CN100513574C - 鲨肌醇的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供：在NAD⁺非存在下将肌醇转化成鲨肌醇的新型的NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶；在NADH或NADPH存在下将青蟹肌糖立体特异地还原成鲨肌醇的新型酶鲨肌醇脱氢酶；以及具有将肌醇转化成鲨肌醇的能力的属于醋酸杆菌属或伯克霍尔德氏菌属的新型微生物。使用这些酶或微生物制备鲨肌醇。另外，向含有鲨肌醇及鲨肌醇以外的中性糖的混合液中加入硼酸和金属盐，从而形成鲨肌醇·硼酸复合体，从混合液分离上述复合体，将经分离的复合体溶解于酸中，制备酸性溶液或酸性悬浮液，从该酸性溶液或酸性悬浮液纯化鲨肌醇。

Description

鲨肌醇的制备方法

技术领域

本发明涉及通过微生物转化由肌醇制备鲨肌醇的方法。

本发明还涉及新型的NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶及其制备方法。本发明还涉及以NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶活性为指标的制备青蟹肌糖用微生物的筛选方法。本发明进一步涉及使用NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶或该酶的高活性株的青蟹肌糖及鲨肌醇的制备方法。

本发明还涉及新型酶，即鲨肌醇脱氢酶、以及利用该酶的鲨肌醇的制备方法。更详细地，涉及：催化鲨肌醇与青蟹肌糖间的氧化还原反应、在NADH或NADPH存在下将青蟹肌糖立体特异地还原成鲨肌醇的新型酶鲨肌醇脱氢酶、及利用了该酶的鲨肌醇的制备方法。

本发明进一步涉及：用含有鲨肌醇及鲨肌醇以外的中性糖的混合液高效率地制备鲨肌醇的方法。

鲨肌醇能够作为阿尔茨海默病的治疗药物、或生理活性物质的合成原料、液晶化合物的合成原料而利用。

背景技术

肌醇是如下述立体结构式(A)所示的天然存在的已知物质。

[化1]

另外，青蟹肌糖是如下述立体结构式(B)所示的已知物质。

[化2]

又，鲨肌醇是如下述立体结构式(C)所示的已知物质

[化3]

鲨肌醇是肌醇的立体异构体之一，是广泛见于动物·植物中的物质。另外，青蟹肌糖是具有氧化了肌醇的2位的轴向羟基的结构的化合物，它也作为天然物质普遍地存在。

鲨肌醇是有望作为阿尔茨海默病的治疗药物(参照非专利文献1)、或生理活性物质的合成原料(参照专利文献1)、液晶化合物的合成原料(参照专利文献2)的用途的物质。

在化学合成手法中，作为青蟹肌糖或鲨肌醇的制法，有：(i)用阮内镍还原六羟基苯，得到鲨肌醇的方法(参照非专利文献2)；(ii)由呋喃葡萄糖衍生物通过5步的反应得到青蟹肌糖，进行还原，得到鲨肌醇的方法(参照非专利文献3)；(iii)以顺式-三噁-三均苯为原料，通过4步以上的反应得到鲨肌醇的方法(参照非专利文献4)；(iv)用铂催化剂氧化肌醇得到青蟹肌糖，接着进行酯化之后，进行还原和水解，得到鲨肌醇的方法(参照专利文献2)；等等。

另外，作为利用微生物将肌醇转化成鲨肌醇的方法，已知使用土壤杆菌属细菌的方法(参照专利文献3)。可是，在该方法中，鲨肌醇的收得率低，还产生其他的转化物，因此不能工业规模地利用。

另一方面知道，醋酸杆菌属细菌(参照非专利文献5)，与肌醇作用，吸收氧，氧化成青蟹肌糖，但详细的机理未研讨。

将肌醇氧化成青蟹肌糖的酶(肌醇2-脱氢酶)，有来自动物·藻类·酵母·细菌等很多的生物种的报告，其是在自然界广泛存在的酶。作为具有上述酶的代表性的微生物，有产气气杆菌(Aerobacteraerogenes)(参照非专利文献6)、芽孢杆菌属(Bacillus)细菌(参照非专利文献7或8，参照专利文献4-6)、假单孢菌属(Pesudomonas)细菌等(参照非专利文献9或10)。

可是，这些报告中的肌醇2-脱氢酶是NAD⁺依赖型的酶，为了氧化，需要NAD⁺或NADP⁺，在工业规模下使之作用时，为了再利用这些辅酶，就必须采用发酵生产，使底物的一部分被分解，此外，在工业规模下生产时存在必须保持低底物浓度等问题。

另一方面，关于鲨肌醇脱氢酶，有存在于牛脑中、和蟑螂脂肪组织中的报告例(参照非专利文献11)，一般认为，这种酶，当将青蟹肌糖作为底物，使之用NADPH还原时，产生鲨肌醇、和肌醇这两种物质。可是，因为底物特异性低，又未使用高纯度的酶，各种性质也不明确，因此该酶可能是具有低底物特异性的醇脱氢酶，具有未在酶手册(朝仓书店发行)中记载的情况。这样，虽然在动物中有报告例，但是其真伪不清楚。

另外，还已知通过化学还原由微生物氧化而制备的青蟹肌糖，来制备鲨肌醇的方法(参照专利文献7)。可是，通过青蟹肌糖的化学还原而得到的物质是鲨肌醇和肌醇的混合物，因此，脱盐纯化混合物，再由浓缩液通过结晶析出而得到溶解度低的鲨肌醇这一操作是必要的。为此，这样的方法需要较多的操作，在鲨肌醇收得率这点上还有改善的余地。在上述状况之下，人们希望开发从还原青蟹肌糖所得的鲨肌醇和肌醇的混合物中制备纯化鲨肌醇的方法，由此简便而高效率地制备鲨肌醇。

在溶液中使用NaBH₄还原青蟹肌糖时，在反应后的溶液中除了肌醇、鲨肌醇之外，还少量含有鲨肌醇·硼酸复合体。已知可以通过下述方法得到鲨肌醇：对于上述的鲨肌醇·硼酸复合体，首先将其作为沉淀物过滤，溶解于稀硫酸中，加入甲醇使之与硼酸共沸，从而去除硼酸，将残留的溶液用离子交换树脂脱盐，从而得到鲨肌醇(参照非专利文献12)。

该鲨肌醇·硼酸复合体是由下述立体结构式(D)所示的物质。

[化4]

然而，在如上述的使用NaBH₄还原青蟹肌糖的方法中，产生的鲨肌醇·硼酸复合体的比例低，在溶液中也生成鲨肌醇，因此有必要分离复合体和溶液成分，分别从中得到鲨肌醇。而且，为了用复合体得到鲨肌醇，需要大量的有机溶剂，因此在经济性方面还有改善的余地。因此，人们希望得到在工业规模下，简便且高效率地制备鲨肌醇的方法。

专利文献1：美国专利第5,412,080号说明书

专利文献2：德国联邦共和国专利第3,405,663号说明书

专利文献3：特开平9-140388号公报

专利文献4：特开平4-126075号公报

专利文献5：特开平05-192163号公报

专利文献6：特开平06-007158号公报

专利文献7：特开平2003-102492号公报

非专利文献1：“The Journal of Biological Chemistry”(美国)，2000年，275卷(No.24)，p.18495-18502

非专利文献2：“Journal of the American Chemical Society”(美国)，1948年，70卷，p.2931-2935

非专利文献3：“Journal of the American Chemical Society”(美国)，1968年，90卷，p.3289-3290

非专利文献4：“Angewandte Chemie”(德国)，1973年，85卷，p.1110-1111

非专利文献5：“The Journal of Biological Chemistry”(美国)，1948年，174卷，p.173-188

非专利文献6：“Archives of Biochemistry and Biophysics”(美国)，1956年，J，Larner et al.，60卷，p.352-363

非专利文献7：“The Journal of Biological Chemistry”(美国)，1979年，254卷，p.7684-7690

非专利文献8：“Microbiology”(美国)，1994年，140卷，p.2289-2298

非专利文献9：“Monatshefte fur Chemie”(德国)，1969年，100卷，p.1327-1337

非专利文献10：“Journal of Bacteriology”(美国)，1977年，131卷，p.872-875

非专利文献11：“生物化学和生物物理学研究报告”(美国)，第68卷，p.1133(1976年)

非专利文献12：“Journal of organic Chemistry”(美国)，1958年，23卷，p.329-330

发明内容

本发明的目的是提供：用肌醇直接地只通过微生物转化，以高收获量制备鲨肌醇的方法。

本发明又一目的是提供：催化将肌醇转化成青蟹肌糖的反应的新型酶、及使用该酶的青蟹肌糖和鲨肌醇的新型制备方法。

本发明又一目的是提供：催化鲨肌醇与青蟹肌糖间的氧化还原反应、在NADH或NADPH存在下，将青蟹肌糖立体特异地还原成鲨肌醇的新型酶鲨肌醇脱氢酶、及利用了该酶的鲨肌醇的新型制备方法。

本发明又一目的是提供：用含有鲨肌醇及鲨肌醇以外的中性糖的混合液高效率地制备高纯度的鲨肌醇的新方法。

本发明人通过寻求具有由肌醇生成青蟹肌糖的能力的微生物的研究，发现了从自然界分离的属于醋酸杆菌属的细菌(AB10253)，该菌株在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心以保藏号FERM P-18868(国际保藏号FERM BP-10136)保藏。而且，确立了用肌醇制备青蟹肌糖的方法、及将得到的青蟹肌糖通过化学还原而制备鲨肌醇的方法(特开平2003-102492号公报)。

那以后，出于提高向青蟹肌糖转化的能力，将该菌株通过突变来育种便发现在这些突变菌株之中存在：将由肌醇生成的青蟹肌糖生物还原成少量鲨肌醇的菌株。于是，本发明人对这些菌株进一步的突变育种，以期得到只通过培养转化即可由肌醇直接、大量地生成并积累鲨肌醇的菌株。结果成功地得到所期望的突变株，具有将由肌醇氧化所产生的青蟹肌糖还原成鲨肌醇并积累在培养基中的能力的菌株。

进一步地，在自然界中发现了虽然转化能力比AB10253低，但具有由肌醇生成鲨肌醇的能力的菌株，通过16SrRNA的碱基序列鉴定确定了所述菌株是属于啤酒醋杆菌(Acetobacter cerevisiae)、Acetobacter malorum、或须芒草伯克霍尔德氏菌(Burkholderiaandropogonis)的微生物。

发现利用这些微生物能够高效率地制备鲨肌醇。

本发明人进一步地认为：如果能够取得能将肌醇高效率地转化成青蟹肌糖的酶，则利用此种酶可以由高浓度的底物肌醇高效率地制备青蟹肌糖。另外，如果能够通过筛选分离出该酶的高活性株，则可将其用于青蟹肌糖的制备。

于是，本发明人在下述的假说的基础上为分离该酶而进行了刻苦研究，该假说是：具有能够催化由肌醇向青蟹肌糖转化的反应的、以往未知的新型的NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶。研究结果发现，在属于醋酸杆菌属的醋酸杆菌的AB10253中存在NAD⁺非依赖型的肌醇2-脱氢酶。进一步地，本发明人通过利用该酶、或该酶的活性高的微生物，能够高效率地制备青蟹肌糖，通过还原得到的青蟹肌糖，成功地、高效率地制备了高纯度的鲨肌醇。

本发明人接着研究了在由上述肌醇直接地生成鲨肌醇的菌株的菌体中怎样地由肌醇向鲨肌醇转化，结果发现以氧依赖的方式氧化肌醇的2位羟基使其转变为青蟹肌糖后，在具有以NADH或NADPH依赖的方式将青蟹肌糖还原成鲨肌醇的活性的酶的作用下生成鲨肌醇。基于上述活性，本发明人成功地纯化了具有将青蟹肌糖还原成鲨肌醇的活性的酶。这种酶具有以NADPH依赖的方式将青蟹肌糖立体特异地还原成鲨肌醇的活性、以及以NADP⁺依赖的方式将鲨肌醇氧化成青蟹肌糖的活性，将这种酶命名为“鲨肌醇脱氢酶”。另外本发明的酶由于也具有氧化肌醇的5位的羟基的能力，因此也可称为肌醇5-脱氢酶。

进一步地，由大肠杆菌或土壤杆菌属、枯草芽孢杆菌、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)的基因组，利用PCR法成功地克隆了编码鲨肌醇脱氢酶的基因。

另外，本研究人在本发明的酶以NAD+或NADP+依赖的方式进行氧化还原反应的事实基础上认为，通过使之与已经存在的肌醇2-脱氢酶(具有以NAD+或NADP+依赖的方式将青蟹肌糖还原成肌醇的活性；EC 1.1.1.18)联合(参照图1)，能够从肌醇经由青蟹肌糖向鲨肌醇直接转换，并取得了成功。

进一步地，本发明人认为，为了由含有通过青蟹肌糖的还原等而得到的、鲨肌醇、及肌醇等的中性糖的混合液高效率地制备鲨肌醇，形成鲨肌醇·硼酸复合体是有利的。基于这样的想法，本研究人刻苦研究了：只将鲨肌醇和肌醇的混合液中的鲨肌醇高效率地导入到鲨肌醇·硼酸复合体中的方法。其结果发现：由鲨肌醇、硼酸、及金属离子构成的鲨肌醇·硼酸复合体，具有特异的键，是在其他的中性糖的复合体中看不到的溶解度低的复合体。进而发现：通过向混合液中加入相当于溶解鲨肌醇2倍摩尔以上、优选2-3倍摩尔的硼酸和金属盐，且将溶液保持在pH8.0-11.0、优选pH9.0-10.0的碱性，可使鲨肌醇·硼酸复合体高效率地形成、沉淀。在这样的条件之下，由含有鲨肌醇、及肌醇等的中性糖的混合液形成鲨肌醇·硼酸复合体，使该复合体溶解于酸之后，使用离子交换树脂和水溶性有机溶剂等纯化，由此可成功地高效率制备鲨肌醇。

根据上述完成了本发明。

即，本发明如下。

(1)一种鲨肌醇的制备方法，其特征在于，通过使属于醋酸杆菌属或伯克霍尔德氏菌属的、具有将肌醇转化成鲨肌醇的能力的微生物在含有肌醇的溶液中与肌醇作用，从而使上述溶液中生成、积累鲨肌醇，然后从该溶液中收集鲨肌醇。

(2)根据(1)所述的制备方法，其特征在于，上述含有肌醇的溶液是含有肌醇的液体培养基，通过在该液体培养基中培养上述微生物，从而使之与肌醇作用。

(3)根据(1)所述的制备方法，其特征在于，使通过培养得到的上述微生物菌体在上述溶液中与肌醇作用。

(4)根据(1)-(3)的任1项所述的制备方法，其中，上述微生物是属于啤酒醋杆菌(Acetobacter cerevisiae)、Acetobactermalorum、或须芒草伯克霍尔德氏菌(Burkholderia andropogonis)的微生物。

(5)根据(1)-(3)的任1项所述的制备方法，其中，上述微生物是醋酸杆菌AB10281FERM BP-10119或其突变株。

(6)一种具有将肌醇转化成鲨肌醇的能力的醋酸杆菌AB10281FERM BP-10119或其突变株。

(7)一种至少具有下述理化性质的NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶，(a)作用：在电子受容物的存在下，催化从肌醇夺取电子，生成青蟹肌糖的反应；(b)最适pH：在pH4.5-5.5下活性显示出最大值；(c)辅因子：每1摩尔的酶中含有1摩尔的血红素铁；(d)抑制剂：酶活性被1mM的Sn²⁺离子抑制在1％以下；(e)亚单位结构：是至少含有分子量76k道尔顿和46k道尔顿的蛋白质的异聚体；(f)底物特异性：与D-chiro-肌醇、muco-肌醇、肌醇反应，分别转化成D-chiro-1-肌糖、L-chiro-2-肌糖、青蟹肌糖，不与allo-肌醇、鲨肌醇、L-chiro-肌醇、葡萄糖反应。

(8)一种肌醇2-脱氢酶的制备方法，其特征在于，培养具有生产NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶能力的属于醋酸杆菌属的微生物，从所培养的微生物菌体分离纯化肌醇2-脱氢酶。

(9)根据(8)所述的制备方法，其中，上述微生物是醋酸杆菌AB10253FERM BP-10136。

(10)一种青蟹肌糖的制备方法，其特征在于，在含有肌醇和电子受体的溶液中使NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶与肌醇作用，生成青蟹肌糖，从溶液中分离纯化生成的青蟹肌糖。

(11)一种鲨肌醇的制备方法，包括：在含有肌醇和电子受体的溶液中使NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶与肌醇作用，生成青蟹肌糖的步骤；使还原剂与上述青蟹肌糖作用，生成鲨肌醇的步骤；以及，分离纯化上述鲨肌醇的步骤。

(12)一种制备青蟹肌糖用微生物的筛选方法，其特征在于，诱变处理醋酸杆菌AB10253，以NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶活性为指标，对得到的突变株进行筛选。

(13)一种制备青蟹肌糖用微生物的筛选方法，其特征在于，从含有微生物的天然试样之中分离微生物，以NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶活性为指标，对经分离的微生物进行筛选。

(14)一种青蟹肌糖的制备方法，其特征在于，通过在含有肌醇的培养基中培养由(12)或(13)所述的筛选方法得到的制备青蟹肌糖用微生物，由肌醇生成青蟹肌糖，从培养基分离纯化生成的青蟹肌糖。

(15)一种鲨肌醇的制备方法，包括：通过在含有肌醇的培养基中培养由(12)或(13)所述的筛选方法得到的制备青蟹肌糖用微生物，由肌醇生成青蟹肌糖的步骤；使还原剂与上述青蟹肌糖作用，生成鲨肌醇的步骤；以及，分离纯化上述鲨肌醇的步骤。

(16)一种具有下述理化性质的鲨肌醇脱氢酶，反应：如下述反应式所示，催化鲨肌醇与青蟹肌糖间的氧化还原反应、在NADH或NADPH存在下将青蟹肌糖立体特异地还原成鲨肌醇。

[化5]

(17)根据(16)所述的鲨肌醇脱氢酶，其中，还进一步具有下述的理化性质，(a)分子量及缔合特性：38-46k道尔顿，形成2聚体或3聚体；(b)辅酶：将NAD⁺或NADP⁺或者NADH或NADPH作为辅酶；(c)活化重金属：在Co²⁺离子的存在下被活化；(d)抑制重金属：在Sn²⁺离子的存在下被抑制；(e)最适pH：在pH5-9下具有活性。

(18)下述(A)或(B)的蛋白质，

(A)包含SEQ.ID.NO：28所示的氨基酸序列的蛋白质；

(B)在SEQ.ID.NO：28所示的氨基酸序列中，有1个或多个氨基酸发生取代、缺失、插入、和/或附加的氨基酸序列，具有催化鲨肌醇与青蟹肌糖间的氧化还原反应、在NADH或NADPH存在下将青蟹肌糖立体特异地还原成鲨肌醇的酶活性的蛋白质。

(19)编码以下(A)或(B)的蛋白质的DNA，

(A)包含SEQ.ID.NO：28所示的氨基酸序列的蛋白质；

(B)包含在SEQ.ID.NO：28所示的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸发生取代、缺失、插入、和/或附加的氨基酸序列，并具有催化鲨肌醇与青蟹肌糖间的氧化还原反应、在NADH或NADPH存在下将青蟹肌糖立体特异地还原成鲨肌醇的酶活性的蛋白质。

(20)下述(a)或(b)的DNA，

(a)包含SEQ.ID.NO：27所示的碱基序列的编码区的DNA；

(b)与具有SEQ.ID.NO：27所示的碱基序列或与该碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格条件下杂交，并编码具有催化鲨肌醇与青蟹肌糖间的氧化还原反应、在NADH或NADPH存在下将青蟹肌糖立体特异地还原成鲨肌醇的酶活性的蛋白质的DNA。

(21)一种包含(19)或(20)所述的DNA的载体。

(22)一种包含(19)或(20)所述的DNA、或者(21)所述的载体的转化微生物。

(23)根据(22)所述的转化微生物，转化的宿主是大肠杆菌。

(24)一种鲨肌醇脱氢酶的制备方法，其特征在于，培养(22)或(23)所述的转化微生物，从培养物收集鲨肌醇脱氢酶。

(25)一种鲨肌醇的制备方法，其特征在于，使(16)所述的鲨肌醇脱氢酶、和催化在NAD⁺或NADP⁺存在下氧化肌醇生成青蟹肌糖的反应的肌醇2-脱氢酶(EC1.1.1.18)共存的溶液中，在pH6.0-8.5下且在NAD⁺或NADP⁺存在下，将肌醇作为底物，使之发生酶转化反应成为鲨肌醇。

(26)根据(25)所述的鲨肌醇的制备方法，其特征在于，在溶液中添加青蟹肌糖并使之达到0.01-3％。

(27)根据(25)所述的鲨肌醇的制备方法，其特征在于，在溶液中添加青蟹肌糖并使之达到0.2-0.5％。

(28)根据(25)所述的鲨肌醇的制备方法，其特征在于，在溶液中添加Co盐和/或Mg盐，并使之达到0.01-5.0mM。

(29)根据(25)所述的鲨肌醇的制备方法，其特征在于，在溶液中添加Co盐和/或Mg盐，并使之达到0.2-2.0mM。

(30)根据(25)所述的鲨肌醇的制备方法，其特征在于，进行制备使得溶液中的肌醇浓度达到5-22％，使经酶反应生成的鲨肌醇在反应溶液中结晶化，将鲨肌醇以晶体形式筛选到体系外。

(31)根据(25)所述的制备方法，其中，鲨肌醇脱氢酶是下述(A)或(B)的蛋白质，

(A)包含SEQ.ID.NO：28所示的氨基酸序列的蛋白质；

(B)包含在SEQ.ID.NO：28所示的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸发生取代、缺失、插入、和/或附加的氨基酸序列，并具有催化鲨肌醇与青蟹肌糖间的氧化还原反应、在NADH或NADPH存在下将青蟹肌糖立体特异地还原成鲨肌醇的酶活性的蛋白质。

(32)根据(25)所述的制备方法，其中，鲨肌醇脱氢酶是由下述(a)或(b)的DNA编码的蛋白质，

(a)包含SEQ.ID.NO：27所示的碱基序列的编码区的DNA；

(b)与具有SEQ.ID.NO：27所示的碱基序列或与该碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格条件下杂交，并编码具有催化鲨肌醇与青蟹肌糖间的氧化还原反应、在NADH或NADPH存在下将青蟹肌糖立体特异地还原成鲨肌醇的酶活性的蛋白质的DNA。

(33)根据(25)所述的制备方法，其中，鲨肌醇脱氢酶是下述(C)或(D)的蛋白质，

(C)包含SEQ.ID.NO：2、4、6、8、10、12或14所示的氨基酸序列的蛋白质；

(D)包含在SEQ.ID.NO：2、4、6、8、10、12或14所示的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸发生取代、缺失、插入、和/或附加的氨基酸序列，并具有催化鲨肌醇与青蟹肌糖间的氧化还原反应、在NADH或NADPH存在下将青蟹肌糖立体特异地还原成鲨肌醇的酶活性的蛋白质。

(34)根据(25)所述的制备方法，其中，鲨肌醇脱氢酶是由下述(c)或(d)的DNA编码的蛋白质，

(c)包含SEQ.ID.NO：1、3、5、7、9、11或13所示的碱基序列的编码区的DNA；

(d)与具有SEQ.ID.NO：1、3、5、7、9、11或13所示的碱基序列或与该碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格条件下杂交，并编码具有催化鲨肌醇与青蟹肌糖间的氧化还原反应、在NADH或NADPH存在下将青蟹肌糖立体特异地还原成鲨肌醇的酶活性的蛋白质的DNA。

(35)一种鲨肌醇的制备方法，包括，在含有鲨肌醇及鲨肌醇以外的中性糖的混合液中，加入在该混合液中溶解的鲨肌醇的2倍摩尔以上的量的硼酸和金属盐，且将该混合液的pH调至8.0-11.0，形成鲨肌醇·硼酸复合体的第1步骤；从混合液中分离上述复合体的第2步骤；使经分离的复合体溶解于酸中，使之分解为鲨肌醇和硼酸的第3步骤；由在第3步骤中得到的酸性溶液或酸性悬浮液分离纯化鲨肌醇的第4步骤。

(36)根据(35)所述的制备方法，其特征在于，在上述第1步骤中，加入的硼酸和金属盐的量是在上述溶解于混合液中的鲨肌醇的2倍摩尔以上、且3倍摩尔以下。

(37)根据(35)所述的制备方法，其特征在于，在上述第1步骤中，将上述混合液的pH调整为9.0-10.0。

(38)根据(35)所述的制备方法，其中，上述金属盐是选自NaCl、NaHCO₃、Na₂CO₃、Na₂SO₄、NaHSO₄、NaH₂PO₄、Na₂HPO₄、Na₃PO₄、硼砂、KCl、KHCO₃、K₂CO₃、K₂SO₄、KHSO₄、KH₂PO₄、K₂HPO₄、K₃PO₄、MgCI₂、MgCO₃、及MgSO₄的1种或2种以上的金属盐。

(39)根据(35)所述的制备方法，其中，上述含有鲨肌醇及鲨肌醇以外的中性糖的混合液，是通过在含有青蟹肌糖的溶液中还原青蟹肌糖而得到的含有肌醇和鲨肌醇的混合液。

(40)根据(35)所述的制备方法，其特征在于，在上述第3步骤中，将使上述复合体溶解于酸而得到的溶液调整为0.1当量以上的酸性，并且，在上述第4步骤中，使上述酸性溶液与强酸性离子交换树脂、及强碱性离子交换树脂或硼酸选择性吸附树脂接触后，从该酸性溶液析出鲨肌醇。

(41)根据(35)所述的制备方法，其特征在于，在上述第4步骤中，向上述酸性溶液或酸性悬浮液中加入水溶性有机溶剂，使鲨肌醇析出。

(42)根据(41)所述的制备方法，其特征在于，上述水溶性有机溶剂是乙醇或甲醇，相对于上述酸性溶液或酸性悬浮液，加入0.3-3倍容积的乙醇、或0.3-5倍容积的甲醇。

(43)根据(41)所述的制备方法，其特征在于，上述水溶性有机溶剂是乙醇或甲醇，相对于上述酸性溶液或酸性悬浮液，加入0.6-1.5倍容积的乙醇、或0.9-2倍容积的甲醇。

(44)一种鲨肌醇的制备方法，包括，在含有青蟹肌糖的溶液中，使用硼氢化金属盐(metal salt of boron hydirde)还原青蟹肌糖，得到含有肌醇和鲨肌醇的混合液的第1步骤；向上述混合液中加入酸，使混合液中的鲨肌醇·硼酸复合体溶解，并且将溶液调至0.01当量以上的酸性溶液的第2步骤；以及，以肌醇不析出的量向上述酸性溶液中加入水溶性有机溶剂，只使鲨肌醇析出的第3步骤。

(45)根据(44)所述的制备方法，其特征在于，在上述第3步骤中，加入的水溶性有机溶剂是乙醇、甲醇或者1-丙醇，相对于上述酸性溶液，加入0.2-0.4倍容积的乙醇、0.2-0.8倍容积的甲醇、或者0.2-0.4倍容积的1-丙醇。

(46)根据(44)所述的制备方法，其特征在于，在上述第3步骤中，加入的水溶性有机溶剂是乙醇、甲醇或者1-丙醇，相对于上述酸性溶液，加入0.35-0.45倍容积的乙醇、0.45-0.55倍容积的甲醇、或者0.35-0.45倍容积的1-丙醇。

附图的简单说明

图1是表示通过酶的缔合来制备鲨肌醇的原理的图。

实施发明的最佳方案

1.使用醋酸杆菌属或伯克霍尔德氏菌属的微生物的制备鲨肌醇的方法

本发明的一个方案，涉及鲨肌醇的制备方法，该制备方法的特征在于，通过使属于醋酸杆菌属或伯克霍尔德氏菌属的、具有将肌醇转化成鲨肌醇的能力的微生物在含有肌醇的溶液中与肌醇作用，从而使上述溶液中生成、积累鲨肌醇，然后从该溶液中收集鲨肌醇。

在该制备方法中使用的微生物，是属于醋酸杆菌属或者伯克霍尔德氏菌属的微生物，是具有将肌醇转化成鲨肌醇的能力的微生物。在此，作为属于醋酸杆菌属的微生物，可举出：啤酒醋杆菌(Acetobactercerevisiae)、Acetobacter malorum、Acetobacter orleanensis、Acetobacterindonesiensis、东方醋杆菌(Acetobacter orientalis)、醋化醋杆菌(Acetobacter aceti)、液化醋杆菌(Acetobacter liquefaciens)、巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)、汉氏醋杆菌(Acetobacterhansenii)、或者上述属中种未鉴定菌株(sp.)。作为属于伯克霍尔德氏菌属的微生物，可举出：须芒草伯克霍尔德氏菌(Burkholderiaandropogonis)、石竹伯克霍尔德氏菌(Burkholderia caryophylli)、草根伯克霍尔德氏菌(Burkholderia graminis)。其中，特别优选啤酒醋杆菌、Acetobacter malorum、或者须芒草伯克霍尔德氏菌。所谓“将肌醇转化成鲨肌醇的能力”，例如是指在含有肌醇的培养基中培养时，在该培养基中积累鲨肌醇的能力。

作为上述微生物的具体例，可举出醋酸杆菌AB10281。该菌株是将醋酸杆菌AB10253FERM BP-10136诱变育种，赋予将肌醇转化成鲨肌醇的能力的菌株，在2004年1月20日在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(日本国茨城县筑波东1丁目1番地1中央第6邮编305-8566)保藏，保藏号FERM P-19639。并基于布达佩斯条约转为国际保藏，保藏号为FERM BP-10119。

另外，也可以利用上述醋酸杆菌AB10281或者醋酸杆菌AB10253等的属于醋酸杆菌属的微生物的衍生株。衍生株，将上述微生物诱变育种，从导入了变异的菌株选择具有能够将肌醇直接选择性地转化成鲨肌醇的特性的菌株而得。作为诱变育种的方法，例如除了UV照射、放射线照射等物理诱变方法以外，还可例举出通过混合N-亚硝基胍、甲磺酸乙酯、亚硝酸、甲磺酸甲酯、吖啶色素、苯并芘、硫酸二甲酯等诱变剂而进行的化学诱变方法。

作为使上述的微生物在含有肌醇的溶液中与肌醇作用的方法，首先可举出在含有肌醇的液体培养基中培养本发明的微生物的方法。

在该情况下，所使用的液体培养基的组成，只要能够所述目的则没有特别的限制，只要是除了含有向鲨肌醇转化的原料肌醇以外还含有碳源、氮源、有机营养源、无机盐类等的培养基即可，合成培养基·天然培养基均可使用。肌醇优选添加0.1％-40％，更优选添加10％-30％，作为碳源，添加甘油、蔗糖、麦芽糖或者淀粉，添加量优选为0.1％-20％、更优选为0.3-5％，作为氮源，添加酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵或尿素等，添加量优选为0.01％-5.0％、更优选为0.5％-2.0％。此外，还能够根据需要在培养基中添加能够生成钠、钾、钙、镁、钴、锰、锌、铁、铜、钼、磷酸、硫酸等的离子的无机盐类。培养液中的氢离子浓度不需要特别调制，但优选调至pH4-10、更优选调至pH5-9而培养，如此即可高效率地得到鲨肌醇。

培养条件根据培养基的种类不同而异，但培养温度为12-35℃，优选为20-27℃，另外，通过液体摇床振荡培养，或向液体培养基中吹入空气或氧气等需氧培养即可。在该培养中，肌醇在培养初期被氧化，产生的青蟹肌糖在培养后期在有机体中被还原，产生鲨肌醇。当进一步进行培养时，鲨肌醇也缓慢地分解。因此，培养期间，只要进行到鲨肌醇显示最大或必要量的积累量即可，通常为1-10天，优选为3-8天。

另外，也可以使通过培养而得到的微生物菌体在含有肌醇的溶液中与肌醇作用。在此，作为通过培养而得到的菌体，既可以使用另行在适当的培养条件下培养微生物而得到的菌体，也可以再度使用从培养液分离用于制备肌醇的微生物而收集的菌体。可以利用离心分离、过滤等公知的方法收集菌体。

通过如如上所述使微生物与肌醇作用，在溶液中积累鲨肌醇。从培养液收集鲨肌醇的方法，可应用通常的分离纯化水溶性中性物质的一般的方法。即，从培养液去除菌体之后，通过用活性炭和离子交换树脂等处理培养液上清，可基本除掉鲨肌醇以外的杂质。然后，通过使用再结晶等的方法，可分离目的物质。

更具体地，出于去除不希望有的成分的目的，使积累了鲨肌醇的培养液上清在填充有强酸性阳离子交换树脂、例如

(H⁺型)的柱中通过，收集通过液，然后使去离子水在该柱中通过，洗涤，收集洗涤液，合并所得到的通过液和洗涤液。使所得的溶液在填充有强碱性阴离子交换树脂、例如(OH-型)的柱中通过，收集通过液，然后使去离子水在该柱中通过，洗涤，收集洗涤液，合并所得到的通过液和洗涤液，取得含有鲨肌醇、几乎不含其它的杂质的水溶液。在浓缩该水溶液而得到的鲨肌醇的浓稠溶液中加入适当量的乙醇，在室温或低温放置一夜，就能够结晶析出纯的鲨肌醇晶体。另外，利用鲨肌醇的水溶解性低，只浓缩并过滤该水溶液也能结晶析出纯的鲨肌醇晶体。而且，在进行柱操作时，也能够使用以脱色为目的而填充有活性炭的柱。

作为其他的纯化方法，采用下述的方法也能够得到纯的鲨肌醇的晶体：在后述的、含有通过培养而得到的鲨肌醇的溶液中加入硼酸、NaCl，制备鲨肌醇硼酸复合体，将其过滤出后，采用酸使硼酸游离，通过加入甲醇之类的有机溶剂使鲨肌醇结晶化。

而且，在本菌株的培养中，在常温下水溶解性低(溶解度约1.6％)的鲨肌醇结晶化，产生沉淀。为此，在该培养过程中，追加加入肌醇，再使鲨肌醇以晶体形式积累也可以。

2.新型的NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶、以及使用该酶的青蟹肌糖和鲨肌醇的制法

本发明的另一方案涉及新型的NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶、以及使用该酶的青蟹肌糖和鲨肌醇的制法。

<2-1>新型的NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶

本发明的NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶，至少具有下述理化性质。

(a)作用：在电子受容物的存在下，催化从肌醇夺取电子，生成青蟹肌糖的反应；

(b)最适pH：在pH4.5-5.5下活性显示出最大值；

(c)辅因子：每1摩尔的酶中含有1摩尔的血红素铁；

(d)抑制剂：酶活性被1mM的Sn²⁺离子抑制在1％以下；

(e)亚单位结构：是至少含有分子量76k道尔顿和46k道尔顿的蛋白质的异聚体；

(f)底物特异性：与D-chiro-肌醇、muco-肌醇、肌醇反应，分别转化成D-chiro-1-肌糖、L-chiro-2-肌糖、青蟹肌糖，不与allo-肌醇、鲨肌醇、L-chiro-肌醇、葡萄糖反应。

(a)的作用，通过在电子受容物的存在下，测定肌醇2-脱氢酶活性就能确认。在此，作为电子受容物，可例举出氧化型DCIP、PMS(吩嗪硫酸甲酯)、亚甲基蓝、Fe³⁺离子等，可组合这些物质来使用，但优选使用氧化型DCIP。肌醇2-脱氢酶活性，例如可将由100mM磷酸缓冲液(pH5.0)、肌醇5mg、2，4-二氯吲哚酚(氧化型DCIP)0.4mg组成的1mL溶液中的600nm的吸光度变化换算成反应速度，将每1min氧化1μmol的肌醇的活性作为1单位而测定。(b)的最适pH，在各pH下测定肌醇2-脱氢酶活性，寻找酶活性显示最大值的pH范围，由此得以确认。另外，(d)的性质，在酶活性测定体系中添加Sn²⁺离子，测定酶活性，与未添加Sn²⁺离子时的活性比较，由此得以确认。另外，(e)的亚单位结构，例如通过SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)等得以确认。再者，各亚单位的76k道尔顿和46k道尔顿分子量，分别是近似的值，其可以是上下相差几千道尔顿的值。

本发明的NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶，只要具有上述性质即可，无其它特别限定，例如举出来源于醋酸杆菌AB10253的该种酶。本发明的NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶的底物特异性如上所述，但关于来源于醋酸杆菌AB10253的酶，显示在底物浓度50mM下的相对活性和Km值，如下所示。即为：D-chiro-肌醇(相对活性100％、Km＝8.8mM)、D-chiro-肌醇(相对活性100％、Km＝8.8mM)、muco-肌醇(相对活性68％、Km＝14.5mM)、肌醇(相对活性53％、Km＝20mM)。

本发明的NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶，是与已知的NAD⁺依赖型的肌醇2-脱氢酶不同的类型的NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶。关于两种酶不同点的比较如下述表1所示。

表1

 

	本发明申请酶(NAD<sup>+</sup>非依赖型)	以往类型的酶(NAD<sup>+</sup>依赖型)
			细胞内局部存在	膜组分	细胞质可溶性组分
最适pH	PH4.5-5.5	pH8.0-9.0
			电子受体	血红素铁	NAD<sup>+</sup>

<2-2>NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶的制备方法

本发明的NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶的制备方法，其特征在于，培养具有生产NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶的能力的、属于醋酸杆菌属的微生物，从所培养的微生物菌体分离纯化肌醇2-脱氢酶。

作为能够用于制备NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶的微生物，只要具有生产NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶的能力即可，无其它特别限定，例如举出醋酸杆菌AB10253FERM BP-10136。为培养微生物所使用的培养基是已知的一般的微生物培养所使用的培养基，可使用含有碳源、氮源、其他营养源等的培养基。在此，作为碳源可例举出葡萄糖、蔗糖、麦芽糖或者淀粉等，其浓度优选为0.1-20％、更优选为0.3-5％。作为氮源，可例举出蛋白胨、酵母提取物、酪蛋白水解物、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、尿素或者肉膏等，其浓度优选为0.01-5.0％、更优选为0.5-2.0％。此外，优选根据需要在培养基中添加能够生成钠、钾、钙、镁、钴、锰、锌、铁、铜、钼、磷酸、硫酸等的离子的无机盐类。培养液中的氢离子浓度调至pH3-10、优选调至pH5-7而培养，如此即能够高效率地诱导本发明的酶的表达。用％表示的值指w/v的百分率，用％表示浓度时也包含相同的含义。

再有，为了诱导NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶的表达，优选使用含有肌醇的培养基。该情况下，加入的肌醇的浓度，适宜为0.2-15％，优选为1％-5％，更优选为3％。

培养条件也根据培养基的种类不同而不同，但培养温度优选为12-35℃，更优选为20-27℃，另外以液体培养基摇床振荡培养，或向液体培养基中吹入空气或氧气等需氧培养为好。培养期间，优选进行到在培养液中肌醇完全消失，且青蟹肌糖显示最大的积累量，通常是1-10天，优选是3-8天。

通过从这样培养的菌体分离纯化酶，能够得到本发明的酶。酶的分离纯化可与通常的蛋白质的纯化方法同样地进行。以下举出具体例说明，但分离纯化方法不限定于这些方法。

首先通过离心分离和过滤器过滤等将培养得到的菌体沉淀或浓缩。然后，将得到的菌体沉淀物、或菌体悬浮液破碎。破碎可使用细胞压碎器、dyna磨、超声波破碎等方法，但优选超声波破碎。例如，从1升培养液收集菌体时，用水进行洗涤，最终悬浮在50ml的水中，向该悬浮液照射超声波，将细胞破碎，通过12000rpm的离心分离而得到沉淀。进而将得到的沉淀悬浮在适当的缓冲液、例如Tris缓冲液、磷酸缓冲液(浓度为2mM-100mM，pH为pH6.0-8.0)中，通过向其中加入表面活性剂，能够提取膜酶。作为表面活性剂的种类，可例举出TritonX-100(注册商标)、Tween20(注册商标)、Tween80(注册商标)等，其浓度可为0.02％-1.0％，但优选以0.6％的浓度使用TritonX-100。

将上述得到的加入了表面活性剂的悬浮液在低温下孵化1-5小时左右，由此能提取酶。此后，再度进行离心分离，能够得到可溶化到上清液中的酶。所得的酶液可以原样地用于青蟹肌糖的制备，但如果需要，则能够采用通常的酶浓缩所使用的方法将酶浓缩后再使用。作为酶浓缩方法，例如可例举出硫酸铵分馏、超滤等。另外，为了更高度地纯化，优选进一步进行以下的处理。

对于已溶解的酶，优选进行柱色谱纯化。作为柱色谱，例如DEAE柱色谱等。DEAE柱如果有DEAE基，则即使载体的性状特别不同也能使用。优选可例举出DEAE Toyopearl(日本Tosoh公司制)。使用DEAE Toyopearl纯化时，上述的酶液制备成盐度20mM再加入到柱中为好。接着，由不含表面活性剂、但含线性浓度梯度的NaCl或KCl溶液的20mM的缓冲液(pH为pH6.0-8.0)通过柱以洗脱吸附于柱上的蛋白质。NaCl时，使用0mM-500mM的浓度梯度，KCl时，使用0mM-350mM的浓度梯度。然后，不含表面活性剂的20mM的缓冲液(pH为pH6.0-8.0)再度通过该柱以洗涤柱，然后使不含表面活性剂、但含线性浓度梯度的NaCl或KCl的溶液的20mM的缓冲液(pH为pH6.0-8.0)通过以洗脱蛋白质。NaCl时，使用0mM-500mM的浓度梯度，KCl时，使用0mM-350mM的浓度梯度。所添加的表面活性剂，可例举出TritonX-100、Tween20、Tween80等，其浓度可为0.02％-1.0％，但优选以0.1％的浓度使用TritonX-100。在这样的条件下，本发明的酶可利用含有表面活性剂以及100-170mM的NaCl的20mM的缓冲液从柱上洗脱出来。所得的酶液可以原样地用于青蟹肌糖的制备，但为了更高度地纯化，进一步进行处理。

以酶活性为指标而纯化时，酶活性的测定，例如在由100mM磷酸缓冲液(pH5.0)、5mg肌醇、0.4mg2，4-二氯吲哚酚(氧化型DCIP)组成的1ml溶液中加入蛋白质溶液，将600nm的吸光度变化换算成反应速度，将每1min氧化1μmol的肌醇的活性作为1单位而测定。

进一步纯化本发明的酶时，优选将本发明的酶液通过透析、或超滤脱盐后，加入到例如羟基磷灰石柱中。此时，吸附于羟基磷灰石上的蛋白质，可以通过含有表面活性剂的线性浓度梯度磷酸缓冲液(pH7.0)洗脱。所述磷酸缓冲液的浓度梯度可使用0mM-500mM。另外，所添加的表面活性剂可例举出TritonX-100、Tween20、Tween80等，其浓度可为0.02％-1.0％，但优选以0.1％的浓度使用TritonX-100。在这样的条件下，本发明的酶，利用含有表面活性剂的210-260mM的磷酸缓冲液从柱上洗脱。所得的酶液含有基本上纯的NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶，能够原样地用于青蟹肌糖的制备。

<2-3>筛选制备青蟹肌糖用微生物的方法

本发明还涉及一种筛选制备青蟹肌糖用微生物的方法，其特征在于，诱变处理醋酸杆菌AB10253，以NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶活性为指标，筛选所得到的突变株。

在此作为指标的NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶活性的测定，可通过例如将从微生物菌体得到的膜组分加入到由100mM磷酸缓冲液(pH5.0)、5mg肌醇、0.4mg 2，4-二氯吲哚酚(氧化型DCIP)组成的1mL溶液中，测定600nm的吸光度变化来进行。作为筛选的基准，例如在采用上述方法测定活性进行比较，将显示出非变异AB10253的1.2倍以上、优选2倍以上的NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶活性的菌株筛选出来。

诱变处理醋酸杆菌AB10253的方法，可使用通常的微生物诱变方法。例如除了UV照射、放射线照射等物理诱变方法以外，还可例举出通过混合N-亚硝基胍、甲磺酸乙酯、亚硝酸、甲磺酸甲酯、吖啶色素、苯并芘、硫酸二甲酯等诱变剂而进行的化学诱变方法。

以下例举从这些实施了诱变处理的醋酸杆菌筛选制备青蟹肌糖用微生物的方法。但是，筛选方法，只要以NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶活性为指标进行即可，并不限定于该方法。

将经诱变处理的AB10253在含有肌醇和营养成分的琼脂培养基中按每个直径9cm的培养皿形成10-300集落、优选形成100-150集落的方式涂布。在此，作为培养基的营养成分而加入的碳源、氮源、其他营养源，可使用已知的一般的微生物培养所用的物质。例如，作为碳源，可例举出葡萄糖、蔗糖、麦芽糖或者淀粉等。其浓度优选为0.1％-20％、更优选为0.3-5％。作为氮源，可例举出蛋白胨、酵母提取物、酪蛋白水解物、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、尿素或肉膏等。其浓度优选为0.01-5.0％、优选为0.5-2.0％。

此外，根据需要在培养基中添加能够生成钠、钾、钙、镁、钴、锰、锌、铁、铜、钼、磷酸、硫酸等的离子的无机盐类是有效的。培养液中的氢离子浓度调至pH3-10、优选调至pH5-7而培养，如此即能够高效率地诱导本发明的酶。

所述培养进行到形成大量集落时即可，用约3天形成集落。培养温度，优选在菌株的适合生长温度25-30℃、更优选在27℃下培养。

分离集落并培养，逐个地测定NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶活性，以期筛选出活性强的菌株，能够如下述，利用直径9cm的培养皿在琼脂培养基上高效率地筛选。

培养后，在形成于直径9cm的培养皿上的集落之上缓慢注入10ml检定用琼脂培养基。用于分析的琼脂培养基是如下制备的粘稠的溶液：在由100mM磷酸缓冲液、1％肌醇、0.4％氧化型DCIP构成的组分中加入琼脂并使琼脂达到0.5％，琼脂溶解后冷却到36℃，制备使得琼脂不凝固的。进行了上述处理的分析用琼脂培养基，在27℃缓慢冷却，在形成于直径9cm的培养皿上的集落之上以复层的形式固化。

处理后，在27℃孵化培养皿，由此按照NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶活性的大小，在琼脂培养基上在一面上缓慢地展开的氧化型DCIP的蓝色，只有集落的周围开始变得透明。此时，将很快地变得透明的地方的集落转移到新的培养基中传代，能够取得NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶活性高的菌株。

另外，对在此得到的生产青蟹肌糖用微生物进一步实施诱变处理，以有氧呼吸能力为指标进行筛选，由此能够育种以氧为电子受体、具有将肌醇转化成青蟹肌糖的能力的菌株。在此，所谓有氧呼吸能力是指在低氧条件下很好地生长的能力，所谓低氧条件，是指例如氧浓度3％以下的条件。醋酸杆菌AB10253是绝对需氧菌，通过将在低氧条件下生长良好地的集落在新的培养基中传代，能够得到有氧呼吸能力高的菌株。

而且，上述的筛选方法也能够对天然的微生物进行筛选。即，本发明的另一个筛选方法，其特征在于，从含有微生物的天然试样之中分离微生物，以NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶活性为指标，从经分离的微生物中筛选。在此，所谓天然的含有微生物的试样，例如天然的土壤等。从天然试样之中分离微生物的方法，例如：将天然试样的悬浮液或其稀释液涂布在琼脂培养基上，使天然试样所含的微生物以独立的集落的形式在琼脂培养基中生长的方法等。从经分离的微生物之中筛选制备青蟹肌糖用微生物的方法，除了使培养基的pH为3-4、优选为3.5这一点之外，其他能适用与使用醋酸杆菌AB10253的情况同样的操作。

<2-4>青蟹肌糖的制备方法

本发明还涉及青蟹肌糖的制备方法，其特征在于，使NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶或该酶的高活性株(制备青蟹肌糖用微生物)与肌醇作用。

(i)利用NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶的青蟹肌糖的制备方法

本发明的“利用NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶的青蟹肌糖的制备方法”，其特征在于，在含有肌醇和电子受体的溶液中使NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶与肌醇作用，生成青蟹肌糖，从溶液中分离纯化生成的青蟹肌糖。在此，NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶可以使用由已经叙述的方法得到的该种酶。再者，本发明的酶只要具有由肌醇生成青蟹肌糖的活性即可，无论其纯化的程度如何。

在此，作为底物的肌醇在0.1％-20％、优选5％-10％的浓度下使用。本发明的反应所使用的酶液，可使用上述的粗酶液、或者高度纯化的酶液。反应时的pH优选保持在pH5.0，除了监测pH，并适时添加碱性溶液、或酸性溶液之外，还可以使用适当的缓冲液。作为缓冲液的例子，只要是在pH5.0附近具有缓冲能力的缓冲液即可，无其它的特别限定，优选使用磷酸缓冲液。

在使用该酶的制备方法中，需要向反应液中加入电子受容物。在此，作为电子受容物，除了氧化型DCIP以外，还可例举出PMS(吩嗪硫酸甲酯)、亚甲基蓝、Fe³⁺离子等。能够组合这些物质来使用，但优选使用氧化型DCIP。所加入的电子受容物的量，相对于肌醇1摩尔，需要1摩尔的量，可相对于相应的肌醇的摩尔数适时地加入电子受容物。随着反应进行这些电子受容物的浓度变高时，有时析出还原型电子受容物，但该情况下，可通过离心分离、或超滤等操作去除。本发明的反应根据电子受容物的溶解度有时是不均匀体系，故优选在搅拌下进行反应。

本发明的反应的反应温度，只要在酶不灭活的程度下作用即可，无其它特别限定，但优选在20℃-40℃下作用。反应时间优选是1-72小时，更优选是8-12小时。生成的青蟹肌糖例如可采用再结晶法等分离纯化。

(ii)利用微生物的青蟹肌糖的制备方法

本发明还涉及一种利用微生物的青蟹肌糖的制备方法，其特征在于，通过在含有肌醇的培养基中培养由上述筛选方法得到的制备青蟹肌糖用微生物，由肌醇生成青蟹肌糖，从培养基分离纯化生成的青蟹肌糖。

在此使用的液体培养基的组成，只要使微生物能用肌醇生成青蟹肌糖，就毫无特别的限制，例如可举出：除了将转化为青蟹肌糖的原料肌醇之外还含有碳源、氮源、有机营养源、无机盐类等的培养基。合成培养基·天然培养基都能使用。具体地，优选下述的培养基：添加0.1％-40％、更优选添加10％-30％的肌醇，作为碳源，含有甘油、蔗糖、麦芽糖或者淀粉，含量为0.1％-20％、更优选为0.3-5％，作为氮源，含有酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵或尿素等，含量为0.01％-5.0％、优选为0.5％-2.0％。

此外，根据需要在培养基中添加能够生成钠、钾、钙、镁、钴、锰、锌、铁、铜、钼、磷酸、硫酸等的离子的无机盐类是有效的。培养液中的氢离子浓度调至pH4-10、更优选调至pH5-9进行培养，如此即能够高效率地得到鲨肌醇。

培养条件也根据菌株或培养基的种类不同而不同，但培养温度优选为12-35℃，更优选为20-27℃，另外以液体培养基摇床振荡培养，或向液体培养基中吹入空气或氧气等需氧培养为好。培养期间，优选进行到在培养液中肌醇完全消失、且青蟹肌糖显示最大的积累量为好，通常为1-10天，优选为3-8天。

从培养液分离纯化目的物的方法，可应用通常的分离纯化水溶性中性物质的一般的方法。例如，从培养液去除菌体之后，通过用活性炭和离子交换树脂等处理培养液上清，可基本除掉青蟹肌糖以外的杂质。但是，因为强碱性阴离子交换树脂的OH^-型使青蟹肌糖发生化学变化，因此不使用为好。然后，通过使用再结晶等的方法，可分离目的物质。

以下例举分离纯化青蟹肌糖的具体方法。但是，分离纯化的方法不限定于这些方法。首先，出于去除不希望有的成分的目的，使积累了青蟹肌糖的培养液上清在填充有强酸性阳离子交换树脂、例如C-20(H⁺型)(住友化学制)的柱中通过，收集通过液，然后使去离子水在该柱中通过以洗涤，收集洗涤液，合并所得到的通过液和洗涤液。使所得的溶液在填充有弱碱性阴离子交换树脂、例如Duolite(注册商标)A368S(游离碱基型)的柱中通过，收集通过液，然后使去离子水在该柱中通过以洗涤，收集洗涤液，混合所得到的通过液和洗涤液，取得含有青蟹肌糖、几乎不含其它的杂质的水溶液。在浓缩该水溶液而得到的青蟹肌糖的浓稠溶液中加入适当量的乙醇，在室温或低温下放置一夜，就能够结晶析出纯的青蟹肌糖晶体。

<2-5>鲨肌醇的制备方法

本发明还涉及一种鲨肌醇的制备方法，其特征在于，使用NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶或该酶的高活性株，由肌醇生成青蟹肌糖，还原所得到的青蟹肌糖，从而得到鲨肌醇。

在该制备方法中，使用NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶或该酶的高活性株(制备青蟹肌糖用微生物)，由肌醇生成青蟹肌糖的步骤，可采用已述的方法进行。由该步骤得到的青蟹肌糖可以分离纯化而在还原步骤中使用，但也可以不分离纯化就在还原步骤中使用。使用制备青蟹肌糖用微生物生成青蟹肌糖时，在培养液中生成、积累青蟹肌糖之后，不分离青蟹肌糖，只分离菌体而得到的培养滤液也可以用于还原步骤。

作为能够在反应液体系中将青蟹肌糖还原成鲨肌醇的还原剂，无特别限定，例如举出氢化硼钠、氢化硼锂、氢化硼钾、氢化三甲氧基硼钠、氢氰化硼钠。当采用这些还原剂还原青蟹肌糖时，就生成鲨肌醇和肌醇。其生成比率根据反应温度、还原试剂的种类不同而不同，一般地得到鲨肌醇:肌醇＝约4:6的混合物。因此，需要从混合物分离纯化鲨肌醇。

从青蟹肌糖向鲨肌醇的还原，也可以使用后述的、本发明提供的新型鲨肌醇脱氢酶进行。

为了从还原反应液分离纯化鲨肌醇，可应用通常的分离纯化水溶性中性物质的一般的方法。例如，首先通过采用活性炭和离子交换树脂等处理反应液，得到含有鲨肌醇和肌醇、几乎不含其它的杂质的水溶液。为了从该水溶液只取得鲨肌醇，主要利用对于水的溶解度之差是有效的。即，浓缩上述的水溶液，使对于水的溶解度低的鲨肌醇以固体形式析出，取得鲨肌醇的方法。

另外，如后述，也可以采用这样的方法分离纯化鲨肌醇：在含有得到的鲨肌醇的溶液中加入硼酸、和NaCl，制备鲨肌醇硼酸复合体，将其滤选出后，利用酸使硼酸游离，再加入甲醇之类的有机溶剂，由此使鲨肌醇结晶化。

3.鲨肌醇脱氢酶及使用该酶的制备鲨肌醇的方法

本发明的另一方案涉及新型酶鲨肌醇脱氢酶、及使用该酶的制备鲨肌醇的方法

<鲨肌醇脱氢酶>

本发明的鲨肌醇脱氢酶，如下述反应式所示，催化鲨肌醇与青蟹肌糖间的氧化还原反应、在NADH或NADPH存在下将青蟹肌糖立体特异地还原成鲨肌醇。

[化6]

鲨肌醇脱氢酶只要是具有上述反应活性的酶，其来源无特别限定，但优选是来源于微生物，特别优选是大肠杆菌(Escherichia coli)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、黄单胞菌属(Xanthomonas)等。进一步地，特别优选是大肠杆菌K-12ATCC10798(Escherichia coli K-12ATCC10798)、醋酸杆菌AB10281FERM BP-10119(Acetobactersp.AB10281 FERM BP-10119)、枯草芽孢杆菌168 ATCC23857(Bacillus subtilis 168 ATCC23857)、根癌土壤杆菌C58 ATCC33970(Agrobacterium tumefacience C58 ATCC33970)、土壤杆菌AB10121FERM P-17383(Agrobacterium sp.AB10121 FERM P-17383)、野油菜黄单胞菌野油菜致病变种ATCC33913(Xanthomonascampestris pv.campestris ATCC33913)。

本发明的鲨肌醇脱氢酶包含具有下述的理化性质的鲨肌醇脱氢酶。

反应：如下述反应式所示，催化鲨肌醇与青蟹肌糖间的氧化还原反应、在NADH或NADPH存在下将青蟹肌糖立体特异地还原成鲨肌醇。

[化7]

鲨肌醇脱氢酶活性的测定方法，测定还原活性的方法和测定氧化活性的方法任何一个测定方法都能够测定，但氧化活性的测定取决于来源于共存的肌醇2-脱氢酶的活性，精度低，氧化活性自身微弱，因此优选测定还原活性。

还原活性的测定，通过将青蟹肌糖作为底物，使NADH或NADPH共存，测定NADH或NADPH的340nm的吸收的减少，由此确定。另外，用HPLC、GLC等分析装置分析反应后的溶液，也能判断产物(是鲨肌醇还是肌醇)。

本发明的鲨肌醇脱氢酶优选进一步具有下述的理化性质。

分子量及缔合特性：38-46k道尔顿，形成2聚体或3聚体。

分子量，能够由SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)等的结果、或由DNA的全长算出酶的推定分子量。另外，缔合特性，测定用凝胶过滤柱(2000SW_XL；Tosoh公司制)分馏的组分的活性，由相应的分子量组分计算分子量，将计算出的分子量除以酶的分子量得到的值取整数，由此而能够求出。

另外，本发明的鲨肌醇脱氢酶，优选进一步具有下述的理化性质。

辅酶：将NAD⁺或NADP⁺或者NADH或NADPH作为辅酶。

辅酶的选择性，可利用这样的方法确认：混合5μl反应液(200mMTris缓冲液pH8.0、2％ NADPH或NADH、1％青蟹肌糖)、和5μl酶液，在36℃反应30min后，立即加入500μl的水，测定340nm的吸光度，测定用水代替酶液的试验液的空白值在340nm的吸光度的减少量。用％表示的值是表示质量/体积(W/V)的百分率的，用％表示浓度时也同样。

另外，利用上述测定法也能够确认辅酶相对活性。利用该辅酶相对活性，本发明的酶可分成若干组，分别为具有NADPH:NADH的比率为100:1～100:10的组、100:10～100:30的组、100:30～100:60的组、100:60～100:120的组等。

另外，本发明的鲨肌醇脱氢酶，优选进一步具有下述的理化性质。

活化重金属：在Co²⁺离子的存在下被活化。或者也可有在Mn²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺离子的存在下被活化的情况。

抑制重金属：在Sn²⁺离子的存在下被抑制。或者也可有在Zn²⁺离子的存在下被抑制的情况。

由该重金属带来的效果，可利用这样的方法确认：混合5μl反应液(200mM Tris缓冲液pH8.0、2％ NADPH、1％青蟹肌糖、2mM金属盐)、和5μl酶液，在36℃反应30min后，立即加入500μl的水，测定340nm的吸光度，测定用水代替酶液的试验液的空白值在340nm的吸光度的减少量。所谓“活化的”意指：在将未添加重金属区的酶活性记为100％时，1mM重金属添加区的酶活性显示105％以上、优选显示120％以上。另一方面，所谓“被抑制”意指：在将未添加重金属区的酶活性记为100％时，1mM重金属添加区的酶活性变为95％以下，优选变为70％以下。

另外，本发明的鲨肌醇脱氢酶，优选进一步具有下述的理化性质。

最适pH：本发明的酶在pH5-9具有活性。

可利用这样的方法确认最适pH：混合5μl反应液(200mM磷酸缓冲液pH5.0-9.0、2％ NADPH、1％青蟹肌糖)、和5μl酶液，在36℃反应30min后，立即加入500μl的水，测定340nm的吸光度，测定用水代替酶液的试验液的空白值在340nm的吸光度的减少量。所谓最适pH意指：具有最大活性的90％以上的活性。本发明的酶，例如根据最适pH的范围也可分成在酸性区有最适pH的组(最适pH为pH5.5-6.5)、在中性区有最适pH的组(最适pH为pH6.5-7.5或pH6.5-8.5)、在碱性区有最适pH的组(最适pH为pH7.0-8.5或pH7.5-9.0)。

另外，本发明的鲨肌醇脱氢酶，优选进一步具有下述的理化性质。

热稳定性：本发明的鲨肌醇脱氢酶在高达60℃时稳定。

热稳定性可利用这样的方法确认：将酶液在所规定的温度处理10min之后，冷却，混合该酶液和反应液(200mM磷酸缓冲液pH5.0-9.0、2％ NADPH、1％青蟹肌糖)5μl，在36℃反应30min后，立即加入500μl的水，测定340nm的吸光度，测定用水代替酶液的试验液的空白值在340nm的吸光度的减少量。所谓“为热稳定”意指：将20℃10min处理区的活性记为100％，上述热处理过的酶的活性残存90％以上。

另外，本发明的鲨肌醇脱氢酶，优选进一步具有下述的理化性质。

相对于青蟹肌糖的Km值：相对于青蟹肌糖的Km值显示2-13mM。

相对于青蟹肌糖的Km值可利用这样的方法确认：混合反应液(200mM Tris缓冲液pH8.0、2％ NADPH、0.001-2.5％青蟹肌糖)5μl、和5μl酶液，在36℃反应30min后，立即加入500μl的水，测定340nm的吸光度，测定用水代替酶液的试验液的空白值在340nm的吸光度的减少量。测定值按照常规方法倒数作图，算出Km值。本发明的酶，例如也能够分成相对于青蟹肌糖的Km值小于4mM的组、4mM以上小于10mM的组、10mM以上小于13mM的组。

另外，本发明的鲨肌醇脱氢酶，优选进一步具有下述的理化性质。

底物特异性：相对活性为70％以上的底物，可例举出鲨肌醇(SI)、肌醇(MI)、D-chiro-肌醇(DCI)、epi-肌醇(EI)、L-chiro-肌醇(LCI)。相对活性为20％以上小于70％的底物，可例举出L-chiro-肌醇(LCI)、epi-肌醇(EI)、muco-肌醇(MuI)、肌醇(MI)、D-chiro-肌醇(DCI)、allo-肌醇(AI)、neo-肌醇(NI)。相对活性小于20％的底物，可例举出allo-肌醇(AI)、neo-肌醇(NI)、D-chiro-肌醇(DCI)、L-chiro-肌醇(LCI)、epi-肌醇(EI)、muco-肌醇(MuI)。

底物特异性，通过以氧化活性为指标，测定相对于对肌醇的反应性的相对活性而确认。作为肌醇异构体，可例举出鲨肌醇(SI)、肌醇(MI)、D-chiro-肌醇(DCI)、L-chiro-肌醇(LCI)、epi-肌醇(EI)、muco-肌醇(MuI)、allo-肌醇(AI)、neo-肌醇(NI)等。本发明的鲨肌醇脱氢酶的底物特异性，能够分为相对活性为70％以上的区、小于70％但为20％以上的区、小于20％的区。

作为测定方法，能够通过下述方法而测定：混合50μl的反应液(200mM Tris缓冲液pH8.0，包含1％的各种肌醇异构体(只有neo-肌醇为0.4％)、、0.002％ NADP⁺、0.002％黄递酶、0.01％硝基四唑鎓蓝)、和50μl酶液，在25℃每隔3min用微量培养板读出装置测定545nm的吸光度的增加。

这些理化性质，优选具有理化性质的任意的组合。

<鲨肌醇脱氢酶的制备及纯化>

作为能够用于制备鲨肌醇脱氢酶的微生物，只要具有产生该酶的能力即可，无其它特别限定，例如可例举出大肠杆菌K-12ATCC10798(Escherichia coli K-12 ATCC10798)(以下也叫做大肠杆菌K-12)、醋酸杆菌AB10281FERM BP-10119(Acetobacter sp.AB10281 FERMBP-10119)(以下也叫做AB10281)、枯草芽孢杆菌168 ATCC23857(Bacillussubtilis 168 ATCC23857)(以下也叫做Bacillus sub.16株、B.sub.168)、根癌土壤杆菌C58 ATCC33970(Agrobacteriumtumefacience C58 ATCC33970)(以下也叫做A.tume.C58)、土壤杆菌AB10121FERM P-17383(Agrobacterium sp.AB10121 FERM P-17383)(以下也叫做AB10121)、野油菜黄单胞菌野油菜致病变种ATCC33913(Xanthomonas campestris pv.campestris ATCC33913)(以下也叫做X.camp.)。

出于制备鲨肌醇脱氢酶的目的，为培养这些微生物所使用的培养基，可使用已知的一般的微生物用培养基。例如培养醋酸杆菌AB10281FERM BP-10119、枯草芽孢杆菌168 ATCC23857、根癌土壤杆菌C58 ATCC33970、土壤杆菌AB10121FERM P-17383、野油菜黄单胞菌野油菜致病变种ATCC33913时的培养基组成，只要达到目的即可无特别的限制，只要是除了含有向鲨肌醇转化的原料肌醇以外还含有碳源、氮源、有机营养源、无机盐类等的培养基即可，合成培养基·天然培养基都能使用。肌醇优选添加0.1％-40％，更优选添加10％-30％，作为碳源，添加甘油、蔗糖、麦芽糖或者淀粉，添加量优选为0.1％-20％、更优选为0.3-5％，作为氮源，添加酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵或尿素等，添加量为0.01％-5.0％、优选为0.5％-2.0％。此外，还能够根据需要在培养基中添加能够生成钠、钾、钙、镁、钴、锰、锌、铁、铜、钼、磷酸、硫酸等的离子的无机盐类。培养液中的氢离子浓度不需要特别地制备，但优选调至pH4-10、更优选调至pH5-9而培养，如此即能够高效率地得到含有鲨肌醇脱氢酶的菌体。

培养条件也根据培养基的种类不同而不同，但培养温度为12-38℃，优选为20-27℃，另外，培养只要是如液体培养基摇床振荡，或向液体培养基中吹入空气或氧气等需氧性地进行即可。培养期间，只要进行到鲨肌醇脱氢酶显示最大或者必要量的活性量即可，通常为1-10天，优选为3-8天。

另一方面，培养大肠杆菌K-12ATCC10798时的培养基组成也只要达到目的即可，无特别的限制，只要是含有碳源、氮源、有机营养源、无机盐类等的培养基，合成培养基·天然培养基均可使用。例如可例举出LB培养基、TB培养基和YT培养基等。而且，作为使大肠杆菌K-12ATCC10798的鲨肌醇脱氢酶的比活性增加约3倍的物质，优选在培养基中添加0.05-1％、优选0.5％的山梨糖。培养条件也根据培养基的种类不同而不同，但培养温度为28-38℃，优选为36℃，另外，培养只要以液体培养基摇床振荡培养，或向液体培养基中吹入空气或氧气等需氧性地进行即可。培养期间，只要进行到鲨肌醇脱氢酶显示最大或者必要量的活性量即可，通常为1-3天，优选为1天。

由如此培养的菌体分离纯化酶，能够得到鲨肌醇脱氢酶。酶的分离纯化可与通常的蛋白质纯化方法同样地进行。以下具体地说明，但分离纯化方法不限定于这些方法。

首先，为了收集在培养后得到的菌体，可使用离心分离、和膜浓集等的方法。如果必要，则在该阶段在适当的溶液中悬浮菌体，再度采用离心分离和膜浓集等的方法收集菌体，由此进行洗涤。所得的菌体接着采用自动磨机、和超声波等的物理方法破碎，能够提取存在于菌体内的本发明酶。

含有经破碎的菌体的菌体裂解液，采用离心分离和膜浓集等的方法分成可溶物和不溶物。然后，为了从可溶物分离该酶，可按照一般的酶纯化的顺序纯化。即，除了Blue-Toyopearl(Tosoh公司制)等的亲和层析柱、由DEAE柱、CM柱为代表的离子交换柱、凝胶过滤柱、羟基磷灰石柱等的柱操作以外，还能够使用硫酸铵分馏法、等电点沉淀法等的分批式的操作法。

鲨肌醇脱氢酶活性的测定方法，可应用测定还原活性的方法和测定氧化活性的方法中的任意一种，但氧化活性的测定取决于来源于共存的肌醇2-脱氢酶的活性，精度低，氧化活性自身微弱，因此优选测定还原活性。还原活性的测定，通过将青蟹肌糖作为底物，使NADH或NADPH共存，测定NADH或NADPH的340nm的吸收的减少，由此进行。另外，用HPLC、GLC等分析装置分析反应后的溶液，也能判断产物(是鲨肌醇还是肌醇)。

所纯化的酶，可通过采用了Native-PAGE或SDS(十二烷基硫酸钠)PAGE等的电泳确认其纯化度，此外，能够将相应的蛋白质通过转移印迹至PVDF膜等的蛋白质吸附性膜上进行进一步地纯化。

作为本发明的鲨肌醇脱氢酶，具体地可例举出下述(a)或(b)的蛋白质。

(a)由在SEQ.ID.NO：2、4、6、8、10、12、14或28所示的氨基酸序列构成的蛋白质；

(b)在SEQ.ID.NO：2、4、6、8、10、12、14或28所示的氨基酸序列中，有1个或多个氨基酸发生取代、缺失、插入、和/或附加的氨基酸序列，并具有催化鲨肌醇与青蟹肌糖间的氧化还原反应、在NADH或NADPH存在下将青蟹肌糖立体特异地还原成鲨肌醇的酶活性的蛋白质。

在其中，具有SEQ.ID.NO：28的氨基酸序列的鲨肌醇脱氢酶是由本发明提供的新的蛋白质。

所谓上述“有1个或多个氨基酸发生取代、缺失、插入、和/或附加的氨基酸序列，并具有催化鲨肌醇与青蟹肌糖间的氧化还原反应、在NADH或NADPH存在下将青蟹肌糖立体特异地还原成鲨肌醇的酶活性的蛋白质”，表示所述的蛋白质可以具有1个或多个氨基酸残基的取代、缺失、插入、和/或附加，但实质上不损害其催化鲨肌醇与青蟹肌糖间的氧化还原反应、在NADH或NADPH存在下将青蟹肌糖立体特异地还原成鲨肌醇的酶活性。

即，天然存在的蛋白质在纯化过程中或纯化之后，可以由于多态性或编码该蛋白质的DNA的变异，或者细胞内的修饰反应等而发生变异，例如，氨基酸序列中的取代、缺失、插入、和/或附加等，但尽管如此，已知一些发生变异的天然存在的蛋白质，仍显示出与未发生变异的蛋白质实质上等同的生理、生物学活性。如上所述，即使在结构上有少许差异，但其功能未表现出大的不同的蛋白质也包含在本发明的蛋白质中。人为地向蛋白质的氨基酸序列中引入了上述的变异时也同样，在该情况下，能进一步制备多种多样的变异体。另外已知，某些蛋白质具有对其活性而言非必需的肽区域。例如，分泌到细胞外的蛋白质中存在的信号肽、以及在蛋白酶的前体等中存在的脯氨酸序列等肽区域，这些区域的大部分在翻译后或在向活性型蛋白质转化过程中被去除。这些在原生构造上以不同的形式存在，但是最终形成具有同等的功能的蛋白质均包括在本发明的鲨肌醇脱氢酶范围内。

本说明书中的“多个氨基酸”，表示在不丧失本发明酶的活性范围内发生变异的氨基酸数量，例如对于400氨基酸残基组成的多肽的情况，表示2-20左右、优选2-10、更优选2-3个氨基酸。另外，表示与本发明蛋白质的同源性达到80％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上、特别优选98％以上的蛋白质均包括在本发明的鲨肌醇脱氢酶范围内。

作为本发明的鲨肌醇脱氢酶，还可例举出由下述DNA编码的酶。

(a)包含SEQ.ID.NO：1、3、5、7、9、11、13或27所示的碱基序列的编码区的DNA；

(b)与具有在SEQ.ID.NO：1、3、5、7、9、11、13或27所示的碱基序列、或与该碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格条件下杂交，并编码具有催化鲨肌醇与青蟹肌糖间的氧化还原反应、在NADH或NADPH存在下将青蟹肌糖立体特异地还原成鲨肌醇的酶活性的蛋白质的DNA。

在其中，具有SEQ.ID.NO：27的碱基序列的DNA，是编码本发明的新型的鲨肌醇脱氢酶的DNA。

这里所说的“严格条件下”，是指形成所谓的特异性杂交、不形成非特异性杂交的条件(参照Sambrook，J.et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)等)。作为“严格条件下”，具体举出下述条件：在含有50％甲酰胺、4×SSC、50mM HEPES(pH7.0)、10×Denhardt溶液、100μg/ml鲑鱼精子DNA的溶液中，在42℃进行杂交，接着在室温下用2×SSC、0.1％ SDS溶液洗涤，和在50℃下用0.1×SSC、0.1％SDS溶液洗涤。换句话说，可例举出：具有优选80％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上、特别优选98％以上的同源性的DNA特异地杂交的条件。即，与SEQ.ID.NO：1、3、5、7、9、11、13或27所示的碱基序列的同源性为优选80％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上、特别优选98％以上的DNA，包括在编码本发明的鲨肌醇脱氢酶的DNA中。

<使用鲨肌醇脱氢酶的制备鲨肌醇的方法>

本发明进一步涉及一种制备鲨肌醇的方法，其特征在于，在使鲨肌醇脱氢酶、和肌醇2-脱氢酶共存的溶液中，在NADH或NADPH存在下(参照图1)，将廉价的肌醇作为底物，经由青蟹肌糖，使之发生酶转化反应成为鲨肌醇。

在该制备方法中使用的鲨肌醇脱氢酶，可以是通过纯化上述的酶而制备的酶，还可以是通过对编码鲨肌醇脱氢酶的DNA进行遗传操作而制备的重组酶。

编码鲨肌醇脱氢酶的DNA，可通过如下方式获得，例如以从微生物提取的全基因组作为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增具有SEQ.ID.NO：1、3、5、7、9、11、13或27等的碱基序列的DNA。

另外，编码鲨肌醇脱氢酶的DNA，也可通过分离由其同源性检索的而得到的同源DNA。在此，被称为ydgJ基因的一系列的同源性高的基因为编码鲨肌醇脱氢酶的DNA。

将所得的DNA导入到质粒载体中。所使用的质粒，优选使用具有多克隆位点的表达质粒载体，能表达酶、且具有适当的限制酶位点的其他的质粒载体也可使用。通过预先在片段的末端设定好合适的限制酶位点，将其与位于质粒载体上的相同的限制酶位点连接，由此能够构建质粒。

另外，为了表达导入到质粒中的DNA所使用的启动子，只要使DNA在宿主微生物中表达即可，无其它特别限定。例如可使用lac启动子、tac启动子等。

这样制备的重组质粒载体能够引入到宿主微生物中。所使用的宿主微生物，只要可以使重组质粒载体稳定、且自主地增殖即可，无其它特别限制，优选使用通常的基因重组用的微生物、例如属于埃希氏杆菌属、芽孢杆菌属的微生物等，更优选使用大肠杆菌。

向宿主微生物中引入重组质粒载体的方法，例如，在宿主微生物为属于埃希氏杆菌属的微生物时，既可以在钙离子的存在下引入重组DNA，也可以使用感受态细胞法引入，另外，对于属于芽孢杆菌属的微生物，可使用感受态细胞法、原生质体法、电穿孔法、或显微注射法。对于重组DNA是否已导入到宿主微生物中的选择可以如下进行，在基于构成重组质粒载体的载体的耐药性标记的选择培养基中，培养该宿主微生物，选择生长的宿主微生物即可。

其次，用于表达和诱导酶的培养基，只要是宿主微生物稳定地增殖的培养基即可，无其它特别限定。例如可例举出营养肉汤(NutrientBroth)、L-Broth等。另外，根据质粒载体的种类不同，既可以在培养基中加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)之类的使DNA表达的诱导物，也可以在培养过程中加入诱导物。

培养引入了具有上述DNA的重组质粒载体的宿主微生物，使之表达本发明的DNA。离心分离表达本发明酶的微生物，去除培养基，再用水洗涤成片的微生物后，再进行离心分离，可得到经洗涤的菌体。使该洗涤菌体悬浮在水、或适当的溶液中，利用超声波破碎菌体。破碎后离心分离，能够得到含有来源于在上清液中的本发明DNA的重组酶的溶液。

表达重组酶的菌体，也能够在洗涤后，原样地加入到反应溶液中，制成菌体悬浮液使之反应，但优选使用将菌体破碎并提取了存在于菌体内的酶的溶液。另外，也可以纯化该提取液备用。对于纯化，可通过硫酸铵分级分离处理、或者吸附于离子交换树脂上后利用盐浓度的线性浓度梯度的柱色谱、温度处理等来纯化。而且，本发明酶也可作为固定化酶或固定化菌体使用。作为固定化法，可适用凝胶包埋法、离子交换树脂吸附法等常用的固定化方法。

另一方面，在该方法中使用的肌醇2-脱氢酶，优选使用在NAD⁺或NADP⁺存在下氧化肌醇生成青蟹肌糖的酶。

在该制备方法中，可使用已知的NAD⁺或NADP⁺依赖型肌醇2-脱氢酶。例如，可以使用市售的酶、从枯草芽孢杆菌、Bacillus halodurans等培养菌体纯化而制备的酶、对于基因序列已知的，可通过基因操作而使之表达的重组酶。

作为已知的肌醇2-脱氢酶的氨基酸序列，例如在NCBI(NationalCenter for Biotechnology Information)的蛋白质数据库中以登记号2636516、17982589、23464076、10174936、17742455、50120397、28853468、或者13422633登记的，编码这些氨基酸序列的碱基序列信息也可通过参照上述登记号的CDS而得到。

表达重组酶的菌体也能够在洗涤后，原样地加入到反应溶液中，制成菌体悬浮液使之反应，但优选使用将菌体破碎并提取了存在于菌体内的酶的溶液。另外，也可以纯化该提取液备用。作为纯化，可通过硫酸铵分级分离、或者吸附于离子交换树脂上后利用盐浓度的线性浓度梯度柱色谱、温度处理等来纯化。而且，本发明酶也能作为固定化酶或固定化菌体使用。作为固定化法，可适用凝胶包埋法、离子交换树脂吸附法等常用的固定化方法。

使用重组酶时，也可以通过基因操作，使肌醇2-脱氢酶和本发明酶同时表达，也可以使用如此表达所制备的酶液等。

在本反应体系中的肌醇2-脱氢酶、和鲨肌醇脱氢酶的活性量(U)的比率用单位数定义在36℃下底物为青蟹肌糖时，将在1min期间消耗1μmol的NADH或NADPH作为1U时，两者的活性量(U)的比率希望达到1:10～10:1、优选1:2～2:1。

在本反应体系中，需要辅酶NAD⁺或NADP⁺，在反应液中，因为转化成NADH或NADPH，并且NADH或NADPH再转换成NAD⁺或NADP⁺，可知辅酶可以被再利用。NAD⁺或NADP⁺和NADH或NADPH在溶液中的pH稳定性不同，NAD⁺或NADP⁺在pH8.0以下稳定，NADH或NADPH在pH8.0以上稳定。因此，本反应体系中的pH优选保持在约pH8.0。

在该酶反应中使用的辅酶，能够以NAD⁺、NADH、NADP⁺、NADPH的任1个、或者它们的混合物的形式利用。但考虑到稳定性，希望使用NAD⁺或NADP⁺，其浓度，希望添加0.0001-0.1％，优选添加0.004-0.01％。

而且，通过将本反应体系的中间体青蟹肌糖添加到反应溶液中，本反应的反应速度显著增大。因此，优选在反应溶液中添加青蟹肌糖并使之达到0.01-3％、优选达到0.2-0.5％。

另外，肌醇2-脱氢酶和鲨肌醇脱氢酶在pH8.0下能够反应，因此，酶反应的溶液的pH调至pH6.0-8.5的范围以使酶反应，但考虑NAD⁺或NADP⁺的稳定性、青蟹肌糖的稳定性，优选为pH7.7-8.3，进一步优选为pH8.0。另外，在反应中，为了在反应中保持该pH，需要时也可加入缓冲液。加入的缓冲液的种类无特别限定，但优选为在pH8.0附近有缓冲能力的缓冲液，进一步优选可例举出磷酸缓冲液、Tris缓冲液等。

进一步地，肌醇2-脱氢酶由Mg²⁺离子活化，鲨肌醇脱氢酶由Co²⁺离子活化，因此通过添加这些金属离子，反应速度增大。因此，希望向反应溶液中添加Co盐和/或Mg盐并使之达到0.01-5.0mM、优选达到0.2-2.0mM。所使用的Co盐、Mg盐只要是溶解于水的盐即可，可例举出盐酸盐、硫酸盐等。

在本发明中使用的底物肌醇在反应溶液中的浓度，优选为1-30％，优选为5-22％。当反应进行时，超过1.6％的过饱和的鲨肌醇以晶体形式析出，使肌醇减少。为此，也可向反应溶液中再添加减少了的肌醇量，将肌醇浓度维持为一定，连续地进行反应。

反应温度，只要使反应进行即可，无特别限定，但考虑底物的溶解度、NAD⁺或NADP⁺的稳定性、酶的耐热性，希望在20-50℃、优选35-40℃下使之反应。如果是悬浮菌体的方法，则因为是不均匀反应，故需要搅拌，但使用提取酶时，因为是均匀溶液，因此不需要搅拌，但为了将温度均匀化，优选进行搅拌。

酶反应过程中，如果反应物鲨肌醇达到溶解度以上，则能够使之以结晶性鲨肌醇形式沉淀，因此如果使用过滤、倾滤等固液分离法，则不需要使反应停止，能够在过滤液等的溶液中再度添加肌醇而继续反应。

需要停止酶反应时，只要酶反应自身被停止即可，可使用加热、改变pH、添加蛋白质变性剂等的方法。可是，考虑下道步骤鲨肌醇的纯化，优选采用加热。例如可例举出：在70-120℃、优选80-90℃下将反应溶液加热10-20min，等等。

另外，可通过将酶分离出来使反应停止。通过使反应溶液在离子交换树脂柱中通过将酶分离出来。使用固定化的酶时，通过将反应溶液离心分离、或者过滤操作，能够回收固定化酶。

在反应停止后、或反应中达到过饱和的鲨肌醇以晶体形式析出。结晶性鲨肌醇可采用过滤、或离心分离等的操作分离。而且，与菌体、不溶性变性蛋白质共存时，加入水溶解结晶性鲨肌醇后，通过施加过滤、或离心分离等的操作，能够去除菌体、不溶性变性蛋白质。

所得的结晶性鲨肌醇的纯化方法可如以下所示地进行。在该阶段需注意的是是结晶性鲨肌醇中所含的neo-肌醇。neo-肌醇是：一部分的肌醇的5位被鲨肌醇脱氢酶氧化而产生的neo-青蟹肌糖，被肌醇2-脱氢酶还原而产生的物质，是在本反应体系中微量地产生的物质。另外，neo-肌醇的水溶解度低达0.5％，是易于与鲨肌醇一起引起结晶性的沉淀的物质。

可是，将该结晶性鲨肌醇再度溶解于水而得到的鲨肌醇溶液，几乎不含肌醇，通过采用过滤或离心分离等的操作分离在再浓缩时产生的结晶性鲨肌醇的操作，能够得到含有微量的neo-肌醇的鲨肌醇。另外，更高度地纯化时，使之通过脱盐柱、活性炭柱而纯化后，采用过滤或离心分离等的操作分离通过浓缩液体而再度结晶化的再结晶鲨肌醇，由此能得到不含有neo-肌醇的纯品鲨肌醇。

脱盐柱优选为使用离子交换树脂柱。所使用的离子交换树脂可以是强碱性离子交换树脂和弱碱性离子交换树脂中的任意一个、或两者的混合物，或者强酸性离子交换树脂和弱酸性离子交换树脂的任1个、或两者的混合物。离子交换树脂的作用方法，使溶液在柱状地装满的离子交换树脂中通过的方法为最佳，但也可采用间歇式搅拌混合，通过过滤来脱盐。

活性炭柱以脱色为目的，也可使用使溶液在柱状地装满的活性炭中通过的方法，但也可采用间歇式搅拌混合，通过过滤来脱色。

其次，在酶反应停止后，在反应溶液中溶解的溶解性鲨肌醇的纯化方法可如以下所示进行。在该阶段需注意的是，与结晶性鲨肌醇的情况不同，是肌醇、和neo-肌醇的去除。

溶解性鲨肌醇与原料肌醇、和neo-肌醇一起溶解，可采用过滤或离心分离等的操作获得溶液。该溶液还含有溶解性肽、盐，因此可使之通过脱盐柱、活性炭柱而纯化后，浓缩至肌醇不析出的程度(避免使肌醇达到21％以上)，采用过滤或离心分离等的操作分离析出的结晶性鲨肌醇。如果需要，则也能够加入水溶性的有机溶剂，使之结晶化。作为有机溶剂，可例举出甲醇、乙醇、丙醇等。

另外，如后述，也可以采用这样的方法分离纯化鲨肌醇：向含有得到的鲨肌醇的溶液中加入硼酸和NaCl，制备鲨肌醇硼酸复合体，将其过滤出后，用酸使硼酸游离，通过加入甲醇之类的有机溶剂使鲨肌醇结晶化。

4.由含有鲨肌醇及鲨肌醇以外的中性糖的混合液制备鲨肌醇的方法

本发明进一步涉及由含有鲨肌醇及鲨肌醇以外的中性糖的混合液制备鲨肌醇的方法。

<4-1>

作为本发明的一个实施方案的制备纯化的鲨肌醇的方法包括：在含有鲨肌醇及鲨肌醇以外的中性糖的混合液中，加入在该溶解于混合液中的鲨肌醇的2倍摩尔以上的量的硼酸和金属盐，且将该混合液的pH调至8.0-11.0，形成鲨肌醇·硼酸复合体的第1步骤；从混合液分离上述复合体的第2步骤；使经分离的复合体溶解于酸中，从而使之分解为鲨肌醇和硼酸的第3步骤；从在第3步骤中得到的酸性溶液或酸性悬浮液分离纯化鲨肌醇的第4步骤。

该制备方法的第1步骤，是在含有鲨肌醇及鲨肌醇以外的中性糖的混合液中，加入溶解于该混合液中的鲨肌醇的2倍摩尔以上的量的硼酸和金属盐，且将该混合液的pH调至8.0-11.0，形成鲨肌醇·硼酸复合体的步骤。

在此使用的“含有鲨肌醇及鲨肌醇以外的中性糖的混合液”，可以是溶液也可以是悬浮液。而且，可以是含有“鲨肌醇及鲨肌醇以外的中性糖”以外的物质的混合液，还可以是预先含有少量的鲨肌醇·硼酸复合体的混合液。作为混合液中所含的中性糖，优选四碳糖、五碳糖、六碳糖、七碳糖之类的中性糖，例如可例举出葡萄糖、果糖、半乳糖等的醛糖、酮糖、肌醇的各种异构体、以及甘油、乙二醇等的多元醇类。在此，作为肌醇的异构体，例如可举出肌醇、D-chiro-肌醇、L-chiro-肌醇、epi-肌醇、muco-肌醇、a1lo-肌醇、cis-肌醇、neo-肌醇。

这些异构体之中，可特别优选使用肌醇，作为该情况下的“含有鲨肌醇及鲨肌醇以外的中性糖的混合液”，例如可举出；如以下所示那样在还原青蟹肌糖时产生的、含有鲨肌醇和肌醇的混合液。

用于还原反应的青蟹肌糖，例如可使用：通过在培养基或溶液中利用微生物氧化肌醇而得到的青蟹肌糖(特开2003-102492号公报)。由微生物氧化而得到的青蟹肌糖在纯化之后可以溶解使用，但也可以使用培养滤液。另外，也能使用用铂催化剂氧化肌醇而制备的青蟹肌糖。

为将青蟹肌糖还原成鲨肌醇所使用的还原剂，只要是能够在水系中将青蟹肌糖还原成鲨肌醇的还原剂即可，无其它特别限定，例如可例举出氢化硼钠、氢化硼锂、氢化硼钾、氢化三甲氧基硼钠、氢氰化硼钠。

青蟹肌糖的还原反应，例如可通过在以20％(w/v)以下的含量溶解青蟹肌糖的溶液中以粉末或溶液的形式添加还原剂而进行。此时优选搅拌溶液。另外，有时因为还原反应而产生反应热，但为了抑制生成的青蟹肌糖分解，希望将反应液控制成为50℃以下。而且，在使用氢化硼钠等还原剂时，有时还原剂的一部分分解产生氢气，但为了抑制氢气的起泡，优选添加消泡剂等。

在由青蟹肌糖的还原而得到的鲨肌醇与肌醇的混合液中，当鲨肌醇的浓度超过约1.6％(w/v)时，就缓慢地开始结晶化。通常通过还原5％(w/v)的青蟹肌糖水溶液，产生约3％(w/v)肌醇、及约2％(w/v)鲨肌醇，但在室温下放置数小时时，鲨肌醇的过饱和部分的约0.4％(w/v)开始结晶化。为此，使用由青蟹肌糖的还原而得到的鲨肌醇与肌醇的混合液时，在产生该鲨肌醇自身的晶体之前进行形成鲨肌醇·硼酸复合体的步骤为好。更优选在青蟹肌糖的还原反应后马上进行形成鲨肌醇·硼酸复合体的步骤。

在第1步骤中，在上述的“含有鲨肌醇和肌醇的混合液”等的“含有鲨肌醇及鲨肌醇以外的中性糖的混合液”中，分别以在混合液中溶解的鲨肌醇的2倍摩尔以上、优选2倍摩尔以上且3倍摩尔以下的量加入硼酸和金属盐，使其溶解后，将混合液的pH调至pH8.0-11.0、优选pH9.0-10.0的碱性。在此，所谓2倍摩尔是指2倍的摩尔数。反应液的pH可采用NaOH、KOH、Na₂CO₃、K₂CO₃等碱来调整。

在此，添加的金属盐，例如可使用：选自NaCl、NaHCO₃、Na₂CO₃、Na₂SO₄、NaHSO₄、NaH₂PO₄、Na₂HPO₄、Na₃PO₄、硼砂、KCl、KHCO₃、K₂CO₃、K₂SO₄、KHSO₄、KH₂PO₄、K₂HPO₄、K₃PO₄、MgCl₂、MgCO₃、及MgSO₄的1种或2种以上的金属盐。另外，添加的硼酸量，在混合液中已经含有硼酸时，与其量合计达到溶解鲨肌醇的量的2倍以上的摩尔数、优选2倍以上且3倍以下的摩尔数。

第1步骤为了使硼酸或金属盐在混合液中高效率地溶解，以及，为了在调整pH时使溶液均一，优选边搅拌边进行。该步骤希望在5℃-85℃、优选15-40℃的范围的温度下进行。该步骤所需要的时间，只要得到必要量的鲨肌醇·硼酸复合体即可，无其它特别限定，但为了得到90％以上的回收率，优选12-76小时。

用NMR确认了鲨肌醇·硼酸复合体对水的溶解度为0.01％(w/v)以下，因此在混合液中大部分以沉淀形式存在。在第2步骤中，从混合液分离该鲨肌醇·硼酸复合体。在该步骤中，可适用通常的固液分离操作，例如可适用过滤操作、离心分离操作等。在通过该步骤分离了鲨肌醇·硼酸复合体之后的混合液中残留的鲨肌醇为0.2％(w/v)以下的浓度，因此能够以鲨肌醇·硼酸复合体的形式回收在反应开始前的混合液中含有的鲨肌醇的大部分。另一方面，肌醇等的中性糖在溶液中以溶解状态存在，因此在过滤操作中存在于液体中，能够通过该步骤分离中性糖和鲨肌醇。

所经分离的鲨肌醇·硼酸复合体，使之干燥，能够作为粉末而分离。另外，如果需要，也可通过从热水再结晶，从而以晶体形式分离。

接着，在第3步骤中，将经分离的鲨肌醇·硼酸复合体溶解于酸中。通过该溶解，鲨肌醇·硼酸复合体分裂成为鲨肌醇和硼酸，而且在复合体中一直结合着的金属离子也离解到溶液中。作为在该步骤用于溶解的酸的种类，只要能够溶解复合体即可，无其它特别限定，但根据金属离子的种类优选为不形成低溶解度的盐的酸。可优选使用盐酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸，可更优选使用盐酸。因为这些酸与由溶解而产生的金属离子引起中和反应，因此溶解鲨肌醇·硼酸复合体的溶液调至最终成为0.1当量以上的酸性溶液为好。另外，为了高效率地溶解鲨肌醇·硼酸复合体，用1当量以上的酸溶解复合体，最终形成0.1当量以上的酸性溶液为好。

在第4步骤中，从在第3步骤中得到的酸性溶液或酸性悬浮液分离纯化鲨肌醇。从酸性溶液分离纯化鲨肌醇的方法无特别限制，例如可使用：后述的采用离子交换树脂等树脂的方法、利用对有机溶剂的溶解度差的方法等。

另外，也可以使用：使硼酸游离之后，加入低级醇，形成低级醇与硼酸的酯，再使用减压蒸馏的方法(Journal of Organic Chemistry，23卷，p.329-330，1958年)。

这些方法之中，使用离子交换树脂的分离纯化鲨肌醇的方法可如以下所示地进行。该场合，在第3步骤中得到的液体优选是完全溶解了复合体的0.1当量以上的酸性溶液。另外，该酸性溶液，为了避免游离了的鲨肌醇析出，优选是以鲨肌醇·硼酸复合体的比例达到2.5(w/v)％以下的容量加入酸而制备的溶液。

首先，为了去除金属离子，使这样的酸性溶液与强酸性离子交换树脂接触。使用的强酸性离子交换树脂只要是吸附金属离子的即可，无其它特别限定，例如可举出具有硫酸基的离子交换树脂。例如可例举出DuoliteC20·H⁺(住友化学公司制)等。接触的方法，可以通过分批地向一定量的溶液中加入强酸性离子交换树脂并搅拌的操作而进行，但希望使溶液在柱状地装满的强酸性离子交换树脂中通过而进行。

利用强酸性离子交换树脂去除了金属离子的溶液，接着为了去除硼酸，使之与强碱性离子交换树脂或吸附硼酸的树脂接触。这些树脂只要是吸附硼酸的即可，无其它特别限定，例如作为强碱性离子交换树脂，可例举出具有季铵盐基的该种树脂，作为吸附硼酸的树脂，可例举出具有N-甲基葡萄糖胺基的树脂等。作为强碱性离子交换树脂具体可举出DuoliteA116·OH^-类型(住友化学公司制)等。另外，作为吸附硼酸的树脂具体可举出DuoliteES371N(住友化学公司制)等。接触的方法，可以通过分批地向一定量的溶液中加入离子交换树脂并搅拌的操作而进行，但希望使溶液在柱状地装满的离子交换树脂中通过而进行。

使溶液接触树脂的顺序并不是随机的，这是因为硼酸和鲨肌醇在酸性状态下离解，开始使之与强酸性离子交换树脂接触，接着使之与强碱性离子交换树脂或者吸附硼酸的树脂接触。

在与树脂接触从而去除了金属离子和硼酸的溶液中，只含有中性糖鲨肌醇。因此，利用常规方法浓缩该溶液，使鲨肌醇析出，由此能够以晶体或粉末的形式分离纯化的鲨肌醇。

另外，在第4步骤中，利用对有机溶剂的溶解度差分离纯化鲨肌醇时，可如以下所示地进行。在该方法中，因为从溶解后到添加有机溶剂的期间不采用离子交换树脂等进行纯化操作，因此通过第3步骤的酸溶解而得到的液体可以是溶解液，但也可以是悬浮液。另外，在第3步骤中，为了在溶解后鲨肌醇易于析出，希望以鲨肌醇·硼酸复合体的比例达到2.5％(w/v)以上、优选3.0％-10％(w/v)、更优选4.0％-6.0％(w/v)的容量加入酸。

首先，为了析出游离了的鲨肌醇，向得到的酸性溶液或悬浮液中加入水溶性有机溶剂。所使用的有机溶剂，只要是能够在硼酸溶解、与酸形成盐的金属盐溶解状态下析出鲨肌醇的有机溶剂即可，无其它特别限定，例如举出乙醇、甲醇。

有机溶剂的量，例如使用乙醇时，相对于酸性溶液优选加入0.3-3倍容积的乙醇，更优选加入0.6-1.5倍容积的乙醇。使用甲醇时，相对于酸性溶液优选加入0.3-5倍容积的甲醇，更优选加入0.9-2倍容积的甲醇。特别是在形成鲨肌醇·硼酸复合体时使用的金属盐为NaCl、NaHCO₃、Na₂CO₃之中的任一种、或者2种以上时，以上述容量加入有机溶剂是有效的。而且，加入水溶性有机溶剂之后的混合液优选调至为0.1当量以上的酸性溶液。

在第4步骤中，混合体系为均一溶液时，未必搅拌，为悬浮液时，也是搅拌为好。另外，混合的温度，只要是只析出鲨肌醇的温度即无特别限定，但优选为-10℃至50℃，更优选为4℃-35℃。混合的时间优选10min-24小时，更优选3-5小时。

通过这样的操作，能够只析出鲨肌醇。通过过滤、或离心分离等的通常的固液分离操作，能够将析出的鲨肌醇从溶液分离。得到的鲨肌醇为纯的，但如果需要，则也可采用再结晶等的方法以晶体形式得到。为了更提高纯度，可以将析出的鲨肌醇溶解于水后，利用离子交换树脂等进一步纯化。

<4-2>由青蟹肌糖不经由鲨肌醇·硼酸复合体就制备鲨肌醇的方法

接下来，对于由含有鲨肌醇和鲨肌醇以外的中性糖的混合液制备鲨肌醇的方法的又一方案进行说明。

该方法是制备鲨肌醇的方法，包括：在含有青蟹肌糖的溶液中，使用硼氢化金属盐还原青蟹肌糖，得到含有肌醇和鲨肌醇的混合液的第1步骤；向上述混合液中加入酸，使混合液中的鲨肌醇·硼酸复合体溶解，并且将溶液调至0.01当量以上的酸性溶液的第2步骤；以及，以肌醇不析出的量向上述酸性溶液中加入水溶性有机溶剂，从而只使鲨肌醇析出的第3步骤。

在含有青蟹肌糖的溶液中，使用硼氢化金属盐还原青蟹肌糖时，在溶液中除了存在因被还原而产生的鲨肌醇和肌醇以外，还存在硼酸和金属离子，因此鲨肌醇的一部分形成对水不溶的鲨肌醇·硼酸复合体，只从溶液成分纯化鲨肌醇时，收得率降低。第2发明的目的是：在含有由青蟹肌糖的还原而得到的含有肌醇和鲨肌醇的混合液中，将在该混合液中少量生成的鲨肌醇·硼酸复合体溶解于酸中，从得到的酸性溶液只析出、纯化鲨肌醇。

在第1步骤中，“含有青蟹肌糖的溶液”，例如可使用：通过在培养基或溶液中利用微生物氧化肌醇而得到(特开2003-102492号公报)的溶液。由微生物氧化而得到的青蟹肌糖在纯化之后可以溶解使用，也可以使用培养滤液。“含有青蟹肌糖的溶液”，可以是象该培养滤液那样含有青蟹肌糖以外的物质的溶液。另外，也能使用用铂催化剂氧化肌醇而制备的青蟹肌糖。

用于还原的硼氢化金属，只要是能够在水系中将青蟹肌糖还原成鲨肌醇、且将硼游离的还原剂即可，无其它特别限定，例如可例举出氢化硼钠、氢化硼锂、氢化硼钾。

青蟹肌糖的还原反应，例如可通过在以20％(w/v)以下的含量溶解青蟹肌糖的溶液中以粉末或溶液的形式添加还原剂而进行。此时优选搅拌溶液。另外，有时因为还原反应而产生反应热，但为了抑制生成的青蟹肌糖分解，希望将反应液控制成为50℃以下。而且，有时还原剂的一部分分解产生氢气，但为了抑制氢气的起泡，优选添加消泡剂等。

这样，青蟹肌糖被还原成鲨肌醇和肌醇，在溶液中鲨肌醇和肌醇以混合状态存在。此时，当鲨肌醇的浓度超过约1.6％(w/v)时，就缓慢地开始结晶化。通常通过还原5％(w/v)的青蟹肌糖水溶液，产生约3％(w/v)肌醇、及约2％(w/v)鲨肌醇，但在室温下放置数小时时，鲨肌醇的过饱和部分的约0.4％(w/v)开始结晶化。而且，因为在由青蟹肌糖的还原而得到的鲨肌醇与肌醇的混合液中含有硼酸，因此鲨肌醇的一部分开始形成鲨肌醇·硼酸复合体。在第2发明的制备方法中，可以在第1步骤之后马上进行第2步骤，但因为鲨肌醇·硼酸复合体通过酸处理而溶解，因此也可以在第1步骤之后放置一会儿之后进行第2步骤。

第2步骤，向由第1步骤得到的“含有肌醇和鲨肌醇的混合液”加入酸，溶解混合液中的鲨肌醇·硼酸复合体，将溶液调至0.01当量以上的酸性溶液。此时，所使用的酸可使用盐酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸，但优选使用盐酸或硫酸。

在第3步骤中，向在第2步骤中得到的酸性溶液加入不使肌醇析出、只使鲨肌醇析出的量的水溶性有机溶剂。此时所使用的水溶性有机溶剂，只要是满足使鲨肌醇析出、使肌醇溶解的状态的溶剂即可，无其它特别限定，但优选为乙醇或甲醇或1-丙醇。

所谓不使肌醇析出、只使鲨肌醇析出的量，例如相对于酸性溶液，乙醇时为0.2-0.4倍容积，甲醇时为0.2-0.8倍容积，1-丙醇时为0.2-0.4倍容积，优选相对于酸性溶液，乙醇时为0.35-0.45倍容积，甲醇时为0.45-0.55倍容积，1-丙醇时为0.35-0.45倍容积。

在混合水溶性有机溶剂时，混合体系为均一溶液时，未必需要搅拌，但为悬浮液时，搅拌为好。混合时的温度，只要是只鲨肌醇析出的温度则无特别限定，但优选为-10℃至50℃，更优选为4℃-35℃。混合的时间优选为15-76小时，更优选为20-24小时。

在这样的条件下混合水溶性有机溶剂时，只鲨肌醇析出。通过过滤或离心分离等的通常的固液分离操作，能够以固体形式获得析出的鲨肌醇。该固体只由基本上纯的鲨肌醇构成，但如果需要，则也可采用再结晶等的方法以晶体形式得到。为了更提高纯度，可以将析出的鲨肌醇溶解于水后，利用离子交换树脂等进一步纯化。

[实施例]

以下示出实施例具体说明本发明。

实施例1

<鲨肌醇的制备方法(小规模)>

将含有10.0％肌醇、1.0％酵母提取物、1.0％蔗糖的3升液体培养基使用1N NaOH调至pH7.0，向30个500ml容积的带挡板的锥形烧瓶中各分配注入100ml，用高压釜灭菌。向各个锥形烧瓶中接种醋酸杆菌AB10281FERM BP-10119的斜面培养物1接种环，在27℃摇床培养5天。培养后，向各个锥形烧瓶中各加入250ml水，用摇床搅拌1小时，溶解存在于培养液中的结晶性的鲨肌醇。收集该培养液，离心分离(8,000rpm 20min)，获得上清液作为培养液上清(10.2L)。

利用高速液相色谱法在下述的条件下分析了该培养液上清。结果显示，在培养液上清中生成12.6mg/ml鲨肌醇(129g、转化率43％)。此时的培养液上清中残存2.1mg/ml青蟹肌糖，而肌醇未被检测出。

高速液相色谱法的分析条件如下。

柱：Wakosil 5NH₂(4.6×250mm)

柱温度：40℃

注入量：5μl

溶剂:乙腈-水＝4:1

流量：2ml/min

洗脱时间：青蟹肌糖：11.6min

肌醇：17.8min

鲨肌醇：18.2min

上述的鲨肌醇的转化率通过下式求出。

[数1]

转化率(％)＝(培养液上清中的鲨肌醇摩尔数)/(培养前的肌醇摩尔数)×100

接着，使培养液上清在连结了填充有500ml强酸性阳离子交换树脂C-20(H⁺型)(住友化学公司制)的柱(内径5cm、长40cm)和填充有200ml活性炭的柱(内径5cm、长16cm)的柱中通过，然后，使该柱中通过500ml的离子交换水以洗涤。使该通过液和洗涤液在填充有1000ml强碱性阴离子交换树脂A116(OH-型)(住友化学公司制)的柱(内径7cm、长40cm)中通过，然后使该柱中通过1000ml的离子交换水以洗涤。在所得的通过液和水洗涤液中除上述鲨肌醇以外几乎不存在杂质。

将通过上述而得到的水溶液在减压下浓缩到约700ml，加入3倍量的乙醇，在5℃放置一夜，然后过滤纯的鲨肌醇的无色晶体，使之干燥，得到118g。此时的纯化回收收得率为92％，来自肌醇的鲨肌醇的总回收率为39％。

实施例2

<鲨肌醇的制备方法(大规模)>

将含有10.0％肌醇、1.0％酵母提取物、1.0％蔗糖的40升液体培养基导入50L容积发酵罐中，使用1N NaOH调节pH7.0，用高压釜灭菌。接着400ml在相同组成的培养基(锥形烧瓶)中培养的醋酸杆菌AB10281FERM BP-10119，在27℃以通气量1vvm、转速200rpm培养5天。培养后，向取出的约40L培养液中加入60L约50℃的温水，搅拌1小时，溶解存在于培养液中的结晶性的鲨肌醇。将该培养液连续离心分离(8,000rpm)，获得去除了菌体的液体作为培养除菌液(约100L)。

利用高速液相色谱法在下述的条件下分析了该培养除菌液。结果显示，在培养除菌液中生成16.8mg/ml鲨肌醇(1.68kg、转化率42％)。此时的培养除菌液中残存2.9mg/ml青蟹肌糖，而肌醇未被检测出。高速液相色谱法的分析条件与实施例1相同。

接着，向得到的100L溶液中加入400g氢氧化钠，在搅拌下加热，98℃处理1小时。然后，趁热加入560g氢氧化钠、1340g硼酸、1260g的NaCl，使其溶解。停止搅拌，使溶液放热，放置到达到23℃(约24小时)。

然后，为了分离在液体中形成的鲨肌醇硼酸复合体的晶体，过滤该溶液，用水洗涤晶体直到变为白色为止。得到的晶体(约3.9kg)取出放到另一容器中，向其中加入5.9L水、1.95L 37％盐酸，搅拌。30min后，为了在该操作下使与硼酸分离的鲨肌醇进一步沉淀，加入9.4L甲醇，再搅拌1小时。

接着，为了分离在液体中结晶化的鲨肌醇，将该溶液过滤，用1L50％甲醇洗涤晶体。得到的微粉晶体(约1.8kg)取出放到另一容器中，向其中加入10L水，边搅拌边加温，煮沸1小时。然后，将该溶液边搅拌边冷却，在达到20℃的阶段过滤，得到鲨肌醇微晶。干燥后，得到纯的鲨肌醇的无色晶体1.35kg。此时的纯化回收收得率为80％，来自肌醇的鲨肌醇的总回收率为34％。

实施例3

<鲨肌醇生成菌的根据16SrRNA碱基序列进行的鉴定>

对具有将肌醇转化成鲨肌醇的能力的3种自然分离菌株AB10285株、AB10286株、AB10287株、以及由AB10253育种的AB10281计4种菌株的16SrRNA碱基序列按照常规方法进行分析。即，从培养后的菌体提取基因组DNA后，用设计为能扩增约1.6kbp的16SrRNA的引物，PCR扩增出相应的DNA片段，随后分析了约1.3kbp相关的序列(北海道系统科学公司)。以该序列结果为基础与数据库对照，鉴定了相关菌种(related species)。

表2示出了对照结果、同源性、与实施例1同样地培养时向鲨肌醇的转化率。

表2 通过16SrRNA碱基序列分析进行的菌株鉴定

 

系统名

鉴定菌名

同源性

转化率

 

AB10281	啤酒醋杆菌，Acetobacter malorum	99.93％	40.0％
				AB10285	啤酒醋杆菌，Acetobacter malorum	99.78％	4.5％
AB10286	须芒草伯克霍尔德氏菌	98.12％	2.6％
				AB10287	须芒草伯克霍尔德氏菌	98.04％	1.4％

由该结果表明，具有将肌醇转化成鲨肌醇的能力的4种菌株大致可分成2组。作为第1组，AB10281和AB10285株被鉴定为啤酒醋杆菌、或Acetobacter malorum，又，作为第2组，AB10286株和AB10287株被鉴定为须芒草伯克霍尔德氏菌。

实施例4

<来自醋酸杆菌AB10253的NAD⁺非依赖型的肌醇2-脱氢酶的分离>

在500ml容积的带挡板的锥形烧瓶中加入3g肌醇、1g酵母提取物(FNI205；Lallemand BI公司制)、0.5g葡萄糖，溶解于水中并使之达到100ml，调至pH5.0，制备了4瓶采用高压釜灭菌过的培养基，1接种环醋酸杆菌AB10253从斜面加入上述培养基中，在27℃摇床预培养2天。

接着，向50L容积发酵罐中加入1.2kg肌醇、0.4kg酵母提取物(FNI205；Lallemand BI公司制)、0.2kg葡萄糖，溶解于水中并使之达到40L，调至pH5.0，采用高压釜灭菌。向其中加入预培养过的醋酸杆菌AB10253的菌液约400ml，在27℃以通气量1vvm、转速200rpm培养3天。

培养后，使用连续离心机以沉淀形式得到菌体。得到的菌体在2升水中再悬浮，通过离心分离得到洗涤菌体后，在2升的pH7.0的20mM Tris缓冲液中悬浮。接着，对该悬浮液照射超声波，将菌体破碎。菌体破碎液，为了使破碎的菌体沉淀，进行离心分离，以沉淀物形式得到破碎菌体。向该沉淀物中加入500ml pH7.0的20mM Tris缓冲液、0.6％ Triton X-100(Kodak公司制)，悬浮，在15℃提取酶3小时。然后，进行离心分离，取出了上清的粗酶液420ml。

420ml粗酶液利用超滤装置(MW30000cut off)浓缩至150ml，使该浓缩液在用20mM的Tris缓冲液(pH7.0)经平衡的400ml的DEAEToyopearl柱中通过，使之吸附蛋白质。接着使含有0mM～500mM线性梯度NaCl的、不含表面活性剂的20mM的Tris缓冲液(pH7.0)(总量1.6升)以每分钟10ml的速度通过吸附了蛋白质的柱，以使吸附在柱上的蛋白质洗脱。洗脱液分馏成各40ml的级分。然后，再度使不含表面活性剂的20mM的Tris缓冲液(pH7.0)600ml通过该柱以洗涤，接着使含有0mM～500mM线性梯度NaCl的含有0.1％ Triton X-100的20mM的Tris缓冲液(pH7.0)(总量1.6升)以每分钟10ml的速度在柱中通过，以洗脱蛋白质。洗脱液分馏成各40ml的级分。

各级分的酶活性的测定，作为标准的方法，将由50μl蛋白质溶液、100mM磷酸缓冲液(pH5.0)、肌醇5mg、2，4-二氯吲哚酚(氧化型DCIP)0.4mg组成的1mL溶液中的600nm的吸光度变化换算成反应速度，将每1min氧化1μmol的肌醇的活性作为1单位而测定。

其结果表明，目标酶洗脱至含有0.1％ Triton X-100和100mM～170mM NaCl的20mM的Tris缓冲液(pH7.0)的溶液组分中。然后，收集该组分(240ml)，利用超滤装置(MW30000cut off)浓缩至30ml，加入含有0.1％TritonX-100的20mM的Tris缓冲液(pH7.0)进一步浓缩，向浓缩到30ml的溶液中加入70ml的20mM的Tris缓冲液(pH7.0)，进行了脱盐。

这样制备的酶液，接着在用含有0.1％ Triton X-100的20mM的Tris缓冲液(pH7.0)经平衡的100ml羟基磷灰石柱中通过，使之吸附蛋白质。接着使含有0mM～500mM线性梯度磷酸缓冲液(pH7.0)的含有0.1％ Triton X-100的Tris缓冲液(pH7.0)(总量400ml)以每分钟3ml的速度通过吸附了蛋白质的柱，以使吸附在柱上的蛋白质洗脱。洗脱液分馏成各10ml的级分，测定了各级分的酶活性。

其结果表明，目标酶洗脱至含有0.1％ Triton X-100和100mM～170mM磷酸缓冲液的20mM的Tris缓冲液(pH7.0)的溶液组分中。所得的酶液含有基本上纯的NAD⁺非依赖型的肌醇2-脱氢酶。然后，收集该级分(40ml)，利用超滤装置(MW30000cut off)浓缩至5ml，加入100ml的20mM的Tris缓冲液(pH7.0)进一步浓缩到5ml，进行了脱盐。

使这样制备的该酶液，再度通过用含有0.1％ Triton X-100的20mM的Tris缓冲液(pH7.0)平衡的20ml-DEAE Toyopearl柱(Tosoh公司制)中通过，使柱吸附蛋白质。接着使含有50mM250mM线性梯度NaCl的、含有0.1％ Triton X-100的20mM的Tris缓冲液(pH7.0)(总量160ml)以每分钟1ml的速度通过吸附了蛋白质的柱，以使吸附在柱上的蛋白质洗脱。洗脱液分馏成各4ml的级分，分馏后进行了各级分的酶活性测定、对有活性的各级分进行SDS电泳。

结果，由SDS电泳明确了与目标酶的酶活性有相关性的蛋白质的条带。去除来自前后没有活性的级分的蛋白质的条带，表明目标酶是至少含有分子量约76k道尔顿和约46k道尔顿的蛋白质的酶。

另外，有酶活性的级分具有红色，从UV光谱图表明含有细胞色素C。进一步由目的蛋白质的含量、和细胞色素C的吸光度表明每1摩尔目标酶含有1摩尔的细胞色素C。

最适pH的测定，测定酶活性时改变缓冲液和pH而进行测定。缓冲液使用100mM磷酸缓冲液(pH3-8)、100mM Tris缓冲液(pH7-8)及100mM碳酸缓冲液(pH8-11)。其结果表明，目标酶在pH4.5-5.5下具有最大活性。而且，在标准酶活性测定(100mM磷酸缓冲液(pH5.0))时加入各种重金属离子(Sn²⁺、Mn²⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、Fe、Zn²⁺、Co²⁺、pb²⁺、Ca²⁺、Cd²⁺、Ni²⁺)而测定，表明了目标酶被Sn²⁺离子特异地抑制。酶活性在1mM的Sn²⁺离子存在下被抑制到Sn²⁺离子非存在下的活性的1％以下。

另外证实了：目标酶是采用TritonX-100从膜组分提取的酶，提取的酶在还原型DCIP存在下氧化肌醇，但在还原型DCIP非存在下不引起氧吸收。这意味着：该酶在生物体中与细胞膜电子传递体系缔合，从肌醇夺取电子，生成青蟹肌糖。

目标酶的底物特异性，通过在代替肌醇含有最终浓度50mM的各种糖的溶液中测定酶活性而确定。另外，关于有活性的糖，改变糖的浓度测定酶活性，测定Km值。而且，通过HPLC分析氧化反应物，测定了生成什么物质。HPLC条件，柱使用Wakosil 5NH2柱Φ4.6×250mm(柱温度40℃)，流动相使用80％乙腈(流速2ml/min)，检测器使用RI检测器而测定。

作为结果，目标酶与D-chiro-肌醇(相对活性100％：Km＝8.8mM)、muco-肌醇(相对活性68％：Km＝14.5mM)、肌醇(相对活性53％：Km＝20mM)反应，分别转化成D-chiro-1-肌糖、L-chiro-2-肌糖、青蟹肌糖。表明不与allo-肌醇、鲨肌醇、L-chiro-肌醇、葡萄糖反应。

实施例5

<利用NAD⁺非依赖型的肌醇2-脱氢酶进行的肌醇向鲨肌醇的转化>

与实施例4同样地用40L发酵罐进行纯化，中途采用100ml羟基磷灰石柱进行了纯化、脱盐，将所得到的5ml的酶溶液作为酶液进行了以下的转化反应。

在400ml容积的离心管中加入30g肌醇(166.7mmol)、15mllM磷酸缓冲液(pH5.0)，用水稀释至300ml，使肌醇溶解。在30℃向其中加入1ml酶液，边搅拌边缓慢加入8g还原型DCIP(Na盐)。来源于还原型DCIP的蓝色消失之后，通过离心分离使随蓝色的消失而产生的白色的不溶物(氧化型DCIP)沉淀，将上清液转移到新的400ml容积的离心管中。再采用1当量磷酸将该溶液调至pH5.0，边搅拌边进一步加入8g的还原型DCIP(Na盐)。将该操作重复6次，加入合计48g的还原型DCIP(Na盐)，在蓝色消失了的阶段，最后加入3g的还原型DCIP(Na盐)，放置1小时后，通过离心分离取出了上清液。通过这样的操作得到上清液292ml。操作时间需要8小时。

接着，得到的上清液，以每分钟1.5ml的速度使溶解液在用100ml强酸性离子交换树脂(Duolite C20、H⁺类型)装满的柱中通过，使得到的洗脱液在用150ml弱碱性离子交换树脂(Duolite 368S、OH^-类型)装满的柱中通过，再使得到的洗脱液在用50ml活性炭装满的柱中通过。浓缩得到的洗脱液，得到白色粉末26.5g(148.9mmol)(收得率89％)。将该物质采用NMR和HPLC分析的结果，在该物质中含有青蟹肌糖99％、肌醇1％。

实施例6

<以NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶活性为指标，从突变株中筛选中醋酸杆菌AB10253>

将含有1％酵母提取物(Difco公司制)、0.5％的葡萄糖的pH5.0的5ml液体培养基的试管灭菌，从斜面向其中接入一环醋酸杆菌AB102531，在27℃进行了16小时振荡培养。将培养液2.5ml取出放到灭菌管中，进行3000×g的离心分离，收集菌体。弃上清，再度悬浮在2.5ml 200mM磷酸缓冲液(pH8.0)中，进行3000×g的离心分离，收集菌体。弃上清，再度悬浮在2.5ml 200mM磷酸缓冲液(pH8.0)中，其中，将2.0ml悬浮液装入灭菌了的100ml容积的锥形烧瓶中，加入0.5ml的40％葡萄糖溶液、和7.5ml的200mM磷酸缓冲液(pH8.0)使之混合，向其中加入20μl的甲磺酸乙酯，在30℃进行45min振荡培养。处理后，取出1ml混合物放到灭菌管中，进行3000×g的离心分离，收集菌体。弃上清，悬浮在200mM磷酸缓冲液(pH7.0)2.5ml中，进行3000×g的离心分离，收集菌体。弃上清，再度悬浮在200mM磷酸缓冲液(pH7.0)2.5ml中，得到诱变处理菌液。

其次，这些实施了诱变处理的醋酸杆菌AB10253，通过：将含有3％肌醇、1％酵母提取物(Difco公司制)、0.5％的葡萄糖、1.5％琼脂的pH5.0的培养基灭菌，在直径9cm的培养皿中固化，在固化了的琼脂培养基中每个培养皿涂布0.12ml诱变处理菌液，由此而接种，在27℃培养2天。通过该操作，活菌数减少至约1.6％。另外，每个培养皿形成了约95-125集落。

培养后，在形成于直径9cm的培养皿中的集落之上缓慢注入10ml下述的溶液：将由100mM磷酸缓冲液、1％肌醇、0.4％氧化型DCIP组成的组成液过滤灭菌，趁着热向其中等量混合用高压釜灭菌过的1％琼脂，冷却到36℃后以琼脂不凝固的方式制备的粘稠的溶液。进行了这样的处理的琼脂培养基在27℃缓慢地冷却，在形成于直径9cm的培养皿中的集落之上以复层的形式固化。

处理后，将培养皿在27℃孵化，由此根据NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶活性的大小，在琼脂培养基上在一面上缓慢地展开的氧化型DCIP的蓝色，只在集落的周围开始变得透明。此时，将较快地变得透明的地方的集落用灭菌了的针刮取，在新的培养基中传代，经初始选择，可从总集落数2154集落中取得NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶活性高的菌株22株。

其次，作为二次选择，在含有3％肌醇、1％酵母提取物(Difco公司制)、0.5％的葡萄糖的pH5.0的5ml灭菌液体培养基的试管中，分别导入形成了集落的上述22株菌。在27℃进行了3天振荡培养后，将取出1ml培养液放入试验管中，进行3000×g的离心分离，收集菌体。弃上清，向装有菌体的试验管中加入含有10％肌醇、50mM磷酸缓冲液(pH5.0)的溶液1ml，在27℃进行了4小时振荡培养后，16000×g的离心分离，通过HPLC测定了从上清液所含的肌醇向青蟹肌糖的转化率。另一方面，5ml培养液之中，取出0.5ml放入灭菌管中，进行3000×g的离心分离，弃上清，沉淀的菌体用水洗涤后，测定了NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶活性。

其结果，22株的突变株之中，与变异前的菌比，NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶活性增加至1.3倍以上的菌株有3株(系统No.E6-55、H2-68、B7-14)分别增加至1.6倍、2.2倍、2.8倍。另外，它们的从肌醇向青蟹肌糖的转化率，分别增加至1.1倍、1.4倍、1.5倍，NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶活性为1.3倍以下的菌株的从肌醇向青蟹肌糖的转化率，与变异前的菌同等。由此知道，以NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶活性为指标的筛选，与从肌醇向青蟹肌糖的转化率的增加有相关性。

实施例7

<使用变异菌株(B7-14)使肌醇向青蟹肌糖的转化来制备青蟹肌糖>

在500ml容积的带挡板的锥形烧瓶中加入10g肌醇、1g酵母提取物(FNI205；Lallemand BI公司制)、0.5g葡萄糖，溶解于水中并使之达到100ml，调至pH5.0，制备了20个(相当于2升：肌醇200g(1.11mol))采用高压釜灭菌过的培养基，从斜面向其中分别加入变异菌株(B7-14)1接种环，在27℃摇床培养3天。

培养后，离心分离培养液，得到的上清液，以每分钟10ml的速度使溶解液在用500ml强酸性离子交换树脂(Duolite C20、H⁺类型)装满的柱中通过，使得到的洗脱液在用900ml弱碱性离子交换树脂(Duolite 368S、OH^-类型)装满的柱中通过，再使得到的洗脱液在用50ml活性炭装满的柱中通过。浓缩得到的洗脱液，得到白色粉末162g(0.91mol)(收得率82％)。将该物质采用NMR和HPLC分析的结果，在该物质中含有青蟹肌糖91％、肌醇3％、鲨肌醇6％(青蟹肌糖纯度91％)。

实施例8

<使用变异菌株(B7-14)的通过从肌醇向青蟹肌糖的转化和化学还原来制备鲨肌醇>

在500ml容积的带挡板的锥形烧瓶中加入10g肌醇、1g酵母提取物(FNI205；Lallemand BI公司制)、0.5g葡萄糖，溶解于水中并使之达到100ml，调至pH5.0，制备了20个(相当于2升：肌醇200g(1.11mol))采用高压釜灭菌过的培养基，从斜面向其中分别加入变异菌株(B7-14)1接种环，在27℃摇床培养3天。

培养后，以8000×g离心分离培养液，将得到的上清液约2升用5当量NaOH溶液调至pH7.5。边搅拌边向其中加入9.2g NaBH₄，进行了还原反应。因反应热，反应液的温度上升至37℃。30min后，不溶物缓慢显现，向其中加入1.2升的水，溶解了大部分的不溶物。过滤该溶液，去除了不溶物的液体，以每分钟10ml的速度使溶解液在用500ml强酸性离子交换树脂(Duolite C20、H⁺类型)装满的柱中通过，使得到的洗脱液在用900ml强碱性离子交换树脂(A116、OH^-类型)装满的柱中通过，再使得到的洗脱液在用300ml活性炭装满的柱中通过。浓缩得到的洗脱液，得到白色粉末145g。将该物质采用HPLC分析的结果，在该物质中含有鲨肌醇36％、肌醇64％。

将得到的白色粉末用水悬浮并达到470ml，加热至70℃，充分溶解肌醇。边搅拌边冷却到30℃，过滤白浊的溶液，收集了不溶物。不溶物用少量的水洗涤，干燥后，得到44.2g的粉末。将该物质采用HPLC分析的结果，在该物质中含有鲨肌醇98％、肌醇2％。进一步地，在得到的粉末中加入700ml的水，加热至85℃，使之全部溶解，边缓慢搅拌边冷却到30℃，向其中加入700ml乙醇。在室温下放置一夜后，过滤并收集得到的晶体，干燥后，得到40.1g(222.8mmol)的晶体(收得率20％)。将晶体采用NMR和HPLC分析的结果，该物质是99.9％以上的纯度的鲨肌醇。

实施例9

<醋酸杆菌AB10281FERM BP-10119产生的鲨肌醇脱氢酶的纯化>

将含有10.0％肌醇、1.0％酵母提取物、3升1.0％蔗糖的液体培养基使用1N NaOH调至pH7.0，向500ml容积的带挡板的锥形烧瓶30个中分配注入各100ml，用高压釜灭菌。向各个锥形烧瓶中接种醋酸杆菌AB10281FERM BP-10119的斜面培养物1接种环，在27℃使用摇床(180rpm)培养5天。培养后，向各个锥形烧瓶中各加入250ml水，用摇床搅拌1小时，溶解存在于培养液中的结晶性的鲨肌醇。收集该培养液，离心分离(8,000rpm20min)，获得菌体(湿重量75g)。

将该菌体悬浮于300ml的水中，在10℃以下用超声波破碎。破碎溶液显示出pH4.8，用1N NaOH将该溶液调至pH7.0后，通过离心分离(16,000rpm 20min)分离了上清液。接着，加入MgSO₄使上清液达到2mM Mg²⁺，将溶液填充到Blue-Toyopearl柱(Tosoh公司制；20ml)中，然后使50ml添加了2mM Mg2+的20mM Tris缓冲液(pH7.0)洗柱。然后，使添加了1M KCl的20mM Tris缓冲液(pH7.0)50ml通过柱，使吸附蛋白质洗脱。接着，将洗脱液用超滤装置(MW30000cut off)进行浓缩，在浓缩液中加入20mM Tris缓冲液(pH7.0)50ml，再度浓缩，得到脱盐浓缩液。接着，将该脱盐浓缩液填充到DEAE Toyopearl柱(Tosoh公司制；20ml)中，采用：含有0mM-500mM NaCl的线性浓度梯度的20mM Tris缓冲液(pH7.0)洗脱，然后将洗脱液分级分离。测定每个级分溶液中的鲨肌醇脱氢酶活性，发现未吸附的级分(SIDH1)、用200mM NaCl洗脱的级分(SIDH2)、用300mM NaCl洗脱的级分(SIDH3)有活性。

对于活性测定，将5μl反应液(200mM Tris缓冲液(pH8.0)、2％NADPH、1％青蟹肌糖)和5μl酶液混合，在36℃反应30min后，立即加入500μl水，测定340nm的吸光度，从用水代替酶液的试验液的空白值测定了340nm的吸光度的减少量。根据将酶液进行稀释。

上述柱非吸附级分，进一步填充到CM Toyopearl柱(Tosoh公司制；20ml)中，然后采用：含有0mM-500mM NaCl的线性浓度梯度的20mM Tris缓冲液(pH7.0)洗脱，然后将洗脱液分级分离。测定每个级分溶液中的鲨肌醇脱氢酶活性，结果发现未吸附的级分有活性。用200mM NaCl洗脱的级分、用300mM NaCl洗脱的级分分别通过再度超滤脱盐，填充到DEAE Toyopearl柱(Tosoh公司制；20ml)中，采用：含有200mM-300mM NaCl的线性浓度梯度的20mM Tris缓冲液(pH7.0)洗脱，然后将洗脱液分级分离，纯化。进一步地将这3种具有鲨肌醇脱氢酶活性的酶液分别用超滤装置浓缩，填充到凝胶过滤柱(Tosoh公司制；2000SW_XL)中，然后使用添加了200mM NaCl的20mM磷酸缓冲液(pH7.0)对洗脱液进行纯化。将纯化的酶液进行平板凝胶SDS电泳，电泳后取出凝胶，用考马斯亮蓝染色液(RapidCBB KANTO：关东化学公司制)染色后脱色，用光密度计(ATTO公司制)测定蛋白质的蓝带，从而测定了目的条带的纯度，各个级分的纯度均为85％以上。

实施例10

<纯化大肠杆菌K12株ATCC10798产生的本发明酶、和N末端分析>

将3升含有0.5％L-山梨糖的LB肉汤培养基(1％细菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％ NaCl、pH7.0)向500ml容积的坂口烧瓶30个中分配注入各100ml，用高压釜灭菌。在各个锥形烧瓶中接种大肠杆菌K12株的斜面培养物1接种环，在36℃使用往复式摇动器(135rpm)培养1天。培养后，收集培养液，离心分离(8,000rpm20min)，得到菌体(湿重量32g)。将该菌体悬浮在100ml水中，在10℃以下用超声波破碎。破碎溶液显示出pH6.8，用1N NaOH溶液将该溶液调至pH7.0后，通过离心分离(16,000rpm20min)分离上清液。接着，加入MgSO₄使上清液达到2mM Mg²⁺，将溶液填充到Blue-Toyopearl柱(Tosoh公司制；20ml)中，然后使50ml添加了2mMMg2+的20mM Tris缓冲液(pH7.0)洗柱。然后，使添加了1M KCl20mM Tris缓冲液(pH7.0)50ml通过柱，使吸附蛋白质洗脱。接着，将洗脱液用超滤装置(MW30000cut off)进行浓缩，在浓缩液中加入20mM Tris缓冲液(pH7.0)50ml，再度浓缩，得到脱盐浓缩液。接着，将该脱盐浓缩液填充到DEAE Toyopearl柱(Tosoh公司制；20ml)中，采用：含有0mM-500mM NaCl的线性浓度梯度的20mM Tris缓冲液(pH7.0)洗脱，然后将洗脱液分级分离。测定各级分溶液中的鲨肌醇脱氢酶活性，结果用300mM NaCl洗脱的级分有活性。

活性测定，与在实施例9中叙述的方法相同，测定了340nm的吸光度的减少量。根据将酶液进行稀释。

用300mM NaCl洗脱的级分再度用超滤装置脱盐，然后填充到DEAE Toyopearl柱(Tosoh公司制；20ml)中，采用：含有250mM-350mM NaCl的线性浓度梯度的20mM Tris缓冲液(pH7.0)洗脱，进行3次将洗脱液分级分离的操作，从而去除杂质蛋白质进行纯化。进一步地，将该具有鲨肌醇脱氢酶活性的酶液分别用超滤装置浓缩，填充到凝胶过滤柱(Tosoh公司制；2000SW_XL)中，然后使用添加了200mM NaCl的20mM磷酸缓冲液(pH7.0)对洗脱液进行纯化。

将纯化的酶液进行平板凝胶SDS电泳，然后取出凝胶，用半干电子绘图仪将蛋白转移至大小与凝胶相同的PVDF膜(Immobilon PSQ：Millipore公司制)，取出该PVDF膜，用考马斯亮蓝染色液(Rapid CBBKANTO：关东化学公司制)染色后脱色，用与在实施例9中记述的方法同样，用光密度计测定纯度，结果纯度为40％。进一步地，为了去除在前后存在的不需要的蛋白质，切除相应的蛋白质部分，得到纯度高的本发明酶。

然后，利用N末端氨基酸分析装置(Hewlett Packard)对在PVDF膜上的纯度高的本发明酶进行分析。其结果检测出丝氨酸-天冬氨酸-天冬酰胺-异亮氨酸-精氨酸的序列，在大肠杆菌全部碱基序列数据库中(数据库名“Colibri”)检索编码具有上述序列的蛋白质的DNA，结果ydgJ基因(或者b1624基因)匹配。预测该基因产物是氧化还原酶的一种，但底物、产物是未知的。

实施例11

<来源于大肠杆菌K12株ATCC10798的本发明DNA的分离和表达>

为了获得认为编码本发明的酶的ydgJ基因，首先如以下所示提取了作为模板的大肠杆菌K12株的全基因组。向100mlLB烧瓶培养基(1％细菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％ NaCl、pH7.0)中接种一环在LB斜面培养基(1％细菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％ NaCl、pH7.0、1.5％琼脂)中培养的大肠杆菌K12株，在36℃需氧培养8小时，收集菌体。向所得的菌体中加入15ml的Saline-EDTA溶液(0.15M NaCl、0.1M EDTA、pH8.0)和50mg溶菌酶，悬浮，在37℃作用2小时。处理后，向该溶液中加入25％ SDS溶液0.5ml，使菌体细胞完全溶解，加入3ml苯酚，使蛋白质变性后，离心分离，取上清，向该溶液中加入20ml的2-丙醇，使粗基因组DNA析出。离心分离出的粗基因组DNA，弃上清，在减压下干燥。干燥了的粗基因组DNA再溶解于3ml TE液(10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.0)中后，加入0.01mg的RNAase，在36℃反应2小时，降解RNA。进一步地加入0.01mg的蛋白酶K，在36℃反应2小时，使蛋白质降解。接着，加入1ml的苯酚-氯仿(1:1)混合液，缓慢地搅拌，使RNAase和蛋白酶K变性，离心分离成2相，取上层水相，向其中加入3M醋酸钠溶液0.3ml，调至pH5.2。向其中加入3ml的2-丙醇，使基因组DNA析出。离心分离基因组DNA，使之沉淀，弃上清后，在减压下干燥。干燥了的基因组DNA溶解于3ml TE液中，从向其中加入1ml的苯酚-氯仿(1:1)混合液的操作到使之溶解于3ml TE液中的过程再度重复进行，进行离心分离，同样在pH5.2下向上清液加入等量的2-丙醇，由此制备出大肠杆菌K12株的基因组DNA溶液。将所得的基因组DNA作为用于PCR反应的模板DNA溶液。

为了克隆来源于大肠杆菌K12株的包含ydgJ基因的核糖体结合位点(RBS)的片段，且为了作为重组酶表达，利用具有以下序列的引物进行了PCR反应。

序列号15：ydgj-F 5’-cattcaagcttaatgagaggcaatgacatgagcg-3’

序列号16：ydgj-R 5’-tcggaattcttcatgcaaggcacaaagtcgc-3’

PCR反应使用宝酒造公司的Ex taq反应液，该溶液的组成为：Takara ExTaq Buffer×10倍液5μl、dNTP混合物4μl、模板DNA30ng、10μM引物溶液各1μl、Takara ExTaq 0.5μl，加入水达到50μl，并覆盖30μl的矿物油。反应条件，使用PCR扩增装置(ASTEC公司制PC-700)，变性(94℃，30秒)、退火(55℃，1min)、延伸(72℃，1min)这3步的反应重复进行了35次。通过上述的PCR反应，扩增了约1.0kbp大小的DNA片段。反应后，重复3次：用0.3ml己烷提取覆盖的矿物油，并去除己烷层的操作，通过减压1min，去除了矿物油。从所得的反应液50μl使用GENECLEAN(Bio101公司制)纯化了PCR片段。即，加入300μl试剂盒中的NaI溶液并混合，加入10μl玻璃珠溶液并混合，在4℃静置15min后，离心分离，使吸附了DNA片段的玻璃珠沉淀，去除上清液。进一步地加入试剂盒中的New wash溶液500μl，使玻璃珠悬浮，离心分离，去除上清液。采用该New wash溶液进行的洗涤操作重复了3次。接着，在减压下干燥玻璃珠，干燥后，加入15μl灭菌水悬浮，在55℃加温15min后进行离心分离，得到含有DNA片段的上清液12μl。

将纯化的DNA片段导入表达载体中的操作象以下那样进行。即，向DNA片段溶液10μl中加入表达用质粒(pUC119：宝酒造公司制)0.5μg、宝酒造公司的限制酶HindIII和EcoRI各1μl、宝酒造公司的限制酶用缓冲液K buffer×10倍液2μl，加入灭菌水以便达到20μl并混合。将该反应液在36℃反应2小时。限制酶反应后，使用GENECLEAN分离DNA片段和表达载体，使它们连接。即，向限制酶反应液20μl中加入试剂盒中的NaI溶液300μl并混合，加入10μl玻璃珠溶液并混合，在4℃静置15min后，离心分离，使吸附DNA片段和表达载体的玻璃珠沉淀，去除上清液。进一步地加入试剂盒中的New wash溶液500μl，使玻璃珠悬浮，离心分离，去除上清液。采用该New wash溶液进行的洗涤操作重复3次。接着，在减压下干燥玻璃珠，干燥后，加入15μl灭菌水悬浮，在55℃加温15min后进行离心分离，得到含有DNA片段和表达载体的上清液12μl。通过该操作，由限制酶产生的约50bp以下的小的DNA片段被去除，得到了目的DNA片段、和表达载体。

向这样制备的溶液10μl中加入Takara Ligation kit-I溶液(宝酒造公司制)10μl，在16℃反应1小时。该溶液用于转化感受态细胞(宝酒造公司：DH5)。即，向60μl在4℃解冻的感受态细胞溶液中加入5μl连接反应溶液并混合，进行0℃×30min的处理后，进行42℃×45秒和0℃×2min的处理，向其中加入500μl SOC溶液(2％细菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、10mM NaCl、20mM葡萄糖、10mM MgSO₄、10mM MgCl₂)，在36℃恢复培养1小时，将100μl该培养液涂布在含有50μg/ml氨苄青霉素、40μg/ml X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)、1mM IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)的LB琼脂培养基(1％细菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％ NaCl、pH7.0、1.5％琼脂)上。进而在37℃培养16小时。通过该培养，筛选白色的集落得到通过上述的质粒的引入而转化的大肠杆菌。在含有氨苄青霉素(50μg/ml)的Lb液体培养基中培养这样分离的转化大肠杆菌集落。从增殖的转化大肠杆菌的菌体利用质粒纯化试剂盒(QiA filter PlasmidMidiKit，QIAGEN公司)分离和纯化质粒DNA。证实了所得的质粒DNA具有与目的ydgJ基因相当的约1.0kbp的DNA片段。

其次，为了确认鲨肌醇脱氢酶活性，将作为集落而分离的菌株移植到含有50μg/ml氨苄青霉素的100ml LB培养基(1％细菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％ NaCl、pH7.0)中，在36℃培养7小时，向该培养液中加入200Mm IPTG溶液0.3ml，进一步在36℃培养3小时。培养结束后，通过离心分离收集菌体，用生理盐水将其洗涤1次。进而将洗涤菌体悬浮在0.6％ Triton-X100溶液3ml中，在4℃利用超声波将菌破碎。离心分离该溶液，取出上清的酶液2.8ml，向上清加入1.2g硫酸铵，在4℃使蛋白质盐析。通过离心分离(15,000rpm、20min)收集盐析了的蛋白质，去除上清，使该沉淀物溶解于2.5ml的20mM Tris缓冲液(pH7.0)中，再度进行离心分离(15,000rpm、20min)，将上清应用到用20mM Tris缓冲液(pH7.0)平衡化的Sephadex G-25柱(Pharmacia K.K：14ml)中，用20mM Tris缓冲液(pH7.0)洗脱，进行了脱盐。通过该操作，得到了ydgJ基因产物的粗酶液3.5ml。

鲨肌醇脱氢酶的活性测定，混合反应液(200mM Tris缓冲液pH8.0、2％ NADPH、1％青蟹肌糖)5μl、和5μl酶液，在36℃反应30min后，立即加入500μl的水，测定340nm的吸光度，测定用水代替酶液的试验液的空白值在340nm的吸光度的减少量。根据将酶液进行稀释。

另外，酶反应产物的测定如下述：在含有青蟹肌糖10mg、NADPH40mg、1.0ml 10U相当的酶的100mM Tris缓冲液(pH8.0)中在36℃反应4小时后，进行80℃×10min的加热处理，冷却后，加入强碱性阳离子交换树脂100μl、强酸性阴离子交换树脂100μl、活性炭10mg并搅拌，离心分离后，将上清稀释2倍，采用HPLC(Shodex AsahipakNH2P-50 4E Φ4.6×250mm：Shodex公司制)，在柱温度40℃、流动相流速1.5ml(80％乙腈)的条件下用RI检测器测定。其结果，ydgJ基因产物显示出高的鲨肌醇脱氢酶活性，该产物是100％还原成鲨肌醇的产物，作为异构体的肌醇未检测出。作为结果，证实了：来源于ydgJ基因产物的重组酶溶液具有高的鲨肌醇脱氢酶活性，该基因产物是鲨肌醇脱氢酶。另外，来自青蟹肌糖的还原反应物只检测出鲨肌醇，是立体特异地还原成鲨肌醇的酶。另外，ydgJ基因的序列如SEQ.ID.NO：1所示，相应的氨基酸序列如SEQ.ID.NO：2所示。

实施例12

<从大肠杆菌ydgJ基因的同源性推定的同源DNA的分离和表达、以及其各种性质>

从大肠杆菌ydgJ基因产物的氨基酸序列推定三维结构，推定属于葡萄糖-果糖氧化还原酶家族。在该家族中也包括肌醇2-脱氢酶(EC1.1.1.18)，表明了：氨基酸序列之中，与NAD结合有关的序列其同源性高。而且，由葡萄糖-果糖氧化还原酶的X射线结构分析，鉴定了与底物结合有关的部位的氨基酸序列，检索具有部分地相同的氨基酸序列、并与ydgJ基因产物同源的蛋白质，结果表明，无论革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌，在许多的细菌中具有同源的蛋白质。

从这些细菌之中检索由大肠杆菌ydgJ基因的同源性推定的同源DNA，结果发现关于根癌土壤杆菌C58 ATCC33970(Agrobacteriumtumefacience C58 ATCC33970)基因组中的Atu4375基因、Atu3234基因、枯草芽孢杆菌168 ATCC23857(Bacillus subtilis 168ATCC23857)基因组中的BG14057基因、野油菜黄单胞菌野油菜致病变种ATCC33913(Xanthomonas campestris pv.campestrisATCC33913)基因组中的Xcc3438基因、以及具有从肌醇直接转化成鲨肌醇的能力的微生物的土壤杆菌AB10121FERM P-17383(Agrobacterium sp.AB10121 FERM P-17383)基因组中的Atu4375基因、Atu3234基因与大肠杆菌ydgJ基因具有同源性。因此，进行了各自的DNA的分离和表达。

为了获得上述备选DNA，如以下所示地提取了作为模板的根癌土壤杆菌C58 ATCC33970、枯草芽孢杆菌168 ATCC23857、野油菜黄单胞菌野油菜致病变种ATCC33913、及土壤杆菌AB10121FERM P-17383的全基因组。将LB斜面培养基(1％细菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％ NaCl、pH7.0、1.5％琼脂)中培养的根癌土壤杆菌C58、野油菜黄单胞菌野油菜致病变种、及土壤杆菌AB10121各一环接种于100ml LB烧瓶培养基(1％细菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％ NaCl、pH7.0)中LB斜面培养基(1％细菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％ NaCl、pH7.0、1.5％琼脂)中培养的根癌土壤杆菌C58、野油菜黄单胞菌野油菜致病变种、及土壤杆菌AB10121，在27℃需氧培养18小时，收集菌体。向所得的菌体中加入15ml的Saline-EDTA溶液(0.15M NaCl、0.1M EDTA、pH8.0)和50mg溶菌酶，悬浮，在37℃作用2小时。处理后，向该溶液中加入25％ SDS溶液0.5ml，使菌体细胞完全溶解，加入3ml苯酚，使蛋白质变性后，离心分离，取上清，向该溶液中加入20ml的2-丙醇，使粗基因组DNA析出。离心分离出的粗基因组DNA，弃上清，在减压下干燥。干燥了的粗基因组DNA再溶解于3ml TE液(10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.0)中后，加入0.01mg的RNAase，在36℃反应2小时，降解RNA。进一步加入0.01mg的蛋白酶K，在36℃反应2小时，使蛋白质降解。接着，加入1ml的苯酚-氯仿(1:1)混合液，缓慢地搅拌，使RNAase和蛋白酶K变性，离心分离成2相，取上层水相，向其中加入3M醋酸钠溶液0.3ml，调至pH5.2。向其中加入3ml的2-丙醇，使基因组DNA析出。离心分分离出的基因组DNA，使之沉淀，除掉上清液之后，在减压下干燥。干燥了的基因组DNA溶解于3ml TE液中，从向其中加入1ml的苯酚-氯仿(1:1)混合液重复进行纯化直至使之再次溶解于3ml TE液中，进行离心分离，同样在pH5.2下向上清液加入等量的2-丙醇，分别制备了根癌土壤杆菌C58、野油菜黄单胞菌野油菜致病变种、及土壤杆菌AB10121的基因组DNA溶液。将所得的基因组DNA作为用于PCR反应的模板DNA溶液。

对于枯草芽孢杆菌168ATCC23857，向100ml LB烧瓶培养基(1％细菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％ NaCl、pH7.0)中接种1接种环在LB斜面培养基(1％细菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％ NaCl、pH7.0、1.5％琼脂)中培养的枯草芽孢杆菌168，在36℃需氧培养18小时，进而取1ml加入到同样制备的LB烧瓶培养基100ml中，培养4小时，收集菌体。集菌后的全基因组的提取方法，与土壤杆菌所用的方法同样。

其次，为了克隆根癌土壤杆菌C58基因组中的Atu4375基因、Atu3234基因、土壤杆菌AB10121基因组中的Atu4375基因、Atu3234基因、野油菜黄单胞菌野油菜致病变种基因组中的Xcc3438基因的全部包含RBS、作为重组酶表达，使用具有下述序列的引物进行了PCR反应。

序列号17：Atu4375-F 5’-ggcggatcctttgaaagggatagtcatgtcct-3’

序列号18：Atu4375-R 5’-attggaagcttcgattggctgcgacctag-3’

序列号19：Atu3234-F 5’-ttgggatcctttcaggggaaatattatggc-3’

序列号20：Atu3234-R 5’-gccgcaagcttgttttacagcttcac-3’

序列号23：Xcc3438-F 5’-tcggaattcgcgttgcggtgaatcgttttcaatg-3’

序列号24：Xcc3438-R 5’-ataagaagcttgctcagtcgctgctgttgccttc-3’

为了克隆枯草芽孢杆菌168基因组中包括RBS的BG14057基因的克隆、作为重组酶表达，使用具有下述序列的引物进行了PCR反应。但是，从5’末端开始第10位上的a本来是t，但为了在大肠杆菌中表达而变更成a。

序列号21：BG14057-F 5’-aggaattcgatgataacgcttttaaaggggagaa-3’

序列号22：BG14057-R 5’-tttctgcagtttagtgctccagcataatggttcg-3’

PCR反应使用宝酒造公司的Ex taq反应液，该溶液的组成为：Takara ExTaq Buffer×10倍液5μl、dNTP混合物4μl、模板DNA30ng、10μM引物溶液各1μl、Takara ExTaq 0.5μl，加入水达到50μl，并覆盖30μl的矿物油。反应条件，使用PCR扩增装置(ASTEC公司制PC-700)，变性(94℃，30秒)、退火(52℃、55℃或58℃(参照表3)，1min)、延伸(72℃，1min)这3步的反应重复进行了35次。通过上述的PCR反应，扩增了约1.1kbp大小的DNA片段。

表3 退火温度一览

反应后，重复3次：用0.3ml己烷提取覆盖的矿物油，并去除己烷层的操作，通过减压1min，去除了矿物油。从所得的反应液50μl使用GENECLEAN(Bio101公司制)纯化了PCR片段。即，加入300μl试剂盒中的NaI溶液并混合，加入10μl玻璃珠溶液并混合，在4℃静置15min后，离心分离，使吸附DNA片段的玻璃珠沉淀，去除上清液。进一步地加入试剂盒中的New wash溶液500μl，使玻璃珠悬浮，离心分离，去除上清液。采用该New wash溶液进行的洗涤操作重复了3次。接着，在减压下干燥玻璃珠，干燥后，加入15μl灭菌水悬浮，在55℃加温15分后进行离心分离，得到含有DNA片段的上清液12μl。

将纯化的DNA片段导入表达载体中的操作分别在以下所示的组合下进行。即，向DNA片段溶液10μl中加入表达用质粒(pUC118：宝酒造公司制)0.5μg、宝酒造公司的限制酶2种各1μl、宝酒造公司的限制酶用缓冲液buffer×10倍液2μl，加入灭菌水以便达到20μl并混合。将该反应液在36℃反应2小时。因为AB10121的Atu3234基因具有HindIII位点，因此不用限制酶处理，分离后使之与pT7Blue载体(Novagen公司制)连接。

表4 表达用质粒、使用的限制酶一览

限制酶反应后，使用GENECLEAN分离DNA片段和表达载体，使它们连接。即，向限制酶反应液20μl中加入试剂盒中的NaI溶液300μl并混合，加入10μl玻璃珠溶液并混合，在4℃静置15min后，离心分离，使吸附DNA片段和表达载体的玻璃珠沉淀，去除上清液。进一步地加入试剂盒中的New wash溶液500μl，使玻璃珠悬浮，离心分离，去除上清液。采用该New wash溶液进行的洗涤操作重复了3次。接着，在减压下干燥玻璃珠，干燥后，加入15μl灭菌水悬浮，在55℃加温15min后进行离心分离，得到含有DNA片段和表达载体的上清液12μl。通过该操作，由限制酶产生的约50bp以下的小的DNA片段被去除，得到了目的的DNA片段、和表达载体。

向这样制备的溶液10μl中加入Takara连接试剂盒-I溶液(宝酒造公司制)10μl，使混合物在16℃反应1小时。用该溶液转化感受态细胞(宝酒造公司：DH5α)。即，向在4℃解冻的感受态细胞溶液60μl中加入连接反应溶液5μl并混合，进行0℃×30min的处理后，进行42℃×45秒和0℃×2min的处理，向其中加入500μl SOC溶液(2％细菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、10mM NaCl、20mM葡萄糖、10mMMgSO₄、10mM MgCl₂)，在36℃恢复培养1小时，将该培养液100μl涂布在含有50μg/ml氨苄青霉素、40μg/ml X-gal、1mM IPTG的LB琼脂培养基(1％细菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％ NaCl、pH7.0、1.5％琼脂)上。进而在37℃培养16小时。通过该培养，筛选白色的集落得到通过上述的质粒的引入而转化的大肠杆菌，因此将其选择。在含有氨苄青霉素(50μg/ml)的Lb液体培养基中培养这样分离的转化大肠杆菌集落。从增殖的转化大肠杆菌的菌体利用质粒纯化试剂盒(QiA filter Plasmid Midi Kit，QIAGEN公司)分离和纯化质粒DNA。证实了所得的质粒DNA分别具有与目的ydgJ基因相当的约1.0-1.1kbp的DNA片段。

其次，为了确认鲨肌醇脱氢酶活性，将作为集落而分离的菌株移植到含有50μg/ml氨苄青霉素的100ml LB培养基(1％细菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％ NaCl、pH7.0)中，在36℃培养7小时，向该培养液中加入200mMIPTG溶液0.3ml，进一步在36℃培养3小时。培养结束后，通过离心分离收集菌体，用生理盐水将其洗涤1次。进而将洗涤菌体悬浮在0.6％ Triton-X 100溶液3ml中，在4℃利用超声波将菌破碎。离心分离该溶液，取出上清的酶液2.8ml，向上清加入1.2g硫酸铵，在4℃使蛋白质盐析。通过离心分离收集盐析了的蛋白质，去除上清，使该沉淀物溶解于2.5ml的20mM Tris缓冲液(pH7.0)中，再度进行离心分离，将上清应用到用20mM Tris缓冲液(pH7.0)平衡化的Sephadex G-25柱(Pharmacia K.K：14ml)中，用20mM Tris缓冲液(pH7.0)洗脱，进行了脱盐。通过该操作，得到了各自的基因产物的粗酶液3.5ml。

鲨肌醇脱氢酶的活性测定如下述：混合反应液(200mM Tris缓冲液pH8.0、2％ NADPH、1％青蟹肌糖)5μl、和5μl酶液，在36℃反应30min后，立即加入500μl的水，测定340nm的吸光度，测定用水代替酶液的试验液的空白值在340nm的吸光度的减少量。根据将酶液进行稀释。

另外，酶反应产物的测定如下述：在含有青蟹肌糖10mg、NADPH40mg、1.0ml 10U相当的酶的100mM Tris缓冲液(pH8.0)中在36℃反应4小时后，进行80℃×10min的加热处理，冷却后，加入强碱性阳离子交换树脂100μl、强酸性阴离子交换树脂100μl、活性炭10mg并搅拌，离心分离后，将上清稀释2倍，采用HPLC(Shodex AsahipakNH2P-50 4E Φ4.6×250mm：Shodex公司制)，在柱温度40℃、流动相流速1.5ml(80％乙腈)的条件下用RI检测器测定。其结果，来源于根癌土壤杆菌C58的Atu4375基因产物和Atu3234的基因产物、枯草芽孢杆菌168的BG14057基因产物，野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的Xcc3438基因产物以及AB10121的Atu4375基因和Atu3234的基因产物显示高酶活性，其产物100％是还原反应获得的鲨肌醇，未检测到肌醇异构体。结果发现，源于上述基因的重组酶具有高鲨肌醇脱氢酶活性，基因产物是鲨肌醇脱氢酶。青蟹肌糖还原反应产物只检测到鲨肌醇，检测到所述的酶将青蟹肌糖立体异构地还原成鲨肌醇。

来源于根癌土壤杆菌C58的Atu4375基因序列如SEQ.ID.NO：3所示，相应的氨基酸序列如SEQ.ID.NO：4号所示，Atu3234基因序列如SEQ.ID.NO：5所示，相应的氨基酸序列如SEQ.ID.NO：6上。另外，来源于枯草芽孢杆菌168的BG14057基因序列如SEQ.ID.NO：7所示，相应的氨基酸序列如SEQ.ID.NO：8号所示，来源于AB10121的Atu4375基因序列如SEQ.ID.NO：9所示，相应的氨基酸序列如在SEQ.ID.NO：10所示，Atu3234基因序列如SEQ.ID.NO：11所示，相应的氨基酸序列如SEQ.ID.NO：12号所示，来源于野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的Xcc3438基因序列如SEQ.ID.NO：13所示，相应的氨基酸序列如SEQ.ID.NO：14号上。另外，包含AB10121的Atu4375基因、和Atu3234基因的质粒的碱基序列(北海道系统科学公司)分析的结果，根癌土壤杆菌C58的Atu4375基因、和AB10121的Atu4375基因，其碱基序列上的同源性为89％，氨基酸序列上的同源性为96％，根癌土壤杆菌C58的Atu3234基因、和AB10121的Atu3234基因的碱基序列上的同源性为87％，氨基酸序列上的同源性为95％。

实施例13<编码醋酸杆菌AB10281FERM BP-10119产生的SIDH1的DNA的分离>

所纯化的酶之中，使含有SIDH1的酶液通过PVDF膜(ImmobilonPSQ：Millipore公司制)，吸附于PVDF膜上。取出该PVDF膜，用考马斯亮蓝染色液(Rapid CBB KANTO：关东化学公司制)染色后脱色，干燥后，利用N末端氨基酸分析装置(hewlett Packard)进行了分析。其结果，从N末端检测出Met-Lys-Arg-Lys-Leu-Arg-Ile-Gly-Leu-Ile-Gly-Ser-Gly-Phe-Met-Gly-Arg-Thr-His-Ala-Phe-Gly-Tyr-Ser序列，设想编码该氨基酸序列的DNA序列，制备了以下2种的引物。

序列号29：SIDH1-F1  atgaarcgnaarytncgiatyggyytiatygg

序列号30：SIDH1-F2  ggyttyatgggycgnacicaygcittyggyta

其次，以在实施例10-12中得到的各种鲨肌醇脱氢酶的碱基序列为基础，制备了包含序列内部的高度保守的区域的下述2种引物。

序列号31：SIDH1-B1  ggyttrtcrmmgayracrtgrstrcc

序列号32：SIDH1-B2  artgwrirtgrttgggigt

另外，作为模板的AB10281的基因组DNA，以在实施例9中制备的菌体片(湿重量约400mg)为对象，采用与在实施例12中记载的DNA制备方法同样的方法制备了AB10281的基因组DNA溶液。

PCR反应使用宝酒造公司的Ex taq反应液，该溶液的组成为：Takara ExTaq Buffer×10倍液5μl、dNTP混合物4μl、模板DNA30ng、10μM引物溶液各1μl(SIDH1-F1、和SIDH1-B1)、Takara ExTaq0.5μl，加入水达到50μl，并覆盖30μl的矿物油。反应条件，使用PCR扩增装置(ASTEC公司制PC-700)，变性(94℃，30秒)、退火(50℃，30秒)、延伸(72℃，1min)这3步的反应重复进行了35次。证实了：通过上述的PCR反应，在电泳后，扩增了约0.3kbp大小的DNA片段。进而从凝胶切取该0.3kbp的条带，将凝胶破碎溶液的一部分作为模板(2μl)，使引物的组合为SIDH1-F2和SIDH1-B2，除此以外以同样的PCR反应液组成制备反应液，反应条件，使用PCR扩增装置(ASTEC公司制PC-700)，变性(94℃，30秒)、退火(46℃，30秒)、延伸(72℃，1min)这3步的反应重复进行了35次。证实了：通过上述的PCR反应，在电泳后，扩增了约0.25kbp大小的DNA片段。

约0.25kbp大小的DNA片段，从凝胶切取该部分，使用GENECLEAN(Bio101公司制)纯化了PCR片段。即，除了使凝胶溶解于NaI溶液以外，采用与在实施例12中记载的纯化方法同样的方法得到了DNA片段溶液12μl。

其次，使纯化的DNA片段与pT7Blue载体连接。即，向DNA片段溶液10μl中加入pT7Blue载体0.5μg、Takara Ligation kit-I溶液(宝酒造公司制)10μl，在16℃反应1小时。用该溶液转化感受态细胞(宝酒造公司：DH5α)。转化操作、和来自转化的质粒的分离采用与实施例12同样的方法进行。

将得到的质粒使用通用引物(R-20mer和U-19mer)进行碱基序列分析(北海道系统科学公司)，结果，编码该酶的基因的碱基序列的前半部分约1/3得以明确。

而且，为了确定完全长的碱基序列，用限制酶BamHI完全消化AB10281的基因组DNA，将得到的DNA片段溶液使用GENECLEAN(Bio101公司制)纯化，然后使片段自连，将10μl宝生物公司Ligationkit-I溶液加入10μlDNA片段溶液中，使混合物在16℃反应1小时，反应后用GENECLEAN(Bio101公司制)纯化该DNA，形成用于反向PCR的模板DNA溶液。

接着，以明确了的前半部分约1/3的碱基序列为基础，制备下述3种引物，进行了反向PCR反应。

序列号33：SIDH1-INV-F  gctcgtcaacgatcctgaaattgat

序列号34：SIDH1-INV-B  ttcgctgcagcttcatcggaaatat

序列号35：SIDH1-INVF3  cccttcaatttccgggcgggt

反向PCR反应使用宝酒造公司的Ex taq反应液，该溶液的组成为：Takara ExTaq Buffer×10倍液5μl、dNTP混合物4μl、模板DNA30ng、10μM引物溶液1μl(SIDH1-INV-F和SIDH1-INV-B的组合、SIDH1-INV-F和SIDH1-INV3的组合)、Takara ExTaq 0.5μl，加入水达到50μl，并覆盖30μl的矿物油。反应条件，使用PCR扩增装置(ASTEC公司制PC-700)，变性(94℃，30秒)、退火(50℃，1min)、延伸(72℃，2min)这3步的反应重复进行了35次。通过上述的PCR反应，在电泳后，扩增了约2.7kbp、和约1.8kbp大小的DNA片段。从凝胶切取该约2.7kbp、和约1.8kbp的条带，使用GENECLEAN(Bio101公司制)纯化了PCR片段，得到DNA片段溶液10μl。对于得到的2种DNA片段，使用在PCR中使用的引物进行碱基序列分析(北海道系统科学公司)，确定了编码该酶的基因的全部碱基序列。

接着，为了克隆包含RBS位点的AB10281的SIDH1基因、作为重组酶而表达，使用具有以下序列的引物进行了PCR反应。

序列号36：281SIDH1-F  gctggatcccgcccttattgtgaata

序列号37：281SIDH1-R  tatgaattcgttatgccttctcatgctgtcg

PCR反应使用宝酒造公司的Ex taq反应液，该溶液的组成为：Takara ExTaq Buffer×10倍液5μl、dNTP混合物4μl、模板DNA30ng、10μM引物溶液1μl、Takara ExTaq 0.5μl，加入水达到50μl，并覆盖30μl的矿物油。反应条件，使用PCR扩增装置(ASTEC公司制PC-700)，变性(94℃，30秒)、退火(55℃，1min)、延伸(72℃，1min)这3步的反应重复进行了35次。通过上述的PCR反应，扩增了约1.2kbp大小的DNA片段。

约1.2kbp大小的DNA片段，使用GENECLEAN(Bio101公司制)纯化，得到了DNA片段溶液12μl。将该DNA片段导入表达载体中的操作如下述：向DNA片段溶液10μl中加入表达用质粒0.5μg(pUC119)、宝酒造公司的限制酶(BamHI和EcoRI)各1μl、宝酒造公司的限制酶用缓冲液K buffer×10倍液2μl，加入灭菌水以便达到20μl并混合。将该反应液在36℃反应2小时。

采用与实施例12同样的方法进行：从反应溶液回收、纯化DNA片段、连接反应、以及向感受态细胞(宝酒造公司：DH5α)转化。而且，用于确认鲨肌醇脱氢酶活性的、酶的表达、和活性测定方法也采用与实施例12同样的方法进行，证实了该基因产物是鲨肌醇脱氢酶。

作为结果，编码AB10281FERM BP-10119产出的SIDH1的基因的碱基序列如SEQ.ID.NO：27所示，另外，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO：28所示。

实施例14

<作为本发明酶的各种鲨肌醇脱氢酶的各种性质的研讨>

用以下所示的方法研讨：通过实施例9的纯化而得到的来源于AB10281的SIDH1、SIDH2、SIDH3、和作为实施例11的重组酶而得到的来源于大肠杆菌的ydgJ基因产物、和作为实施例12的重组酶而得到的根癌土壤杆菌C58的Atu4375基因产物、野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的Xcc3438基因产物、以及AB10121的Atu4375基因产物、Atu3234基因产物的作为酶的各种性质，表5记载了其结果。

另外，表6是表示氨基酸序列的同源性的表，在全部序列中只有共同的氨基酸的同源性为低(约5％)，但表明：当连具有相似性质的氨基酸，特别是N末端的前半部分约30％的NAD或NADP结合范围，其同源性高。而且，与NAD或NADP的氧化还原部位即烟酰胺的键有关的靠序列中央前半的赖氨酸-脯氨酸序列高度保守。从赖氨酸-脯氨酸序列到C末端侧第27位的天冬酰胺、和在序列中央附近的天冬氨酸-(3-氨基酸)-组氨酸序列也高度保守，由推定三维结构认为是与底物结合有关的重要的序列。表中，共通的序列用“＊”号表示，性质相似的氨基酸用“：”或“.”号表示，而且，赖氨酸-脯氨酸序列、从赖氨酸-脯氨酸序列到C末端侧第27位的天冬酰胺、在序列中央附近的天冬氨酸-(3-氨基酸)-组氨酸序列用阴影线标识出。

在分子量的比较中，来源于AB10281的本发明酶，从以分子量标记(预先染色·标本(宽围类型)：Bio-Rad公司制)为指标的SDS-PAGE的结果算出分子量，其他的本发明酶的分子量，从基因的全长算出推定的酶分子量。其结果，由酶纯化而得到的来源于AB10281的本发明酶SIDH1、SIDH2、SIDH3的分子量，分别是46k道尔顿、42k道尔顿、40k道尔顿。另外，作为实施例11的重组酶而得到的源于来源于大肠杆菌K-12的ydgJ基因的本发明酶的分子量是38.2道尔顿，作为实施例12的重组酶而得到的源于来源于根癌土壤杆菌C58的Atu4375基因、Atu3234基因的本发明酶的分子量分别是41.3道尔顿、42.4道尔顿，来源于枯草芽孢杆菌168的BG14057基因、野油菜黄单胞菌野油菜致病变种的Xcc3438基因、以及AB10121的Atu4375基因、Atu3234基因的本发明酶的分子量分别是40.1道尔顿、38.5道尔顿、41.4道尔顿、42.5道尔顿。也就是说，表明了：作为本发明酶的各种鲨肌醇脱氢酶，显示出38-46k道尔顿的分子量。

本发明酶的缔合特性，如下述那样测定：测定用凝胶过滤柱(2000SW_XL；Tosoh公司制)分馏的级分的活性，由相应的分子量级分计算分子量，将计算出的分子量除以酶的分子量得到的值取整数。其结果，作为本发明酶的各种鲨肌醇脱氢酶，显示出80-110k道尔顿的分子量，在未变性状态下，形成着2聚体或3聚体。

本发明酶的辅酶的选择性如下述那样测定：混合5μl反应液(200mM Tris缓冲液pH8.0、2％ NADPH或NADH、1％青蟹肌糖)、和5μl酶液，在36℃反应30min后，立即加入500μl的水，测定340nm的吸光度，测定用水代替酶液的试验液的空白值在340nm的吸光度的减少量。根据将酶液进行稀释。其结果，作为本发明酶的各种鲨肌醇脱氢酶，NADPH或NADH都可作为辅酶使用，显示出表5所示的辅酶相对活性。表明对NADPH良好地作用的酶较多。

本发明酶的最适pH如下述那样测定：混合反应液(200mM Tris缓冲液pH5.0-9.0、2％ NADPH、1％青蟹肌糖)5μl、和5μl酶液，在36℃反应30min后，立即加入500μl的水，测定340nm的吸光度，测定用水代替酶液的试验液的空白值在340nm的吸光度的减少量。根据将酶液进行稀释。其结果，作为本发明酶的各种鲨肌醇脱氢酶，显示出表5所示的最适pH。也就是表明了：本发明酶在pH5-9的宽范围内作用。另外也知道了：有最大活性在酸性侧的pH6附近的酶、在中性区pH6.5-7.5附近的酶、在碱性侧的pH7.5-9附近的酶。

本发明酶的热稳定性如下述那样测定：将酶液在所规定的温度处理10min后，冷却，混合该酶液和5μl反应液(200mM Tris缓冲液pH5.0-9.0、2％ NADPH、1％青蟹肌糖)，在36℃反应30min后，立即加入500μl的水，测定340nm的吸光度，测定用水代替酶液的试验液的空白值在340nm的吸光度的减少量。根据将酶液进行稀释。将20℃×10min处理区的活性记为100％，比较了相对活性。其结果作为本发明酶的各种鲨肌醇脱氢酶的热稳定性，如表5所示，根据各酶不同而不同，表明：根据酶，其稳定性也不同，处在40-60℃的范围。

本发明酶的重金属效应如下述那样测定：混合5μl反应液(200mMTris缓冲液pH8.0、2％ NADPH、1％青蟹肌糖、2mM金属盐)、和5μl酶液，在36℃反应30min后，立即加入500μl的水，测定340nm的吸光度，测定用水代替酶液的试验液的空白值在340nm的吸光度的减少量。根据将酶液进行稀释。金属盐的种类，使用CaCl₂、CoCl₂、ZnSO₄、MgSO₄、SnCl₂、NiCl₂、MnSO₄，将未添加区的活性记为100％，比较了相对活性。其结果，作为本发明酶的各种鲨肌醇脱氢酶，如表5所示，至少在Co²⁺离子的存在下被活化，在Sn²⁺离子的存在下被抑制。大部分的酶在Zn²⁺离子的存在下被抑制，但来源于枯草芽孢杆菌168的酶反倒在Zn²⁺离子的存在下被活化。

本发明酶对于青蟹肌糖的Km值，如下述那样测定：混合反应液(200mM Tris缓冲液pH8.0、2％ NADPH、0.001-2.5％青蟹肌糖)5μl、和5μl酶液，在36℃反应30min后，立即加入500μl的水，测定340nm的吸光度，测定用水代替酶液的试验液的空白值在340nm的吸光度的减少量。根据将酶液进行稀释。测定值被倒数作图，算出了Km值。其结果，作为本发明酶的各种鲨肌醇脱氢酶的Km值，如表5所示，显示出2.6-12.6mM的范围。

本发明酶的底物特异性，以氧化活性为指标，测定相对于对肌醇的反应性的相对活性。使用的肌醇异构体，是鲨肌醇(SI)、肌醇(MI)、D-chiro-肌醇(DCI)、L-chiro-肌醇(LCI)、epi-肌醇(EI)、muco-肌醇(MuI)、allo-肌醇(AI)、neo-肌醇(NI)。在表5中用相对活性为70％以上的区、小于70％但为20％以上的区、小于20％的区标识出。

底物特异性的测定方法如下述：混合反应液(各种肌醇异构体1％(只有neo-肌醇为0.4％)、200mM Tris缓冲液pH8.0、0.002％ NADP⁺、0.002％黄递酶、0.01％硝基四唑鎓蓝)50μl、和50μl酶液，在25℃每隔3min用微量培养板读出装置测定545nm的吸光度的增加。由在各个相应的时间时的吸光度的增量算出反应速度，结果酶的种类不同，底物特异性有少许不同，由与肌醇异构体的相关性也表明了：这些酶至少具有着鲨肌醇脱氢酶活性、和肌醇5-脱氢酶活性。

表6各种鲨肌醇脱氢酶的氨基酸序列同源性

E.coli.ydgJ(序列号2)————MSDNIRVGLIGYGYASKTFHAPLI——AGTPGQELAVIS—SSDETKV

X.camp.Xcc3438    ————MPKPFNLAVVGYGYVGRTFHAPLI——ASTPGLQLHSVV——SSKPQQP(序列号14)

B.sub.BG14057     -MITLLKGRRKVDTIKVGILGYGLSGSVFHGPLL——DVLDEYQISKIM——TSRTEEV(序列号8)

A.tume.Atu4375    —MSSATKKFDSRRIRLGMVGGGQGAFIGAVHRI——AARLDDRYELVAGALSSDPARA(序列号4)

AB10121Atu4375-   -MSSAPKKFDSRRIRLGMVGGGQGAFIGAVHRI——AARLDDRYELVAGALSSDPARA(序列号10)

A.tume.Atu3234    MAIEGKTTDVANKRIRLGMVGGGSGAFIGGVHRM——AARLDNRFDLVAGALSSTPEKS(序列号6)

AB10121Atu3234    MAIEGKTTDKANKRIRLGMVGGGSGAFIGGVHRM——AARLDNRFDLVAGALSSTPEKS(序列号12)

AB10281SIDH1      ————MTKRKLRIGLIGSG——FMGRTHAFGYSTASRVFDLPFQPELTCLADISDE(序列号28)

                               ::::::* *    :          .       .     .

E.coli.ydgJ      KADWPTVTVVSE————PKHLFNDPNIDLIVIPTPNDTHFPLAKAALEAGKHVVV

X.camp.Xcc3438    QADFREVRVLPD————LEAALADPALDAVVIATPNQTHAPMALQALAAGKHVLV

B.sub.BG14057     KRDFPDAEVVHE————LEEITNDPAIELVIVTTPSGLHYEHTMACIQAGKHVVM

A.tume.Atu4375   AASATLLGIAPERSYASFEDMAATEAGREDGIEAVAIVTPNHLHFAPSKAFLEAGIHVIC

AB10121Atu4375    从SATLLGlAPERSYASFEEMAAAEAGRDDGIEAVAIVTPNHLHFAPSKAFLEAGIHVIC

A.tume.Atu3234    LASGRELGLDSERCYGSFEEMAEKEALREDGIEAVAIVTPNHVHYPAAKAFLERGIHVIG

AB10121Atu3234    LASGRELGLDPERCYGSFEEMAEKEALREDGIEAVAIVTPNHVHYPAAKAFLERGIHVIC

AB10281S IDH1     AAAKAADALGFARSTSDWRTLV——NDPEIDVVNITAPNAFHKEMALAAIAAGKHVYC

                         :                   :  :: : : :*   *   :::. * **:

E.coli.ydgJ       DKPFTVTLSARELDALAKSLGRVLSVFHNRRWDSDFLTLKGLLAEGVLGEVAYFESHFD

X.camp.Xcc3438    DKPFALDAAARTVVDAAAEAGKIVSVFNRRWDADFLTVRRLIEDGQLGEVVEFHSHFD

B.sub.BG14057     EMTATAEEGETLKRAADEKGVLLSVYHNRRWDNDFLTIKKLISEGSLEDINTYQVSYN

A.tume.Atu4375    DKPVTATLEEAKALAGIVRASDSLFVLTHNYTGYAMLRMREMIAEGAIGKLRHVAEYA

AB10121Atu4375    DTATLEEAKALAEIVRASDSLFVLTYTGYAMLRMRQMVADGAIGKLRHVAEYA

A.tume.Atu3234    LTSNLEDAKKLKDVADKADALFILTYTGYPMVRHARELVEAGALGNIRLVQMEYP

AB10121Atu3234    DLTSNLEDAKKLKDVADKADALFILTHGYPMVRHARELVESGALGTIRLVQMEYP

AB10281SIDH1      EKPLAPLAADAREMAEAAEAKGVKTQVGFNYLCNPMLALARDMIAAGELGEIRGYRGLHA

                  :**.: .  .   :   .   .  :   *      .    : ::   * : . : .

E.coli.ydgJ      RFRPVRDRWREQGGP—GSGIWYDLAPHLLDQAITLFG-LPVSMTVDL

X.camp.Xcc3438    RYRP——VRDRWRESDIP—GAGLWYDLGPHLLDQALQLFG-MPQAI——SADL

B.sub.BG14057     RYRP——EVQARWREKEGT—ATGTLYDLGSHIDQTLHLFG-MPKAV——TANV

A.tume.Atu4375    DWLTEAVEKTGAKGAEWRTDPSRSGAGGAIGDIGTHAFNAAAFVTGEIPSSL——YADL

AB10121Atu4375    DWLTEAVEKTGAKGAEWRTDPSRSGAGGAIGDIGTHAFNAAAFVTGEIPKSL——YADL

A.tume.Atu3234   DWLTEAVEQTGAKQAVWRTDPASGVGGSTGDIGTHAYNLGCFISGLEADEL—AADV

AB10121Atu3234    DWLAEPIEQTGAKAVWRTDPASGAGGSTGDIGTHAYNLGCFISGLEVDEL——AADV

AB10281SIDH1     EDYMADA——SSPFTFRLDPA—GGGALADIGSHALATAEFLMGPAAGAITQVMGDC

                 :                ::  .   *    *:.:    *    :* .  :   .::

表6-2

E.coli.ydgJ          ALRPGA————STDYFHAILSYPQR————RVILHGTMLAAAESARYIVH

X.camp.Xcc3438        QRQRTQA————RSDDYFNVVLRYPRL————RVILHAGSLVADGSLRFAVH

B.sub.BG14057         MAQRENA————ETVDYFHLTLDYGKL————QAILYGGSIVPANGPRYQIH

A.tume.Atu4375        TSFVPGR————QLDDSANILLRYDSG——AKGMLWASQAVGNENALSLRVY

AB10121Atu4375        TSFVPGR————LDDSANILLRYESG——AKGMLWASQIAVGNENALSLRVY

A.tume.Atu3234        HTFVEGR————RLDDNAHVMMRFKPKGGKQPARGMLWCSVAVGHENGLKIRLY

AB10121Atu3234        HTFVEGR————RLDDNAHVMLRFKPKGGKQPAKGLLWCSQVAVGHENGLKVRVY

AB10281SIDH1          VTVIKTRPDGKGGTRAVEVDDIGRALLRFENG——ATGSVEGNWIATGRTMQHDFEVY

                         .          .  *  :  :  :            :    .     ::

E.coli.ydgJ          GSRGSYVKYGLDPQEERL—KNGERLP——QEDWGYDMRD—GVLTRVEGEERVEETL

X.camp.Xcc3438        GTRGSYLKHGADTQEDQL—RAGRRPG——TAGWGMDPLP—GTLTRVDDEGRVHTHQ

B.sub.BG14057         GKDSSFIKYGIDGQEDAL—RAGRKPE——DDSWGADVPEFYGKLTTIRGSDKKTETI

A.tume.Atu4375        GDKGGLEWHHRVPDELWF—TPYGEPKRLITRNGAGAGAAANRVSRVPSGHPEGYLEGFA

AB10121Atu4375        GEKGGLEWHHRVPDELWF—TPYGEPKRLITRNGAGAGAAANRVSRVPSGHPEGYLEGFA

A.tume.Atu3234        GDKAGLEWTQADPNYLWF—TKLGEPKQLITRGGAGAGAAAARVTRIPSGHPEGYLEAFA

AB10121Atu3234        GDKAGIEWTQADPNYLWF—TKLGELKQLITRGGAGAGAAAARVTRIPSGHPEGYLEAFA

AB10281SIDH1         GTKGALAFTQQRFNELHFFSSTDARGRKGFRRIEAGPEHAPYGLFCVAPGHLGFN—

                      *.  ..       ..    .          .          :.  .  .

E.coli.ydgJ           LT-VPGNYPAYYAAIRDALNGDGENPV-PASQAIQVMELIELGIESAKHRATLCLA——

X.camp.Xcc3438        PDGVPGDYRHCYAAFRDAMAGTAPPPV-SAADAVRLMELLELAQRGARLGQVLWLEGNSS

B.sub.BG14057         PS-VNGSYLTYYRKIAESIREGAALPV-TAEEGINVIRIIEAAMESSKEKRTIMLE—

A.tume.Atu4375        TI-YREAADAIIAKREGETAAGEVIYP-GMEDGLAGLAFIDAAVRSSQ-TSTWNGIDI

AB10121Atu4375        TI-YREAADAIIAKREGKAAAGEVIYP-GMEDGLAGLAFIDAAVRSSQ-TSTWINIDI--

A.tume.Atu3234        TI-YTEAAHAIEARRTGSALDKAVIYP-TVDDGVKGVAFVTACIESGKKNGGMVKL——

AB10121Atu3234        TI-YTEAAHAIEARRTGSVLDKAVIYP-TVDDGVKGVAFVTACIESGKKNGVWVKL——

AB10281SIDH1          ————LKAIEVARYLEALAGHHPEPFNFRAGLRITLVETIHASS-KSAAWRDVPTDK

                                .:::   .::    ..:.    .:    ::    :      :

E.coli.ydgJ           ————

X.camp.Xcc3438        D————

B.sub.BG14057         ————

A.tume.Atu4375        ————

AB10121Atu4375        ————

A.tume.Atu3234        ————

AB10121Atu3234        ————

AB10281SIDH1          LQAKSRQHEKA

实施例15

<使用本发明酶的鲨肌醇的制备>

在本制备方法中使用的酶，需要肌醇2-脱氢酶、和本发明酶这2种。在此，示出使用作为来源于枯草芽孢杆菌168 ATCC23857的BG10669基因产物的肌醇2-脱氢酶、和由本发明DNA编码(来源于大肠杆菌K12株的ydgJ基因：SEQ.ID.NO：1)的本发明酶的重组酶的实施例。

首先，为了得到作为来源于枯草芽孢杆菌168 ATCC23857的BG10669基因产物的肌醇2-脱氢酶的重组酶，进行了以下的实验。为了来源于枯草芽孢杆菌168 ATCC23857的BG10669基因的克隆、且为了作为重组酶而表达，使用具有下述序列的引物进行了PCR反应。

序列号25：BG10669-F  5’-ttgggatccgatgagtttacgtattggcgtaattg-3’

序列号26：BG10669-R  5’-aaactgcagttagttttgaactgttgtaaaagattgata-3’

PCR反应使用宝酒造公司的Ex taq反应液，该溶液的组成为：Takara ExTaq Buffer×10倍液5μl、dNTP混合物4μl、模板DNA30ng、10μM引物溶液各1μl、Takara ExTaq 0.5μl，加入水达到50μl，并覆盖30μl的矿物油。反应条件，使用PCR扩增装置(ASTEC公司制PC-700)，变性(94℃，30秒)、退火(53℃，1min)、延伸(72℃，1min)这3步的反应重复进行了35次。通过上述的PCR反应，扩增了约1.0kb大小的DNA片段。反应后，重复3次：用0.3ml己烷提取覆盖的矿物油，并去除己烷层的操作，通过减压1min，去除了矿物油。使用GENECLEAN(Bio101公司制)从所得的反应液50μl纯化了PCR片段。即，加入300μl试剂盒中的NaI溶液并混合，加入10μl玻璃珠溶液并混合，在4℃静置15min后，离心分离，使吸附DNA片段的玻璃珠沉淀，去除上清液。进一步地加入试剂盒中的New wash溶液500μl，使玻璃珠悬浮，离心分离，去除上清液。采用该New wash溶液进行的洗涤操作重复了3次。接着，在减压下干燥玻璃珠，干燥后，加入15μl灭菌水悬浮，在55℃加温15min后进行离心分离，得到含有DNA片段的上清液12μl。

将纯化的DNA片段导入表达载体中的操作如以下所示地进行。即，向DNA片段溶液10μl中加入表达用质粒(pUC118：宝酒造公司制)0.5μg、宝酒造公司的限制酶BamHI、PstI各1μl、宝酒造公司的限制酶用缓冲液K buffer×10倍液2μl，加入灭菌水以便达到20μl并混合。将该反应液在36℃反应2小时。限制酶反应后，使用GENECLEAN分离DNA片段和表达载体，使它们连接。即，向限制酶反应液20μl中加入试剂盒中的NaI溶液300μl并混合，加入10μl玻璃珠溶液并混合，在4℃静置15min后，离心分离，使吸附DNA片段和表达载体的玻璃珠沉淀，去除上清液。进一步地加入试剂盒中的New wash溶液500μl，使玻璃珠悬浮，离心分离，去除上清液。采用该New wash溶液进行的洗涤操作重复了3次。接着，在减压下干燥玻璃珠，干燥后，加入15μl灭菌水悬浮，在55℃加温15min后进行离心分离，得到含有DNA片段和表达载体的上清液12μl。通过该操作，由限制酶产生的约50bp以下的小的DNA片段被去除，得到了目的的DNA片段、和表达载体。

向这样制备的溶液10μl中加入Takara Ligation kit-I溶液(宝酒造公司制)10μl，使混合物在16℃反应1小时。用该溶液转化感受态细胞(宝酒造公司：DH5α)。即，向在4℃解冻的感受态细胞溶液60μl中加入连接反应溶液5μl并混合，进行0℃×30min的处理后，进行42℃×45秒和0℃×2min的处理，向其中加入500μl SOC溶液(2％细菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、10mM NaCl、20mM葡萄糖、10mMMgSO₄、10mM MgCl₂)，在36℃恢复培养1小时，将该培养液100μl涂布在含有50μg/ml氨苄青霉素、40μg/ml X-gal、1mM IPTG的LB琼脂培养基(1％细菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％ NaCl、pH7.0、1.5％琼脂)上。进而在37℃培养16小时。通过该培养，筛选白色的集落得到通过上述的质粒的引入而转化的大肠杆菌，因此将其选择。在含有氨苄青霉素(50μg/ml)的Lb液体培养基中培养这样分离的转化大肠杆菌集落。从增殖的转化大肠杆菌的菌体利用质粒纯化试剂盒(QiA filter Plasmid Midi Kit，QIAGEN公司)分离和纯化质粒DNA。证实了所得的质粒DNA分别具有与目的BG10669基因相当的约1.0kbp的DNA片段。

其次，为了确认肌醇2-脱氢酶活性，将作为集落而分离的菌株移植到30个含有50μg/ml氨苄青霉素的100ml LB培养基(1％细菌用胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％ NaCl、pH7.0)中，在36℃培养7小时，向每个这种培养液100ml中加入200mM IPTG溶液0.3ml，进一步在36℃培养3小时。培养结束后，通过离心分离收集菌体，用生理盐水将其洗涤1次。进而将洗涤菌体悬浮在0.6％ Triton-X100溶液3ml中，在4℃利用超声波将菌破碎。离心分离该溶液，取出上清的酶溶液84ml，向上清加入36g硫酸铵，在4℃使蛋白质盐析。通过离心分离收集盐析了的蛋白质，去除上清，使该沉淀物溶解于75ml的20mM Tris缓冲液(pH7.0)中，再度进行离心分离，将上清应用到用20mM Tris缓冲液(pH7.0)平衡化的Sephadex G-25柱(Pharmacia制)(400ml)中，用20mM Tris缓冲液(pH7.0)洗脱，进行了脱盐。通过该操作，得到了作为BG10669基因产物的粗酶液105ml。

肌醇2-脱氢酶还原活性如以下所示测定：混合反应液(200mM Tris缓冲液pH8.0、2％ NADH、1％青蟹肌糖)5μl、和5μl酶液，在36℃反应30min后，立即加入500μl的水，测定340nm的吸光度，由代替酶液使用水的试验管的空白值测定340nm的吸光度的减少量。根据将酶液进行稀释，证实了该酶具有还原青蟹肌糖的活性。另一方面，氧化活性的测定方法如下进行：混合反应液(肌醇或鲨肌醇1％、200mMTris缓冲液pH8.0、0.002％ NAD⁺、0.002％黄递酶、0.01％硝基四唑鎓蓝)50μl、和50μl酶液，在25℃每隔3min用微量培养板读出装置测定545nm的吸光度的增加。由在各个相应的时间时的吸光度的增量算出反应速度，所制备的酶的氧化活性，证实了对肌醇显示活性，对鲨肌醇不显示活性。

使用这样制备的肌醇2-脱氢酶酶溶液、和在实施例11中制备的鲨肌醇脱氢酶粗酶溶液(用30倍规模的3L培养液制备的酶液105ml)，进行了从肌醇向鲨肌醇的转化反应。为制备反应溶液，加入肌醇200g、5％青蟹肌糖70ml、CoCl₂130mg、MgSO₄·7H₂O250mg、和水，使之达到750ml，加热至50℃，使肌醇溶解。将该溶液冷却到36℃，用1N的NaOH调pH至8.0，加水使体积达790ml，在36℃加入肌醇2-脱氢酶的粗酶液105ml、鲨肌醇脱氢酶粗酶溶液105ml、NADP⁺70mg，将达到约1L的溶液在36℃保温，边缓慢搅拌边使之反应。因为反应液的pH慢慢变成酸性，因此用1N NaOH调整以便达到pH8.0。42小时后，在反应液中产生鲨肌醇的晶体，得到白浊的反应液。用滤纸过滤该溶液，回收了结晶性鲨肌醇(湿重量73g)。向该固体加入3L水，在50℃使之溶解，加入水以便达到4.5L，冷却到室温，将得到的溶液离心分离(8,000rpm 20min)，使去除了微量的不溶物的上清液顺序在强碱性阳离子交换树脂100ml柱、强酸性阴离子交换树脂100ml柱、活性炭50ml柱中通过，得到洗脱了的洗脱液之后，将洗脱液与为了洗涤柱而使500ml水按上述顺序在柱中通过并使之洗脱的洗涤液一起浓缩。

作为浓缩的结果，在溶液的量变少时，开始析出鲨肌醇的微晶，浓缩到内容物变为130g为止，将其冷却到4℃后，放置一夜。放置后，过滤变成浆状的物质，用少量的水洗涤滤纸上的鲨肌醇晶体后，在105℃使之干燥3小时。得到的鲨肌醇为白色的晶体(61g)，在NMR分析及HPLC分析中，晶体未发现杂质，是纯度99％以上的晶体。来自肌醇的收得率为31％。另外，过滤出的反应液还能使用，当使之溶解64g肌醇时，结晶性鲨肌醇进一步析出了。

实施例16

<鲨肌醇·硼酸复合体的形成、及形成条件的研讨>

将粉末的青蟹肌糖100g溶解于500ml热水中，冷却到室温后，加入水，使之达到900ml。使用5当量NaOH水溶液将该溶液调至pH7.5，进一步加入水，使之达到1升。

边搅拌边用15min向该溶液缓慢加入粉末的NaBH₄ 5.9g，进行了还原反应。反应溶液的温度因反应热而上升到38℃。30min后冷却到32℃，使硼酸67.5g和NaCl 72.2g溶解于反应液中，制备了复合体形成用溶液。该溶液的pH为5.9。

接着，将使用8当量NaOH水溶液调至pH6.0的复合体形成用溶液100ml装进200ml容积的带盖的塑料容器中，而且，将使用8当量NaOH水溶液调至pH7.0的复合体形成用溶液100ml以同样的操作装进另一同样的容器中，还有，调整达到pH8.0、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、12.0及12.8的复合体形成用溶液各100ml也顺次分装到各自的容器中。

这样进行了pH调整的溶液开始缓慢地形成了沉淀。每隔1天滤选出沉淀，滤液使用8当量NaOH水溶液将pH调至所规定的pH之后返回到原来的容器中，得到的沉淀干燥后，测定了重量。本来通过还原生成的鲨肌醇全部变成鲨肌醇·硼酸复合体，而且全部以沉淀形式得到时，沉淀的重量达到61.8g，因此每隔1天累计从各进行了pH调整的溶液得到的沉淀的重量，将累计值除以理论收获量61.8g所得到的值作为鲨肌醇·硼酸复合体沉淀的回收率。

所得的数值汇总于表中，如以下所示。

表中的灰色部分表示回收率超过了90％的试验区。

表7

如表7所示，表明处理pH9.5的试验区最适于形成鲨肌醇·硼酸复合体沉淀。另外，pH9.0、pH9.5、pH10.0的试验区在第4天之前显示出90％以上的回收率，表明即使日期延长，回收率也达到94％的定值。

从pH9.5的试验区的第7天的滤液的NMR分析表明，在溶液中残留着5.9％(w/v)的肌醇、约0.2％(w/v)的鲨肌醇。也就是表明：0.2％(w/v)以上浓度的鲨肌醇·硼酸复合体可根据本方法以沉淀形式取得。

实施例17

<用青蟹肌糖还原混合液形成鲨肌醇·硼酸复合体，使复合体溶解后，使用离子交换树脂将鲨肌醇游离、脱盐的方法>

将粉末的青蟹肌糖10g(56mmol)溶解于50ml热水中，冷却到室温后，加入水，使之达到90ml。使用5当量NaOH水溶液将该溶液调至pH7.5，进一步加入水，使之达到100ml。

边搅拌边用15min向该溶液缓慢加入粉末的NaBH₄ 0.59g，进行了还原反应。反应溶液的温度因反应热而上升到36℃。30min后冷却到31℃，使硼酸6.75g和NaCl 7.22g溶解于反应液中，制备了复合体形成用溶液。接着，使用5当量NaOH水溶液将该复合体形成用溶液调至pH9.5，边搅拌边装进pH stat装置，使用5当量NaOH水溶液使之维持pH9.5。3天后过滤在复合体形成用溶液中析出的沉淀，用少量的水洗涤，干燥后，得到5.71g(20.5mmol)的鲨肌醇·硼酸复合体。

向得到的鲨肌醇·硼酸复合体5.71g中加入1.05当量的盐酸溶液230ml，溶解鲨肌醇·硼酸复合体，得到溶解液。该溶解液为0.2当量的酸性溶液。接着，以每分钟2ml的流度使溶解液在用200ml强酸性离子交换树脂(Duolite C20、H⁺类型，住友化学制)装满的柱中通过，使得到的洗脱液在用400ml强碱性离子交换树脂(Duolite A116、OH⁺类型，住友化学制)装满的柱中通过，浓缩得到的洗脱液，得到白色粉末3.52g(19.5mmol)。通过NMR分析，表明是鲨肌醇。另外，来自青蟹肌糖的收得率是35％。

实施例18

<用青蟹肌糖还原混合液形成鲨肌醇·硼酸复合体，将复合体溶解后，采用有机溶剂沉淀将鲨肌醇游离、结晶化的方法>

将用粉末的青蟹肌糖10g(56mmol)采用与实施例17所示的方法同样的方法制备的5.71g(20.5mmol)的鲨肌醇·硼酸复合体作为原料。

将鲨肌醇·硼酸复合体5.71g与搅拌器一起放入100ml容积的带盖锥形烧瓶中，加入22.8ml的1.83当量的盐酸溶液，制备了悬浮液。搅拌1小时后，加入23ml甲醇，进一步搅拌。5小时后过滤悬浮液，用少量的甲醇洗涤固体，使之干燥，得到粗鲨肌醇3.58g(20.0mmol)。

进一步地，将得到的粗鲨肌醇3.58g溶解于230ml水中，加入20ml强酸性离子交换树脂(Duolite C20、H⁺类型)、40ml强碱性离子交换树脂(Duolite A116、OH⁺类型)并搅拌。搅拌30min后，过滤出离子交换树脂，浓缩得到的滤液，得到白色粉末3.41g(18.9mmol)。该白色粉末通过NMR分析，表明是鲨肌醇。另外，来自青蟹肌糖的收得率是34％。

实施例19

<还原青蟹肌糖后，直接使鲨肌醇游离、结晶化的方法>

将粉末的青蟹肌糖5g(28mmol)溶解于40ml热水中，冷却到室温之后，使用5当量NaOH水溶液将该溶液调至pH7.5，加入水使之达到45ml。

边搅拌边用15min向该溶液缓慢加入粉末的NaBH₄ 0.29g，进行了还原反应。反应溶液的温度因反应热而上升到37℃。30min后冷却到30℃，使用5当量盐酸将反应液调至pH1.0。然后，加入水使之达到50ml，形成0.1当量的酸性溶液。接着，边搅拌边向该溶液加入甲醇25ml，溶液10min后就开始缓慢地混浊，进一步搅拌该悬浮液24小时。24小时后，过滤悬浮液，用少量的甲醇洗涤，干燥后，得到1.55g(8.6mmol)的粗鲨肌醇。

进而，将得到的粗鲨肌醇1.55g溶解于120ml水中，加入10ml强酸性离子交换树脂(Duolite C20、H⁺类型)、20ml强碱性离子交换树脂(Duolite A116、OH⁺类型)并搅拌。搅拌30min后，过滤出离子交换树脂，浓缩得到的滤液，得到白色粉末1.51g(8.3mmol)。该白色粉末通过NMR分析，表明是鲨肌醇。另外，来自青蟹肌糖的收得率是30％。

工业实用性

根据本发明，用廉价的肌醇只通过微生物转化或酶反应，就能够直接制备作为医药品有利用价值的鲨肌醇，能够高效率地制备鲨肌醇。另外，本发明的制备方法也有难产生异构体的优点。

通过使用本发明的NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶，不向反应液中添加NAD⁺就能够制备青蟹肌糖。而且，通过还原所得到的青蟹肌糖，能够简便且高效率地得到高纯度的鲨肌醇。

根据本发明，能够用含有鲨肌醇和鲨肌醇以外的中性糖的混合液高效率地形成鲨肌醇·硼酸复合体，能够采用高效而简便的操作从所得到的鲨肌醇·硼酸复合体得到高纯度的鲨肌醇。

序列表

<110>Hokko CHEMICAL INDUSTRY CO.，LTD.

<120>鲨肌醇的制造方法

<130>0P-C4204

<150>JP2003-353490

<151>2003-10-14

<150>JP2003-353491

<151>2003-10-14

<150>JP2004-18128

<151>2004-1-27

<150>JP2004-194088

<151>2004-6-30

<160>37

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1041

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1041)

<223>

<400>1

<210>2

<211>346

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>2

<210>3

<211>1170

<212>DNA

<213>根癌土壤杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1170)

<223>

<400>3

<210>4

<211>389

<212>PRT

<213>根癌土壤杆菌

<400>4

<210>5

<211>1188

<212>DNA

<213>根癌土壤杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1188)

<223>

<400>5

<210>6

<211>395

<212>PRT

<213>根癌土壤杆菌

<400>6

<210>7

<211>1077

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1077)

<223>

<400>7

<210>8

<211>358

<212>PRT

<213>枯草芽孢杆菌

<400>8

<210>9

<211>1170

<212>DNA

<213>土壤杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1170)

<223>

<400>9

<210>10

<211>389

<212>PRT

<213>土壤杆菌

<400>10

<210>11

<211>1188

<212>DNA

<213>土壤杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1188)

<223>

<400>11

<210>12

<211>395

<212>PRT

<213>土壤杆菌

<400>12

<210>13

<211>1059

<212>DNA

<213>野油菜黄单胞菌.野油菜致病变种

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1059)

<223>

<400>13

<210>14

<211>352

<212>PRT

<213>野油菜黄单胞菌.野油菜致病变种

<400>14

<210>15

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>15

<210>16

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>16

<210>17

<211>32

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>17

<210>18

<211>29

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>18

<210>19

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>19

<210>20

<211>26

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>20

<210>21

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>21

<210>22

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>22

<210>23

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>23

<210>24

<211>34

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>24

<210>25

<211>35

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>25

<210>26

<211>39

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>26

<210>27

<211>1179

<212>DNA

<213>醋酸杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1179)

<223>

<400>27

<210>28

<211>392

<212>PRT

<213>醋酸杆菌

<400>28

<210>29

<211>32

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(9)，(15)

<223>n＝a，t，g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(18)，(27)

<223>n＝肌苷

<400>29

<210>30

<211>32

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(15)

<223>n＝a，t，g或c

<220>

<221>misc_feature

<222>(18)，(24)

<223>n＝肌苷

<400>30

<210>31

<211>26

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>31

<210>32

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<220>

<221>misc_feature

<222>(7)，(17)

<223>n＝肌苷

<400>32

<210>33

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>33

<210>34

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>34

<210>35

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>35

<210>36

<211>26

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>36

<210>37

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>37

Claims (42)

1.一种鲨肌醇的制备方法，其特征在于，通过使属于醋酸杆菌属(Acetobacter)或伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)的、具有将肌醇转化成鲨肌醇的能力的微生物在含有肌醇的溶液中与肌醇作用，从而使上述溶液中生成、积累鲨肌醇，然后从该溶液中收集鲨肌醇。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，上述含有肌醇的溶液是含有肌醇的液体培养基，通过在该液体培养基中培养上述微生物，从而使之与肌醇作用。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，使通过培养得到的上述微生物菌体在上述溶液中与肌醇作用。

4.根据权利要求1-3的任1项所述的制备方法，其中，上述微生物是属于啤酒醋酸杆菌(Acetobacter cerevisiae)、Acetobactermalorum、或须芒草伯克霍尔德氏菌(Burkholderia andropogonis)的微生物。

5.根据权利要求1-3的任1项所述的制备方法，其中，上述微生物是保藏号为FERM BP-10119的醋酸杆菌AB10281或其突变株。

6.一种具有将肌醇转化成鲨肌醇的能力的、保藏号为FERM BP-10119的醋酸杆菌AB10281或其突变株。

7.一种至少具有下述理化性质的NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶，(a)作用：在电子受容物的存在下，催化从肌醇夺取电子，生成青蟹肌糖的反应；(b)最适pH：在pH4.5-5.5下活性显示出最大值；(c)辅因子：每1摩尔的酶中含有1摩尔的血红素铁；(d)抑制剂：酶活性被1mM的Sn²⁺离子抑制在1％以下；(e)亚单位结构：是至少含有分子量76k道尔顿和46k道尔顿的蛋白质的异聚体；(f)底物特异性：与D-chiro-肌醇、muco-肌醇、肌醇反应，分别转化成D-chiro-1-肌糖、L-chiro-2-肌糖、青蟹肌糖，不与allo-肌醇、鲨肌醇、L-chiro-肌醇、葡萄糖反应。

8.一种NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶的制备方法，其特征在于，培养具有生产NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶能力的属于醋酸杆菌属的微生物，从所培养的微生物菌体分离纯化NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其中，上述微生物是保藏号为FERM BP-10136的醋酸杆菌AB10253。

10.一种青蟹肌糖的制备方法，其特征在于，在含有肌醇和电子受体的溶液中使NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶与肌醇作用，生成青蟹肌糖，从溶液中分离纯化生成的青蟹肌糖。

11.一种鲨肌醇的制备方法，包括：在含有肌醇和电子受体的溶液中使NAD⁺非依赖型肌醇2-脱氢酶与肌醇作用，生成青蟹肌糖的步骤；使还原剂与上述青蟹肌糖作用，生成鲨肌醇的步骤；以及，分离纯化上述鲨肌醇的步骤。

12.一种具有下述理化性质的鲨肌醇脱氢酶，反应：如下述反应式所示，催化鲨肌醇与青蟹肌糖间的氧化还原反应、在NADH或NADPH存在下将青蟹肌糖立体特异地还原成鲨肌醇。

[化1]

青蟹肌糖                   鲨肌醇

13.根据权利要求12所述的鲨肌醇脱氢酶，其中，还进一步具有下述的理化性质，(a)分子量及缔合特性：38-46k道尔顿，形成2聚体或3聚体；(b)辅酶：将NAD⁺或NADP⁺或者NADH或NADPH作为辅酶；(c)活化重金属：在Co²⁺离子的存在下被活化；(d)抑制重金属：在Sn²⁺离子的存在下被抑制；(e)最适pH：在pH5-9下具有活性。

14.下述(A)或(B)的蛋白质，

(A)包含SEQ.ID.NO：28所示的氨基酸序列的蛋白质；

(B)包含在SEQ.ID.NO：28所示的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸发生取代、缺失、插入、和/或附加的氨基酸序列，并具有催化鲨肌醇与青蟹肌糖间的氧化还原反应、在NADH或NADPH存在下将青蟹肌糖立体特异地还原成鲨肌醇的酶活性的蛋白质。

15.编码下述(A)或(B)的蛋白质的DNA，

(A)包含SEQ.ID.NO：28所示的氨基酸序列构成的蛋白质；

(B)包含在SEQ.ID.NO：28所示的氨基酸序列中有1个或2-20个氨基酸发生取代、缺失、插入、和/或附加的氨基酸序列，并具有催化鲨肌醇与青蟹肌糖间的氧化还原反应、在NADH或NADPH存在下将青蟹肌糖立体特异地还原成鲨肌醇的酶活性的蛋白质。

16.下述(a)或(b)的DNA，

(a)包含SEQ.ID.NO：27所示的碱基序列的编码区的DNA；

(b)与具有SEQ.ID.NO：27所示的碱基序列或与该碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格条件下杂交，并编码具有催化鲨肌醇与青蟹肌糖间的氧化还原反应、在NADH或NADPH存在下将青蟹肌糖立体特异地还原成鲨肌醇的酶活性的蛋白质的DNA。

17.一种包含权利要求15或16所述的DNA的载体。

18.一种保留权利要求15或16所述的DNA、或者权利要求17所述的载体的转化微生物。

19.根据权利要求18所述的转化微生物，转化的宿主是大肠杆菌。

20.一种鲨肌醇脱氢酶的制备方法，其特征在于，培养权利要求18或19所述的转化微生物，从培养物收集鲨肌醇脱氢酶。

21.一种鲨肌醇的制备方法，其特征在于，使权利要求12所述的鲨肌醇脱氢酶、和催化在NAD⁺或NADP⁺存在下氧化肌醇生成青蟹肌糖的反应的肌醇2-脱氢酶(EC1.1.1.18)共存的溶液中，在pH6.0-8.5下且在NAD⁺或NADP⁺存在下，将肌醇作为底物，使之发生酶转化反应成为鲨肌醇。

22.根据权利要求21所述的鲨肌醇的制备方法，其特征在于，在溶液中添加青蟹肌糖并使之达到0.01-3％。

23.根据权利要求21所述的鲨肌醇的制备方法，其特征在于，在溶液中添加青蟹肌糖并使之达到0.2-0.5％。

24.根据权利要求21所述的鲨肌醇的制备方法，其特征在于，在溶液中添加Co盐和/或Mg盐，并使之达到0.01-5.0mM。

25.根据权利要求21所述的鲨肌醇的制备方法，其特征在于，在溶液中添加Co盐和/或Mg盐，并使之达到0.2-2.0mM。

26.根据权利要求21所述的鲨肌醇的制备方法，其特征在于，进行制备使得溶液中的肌醇浓度达到5-22％，使经酶反应生成的鲨肌醇在反应溶液中结晶化，将鲨肌醇以晶体形式筛选到体系外。

27.根据权利要求21所述的制备方法，其中，鲨肌醇脱氢酶是下述(A)或(B)的蛋白质，

(A)包含SEQ.ID.NO：28所示的氨基酸序列的蛋白质；

(B)包含在SEQ.ID.NO：28所示的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸发生取代、缺失、插入、和/或附加的氨基酸序列，并具有催化鲨肌醇与青蟹肌糖间的氧化还原反应、在NADH或NADPH存在下将青蟹肌糖立体特异地还原成鲨肌醇的酶活性的蛋白质。

28.根据权利要求21所述的制备方法，其中，鲨肌醇脱氢酶是由下述(a)或(b)的DNA编码的蛋白质，

(a)包含SEQ.ID.NO：27所示的碱基序列的编码区的DNA；

(b)与具有SEQ.ID.NO：27所示的碱基序列或与该碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格条件下杂交，并编码具有催化鲨肌醇与青蟹肌糖间的氧化还原反应、在NADH或NADPH存在下将青蟹肌糖立体特异地还原成鲨肌醇的酶活性的蛋白质的DNA。

29.根据权利要求21所述的制备方法，其中，鲨肌醇脱氢酶是下述(C)或(D)的蛋白质，

(C)包含SEQ.ID.NO：2、4、6、8、10、12或14所示的氨基酸序列的蛋白质；

(D)包含在SEQ.ID.NO：2、4、6、8、10、12或14所示的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸发生取代、缺失、插入、和/或附加的氨基酸序列，并具有催化鲨肌醇与青蟹肌糖间的氧化还原反应、在NADH或NADPH存在下将青蟹肌糖立体特异地还原成鲨肌醇的酶活性的蛋白质。

30.根据权利要求21所述的制备方法，其中，鲨肌醇脱氢酶是由下述(c)或(d)的DNA编码的蛋白质，

(c)包含在SEQ.ID.NO：1、3、5、7、9、11或13所示的碱基序列的编码区的DNA；

(d)与具有SEQ.ID.NO：1、3、5、7、9、11或13所示的碱基序列或与该碱基序列互补的碱基序列的DNA在严格条件下杂交，并编码具有催化鲨肌醇与青蟹肌糖间的氧化还原反应、在NADH或NADPH存在下将青蟹肌糖立体特异地还原成鲨肌醇的酶活性的蛋白质的DNA。

31.一种鲨肌醇的制备方法，包括，在含有鲨肌醇及鲨肌醇以外的中性糖的混合液中，加入溶解于该混合液中的鲨肌醇的2倍摩尔以上的量的硼酸和金属盐，且将该混合液的pH调至8.0-11.0，形成鲨肌醇·硼酸复合体的第1步骤；从混合液分离上述复合体的第2步骤；使经分离的复合体溶解于酸中，从而使之分解为鲨肌醇和硼酸的第3步骤；由在第3步骤中得到的酸性溶液或酸性悬浮液分离纯化鲨肌醇的第4步骤。

32.根据权利要求31所述的制备方法，其特征在于，在上述第1步骤中，加入的硼酸和金属盐的量是在上述溶解于混合液中的鲨肌醇的2倍摩尔以上、且3倍摩尔以下。

33.根据权利要求31所述的制备方法，其特征在于，在上述第1步骤中，将上述混合液的pH调整为9.0-10.0。

34.根据权利要求31所述的制备方法，其中，上述金属盐是选自NaCl、NaHCO₃、Na₂CO₃、Na₂SO₄、NaHSO₄、NaH₂PO₄、Na₂HPO₄、Na₃PO₄、硼砂、KCl、KHCO₃、K₂CO₃、K₂SO₄、KHSO₄、KH₂PO₄、K₂HPO₄、K₃PO₄、MgCl₂、MgCO₃、及MgSO₄的1种或2种以上的金属盐。

35.根据权利要求31所述的制备方法，其中，上述含有鲨肌醇及鲨肌醇以外的中性糖的混合液，是通过在含有青蟹肌糖的溶液中还原青蟹肌糖而得到的含有肌醇和鲨肌醇的混合液。

36.根据权利要求31所述的制备方法，其特征在于，在上述第3步骤中，将使上述复合体溶解于酸而得到的溶液调至0.1当量以上的酸性，并且，在上述第4步骤中，使上述酸性溶液与强酸性离子交换树脂、及强碱性离子交换树脂或硼酸选择性吸附树脂接触后，从该酸性溶液析出鲨肌醇。

37.根据权利要求31所述的制备方法，其特征在于，在上述第4步骤中，向上述酸性溶液或酸性悬浮液中加入水溶性有机溶剂，使鲨肌醇析出。

38.根据权利要求37所述的制备方法，其特征在于，上述水溶性有机溶剂是乙醇或甲醇，相对于上述酸性溶液或酸性悬浮液，加入0.3-3倍容积的乙醇、或者0.3-5倍容积的甲醇。

39.根据权利要求37所述的制备方法，其特征在于，上述水溶性有机溶剂是乙醇或甲醇，相对于上述酸性溶液或酸性悬浮液，加入0.6-1.5倍容积的乙醇、或者0.9-2倍容积的甲醇。

40.一种鲨肌醇的制备方法，包括：在含有青蟹肌糖的溶液中，使用硼氢化金属盐还原青蟹肌糖，得到含有肌醇和鲨肌醇的混合液的第1步骤；向上述混合液中加入酸，使混合液中的鲨肌醇·硼酸复合体溶解，并且将溶液调至0.01当量以上的酸性溶液的第2步骤；以及，以肌醇不析出的量向上述酸性溶液中加入水溶性有机溶剂，从而只使鲨肌醇析出的第3步骤。

41.根据权利要求40所述的制备方法，其特征在于，在上述第3步骤中，加入的水溶性有机溶剂是乙醇、甲醇或者1-丙醇，相对于上述酸性溶液，加入0.2-0.4倍容积的乙醇、0.2-0.8倍容积的甲醇、或者0.2-0.4倍容积的1-丙醇。

42.根据权利要求40所述的制备方法，其特征在于，在上述第3步骤中，加入的水溶性有机溶剂是乙醇、甲醇或者1-丙醇，相对于上述酸性溶液，加入0.35-0.45倍容积的乙醇、0.45-0.55倍容积的甲醇、或者0.35-0.45倍容积的1-丙醇。

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