジンまたはアルギニン;(ll)アミノ酸位置217のアルギニン;(mm)アミノ酸位置225のロイシン;(nn)アミノ酸位置227のグリシン;(oo)アミノ酸位置236のトレオニン;(pp)アミノ酸位置244のメチオニンまたはアルギニン;(qq)アミノ酸位置254のグリシン;(rr)アミノ酸位置256のシステインまたはアルギニン;(ss)アミノ酸位置258のトレオニンまたはバリン;(tt)アミノ酸位置278のリジンまたはバリン;(uu)アミノ酸位置282のセリンまたはバリン;(vv)アミノ酸位置292のフェニルアラニン;(ww)アミノ酸位置297のトレオニンまたはアスパラギン酸またはバリン;(xx)アミノ酸位置298のバリンまたはシステイン;(yy)アミノ酸位置299のロイシン;(zz)アミノ酸位置300のリジンまたはトリプトファンまたはロイシン;(aaa)アミノ酸位置301のシステイン;(bbb)アミノ酸位置302のトレオニン;(ccc)アミノ酸位置316のアルギニン;(ddd)アミノ酸位置321のアルギニン;および(eee)アミノ酸位置322のリジンからなる群より選択されるメンバーである、請求項3記載の操作チオエステラーゼ変種。
- 変種チオエステラーゼが、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58およびSEQ ID NO:59からなる群より選択されるメンバーである、請求項4記載の操作チオエステラーゼ変種。
- SEQ ID NO:1を有するチオエステラーゼと比較して、全体として増加した実効正電荷を有する、請求項5記載の操作チオエステラーゼ変種。
- SEQ ID NO:4を有する変種チオエステラーゼと比較して、全体として増加した実効正電荷を有する、請求項6記載の操作チオエステラーゼ変種。
- SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、およびSEQ ID NO:46からなる群より選択されるメンバーである、請求項7記載の操作チオエステラーゼ変種。
- SEQ ID NO:15と比較して、増加した表面正電荷を有する、請求項6記載の操作チオエステラーゼ変種。
- SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50およびSEQ ID NO:51からなる群より選択されるメンバーである、請求項9記載の操作チオエステラーゼ変種。
- 改良された溶解性を有する、請求項5記載の操作チオエステラーゼ変種。
- SEQ ID NO:49と比較して、改良された溶解性を有する、請求項11記載の操作チオエステラーゼ変種。
- SEQ ID NO:49のアミノ酸2〜40に短縮型変異を有する、請求項12記載の操作チオエステラーゼ変種。
- SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58およびSEQ ID NO:59からなる群より選択されるメンバーである、請求項16記載の操作チオエステラーゼ変種。
- 変種チオエステラーゼが、C10脂肪酸誘導体の生産のための改良された活性を有する、請求項1記載の変種チオエステラーゼ酵素。
- 第1の脂肪酸誘導体を第2の脂肪酸誘導体に変換する生化学経路をコードする1つまたは複数の異種遺伝子を含む組換え宿主細胞であって、
第2の脂肪酸誘導体が、第1の脂肪酸誘導体よりも高い最小阻止濃度(MIC)を有し、
第2の脂肪酸誘導体の存在が、第1の脂肪酸誘導体のMICを増加させる、組換え宿主細胞。 - 生化学経路が、
a. カルボン酸レダクターゼ、
b. カルボン酸レダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼ、
c. カルボン酸レダクターゼおよびアルコール-O-アセチルトランスフェラーゼ、
d. カルボン酸レダクターゼ、およびアルコールデヒドロゲナーゼ、およびアルコールO-アセチルトランスフェラーゼ、
e. エステルシンターゼ、
f. エステルシンターゼおよび脂肪酸アシルCoAシンセターゼ、
g. アシルCoAレダクターゼ、
h. アシルCoAレダクターゼおよびアシルCoAシンセターゼ、
i. アシルCoAレダクターゼおよびアルコールO-アセチルトランスフェラーゼ、
j. アシルCoAレダクターゼ、アルコールO-アセチルトランスフェラーゼ、およびアシルCoAシンセターゼ、
k. O-メチルトランスフェラーゼ、
l. アシルACPレダクターゼ、
m. アシルACPレダクターゼおよびアルデヒドデカルボニラーゼ、
n. アシルACPレダクターゼおよびアルデヒド酸化的デホルミラーゼ、
o. アシルACPレダクターゼおよびアルコールO-アセチルトランスフェラーゼ、
p. アシルACPレダクターゼ、アルコール-O-アセチルトランスフェラーゼ、およびアルコールデヒドロゲナーゼ、
q. OleAタンパク質、
r. OleA、OleC、およびOleDタンパク質、
s. OleAタンパク質および脂肪酸アシルCoAシンセターゼ、または
t. OleA、OleC、およびOleDタンパク質ならびに脂肪酸アシルCoAシンセターゼ
のうちの1つを含む、請求項16記載の組換え宿主細胞。 - 第1の脂肪酸誘導体が、脂肪酸であり、第2の脂肪酸誘導体が、脂肪酸アルキルエステルであり、
生化学経路が、エステルシンターゼおよび脂肪酸アシル-CoAシンセターゼを含む、
請求項17記載の組換え宿主細胞。 - 脂肪酸アルキルエステルが、脂肪酸メチルエステルまたは脂肪酸エチルエステルである、
請求項18記載の組換え宿主細胞。 - 第1の脂肪酸誘導体が、脂肪アルコールであり、第2の脂肪酸誘導体が、脂肪アルコール酢酸エステルであり、
生化学経路が、カルボン酸レダクターゼおよびアルコール-O-アセチルトランスフェラーゼを含む、
請求項17記載の組換え宿主細胞。 - 第1の脂肪酸誘導体および第2の脂肪酸誘導体が、中鎖脂肪酸誘導体である、
請求項16記載の組換え宿主細胞。 - 操作チオエステラーゼ変種をさらに含む、
請求項16記載の組換え宿主細胞。 - 操作チオエステラーゼ変種が、SEQ ID NO:1と少なくとも90%の配列同一性、ならびに3、4、6、14、15、17、22、37、44、45、50、54、56、64、67、73、76、91、99、102、110、111、114、129、132、137、158、162、165、176、178、185、186、196、197、198、203、213、217、225、227、236、244、254、256、258、278、282、292、297、298、299、300、301、302、316、321、および322からなる群より選択されるアミノ酸位置に少なくとも1つの置換変異を有するアミノ酸配列を有する変種チオエステラーゼからなる群より選択されるメンバーである、
請求項23記載の組換え宿主細胞。 - 少なくとも1つの置換変異が、(a)アミノ酸位置3のリジン;(b)アミノ酸位置4のメチオニン;(c)アミノ酸位置6のアルギニン;(d)アミノ酸位置14のグリシンまたはアルギニン;(e)アミノ酸位置15のロイシンまたはトリプトファン;(f)アミノ酸位置17のアラニンまたはシステイン;(g)アミノ酸位置22のアルギニン;(h)アミノ酸位置37のプロリン;(i)アミノ酸位置44のグリシンまたはイソロイシン;(j)位置45のセリン;(k)アミノ酸位置50のトリプトファン;(l)アミノ酸位置54のアルギニン;(m)アミノ酸位置56のリジンまたはシステイン;(n)アミノ酸位置64のアルギニンまたはプロリン;(o)アミノ酸位置67のロイシン;(p)位置73のバリン;(q)アミノ酸位置76のフェニルアラニンまたはロイシンまたはチロシン;(r)アミノ酸位置91のメチオニン;(s)アミノ酸位置99のリジンまたはプロリン;(t)アミノ酸位置102のイソロイシン;(u)アミノ酸位置110のロイシン;(v)位置111のトレオニン;(w)位置114のリジン;(x)アミノ酸位置129のバリン;(y)アミノ酸位置132のトリプトファン;(z)アミノ酸位置137のシステイン;(aa)アミノ酸位置158のグルタミン;(bb)アミノ酸位置162のグルタミン酸;(cc)アミノ酸位置176のバリン;(dd)アミノ酸位置178のプロリン;(ee)アミノ酸位置185のアラニン;(ff)アミノ酸位置186のグリシン;(gg)アミノ酸位置196のバリン;(hh)アミノ酸位置197のアスパラギン;(ii)アミノ酸位置198のトリプトファン;(jj)アミノ酸位置203のアルギニン;(kk)アミノ酸位置213のヒスチジンまたはアルギニン;(ll)アミノ酸位置217のアルギニン;(mm)アミノ酸位置225のロイシン;(nn)アミノ酸位置227のグリシン;(oo)アミノ酸位置236のトレオニン;(pp)アミノ酸位置244のメチオニンまたはアルギニン;(qq)アミノ酸位置254のグリシン;(rr)アミノ酸位置256のシステインまたはアルギニン;(ss)アミノ酸位置258のトレオニンまたはバリン;(tt)アミノ酸位置278のリジンまたはバリン;(uu)アミノ酸位置282のセリンまたはバリン;(vv)アミノ酸位置292のフェニルアラニン;(ww)アミノ酸位置297のトレオニンまたはアスパラギン酸またはバリン;(xx)アミノ酸位置298のバリンまたはシステイン;(yy)アミノ酸位置299のロイシン;(zz)アミノ酸位置300のリジンまたはトリプトファンまたはロイシン;(aaa)アミノ酸位置301のシステイン;(bbb)アミノ酸位置302のトレオニン;(ccc)アミノ酸位置316のアルギニン;(ddd)アミノ酸位置321のアルギニン;および(eee)アミノ酸位置322のリジンからなる群より選択されるメンバーである、請求項22記載の組換え細胞。
- 操作チオエステラーゼ変種が、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58およびSEQ ID NO:59からなる群より選択されるメンバーである、請求項23記載の組換え宿主細胞。
- 操作チオエステラーゼ変種が、SEQ ID NO:1と比較して、増加した表面正電荷を有する、請求項24記載の組換え宿主細胞。
- 操作チオエステラーゼ変種が、SEQ ID NO:4と比較して、増加した表面正電荷を有する、請求項25記載の組換え宿主細胞。
- 操作チオエステラーゼ変種が、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、およびSEQ ID NO:46からなる群より選択されるメンバーである、請求項26記載の組換え宿主細胞。
- 操作チオエステラーゼ変種が、SEQ ID NO:15と比較して、増加した表面正電荷を有する、請求項25記載の組換え宿主細胞。
- 操作チオエステラーゼ変種が、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50およびSEQ ID NO:51からなる群より選択されるメンバーである、請求項28記載の組換え宿主細胞。
- 操作チオエステラーゼ変種が、改良された溶解性を有する、請求項24記載の組換え宿主細胞。
- 操作チオエステラーゼ変種が、SEQ ID NO:49と比較して、改良された溶解性を有する、請求項30記載の組換え宿主細胞。
- 操作チオエステラーゼ変種が、SEQ ID NO:49のアミノ酸2〜40に短縮型変異を有する、請求項31記載の組換え宿主細胞。
- 操作チオエステラーゼ変種が、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58およびSEQ ID NO:59からなる群より選択されるメンバーである、請求項32記載の組換え宿主細胞。
- 操作チオエステラーゼ変種を含む組換え宿主細胞を炭素源の存在下で中鎖脂肪酸誘導体の生産に適した条件で培養する工程を含む、中鎖脂肪酸誘導体を商業的力価で生産するための方法であって、
組換え宿主細胞が、第1の脂肪酸誘導体を第2の脂肪酸誘導体に変換する生化学経路をコードする1つまたは複数の異種遺伝子を含み、
第2の脂肪酸誘導体が、第1の脂肪酸誘導体よりも高い最小阻止濃度(MIC)を有し、
第2の脂肪酸誘導体の存在が、第1の脂肪酸誘導体のMICを増加させる、
方法。 - 第1の脂肪酸誘導体が、中鎖脂肪酸であり、第2の脂肪酸誘導体が、中鎖脂肪酸アルキルエステルであり、
生化学経路が、エステルシンターゼおよび脂肪酸アシル-CoAシンセターゼを含む、
請求項34記載の方法。 - 脂肪酸アルキルエステルが、中鎖脂肪酸メチルエステルまたは中鎖脂肪酸エチルエステルである、
請求項35記載の方法。 - 第1の脂肪酸誘導体が、中鎖脂肪アルコールであり、第2の脂肪酸誘導体が、中鎖脂肪アルコール酢酸エステルであり、
生化学経路が、カルボン酸レダクターゼおよびアルコール-O-アセチルトランスフェラーゼを含む、
請求項35記載の方法。 - 操作チオエステラーゼ変種が、SEQ ID NO:1と少なくとも90%の配列同一性、ならびに3、4、6、14、15、17、22、37、44、45、50、54、56、64、67、73、76、91、99、102、110、111、114、129、132、137、158、162、165、176、178、185、186、196、197、198、203、213、217、225、227、236、244、254、256、258、278、282、292、297、298、299、300、301、302、316、321、および322からなる群より選択されるアミノ酸位置に少なくとも1つの置換変異を有するアミノ酸配列を有する、請求項34記載の方法。
- 少なくとも1つの置換変異が、(a)アミノ酸位置3のリジン;(b)アミノ酸位置4のメチオニン;(c)アミノ酸位置6のアルギニン;(d)アミノ酸位置14のグリシンまたはアルギニン;(e)アミノ酸位置15のロイシンまたはトリプトファン;(f)アミノ酸位置17のアラニンまたはシステイン;(g)アミノ酸位置22のアルギニン;(h)アミノ酸位置37のプロリン;(i)アミノ酸位置44のグリシンまたはイソロイシン;(j)位置45のセリン;(k)アミノ酸位置50のトリプトファン;(l)アミノ酸位置54のアルギニン;(m)アミノ酸位置56のリジンまたはシステイン;(n)アミノ酸位置64のアルギニンまたはプロリン;(o)アミノ酸位置67のロイシン;(p)位置73のバリン;(q)アミノ酸位置76のフェニルアラニンまたはロイシンまたはチロシン;(r)アミノ酸位置91のメチオニン;(s)アミノ酸位置99のリジンまたはプロリン;(t)アミノ酸位置102のイソロイシン;(u)アミノ酸位置110のロイシン;(v)位置111のトレオニン;(w)位置114のリジン;(x)アミノ酸位置129のバリン;(y)アミノ酸位置132のトリプトファン;(z)アミノ酸位置137のシステイン;(aa)アミノ酸位置158のグルタミン;(bb)アミノ酸位置162のグルタミン酸;(cc)アミノ酸位置176のバリン;(dd)アミノ酸位置178のプロリン;(ee)アミノ酸位置185のアラニン;(ff)アミノ酸位置186のグリシン;(gg)アミノ酸位置196のバリン;(hh)アミノ酸位置197のアスパラギン;(ii)アミノ酸位置198のトリプトファン;(jj)アミノ酸位置203のアルギニン;(kk)アミノ酸位置213のヒスチジンまたはアルギニン;(ll)アミノ酸位置217のアルギニン;(mm)アミノ酸位置225のロイシン;(nn)アミノ酸位置227のグリシン;(oo)アミノ酸位置236のトレオニン;(pp)アミノ酸位置244のメチオニンまたはアルギニン;(qq)アミノ酸位置254のグリシン;(rr)アミノ酸位置256のシステインまたはアルギニン;(ss)アミノ酸位置258のトレオニンまたはバリン;(tt)アミノ酸位置278のリジンまたはバリン;(uu)アミノ酸位置282のセリンまたはバリン;(vv)アミノ酸位置292のフェニルアラニン;(ww)アミノ酸位置297のトレオニンまたはアスパラギン酸またはバリン;(xx)アミノ酸位置298のバリンまたはシステイン;(yy)アミノ酸位置299のロイシン;(zz)アミノ酸位置300のリジンまたはトリプトファンまたはロイシン;(aaa)アミノ酸位置301のシステイン;(bbb)アミノ酸位置302のトレオニン;(ccc)アミノ酸位置316のアルギニン;(ddd)アミノ酸位置321のアルギニン;および(eee)アミノ酸位置322のリジンからなる群より選択されるメンバーである、請求項36記載の方法。
- 操作チオエステラーゼ変種が、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58およびSEQ ID NO:59からなる群より選択されるメンバーである、
請求項37記載の方法。 - 操作チオエステラーゼ変種が、SEQ ID NO:1と比較して、増加した表面正電荷を有する、
請求項38記載の方法。 - 操作チオエステラーゼ変種が、SEQ ID NO:4と比較して、増加した表面正電荷を有する、
請求項39記載の方法。 - 操作チオエステラーゼ変種が、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、およびSEQ ID NO:46からなる群より選択されるメンバーである、請求項40記載の方法。
- 操作チオエステラーゼ変種が、SEQ ID NO:15と比較して、増加した表面正電荷を有する、請求項39記載の方法。
- 操作チオエステラーゼ変種が、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50およびSEQ ID NO:51からなる群より選択されるメンバーである、請求項42記載の方法。
- 操作チオエステラーゼ変種が、改良された溶解性を有する、請求項38記載の方法。
- 操作チオエステラーゼ変種が、SEQ ID NO:49と比較して、改良された溶解性を有する、請求項44記載の方法。
- 操作チオエステラーゼ変種が、SEQ ID NO:49のアミノ酸2〜40に短縮型変異を有する、請求項45記載の方法。
- 操作チオエステラーゼ変種が、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58およびSEQ ID NO:59からなる群より選択されるメンバーである、請求項46記載の方法。
- 少なくとも3.6の、C8脂肪酸誘導体のC10脂肪酸誘導体に対する比(C8/C10)を有する、中鎖脂肪酸誘導体の組成物。
- C8脂肪酸誘導体のC10脂肪酸誘導体に対する比が、7.7である、請求項48記載の組成物。
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