JP6110542B2 - シロ‐イノシトールの製造方法 - Google Patents
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Description
従って、本発明の第1の局面は:
(1)シロ‐イノシトールおよびシロイノシトール誘導体の製造方法であって、以下の工程:
1) イノシトール‐1‐リン酸合成酵素遺伝子、イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子およびシロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を保有する形質転換微生物を用意する工程;
2) 前記微生物の生育及び/又は維持に適した条件下で、該微生物とグルコース又はグルコース単位を有する二糖類若しくは多糖類を接触させる工程;
を含む、前記製造方法である。
(2)前記シロイノシトール誘導体が、下記の構造式:
で示される化合物である、上記(1)に記載の製造方法である。
(3)前記形質転換微生物が、機能的なイノシトールモノフォスファターゼの過剰生産又はイノシトールモノフォスファターゼの活性化を誘導する遺伝子組換又は変異を有することを特徴とする、上記(1)又は(2)に記載の製造方法である。
(4)前記形質転換微生物が、ミオイノシトール資化能を有さない微生物に由来することを特徴とする、上記(1)乃至(3)のいずれかに記載の製造方法、並びに
(5)前記形質転換微生物が、大腸菌、バチルス属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ザイモモナス属細菌からなる群から選択される細菌に由来する、上記(1)乃至(4)のいずれかに記載の製造方法である。
(6)前記イノシトールモノフォスファターゼの過剰生産が、前記形質転換微生物に対して、
a) 外来イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を導入する、
b) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子のコピー数を増加させる、
c) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域に変異を導入する、
d) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域を高発現誘導性外来調整領域で置換する、又は
e) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域を欠失させる、
ことにより誘導される、上記(3)乃至(5)のいずれかに記載の製造方法;及び
(7)前記イノシトールモノフォスファターゼの過剰生産が、前記形質転換微生物に対して外来イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を導入することにより誘導される、上記(6)に記載の製造方法、
を含む。
(8)前記イノシトールモノフォスファターゼの活性化が、前記形質転換微生物に対して、
f) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子に変異を導入する、
g) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の一部又は全部を置換する、
h) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の一部を欠失させる、
i) イノシトールモノフォスファターゼ活性を低下させる他のタンパク質を減少させる、
j) イノシトールモノフォスファターゼ活性を低下させる化合物の生成を減少させる、
ことにより誘導される、上記(3)乃至(5)のいずれかに記載の製造方法、
も含む。
(9)イノシトール‐1‐リン酸合成酵素遺伝子、イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子およびシロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を保有する形質転換微生物である。
(10)前記形質転換微生物が、機能的なイノシトールモノフォスファターゼの過剰生産又はイノシトールモノフォスファターゼの活性化を誘導する遺伝子組換又は変異を更に有することを特徴とする、上記(9)に記載の形質転換微生物、
(11)前記形質転換微生物が、ミオイノシトール資化能を有さない微生物に由来することを特徴とする、上記(9)又は(10)に記載の形質転換微生物、
(12)前記形質転換微生物が、大腸菌、バチルス属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ザイモモナス属細菌からなる群から選択される細菌に由来する、上記(9)乃至(11)のいずれかに記載の形質転換微生物、
(13)前記イノシトールモノフォスファターゼの過剰生産が、前記形質転換微生物に対して、
a) 外来イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を導入する、
b) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子のコピー数を増加させる、
c) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域に変異を導入する、
d) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域を高発現誘導性外来調整領域で置換する、又は
e) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の調整領域を欠失させる、
ことにより誘導されている、上記(10)乃至(12)のいずれかに記載の形質転換微生物、
(14)前記イノシトールモノフォスファターゼの過剰生産が、前記形質転換微生物に対して外来イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子を導入することにより誘導されている、上記(13)に記載の形質転換微生物、及び
(15)前記イノシトールモノフォスファターゼの活性化が、前記形質転換微生物に対して、
f) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子に変異を導入する、
g) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の一部又は全部を置換する、
h) 内因性イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子の一部を欠失させる、
i) イノシトールモノフォスファターゼ活性を低下させる他のタンパク質を減少させる、
j) イノシトールモノフォスファターゼ活性を低下させる化合物の生成を減少させる、
ことにより誘導されている、上記(10)乃至(12)のいずれかに記載の形質転換微生物、
を含む。
(17)シロ‐イノシトールの製造方法であって、上記(16)の化合物を、β‐グリコシド結合を加水分解する反応を触媒できる酵素により分解し、シロ‐イノシトールを生成させることを特徴とする、前記方法である。
(18)シロイノシトールと上記(16)に記載の化合物を含む組成物である。
活性1: 適当な炭素源からグルコース‐6‐リン酸を生成させる活性;
活性2: グルコース‐6‐リン酸をミオイノシトール‐1‐リン酸へ変換する活性、つまり、イノシトール‐1‐リン酸合成酵素活性;及び
活性3: ミオイノシトール‐1‐リン酸を基質としたフォスファターゼ活性。
但し、活性1の生成物であるグルコース‐6‐リン酸は、微生物が普遍的に生成する代謝中間体であるので、当該活性を敢て形質転換体に付与することは必須ではない。また、活性3についても、本発明者らの知る限りにおいて、従来の遺伝子組換手法による工業的生産に適する原核微生物宿主細胞の大多数は、内因性イノシトールモノフォスファターゼを発現しているか、ミオイノシトール‐1‐リン酸を基質とできる汎用モノフォスファターゼ活性を有している。
活性4:ミオイノシトールを2‐ケト‐ミオ‐イノシトール(ミオ‐イノソース;2,3,4,5,6‐ペンタヒドロキシシクロヘキサン‐1‐オン)に変換する酵素活性;及び
活性5:2‐ケト‐ミオ‐イノシトールをシロ‐イノシトールに変換する酵素活性。
上記活性4を有する酵素としては、例えばNAD+の存在下でミオイノシトールを酸化する、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ(酵素番号E.C.1.1.1.18)が挙げられる。また、上記活性5を有する酵素としては、例えばNADP+の存在下でシロ‐イノシトールを酸化する、シロイノシトールデヒドロゲナーゼが挙げられる。つまり、本発明に用いることができるシロイノシトールデヒドロゲナーゼは、例えばNADPHの存在下では、2‐ケト‐ミオ‐イノシトールをシロ‐イノシトールに変換することができる。それらの酵素の詳細は後記する。
上記化合物は新規であり、1−O−β−D‐グルコピラノシル‐シロ‐イノシトールとも呼称され得る。
本実施例では、イノシトール‐1‐リン酸合成酵素をコードする核酸を含む発現カセット、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼをコードする核酸を含む発現カセット及びシロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼをコードする核酸を含む3つの発現カセットを保有する本発明の形質転換微生物を作製し、それによるシロ‐イノシトールの生産能力を調べた。
単離した酒精酵母の培養液から菌体を回収し、Nucleo Spin Tissue(製品名、MACHEREY−NAGEL社製)を使用してゲノムDNAを抽出した。抽出したゲノムDNAを鋳型に用い、以下のプライマーによりPCR増幅し(PrimeSTAR Max DNA Polymerase(製品名、タカラバイオ製) 反応条件:98℃ 10sec,55℃ 5sec,72℃ 20sec,28cycle)、INO1遺伝子のコード領域(配列番号1)をクローニングした。
Bacillus subtilis(NBRC13719)をLB培地中(2ml)で30℃にて振盪培養した。培養終了後、培養液から菌体を回収し、Nucleo Spin Tissue(製品名、MACHEREY−NAGEL社製)を使用してゲノムDNAを抽出した。抽出したゲノムDNAを鋳型に用い、以下のプライマーによりPCR増幅し(PrimeSTAR Max DNA Polymerase(製品名、タカラバイオ製) 反応条件:98℃ 10sec,55℃ 5sec,72℃ 20sec,28cycle)、iolG遺伝子のコード領域(配列番号5)をクローニングした。
Bacillus subtilis(NBRC13719)をLB培地中(2ml)で30℃にて振盪培養した。培養終了後、培養液から菌体を回収し、Nucleo Spin Tissue(製品名、MACHEREY−NAGEL社製)を使用してゲノムDNAを抽出した。抽出したゲノムDNAを鋳型に用い、以下のプライマーによりPCR増幅し(PrimeSTAR Max DNA Polymerase(製品名、タカラバイオ製) 反応条件:98℃ 10sec,55℃ 5sec,72℃ 20sec,28cycle)、iolW遺伝子のコード領域(配列番号7)をクローニングした。
pNFP−D78をSalIで消化し、平滑末端化及び5’末端脱リン酸化した。pNFP−J22中のiolG発現カセット及びpNFP−J36中のiolW発現カセットをクローニングして、両発現カセットをpNFP−D78にライゲーションした。pNFP−D78中のINO1発現カセットと順方向にiolG発現カセット及びiolW発現カセットがライゲーションしていたプラスミドを取得した。
上記の手順に従って構築したプラスミドを、大腸菌AKC−016株(FERM P−22104として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに2011年4月20日に寄託した。国際寄託番号:FERM BP−11512)に塩化カルシウム法(羊土社 遺伝子工学実験ノート 上 田村隆明著、参照)を用いてトランスフェクトした。
本実施例では、イノシトール‐1‐リン酸合成酵素をコードする核酸を含む発現カセット、イノシトールモノフォスファターゼをコードする核酸を含む発現カセット、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼをコードする核酸を含む発現カセット及びシロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼをコードする核酸を含む4つの発現カセットを保有する本発明の形質転換微生物を作製し、それによるシロ‐イノシトールの生産能力を調べた。
大腸菌株W3110(NBRC 12713)をLB培地中(2ml)で37℃にて振盪培養した。培養終了後、培養液から菌体を回収し、Nucleo Spin Tissue(製品名、MACHEREY−NAGEL社製)を使用してゲノムDNAを抽出した。抽出したゲノムDNAを鋳型に用い、以下のプライマーによりPCR増幅し(PrimeSTAR Max DNA Polymerase(製品名、タカラバイオ製) 反応条件:98℃ 10sec,55℃ 5sec,72℃ 20sec,28cycle)、suhB遺伝子のコード領域(配列番号3)をクローニングした。
実施例1で作製したpNFP−D78をSalIで消化し、平滑末端化及び5’末端脱リン酸化した。pNFP−A54中のsuhB発現カセットをクローニングして、pNFP−D78にライゲーションした。pNFP−D78中のINO1発現カセットと順方向にsuhB発現カセットがライゲーションしていたpNFP−G22を取得した。次いで、pNFP−G22をSalIで消化し、平滑末端化及び5’末端脱リン酸化した。実施例1で作製したpNFP−J22中のiolG発現カセット及びpNFP−J36中のiolW発現カセットをクローニングして、両発現カセットをpNFP−G22にライゲーションした。pNFP−G22中のINO1発現カセット及びsuhB発現カセットと順方向にiolG発現カセット及びiolW発現カセットがライゲーションしていたプラスミドを取得した。
上記の手順に従って構築したプラスミドを、大腸菌AKC−016株(FERM P−22104として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに2011年4月20日に寄託した。国際寄託番号:FERM BP−11512)に塩化カルシウム法(羊土社 遺伝子工学実験ノート 上 田村隆明著、参照)を用いてトランスフェクトした。
上記2−c)での形質転換体を、アンピシリン(100mg/L)含有LBプレート上で、37℃、一日間培養して、コロニーを形成させた。アンピシリン(100mg/L)を含むLB培地30mLを150mL容のフラスコに入れ、上記プレートからコロニーを白金耳で植菌し、37℃で、3〜5時間、OD(600nm)が0.5程度になるまで180rpmで培養を行い、これを本培養のための前培養液とした。
上記実施例2において、Jar培養装置を用いたシロ‐イノシトール生産試験で得られた培養上清をHPLC(カラム:Shodex Asahipak NH2P−50 4E(商品名:昭和電工株式会社製)、移動相:水/アセトニトリル=25/75、流速:0.8mL/min、カラム温度40℃、検出:RI)で更に分析したところ、12.4g/Lのシロイノシトールと共に、1.4g/Lのシロイノシトール誘導体が培養上清中に生産されていた。当該シロイノシトール誘導体のピークを分取して、以下の実験に用いた。
装置 :Avance600(Bruker Biospin社製)
プローブ :クライオプローブ(13C高感度)
測定温度 :18℃(試料劣化防止と1H−NMRの際に水シグナルを移動させるため、全て291K(18℃)とした。)
溶媒: :D2O(ALDRICH社製)
内部標準 :TSP
1H観測周波数:600.13MHz
13C観測周波数:150.92MHz
実施例3で得られた化合物を、アスペルギルス属のカビ由来のβ‐グルコシダーゼである、Cellobiase(SIGMA社)により分解した。具体的に、実施例3で得られた化合物を、400μLの150mM Bis‐Tris緩衝液(pH=7.0)に、6mg/mlの濃度で溶解した。当該溶液に、25U/mLCellobiaseを100μL加え、40℃で20時間までインキュベート(1200rpm、Bioshaker M・BR022、TAITEC社)して反応させた。反応0時間、3時間、20時間目に反応液をサンプリングし、HPLC(カラム:Shodex Asahipak NH2P−50 4E(商品名:昭和電工株式会社製)、移動相:水/アセトニトリル=25/75、流速:0.8mL/min、カラム温度40℃、検出:RI)で反応状況を確認した。
Claims (1)
- シロイノシトール誘導体の製造方法であって、以下の工程:
1) イノシトール‐1‐リン酸合成酵素遺伝子、イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子およびシロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を保有する形質転換微生物を用意する工程;
2) 前記微生物の生育及び/又は維持に適した条件下で、該微生物とグルコース又はグルコース単位を有する二糖類若しくは多糖類を接触させる工程;
を含み、前記形質転換微生物が大腸菌であり、前記イノシトール‐1‐リン酸合成酵素遺伝子、イノシトールモノフォスファターゼ遺伝子、ミオイノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子およびシロ‐イノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子が該大腸菌に導入されることで該形質転換微生物内で過剰発現されることを特徴とし、但し、前記シロイノシトール誘導体が、下記の構造式:
で示される化合物である、前記製造方法。
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