KR101173148B1 - 실로-이노시톨의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
NAD+ 부재하에 미오-이노시톨을 실로-이노소스로 변환하는 신규한 NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제, NADH 또는 NADPH 존재하에 실로-이노소스를 입체 특이적으로 실로-이노시톨로 환원시키는 신규 효소 실로-이노시톨 데하이드로게나제 및 미오-이노시톨을 실로-이노소스로 변환하는 능력을 갖는 아세토박터속 또는 부르크홀데리아속에 속하는 신규한 미생물을 제공한다. 이들 효소 또는 미생물을 사용하여 실로-이노시톨을 제조한다. 또한 실로-이노시톨 및 실로-이노시톨 이외의 중성당을 함유하는 혼합액에 붕산 및 금속염을 가하여 실로-이노시톨/붕산 복합체를 형성시키며, 상기 복합체를 혼합액에서 분리하고, 분리된 복합체를 산에 용해하여 산성 용액 또는 산성 현탁액을 제조하며, 당해 산성 용액 또는 산성 현탁액으로부터 실로-이노시톨을 정제한다.
Description
본 발명은 미생물 변환에 의해 미오-이노시톨로부터 실로-이노시톨을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 신규한 NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제 활성을 지표로 하는 실로-이노소스 제조용 미생물의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제 또는 당해 효소의 고활성주를 사용하는 실로-이노소스 및 실로-이노시톨의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 신규 효소 실로-이노시톨 데하이드로게나제 및 당해 효소를 이용하는 실로-이노시톨의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 실로-이노시톨과 실로-이노소스 간의 산화-환원반응을 촉매하며, NADH 또는 NADPH 존재하에 실로-이노소스를 실로-이노시톨로 입체 특이적으로 환원시키는 신규 효소 실로-이노시톨 데하이드로게나제 및 당해 효소를 이용한 실로-이노시톨의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 실로-이노시톨 및 실로-이노시톨 이외의 중성당을 함유하는 혼합액으로부터, 실로-이노시톨을 효율적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.
실로-이노시톨은 알츠하이머병의 치료약, 생리 활성물질의 합성원료 또는 액정 화합물의 합성원료로서 사용할 수 있다.
미오-이노시톨은 하기 입체 구조식 A의 천연 발생의 공지된 물질이다.
[화학식 A]
또한, 실로-이노소스는 하기 입체 구조식 B의 공지된 물질이다.
[화학식 B]
또한, 실로-이노시톨은 하기 입체 구조식 C의 공지된 화합물이다.
[화학식 C]
실로-이노시톨은 미오-이노시톨의 입체이성체의 하나이며, 동물?식물중에 광범위하게 발견되는 물질이다. 또한, 실로-이노소스는 미오-이노시톨의 2위치의 축 하이드록실 그룹이 산화된 구조를 갖는 화합물이며, 천연물로서 보편적으로 존재한다.
실로-이노시톨은 알츠하이머병의 치료약[참조: The Journal of Biological Chemistry (미국), 2000년, 275권(No.24), p.18495 내지 18502]이나, 생리 활성물질의 합성원료[참조: 미국 특허 제5,412,080호], 액정 화합물의 합성원료[참조: 독일 특허 제3,405,663호]로서 용도가 기대되고 있는 물질이다.
화학합성적 수법으로 실로-이노소스 또는 실로-이노시톨의 제조방법으로서는 (i)헥사하이드록시벤젠을 라니(Raney) 니켈로 환원시켜, 실로-이노시톨을 수득하는 방법[참조: Journal of the American Chemical Society (미국), 1948년, 70권 p.2931 내지 2935], (ii)글루코푸라노스 유도체로부터 수득된 실로-이노소스를 5단계의 반응으로 환원시켜, 실로-이노시톨을 수득하는 방법[참조: Journal of the American Chemical Society (미국), 1968년, 90권, p.3289-3290], (iii)시스-트리옥사-트리스호모벤젠을 원료로 4단계 이상의 반응으로 실로-이노시톨을 수득하는 방법[참조: Angewandte Chemie (독일), 1973년, 85권, p.1110 내지 1111], 및 (iv) 미오-이노시톨을 백금 촉매로 산화하여 실로-이노소스를 수득하고 계속해서 에스테르화한 다음, 환원과 가수분해를 실시하여, 실로-이노시톨을 수득하는 방법[참조: 독일 특허 제3,405,663호] 등이 있다.
또한, 미생물을 사용하여 미오-이노시톨을 실로-이노시톨로 변환하는 방법으로서, 아그로박테리움(Agrobacterium)속 세균을 사용하는 방법이 공지되어 있다[참조: 일본 공개특허공보 제(평) 9-140388호]. 그러나, 상기 방법은, 실로-이노시톨의 수율이 낮으며 다른 변환물도 생기므로 공업적 규모에서는 이용할 수 없다.
한편, 아세토박터(Acetobacter)속 세균[참조: The Journal of Biological Chemistry (미국), 1948년, 174권, p.173 내지 188]은 미오-이노시톨에 작용하여 산소를 흡수함으로써 실로-이노소스로 산화되는 것이 공지되어 있지만, 상세한 메카니즘은 검토되어 있지 않다.
미오-이노시톨을 실로-이노소스로 산화하는 효소(미오-이노시톨 2-데하이드로게나제)는 동물, 해초류, 효모 및 세균 등의 다수의 생물종으로부터 보고되어 있으며, 자연계에 광범위하게 존재하는 효소이다. 상기 효소를 갖는 대표적인 미생물종으로서는 에로박터 에로게네스(Aerobacter aerogenes)[참조: Archives of Biochemistry and Biophysics (미국), 1956년, J, Larner et a1., 60권, p.352 내지 363], 바실루스(Bacillus)속 세균[참조: The Journal of Biological Chemistry(미국), 1979년, 254권, p.7684 내지 7690 및 Microbiology (미국), 1994년, 140권, p.2289 내지 2298, 일본 공개특허공보 제(평) 4-126075호, 일본 공개특허공보 제(평) 05-192163호 및 일본 공개특허공보 제(평) 06-007158호], 슈도모나스(Pseudomonas)속 세균 등[참조: Monatshefte fur Chemie (독일), 1969년, 100권, p.1327 내지 1337 및 Journal of Bacteriology (미국), 1977년, 131권, p.872 내지 875]이 있다.
그러나, 이들 보고에서 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제는 NAD+ 의존형 효소이며, 산화를 위해 NAD+ 또는 NADP+를 요구하여, 공업적 규모로 적용시키는 경우, 이들 보효소를 재순환시키기 위해 발효생산을 사용해야만 하며, 따라서 기질의 일부가 분해되거나, 기질 농도를 낮게 유지시켜야만 하는 등의 공업적 규모에 있어서 문제점이 있다.
한편, 실로-이노시톨 데하이드로게나제가 소의 뇌 및 바퀴벌레 지방 조직중에 존재한다는 보고예[참조: Biochemical and Biophysical Research Communications (미국), 제68권, p.1133(1976년)]가 있으며, 이러한 효소에 의해 기질로서의 실로-이노소스를 NADPH로 환원시키는 경우, 실로-이노시톨과 미오-이노시톨 둘다가 생성된다고 보고되어 있다. 그러나, 기질 특이성이 낮고, 고도로 정제된 효소를 사용하지 않았으며, 여러가지 성질도 불명확하므로, 상기 효소는 기질 특이성이 낮은 알코올 데하이드로게나제일 가능성이 있다. 따라서, 효소 핸드북(아사쿠라쇼텐 발행)에는 기재되어 있지 않았다. 이와 같이, 동물에 있어서 보고예는 있지만, 이의 진위는 확실하지 않았다.
또한, 미생물 산화에 의해 제조한 실로-이노소스를 화학 환원시킴으로써 실로-이노시톨을 제조하는 방법도 공지되어 있다[참조: 일본 공개특허공보 2003-102492호]. 그러나, 실로-이노소스의 화학 환원에 의해 수득되는 물질은 실로-이노시톨과 미오-이노시톨의 혼합물이므로, 혼합물을 탈염 정제한 다음, 농축액으로부터 용해도가 낮은 실로-이노시톨을 결정 석출함으로써 수득하는 조작이 필요하다. 따라서 이러한 방법은 다수의 조작을 요하며, 실로-이노시톨의 수율이라는 점에서 개선의 여지가 있다. 이러한 상황하에 실로-이노시톨을 간편하고 효율적으로 제조하기 위해, 실로-이노소스의 환원 등에 의해 수득되는 실로-이노시톨과 미오-이노시톨의 혼합물로부터 정제된 실로-이노시톨을 제조하는 방법의 개발이 요망되고 있다.
용액 중의 NaBH4를 사용하여 실로-이노소스를 환원시키는 경우, 반응후의 용액에는 미오-이노시톨, 실로-이노시톨 이외에 실로-이노시톨/붕산 복합체가 소량 함유된다. 이러한 실로-이노시톨/붕산 복합체에 관해서는, 우선, 복합체를 침전물로서 여과하며, 침전물을 묽은 황산에 용해하고, 메탄올을 가하여 붕산과 공비시켜 붕산을 제거하며, 잔류 용액을 이온교환 수지로 탈염하여, 실로-이노시톨을 수득하는 방법[참조: Journal of Organic Chemistry(미국), 1958년, 23권, p.329 내지 330]이 공지되어 있다.
이러한 실로-이노시톨/붕산 복합체는 하기의 입체 구조식(D)의 물질이다.
[화학식 D]
그러나 상기와 같이 NaBH4를 사용하여 실로-이노소스를 환원시키는 방법에서는 발생되는 실로-이노시톨/붕산 복합체의 비율이 낮으며 용액중에 실로-이노시톨이 생성되므로, 복합체와 용액 성분을 분리하여, 각각으로부터 실로-이노시톨을 수득하는 것이 필요하다. 또한, 복합체로부터 실로-이노시톨을 수득하기 위해서는 다량의 유기용매를 필요로 하므로, 경제성의 면에서 개선의 여지가 있다. 따라서, 공업 규모로 간편하면서 또한 효율적으로 실로-이노시톨을 제조하는 방법이 요망되고 있다.
본 발명은 미오-이노시톨로부터 미생물 변환만으로 고수득량으로 실로-이노시톨을 직접적으로 제조하는 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
또한, 본 발명은 미오-이노시톨을 실로-이노소스로 변환하는 반응을 촉매하는 신규한 효소 및 이를 사용하는 실로-이노소스 및 실로-이노시톨의 신규한 제조방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
또한, 본 발명은 실로-이노시톨과 실로-이노소스 간의 산화-환원반응을 촉매하며, NADH 또는 NADPH 존재하에 실로-이노소스를 입체 특이적으로 실로-이노시톨로 환원시키는 신규 효소 실로-이노시톨 데하이드로게나제, 및 당해 효소를 이용하는 실로-이노시톨의 신규한 제조방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
또한, 본 발명은 실로-이노시톨 및 실로-이노시톨 이외의 중성당을 함유하는 혼합액으로부터 고순도의 실로-이노시톨을 효율적으로 제조하는 신규한 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자등은 미오-이노시톨로부터 실로-이노소스를 생성하는 능력을 갖는 미생물을 찾는 연구에 의해 자연계에서 분리된 아세토박터속에 속하는 세균(AB10253주)를 발견하여, 이러한 균주를 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터에 FERM P-18868(국제기탁번호 FERM BP-10136)의 수탁번호로 기탁했다. 또한, 이러한 균주를 이용하여, 미오-이노시톨로부터 실로-이노소스를 제조하는 방법 및 수득된 실로-이노소스를 화학 환원에 의해 실로-이노시톨을 제조하는 방법을 확립했다[일본 공개특허공보 제(평) 2003-102492호].
이어서, 실로-이노소스로의 변환 능력을 향상시킬 목적으로 이러한 균주를 변이에 의해 육종한 결과, 이들 변이 균주 중에 미오-이노시톨로부터 일단 생성된 실로-이노소스를 생물학적으로 환원시켜며, 근소하지만 실로-이노시톨을 생성하는 균주가 존재함을 발견했다. 그래서, 발명자등은 이러한 균주에 있어서 배양 변환 만으로 미오-이노시톨로부터 직접적으로 실로-이노시톨을 주로 생성 축적하는 주를 수득하기 위해 다시 변이 육종을 실시하였다. 그 결과, 목적에 부합하는 변이 균주, 즉 미오-이노시톨의 산화에 의해 생긴 실로-이노소스를 실로-이노시톨로 환원시키며, 실로-이노시톨을 배지중에 축적시키는 능력을 획득한 균주를 수득하는 데에 성공했다.
또한, AB10253주에서 낮은 변환능력이지만, 미오-이노시톨로부터 실로-이노시톨을 생성하는 능력을 갖는 균주를 자연계에서 밝혀내고, 16Sr RNA의 염기서열에 의해 동정을 시도한 결과, 아세토박터 세레비지애(Acetobacter cerevisiae), 아세토박터 말로룸(Acetobacter malorum) 또는 부르크홀데리아 안드로포고니스(Burkholderia andropogonis)에 속하는 미생물을 밝혀내었다.
이들 미생물을 사용함으로써 실로-이노시톨을 효율적으로 제조할 수 있음을 밝혀냈다.
또한, 본 발명자등은 미오-이노시톨을 실로-이노소스로 효율적으로 변환할 수 있는 효소를 수득할 수 있으면, 이러한 효소를 사용함으로써 높은 기질 농도의 미오-이노시톨로부터 실로-이노소스를 효율적으로 제조할 수 있다고 생각했다. 또한, 이러한 효소의 고활성주를 스크리닝에 의해 분리할 수 있으면, 이러한 균주도 실로-이노소스의 제조에 사용할 수 있다고 생각했다.
따라서, 본 발명자등은 미오-이노시톨로부터 실로-이노소스로 변환하는 반응을 촉매할 수 있는 종래 공지되어 있지 않은 신규한 타입의 NAD+ 비의존형의 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제가 있다는 가설하에, 당해 효소를 분리하려고 예의 연구했다. 그 결과, 아세토박터속에 속하는 아세토박터 종 AB10253주에 NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제가 존재함을 밝혀냈다. 또한, 본 발명자등은 이러한 효소 또는 이러한 효소 활성이 높은 미생물을 사용함으로써 실로-이노소스를 효율적으로 제조하고, 수득된 실로-이노소스를 환원시킴으로써 고순도의 실로-이노시톨을 효율적으로 제조하는 데에 성공했다.
이어서, 본 발명자는 미오-이노시톨로부터 직접적으로 실로-이노시톨을 생산하는 균주의 균체에서 미오-이노시톨을 실로-이노시톨로 변환하는 방법을 검토한 결과, 미오-이노시톨의 2위치의 하이드록실 그룹이 산소 의존형으로 산화되어 실로-이노소스가 된 후에, NADH 또는 NADPH 의존형으로 실로-이노소스를 실로-이노시톨로 환원시키는 활성을 갖는 효소 작용에 의해 실로-이노시톨이 생성되는 것을 밝혀냈다. 이러한 활성을 지표로 함으로써 실로-이노소스를 실로-이노시톨로 환원시키는 활성을 갖는 효소를 정제하는 것에 성공했다. 이러한 효소가 NADPH 의존형으로 실로-이노소스를 입체 특이적으로 실로-이노시톨로 환원시키는 활성과 NADP+ 의존형으로 실로-이노시톨을 실로-이노소스로 산화하는 활성을 갖는 것을 밝혀내고 이러한 효소를 「실로-이노시톨 데하이드로게나제」라고 명명했다. 또한, 본 발명의 효소는 미오-이노시톨의 5위치의 하이드록실 그룹을 산화하는 능력을 갖고 있으므로, 미오-이노시톨 5-데하이드로게나제라고 호칭할 수 있다.
또한, 이. 콜라이(Escherichia coli)이나 아그로박테리움속, 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 크산토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris)의 게놈으로부터 PCR법에 따라 실로-이노시톨 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자를 클로닝하는 것에 성공했다.
또한, 본 연구자등은 본 발명의 효소가 NAD+ 또는 NADP+ 의존형으로 산화-환원반응을 수행하므로, 기존의 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제(NAD+ 또는 NADP+ 의존형으로 실로-이노소스를 미오-이노시톨로 환원시키는 활성을 갖는다: EC 1.1.1.18)와 공동 작용시킴으로써(도 1 참조), 미오-이노시톨로부터 실로-이노소스를 경유하여, 실로-이노시톨로 직접 변환할 수 있다고 생각하였고, 성공했다.
또한, 본 발명자등은 실로-이노소스의 환원 등에 의해 수득되는 실로-이노시톨 및 미오-이노시톨 등의 중성당을 함유하는 혼합액으로부터 효율적으로 실로-이노시톨을 제조하기 위해서, 실로-이노시톨/붕산 복합체를 형성시키는 것이 유리하다고 생각했다. 이러한 생각에 기초하여, 본 연구자등은 실로-이노시톨과 미오-이노시톨의 혼합액 중의 실로-이노시톨 만을 효율적으로 실로-이노시톨/붕산 복합체로 유도하는 방법을 예의 연구했다. 그 결과, 실로-이노시톨, 붕산 및 금속이온으로 이루어진 실로-이노시톨/붕산 복합체는 특이한 결합을 가지며 다른 중성당의 복합체와는 상이하게 용해도가 낮은 복합체인 것을 밝혀냈다. 또한, 혼합액 중의 용해 실로-이노시톨에 대해 2배몰 이상, 바람직하게는 2 내지 3배몰의 붕산과 금속염을 가하며 또한, 용액을 pH 8.0 내지 11.0, 바람직하게는 pH 9.0 내지 10.0의 알칼리성으로 유지함으로써 실로-이노시톨/붕산 복합체가 효율적으로 형성되며, 침전하는 것을 밝혀냈다. 이러한 조건하에 실로-이노시톨 및 미오-이노시톨 등의 중성당을 함유하는 혼합액으로부터 실로-이노시톨/붕산 복합체를 형성시켜 당해 복합체를 산에 용해시킨 다음, 이온교환 수지나 수용성 유기용매 등을 사용하여 정제함으로써 실로-이노시톨을 효율적으로 제조하는 것에 성공했다.
이상에 따라 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 하기와 같다.
(1)아세토박터속 또는 부르크홀데리아속에 속하는 미생물이며, 미오-이노시톨을 실로-이노시톨로 변환하는 능력을 갖는 미생물을 미오-이노시톨을 함유하는 용액중에서 미오-이노시톨에 작용시킴으로써 실로-이노시톨을 상기 용액중에 생성 축적시켜 당해 용액 중에서 실로-이노시톨을 채취하는 것을 특징으로 하는 실로-이노시톨의 제조방법.
(2)미오-이노시톨을 함유하는 용액이 미오-이노시톨을 함유하는 액체 배지이며 상기 미생물을 당해 액체 배지중에서 배양함으로써 미오-이노시톨에 작용시키는 것을 특징으로 하는 (1)의 제조방법.
(3)배양에 의해 수득된 상기 미생물의 균체를 상기 용액중에서 미오-이노시톨에 작용시키는 것을 특징으로 하는 (1)의 제조방법.
(4)상기 미생물이 아세토박터 세레비지애, 아세토박터 말로룸 또는 부르크홀데리아 안드로포고니스에 속하는 미생물인 (1) 내지 (3)의 어느 하나의 제조방법.
(5)상기 미생물이 아세토박터 종 AB10281주(FERM BP-10119) 또는 이의 변이주인 (1) 내지 (3)의 어느 하나의 제조방법.
(6)미오-이노시톨을 실로-이노시톨로 변환하는 능력을 갖는 아세토박터 종 AB10281주(FERM BP-10119) 또는 이의 변이주.
(7)적어도 하기의 생리학적 성질을 갖는 NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제:
(a)작용: 전자 수용물질의 존재하에 미오-이노시톨로부터 전자를 탈취하여 실로-이노소스를 생성하는 반응을 촉매하며,
(b)최적 pH: pH 4.5 내지 5.5에서 활성이 극대치를 나타내며,
(c)보인자: 1mol의 효소에 1mol의 헴철을 함유하며,
(d)억제제: 1mM의 Sn2+ 이온에 의해 효소 활성이 1% 이하로 억제되며,
(e)서브유닛 구조: 적어도 분자량 76kDa과 46kDa의 단백질을 함유하는 이종체(heteromer)이며,
(f)기질 특이성: D-키로-이노시톨, 뮤코-이노시톨 및 미오-이노시톨에 반응하여 D-키로-1-이노소스, L-키로-2-이노소스 및 실로-이노소스로 각각 변환된다. 알로-이노시톨, 실로-이노시톨, L-키로-이노시톨 및 글루코스에는 반응하지 않는다.
(8)NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제 생산능을 갖는 아세토박터속에 속하는 미생물을 배양하며, 배양된 미생물의 균체로부터 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제를 분리 정제하는 것을 특징으로 하는 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제의 제조방법.
(9)미생물이 아세토박터 종 AB10253주(FERM BP-10136)인 (8)의 제조방법.
(10)미오-이노시톨 및 전자 수용체를 함유하는 용액 중에서 NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제를 미오-이노시톨에 작용시켜 실로-이노소스를 생성시키며 생성된 실로-이노소스를 용액중에서 분리 정제하는 것을 특징으로 하는 실로-이노소스의 제조방법.
(11)미오-이노시톨 및 전자 수용체를 함유하는 용액 중에서 NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제를 미오-이노시톨에 작용시켜 실로-이노소스를 생성시키는 공정, 실로-이노소스를 환원제와 작용시켜 실로-이노시톨을 생성시키는 공정 및 실로-이노시톨을 분리 정제하는 공정을 포함하는 실로-이노시톨의 제조방법.
(12)아세토박터 종의 AB10253주를 변이처리하여 수득된 변이주로부터 NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제 활성을 지표로 하여 선별하는 것을 특징으로 하는 실로-이노소스 제조용 미생물의 스크리닝 방법.
(13)미생물을 함유하는 천연 시료 중에서 미생물을 분리하고, 분리된 미생물로부터 NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제 활성을 지표로 하여 선별하는 것을 특징으로 하는 실로-이노소스 제조용 미생물의 스크리닝 방법.
(14)(12) 또는 (13)의 스크리닝 방법에 따라 수득되는 실로-이노소스 제조용 미생물을 미오-이노시톨을 함유하는 배지에서 배양함으로써 미오-이노시톨로부터 실로-이노소스를 생성시키며 생성된 실로-이노소스를 배지로부터 분리 정제하는 것을 특징으로 하는 실로-이노소스의 제조방법.
(15)(12) 또는 (13)의 스크리닝 방법에 따라 수득된 실로-이노소스 제조용 미생물을 미오-이노시톨을 함유하는 배지에서 배양함으로써 미오-이노시톨로부터 실로-이노소스를 생성시키는 공정, 실로-이노소스를 환원제로 작용시켜 실로-이노시톨을 생성시키는 공정 및 실로-이노시톨을 분리 정제하는 공정을 포함하는 실로-이노시톨의 제조방법.
(16)하기 생리학적 성질을 갖는 실로-이노시톨 데하이드로게나제:
반응: 하기 반응식에 기재된 바와 같이 실로-이노시톨과 실로-이노소스 간의 산화-환원반응을 촉매하며, NADH 또는 NADPH 존재하에 실로-이노소스를 입체 특이적으로 실로-이노시톨로 환원시킨다.
(17)또한, 하기 생리학적 성질을 갖는 (16)의 실로-이노시톨 데하이드로게나제.
(a)분자량 및 회합 특성: 38 내지 46kDa, 2 또는 3량체를 형성한다.
(b)보효소: NAD+ 또는 NADP+, 또는 NADH 또는 NADPH를 보효소로 한다.
(c)활성화 중금속: Co2+ 이온의 존재하에 활성화된다.
(d)억제 중금속: Sn2+ 이온의 존재하에 억제된다.
(e)최적 pH: pH 5 내지 9에서 활성을 갖는다.
(18)하기의 (A) 또는 (B)의 단백질:
(A)서열번호 28에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는
(B)서열번호 28에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 가지며 실로-이노시톨과 실로-이노소스 간의 산화-환원반응을 촉매하며, NADH 또는 NADPH 존재하에 실로-이노소스를 입체 특이적으로 실로-이노시톨로 환원시키는 효소 활성을 갖는 단백질.
(19)하기의 (A) 또는 (B)의 단백질을 암호화하는 DNA:
(A)서열번호 28에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는
(B)서열번호 28에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 가지며 실로-이노시톨과 실로-이노소스 간의 산화-환원반응을 촉매하며, NADH 또는 NADPH 존재하에 실로-이노소스를 입체 특이적으로 실로-이노시톨로 환원시키는 효소 활성을 갖는 단백질.
(20)하기의 (a) 또는 (b)의 DNA:
(a)서열번호 27에 기재된 염기서열의 암호화 영역을 포함하는 DNA, 또는
(b)서열번호 27에 기재된 염기서열 또는 이의 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖는 DNA와 엄격한 조건하에 하이브리드화하여, 실로-이노시톨과 실로-이노소스 간의 산화-환원반응을 촉매하며, NADH 또는 NADPH 존재하에 실로-이노소스를 입체 특이적으로 실로-이노시톨로 환원시키는 효소 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
(21)(19) 또는 (20)의 DNA를 포함하는 벡터.
(22)(19) 또는 (20)의 DNA 또는 (21)의 벡터를 함유하는 형질전환 미생물.
(23)형질전환하는 숙주가 이. 콜라이인 (22)의 형질전환 미생물.
(24)(22) 또는 (23)의 형질전환 미생물을 배양하며, 배양물로부터 실로-이노시톨 데하이드로게나제를 채취하는 것을 특징으로 하는 실로-이노시톨 데하이드로게나제의 제조방법.
(25)(16)의 실로-이노시톨 데하이드로게나제와 NAD+ 또는 NADP+ 존재하에 미오-이노시톨을 산화시켜 실로-이노소스를 생성하는 반응을 촉매하는 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제(EC1.1.1.18)를 함유하는 용액중에서 pH 6.0 내지 8.5이며 또한 NAD+ 또는 NADP+ 존재하에 미오-이노시톨을 기질로 하여 실로-이노시톨로 효소 변환반응시키는 것을 특징으로 하는 실로-이노시톨의 제조방법.
(26)용액중에 실로-이노소스를 0.01 내지 3%가 되도록 첨가하는 것을 특징으로 하는 (25)의 실로-이노시톨의 제조방법.
(27)용액중에 실로-이노소스를 0.2 내지 0.5%가 되도록 첨가하는 것을 특징으로 하는 (25)의 실로-이노시톨의 제조방법.
(28)용액중에 Co염 및/또는 Mg염을 0.01 내지 5.0mM이 되도록 첨가하는 것을 특징으로 하는 (25)의 실로-이노시톨의 제조방법.
(29)용액중에 Co염 및/또는 Mg염을 0.2 내지 2.0mM이 되도록 첨가하는 것을 특징으로 하는 (25)의 실로-이노시톨의 제조방법.
(30)용액중의 미오-이노시톨 농도가 5 내지 22%가 되도록 제조하며, 효소반응으로 생성된 실로-이노시톨을 반응 용액 중에서 결정화시켜 실로-이노시톨을 반응 시스템으로부터 결정으로서 여과 분리하는 것을 특징으로 하는 (25)의 실로-이노시톨의 제조방법.
(31)실로-이노시톨 데하이드로게나제가 하기의 (A) 또는 (B)의 단백질인 (25)의 제조방법:
(A)서열번호 28에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는
(B)서열번호 28에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 가지며 실로-이노시톨과 실로-이노소스 간의 산화-환원반응을 촉매하며, NADH 또는 NADPH의 존재하에 실로-이노소스를 입체 특이적으로 실로-이노시톨로 환원시키는 효소 활성을 갖는 단백질.
(32)실로-이노시톨 데하이드로게나제가 하기의 (a) 또는 (b)의 DNA에 의해 암호화되는 단백질인 (25)의 제조방법:
(a)서열번호 27에 기재된 염기서열의 암호화 영역을 포함하는 DNA, 또는
(b)서열번호 27에 기재된 염기서열 또는 이의 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖는 DNA와 엄격한 조건하에 하이브리드화하여, 실로-이노시톨과 실로-이노소스 간의 산화-환원반응을 촉매하며, NADH 또는 NADPH의 존재하에 실로-이노소스를 입체 특이적으로 실로-이노시톨로 환원시키는 효소 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
(33)실로-이노시톨 데하이드로게나제가 하기의 (C) 또는 (D)의 단백질인 (25)의 제조방법:
(C)서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 14에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질, 또는
(D)서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 14에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 가지며 실로-이노시톨과 실로-이노소스 간의 산화-환원반응을 촉매하며, NADH 또는 NADPH 존재하에 실로-이노소스를 입체 특이적으로 실로-이노시톨로 환원시키는 효소 활성을 갖는 단백질.
(34)실로-이노시톨 데하이드로게나제가 하기의 (c) 또는 (d)의 DNA에 의해 암호화되는 단백질인 (25)의 제조방법:
(c)서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11 또는 13에 기재된 염기서열의 암호화 영역을 포함하는 DNA, 또는
(d)서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11 또는 13에 기재된 염기서열 또는 이의 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖는 DNA와 엄격한 조건하에 하이브리드화하여, 실로-이노시톨과 실로-이노소스 간의 산화-환원반응을 촉매하며, NADH 또는 NADPH 존재하에 실로-이노소스를 입체 특이적으로 실로-이노시톨로 환원시키는 효소 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
(35)실로-이노시톨 및 실로-이노시톨 이외의 중성당을 함유하는 혼합액에 당해 혼합액 중에 용해된 실로-이노시톨의 2배몰 이상의 양의 붕산 및 금속염을 가한 다음, 당해 혼합액의 pH를 8.0 내지 11.0으로 조정하여 실로-이노시톨/붕산 복합체를 형성시키는 제1 공정, 상기 복합체를 혼합액으로부터 분리하는 제2 공정, 분리된 복합체를 산에 용해시켜 실로-이노시톨과 붕산으로 절단시키는 제3 공정, 및 제3 공정에서 수득되는 산성 용액 또는 산성 현탁액으로부터 실로-이노시톨을 분리 정제하는 제4 공정을 포함하는 실로-이노시톨의 제조방법.
(36)제1 공정에서, 첨가하는 붕산 및 금속염의 양이 상기 혼합액 중에 용해된 실로-이노시톨의 2배몰 이상 및 3배몰 이하인 것을 특징으로 하는 (35)의 제조방법.
(37)제1 공정에서, 상기 혼합액의 pH를 9.0 내지 10.0으로 조정하는 것을 특징으로 하는 (35)의 제조방법.
(38)금속염이 NaCl, NaHCO3, Na2CO3, Na2SO4, NaHSO4, NaH2PO4, Na2HPO4, Na3PO4, 붕사, KCl, KHCO3, K2CO3, K2SO4, KHSO4, KH2PO4, K2HPO4, K3PO4, MgCl2, MgCO3 및 MgSO4로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 금속염인 (35)의 제조방법.
(39)실로-이노시톨 및 실로-이노시톨 이외의 중성당을 함유하는 혼합액이 실로-이노소스를 함유하는 용액중에서 실로-이노소스를 환원시킴으로써으로써 수득되는 미오-이노시톨 및 실로-이노시톨을 함유하는 혼합액인 (35)의 제조방법.
(40)제3의 공정에서 상기 복합체를 산에 용해시켜 수득된 용액을 0.1N 이상의 산성으로 조정하고, 제4 공정에서 산성 용액을 강산성 이온교환 수지 및 강염기성 이온교환 수지 또는 붕산 선택적 흡착수지에 접촉시킨 다음, 당해 산성 용액으로부터 실로-이노시톨을 석출시키는 것을 특징으로 하는 (35)의 제조방법.
(41)제4 공정에서, 산성 용액 또는 산성 현탁액에 수용성 유기용매를 가하여 실로-이노시톨을 석출시키는 것을 특징으로 하는 (35)의 제조방법.
(42)수용성 유기용매가 에탄올 또는 메탄올이며, 산성 용액 또는 산성 현탁액에 대해 에탄올을 0.3 내지 3배 용적 또는 메탄올을 0.3 내지 5배 용적으로 첨가하는 것을 특징으로 하는 (41)의 제조방법.
(43)수용성 유기용매가 에탄올 또는 메탄올이며, 산성 용액 또는 산성 현탁액에 대해 에탄올을 0.6 내지 1.5배 용적 또는 메탄올을 0.9 내지 2배 용적으로 첨가하는 것을 특징으로 하는 (41)의 제조방법.
(44)실로-이노소스를 함유하는 용액중에서 실로-이노소스를 수소화붕소 금속염을 사용하여 환원시켜 미오-이노시톨 및 실로-이노시톨을 함유하는 혼합액을 수득하는 제1 공정, 상기 혼합액에 산을 가하여 혼합액 중의 실로-이노시톨/붕산 복합체를 용해시키고, 또한 용액을 0.01N 이상의 산성 용액으로 조정하는 제2 공정 및 산성 용액에 수용성 유기용매를 미오-이노시톨이 석출되지 않는 양으로 가하여, 실로-이노시톨 만을 석출시키는 제3 공정을 포함하는 실로-이노시톨의 제조방법.
(45)제3 공정에서, 첨가하는 수용성 유기용매가 에탄올, 메탄올 또는 1-프로판올이며, 산성 용액에 대해 에탄올을 0.2 내지 0.4배 용적, 메탄올을 0.2 내지 0.8배 용적 또는 1-프로판올을 0.2 내지 0.4배 용적으로 첨가하는 것을 특징으로 하는 (44)의 제조방법.
(46)제3 공정에서, 첨가하는 수용성 유기용매가 에탄올, 메탄올 또는 1-프로판올이며, 산성 용액에 대해 에탄올을 0.35 내지 0.45배 용적, 메탄올을 0.45 내지 0.55배 용적 또는 1-프로판올을 0.35 내지 0.45배 용적으로 첨가하는 것을 특징으로 하는 (44)의 제조방법.
본 발명에 따르면 의약품으로서 이용가치가 있는 실로-이노시톨을 염가인 미오-이노시톨로부터, 미생물 변환 또는 효소반응만으로 직접적으로 제조할 수 있으며 실로-이노시톨을 효율적으로 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 제조방법은 이성체가 생기기 어렵다는 이점도 있다.
본 발명의 NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제를 사용함으로써 NAD+를 반응액 중에 첨가하지 않고 실로-이노소스를 제조할 수 있다. 또한 수득된 실로-이노소스를 환원시킴으로써 간편하면서 또한 고효율로 고순도의 실로-이노시톨을 수득할 수 있다.
본 발명에 따르면 실로-이노시톨 및 실로-이노시톨 이외의 중성당을 함유하는 혼합액에서 효율적으로 실로-이노시톨/붕산 복합체를 형성할 수 있으며 수득된 실로-이노시톨/붕산 복합체에서 고순도의 실로-이노시톨을 효율적이고 간편한 조작으로 수득할 수 있다.
도 1은 효소의 공동 작용에 의한 실로-이노시톨의 제조원리를 도시하는 도면이다.
1.아세토박터속 또는 부르크홀데리아속에 속하는 미생물을 사용하는 실로-이노시톨의 제조방법
본 발명의 1형태는, 아세토박터속 또는 부르크홀데리아속에 속하는 미생물이며 미오-이노시톨을 실로-이노시톨로 변환하는 능력을 갖는 미생물을 미오-이노시톨을 함유하는 용액중에서 미오-이노시톨에 작용시킴으로써 실로-이노시톨을 상기 용액중에 생성 축적시켜 당해 용액중에서 실로-이노시톨을 채취하는 것을 특징으로 하는 실로-이노시톨의 제조방법에 관한 것이다.
당해 제조방법에서 사용하는 미생물은 아세토박터속 또는 부르크홀데리아속에 속하는 미생물이며, 미오-이노시톨을 실로-이노시톨로 변환하는 능력을 갖는 미생물이다. 여기서, 아세토박터속에 속하는 미생물로서는 아세토박터 세레비지애, 아세토박터 말로룸, 아세토박터 오르레아넨시스(Acetobacter orleanensis), 아세토박터 인도네시엔시스(Acetobacter indonesiensis), 아세토박터 오리엔탈리스(Acetobacter orientalis), 아세토박터 아세티(Acetobacter aceti), 아세토박터 리퀘파시엔스(Acetobacter liquefaciens), 아세토박터 파스테우리아누스(Acetobacter pasteurianus), 아세토박터 한세니이(Acetobacter hansenii) 또는 이들의 동정되지 않은 주(종)을 들 수 있다. 부르크홀데리아속에 속하는 미생물로서는 부르크홀데리아 안드로포고니스, 부르크홀데리아 카리오필리(Burkholderia caryophylli), 부르크홀데리아?그라미니스(Burkholderia graminis)를 들 수 있다. 이중에서는, 아세토박터 세레비지애, 아세토박터 말로룸 또는 부르크홀데리아 안드로포고니스가 특히 바람직하다. 「미오-이노시톨을 실로-이노시톨로 변환하는 능력」이란 예를 들면, 미오-이노시톨을 함유하는 배지에서 배양할 때에 당해 배지중에 실로-이노시톨을 축적하는 능력을 말한다.
상기 미생물의 구체적인 예로서는 아세토박터 종 AB10281주를 들 수 있다. 이러한 균주는 아세토박터 종 AB10253주(FERM BP-10136)를 변이 육종하여 미오-이노시톨을 실로-이노시톨로 변환하는 능력을 부여한 것이며, 2004년 1월 20일자로 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(우편번호 305-8566 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1쵸메 1반지 1 츄오 제6)에 FERM BP-19639의 수탁번호로 기탁되어 있으며 또한, 부다페스트 조약에 근거하는 국제기탁으로 이관되어 FERM BP-10119의 수탁번호가 부여되어 있다.
또한, 아세토박터 종 AB10253주는 2002년 5월 24일에 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(우편번호 305 내지 8566 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1쵸메 1반지 1 츄오 제6)에 수탁번호 FERM BP-18868로서 기탁되어 있으며 또한, 부다페스트 조약에 근거하는 국제기탁으로 이관되어 FERM BP-10136의 수탁번호로 기탁되어 있다.
또한, 상기 미생물 아세토박터 종 AB10281주 또는 아세토박터 종 AB10253주 등의 아세토박터속에 속하는 미생물의 파생주를 사용할 수 있다. 파생주는 상기 미생물을 변이 육종하여, 변이가 도입된 주로부터 미오-이노시톨을 실로-이노시톨로 직접적이고 선택적으로 변환할 수 있는 특성을 갖고 있는 것을 선택함으로써 수득할 수 있다. 변이 육종의 방법으로는, 예를 들면, UV 조사, 방사선 조사 등의 물리적 변이방법 이외에 N-니트로소구아니딘, 메탄설폰산에틸, 아질산, 메탄설폰산메틸, 아크리딘 색소, 벤조피렌, 황산디메틸 등의 변이제의 혼합에 의한 화학적 변이방법이 있다.
상기한 바와 같은 미생물을 미오-이노시톨을 함유하는 용액중에서 미오-이노시톨에 작용시키는 방법으로는 우선, 미오-이노시톨을 함유하는 액체 배지속에서 본 발명의 미생물을 배양하는 방법을 들 수 있다.
이 경우, 사용되는 액체 배지의 조성은 목적에 도달하는 한, 특별한 제한은 없으며, 실로-이노시톨로의 변환 원료인 미오-이노시톨에 추가하여, 탄소원, 질소원 및 유기 영양원, 무기 염류 등을 함유하는 임의의 배지일 수 있으며, 합성배지 및 천연배지 어느 것이나 사용할 수 있다. 미오-이노시톨을 0.1% 내지 40%, 보다 바람직하게는 10% 내지 30% 첨가하며, 탄소원으로서는 글리세롤, 슈크로스, 말토스 또는 전분을 O.1% 내지 20%, 보다 바람직하게는 0.3 내지 5%, 및 질소원으로서는 효모 추출물, 펩톤, 카사미노산, 황산암모늄, 염화암모늄, 질산암모늄 또는 요소 등을 0.01% 내지 5.0%, 바람직하게는 0.5% 내지 2.0% 첨가하는 것이 바람직하다. 기타, 필요에 따라 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 코발트, 망간, 아연, 철, 구리, 몰리브덴, 인산 또는 황산 등의 이온을 생성할 수 있는 무기 염류를 배지중에 첨가할 수 있다. 배양액 중의 수소이온 농도는 특별히 조절할 필요는 없지만, 바람직하게는 pH 4 내지 10, 보다 바람직하게는 pH 5 내지 9로 조정하여 배양하면 효율적으로 실로-이노시톨을 수득할 수 있다.
배양조건은 배지의 종류에 따라 상이하지만, 배양온도는 12 내지 35℃에서 바람직하게는 20 내지 27℃이며 또한, 배양은 예를 들어 액체 배지를 진탕하거나, 액체 배지중에 공기 또는 산소가스를 블로잉하여 호기적으로 실시할 수 있다. 본 배양에서 미오-이노시톨이 배양 초기 산화되어 생성된 실로-이노소스가 배양 후기에 생체속에서 환원되어 실로-이노시톨이 생성된다. 다시 배양을 실시하면 서서히 실로-이노시톨도 분해된다. 따라서, 배양기간은 실로-이노시톨이 최대 또는 필요량의 축적량을 나타낼 때까지 실시할 수 있으며, 통상적으로 1 내지 10일, 바람직하게는 3 내지 8일이다.
또한, 배양에 의해 수득된 미생물의 균체를 미오-이노시톨을 함유하는 용액중에서 미오-이노시톨에 작용시킬 수 있다. 여기서, 배양에 의해 수득되는 균체로서는 미생물을 별도의 적당한 배양조건에서 배양 수득한 것을 사용할 수 있으며 실로-이노시톨의 제조에 사용되는 미생물을 배양액으로부터 분리하여 수집한 균체를 다시 사용할 수 있다. 균체를 수득하기 위한 집균은 원심분리, 여과 등의 공지된 방법에 따라 실시할 수 있다.
상기한 바와 동일하게 하여 미생물을 미오-이노시톨에 작용시킴으로써 용액중에는 실로-이노시톨이 축적된다. 배양액으로부터 실로-이노시톨을 채취하는 방법은 통상적인 수용성 중성물질을 분리 정제하는 일반적인 방법을 응용할 수 있다. 즉, 배양액에서 균체를 제거한 다음, 배양 상등액을 활성탄이나 이온교환 수지 등으로 처리함으로써 실로-이노시톨 이외의 불순물을 거의 제거할 수 있다. 다음에 재결정 등의 방법을 사용함으로써 목적 물질을 분리할 수 있다.
보다 구체적으로는 실로-이노시톨이 축적된 배양 상등액을 목적하지 않는 성분을 제거할 목적으로 강산성 양이온 교환수지, 예를 들면, 듀오라이트(Duolite
) C-20(H+형)을 충전한 칼럼에 통과시켜 통과액을 수집한 다음, 이러한 칼럼에 탈이온수를 통과시켜 세정하여 세정액을 수집하고 수득되는 통과액 및 세정액을 합한다. 이와 같이 수득된 용액을 강염기성 음이온 교환수지, 예를 들면, 듀오라이트 A116(OH-형)을 충전한 칼럼에 통과시켜 통과액을 수집한 다음, 이러한 칼럼에 탈이온수를 통과시켜 세정하여 세정액을 수집하고 수득된 통과액 및 세정액을 합하여, 실로-이노시톨을 함유하며 그 이외의 불순물을 거의 함유하지 않는 수용액을 수득한다. 이러한 수용액을 농축하여 수득되는 실로-이노시톨의 농후 용액에 에탄올의 적당량을 가하여, 실온 또는 저온에서 밤새 방치하면 순수한 실로-이노시톨의 결정을 결정 석출할 수 있다. 또한, 실로-이노시톨은 수용해성이 낮은 것을 이용하여, 이러한 수용액을 농축하고, 여과하는 것만으로도, 순수한 실로-이노시톨의 결정을 석출할 수 있다. 또한, 칼럼 조작을 실시할 때에 탈색을 위해 활성탄을 충전한 칼럼을 사용할 수 있다.
기타 정제방법에서, 하기하는 바와 같은 배양으로 수득된 실로-이노시톨을 함유하는 용액에 붕산과 NaCl을 가하여 실로-이노시톨/붕산 복합체를 제조하고, 이를 여과 분리후에 산에 의해 붕산을 유리시켜 메탄올과 같은 유기용매를 첨가하는 것으로 결정화시키는 방법에 따라 순수한 실로-이노시톨의 결정을 수득할 수 있다.
또한, 본 균주의 배양중에는 상온에서 수용해성이 낮은(용해도 약 1.6%) 실로-이노시톨은 결정화하여, 침전된다. 따라서, 이러한 배양 도중에 미오-이노시톨을 추가하여 첨가한 다음, 실로-이노시톨을 결정으로서 축적시킬 수 있다.
2.신규한 NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제 및 당해 효소를 사용하는 실로-이노소스 및 실로-이노시톨의 제조방법
본 발명의 다른 형태는 신규한 NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제 및 당해 효소를 사용하는 실로-이노소스 및 실로-이노시톨의 제조방법에 관한 것이다.
<2-1> 신규한 NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제
본 발명의 NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제는 적어도 하기의 생리학적 성질을 갖는다.
(a)작용: 전자 수용물질의 존재하에 미오-이노시톨로부터 전자를 탈취하여 실로-이노소스를 생성하는 반응을 촉매하며,
(b)최적 pH: pH 4.5 내지 5.5에서 활성이 극대치를 나타내며,
(c)보인자: 1mol의 효소에 1mol의 헴철을 함유하며,
(d)억제제: 1mM의 Sn2+ 이온에 의해 효소 활성이 1% 이하로 억제되며,
(e)서브유닛 구조: 적어도 분자량 76kDa과 46kDa의 단백질을 함유하는 이종체이며,
(f)기질 특이성: D-키로-이노시톨, 뮤코-이노시톨 및 미오-이노시톨에 반응하며 D-키로-1-이노소스, L-키로-2-이노소스 및 실로-이노소스로 각각 변환된다. 알로-이노시톨, 실로-이노시톨, L-키로-이노시톨 및 글루코스에는 반응하지 않는다.
(a)의 작용은 전자 수용물질의 존재하에 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제 활성을 측정함으로써 확인할 수 있다. 여기서, 전자 수용물질로서는 산화형 DCIP, PMS(페나진메토설페이트), 메틸렌 블루, Fe3+ 이온 등이 예시되며, 이들을 배합하여 사용할 수 있지만, 바람직하게는 산화형 DCIP가 사용된다. 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제 활성은 예를 들면, 100mM 인산염 완충액(pH 5.0), 미오-이노시톨 5mg 및 2,4-디클로로인도페놀(산화형 DCIP) 0.4mg으로 이루어진 1mL 용액에서 600nm의 흡수도 변화를 반응속도로 환산하여, 1분당 1μmol의 미오-이노시톨이 산화되는 활성을 1유닛으로서 측정할 수 있다. (b)의 최적 pH는 각 pH에서 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제 활성을 측정하며, 효소 활성이 극대를 나타내는 pH의 범위를 조사함으로써 확인할 수 있다. 또한, (d)의 성질은 효소 활성 측정계에 Sn2+ 이온을 첨가하여 효소 활성을 측정하며, Sn2+ 이온 비첨가시의 활성과 비교함으로써 확인할 수 있다. 또한, (e)의 서브유닛 구조는 예를 들면, SDS-PAGE(도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드 전기영동) 등에 의해 확인할 수 있다. 또한, 각 서브유닛의 76kDa 및 46kDa이라는 분자량은 각각 대략적인 값이며, 이는 약 76kDa 및 약 46kDa일 수 있다.
본 발명의 NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제는 상기 성질을 갖고 있는 한, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 아세토박터 종 AB10253주 유래의 것을 들 수 있다. 본 발명의 NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제의 기질 특이성은 상기한 바와 같지만, 아세토박터 종 AB10253주 유래의 효소에 관해 기질 농도 50mM에서의 상대활성 및 Km 값을 나타내면 하기와 같다. 즉, D-키로-이노시톨(상대활성 100%, Km= 8.8mM), 뮤코-이노시톨(상대활성 68%, Km= 14.5mM) 및 미오-이노시톨(상대활성 53%, Km= 20mM)이다.
본 발명의 NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제는 종래부터 공지되어 있는 NAD+ 의존형의 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제와 상이한 타입의 NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제이다. 특히 상이한 점에 관해 양쪽 효소를 비교하면 하기의 표 1과 같이 된다.
[표 1]
<2-2> NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제의 제조방법
본 발명의 NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제의 제조방법은 NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제 생산능을 갖는 아세토박터속에 속하는 미생물을 배양하며, 배양된 미생물의 균체로부터 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제를 분리 정제하는 것을 특징으로 하는 제조방법이다.
NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제의 제조에 사용할 수 있는 미생물로서는 NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제 생산능을 갖는 한, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 아세토박터 종 AB10253(FERM BP-10136)을 들 수 있다. 미생물을 배양하기 위해 사용되는 배지는 종래에 공지된 일반적인 미생물 배양에 사용되는 것으로 탄소원, 질소원, 기타 영양소 등을 함유하는 것을 사용할 수 있다. 여기서, 탄소원으로서 글루코스, 슈크로스, 말토스 또는 전분 등이 예시된다. 이의 농도는 0.1% 내지 20%, 보다 바람직하게는 0.3 내지 5% 첨가하는 것이 바람직하다. 질소원으로서는 펩톤, 효모 추출물, 카사미노산, 황산암모늄, 염화암모늄, 질산암모늄, 요소 또는 고기 추출물 등이 예시된다. 이의 농도는 0.01% 내지 5.0%, 바람직하게는 0.5% 내지 2.0% 첨가하는 것이 바람직하다. 기타 필요에 따라 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 코발트, 망간, 아연, 철, 구리, 몰리브덴, 인산 또는 황산 등의 이온을 생성할 수 있는 무기 염류를 배지중에 첨가하는 것이 바람직하다. 배양액 중의 수소이온 농도는 pH 3 내지 10, 바람직하게는 pH 5 내지 7로 조정하여 배양하면 효율적으로 본 발명의 효소의 발현을 유도할 수 있다. 또한, %로 나타낸 값은 w/v의 백분률을 나타내고, %로 나타낸 농도는 하기에서도 동일한 의미를 갖는다.
또한, NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제의 발현을 유도하기 위해 미오-이노시톨을 함유하는 배지를 사용하는 것이 바람직하다. 이 경우, 첨가하는 미오-이노시톨의 농도는 0.2% 내지 15%, 바람직하게는 1% 내지 5%, 보다 바람직하게는 3%가 적당하다.
배양조건은 배지의 종류에 따라 상이하지만, 배양온도는 바람직하게는 12 내지 35℃에서 보다 바람직하게는 20 내지 27℃이며 또한, 배양은 예를 들어 액체 배지를 진탕하거나, 액체 배지중에 공기 또는 산소가스를 블로잉하여 호기적으로 하는 것이 바람직하다. 배양기간은 배양액 중에 미오-이노시톨이 완전하게 소실되며 또한, 실로-이노소스가 최대의 축적량을 나타낼 때까지 실시하는 것이 바람직하며 통상적으로 1 내지 10일, 바람직하게는 3 내지 8일이다.
이와 같이 배양된 균체로부터 효소를 분리 정제함으로써 본 발명의 효소를 수득할 수 있다. 효소의 분리 정제는 통상적인 단백질의 정제방법과 동일하게 실시할 수 있다. 하기에 구체적인 예를 들어 설명하지만, 분리 정제방법은 이들로 한정되지 않는다.
우선, 배양 수득된 균체를 원심분리나 필터 여과 등에 의해 침전 또는 농축한다. 다음에 수득된 균체 침전물 또는 균체 현탁액을 파쇄한다. 파쇄는 프렌치 프레스, 다이나 밀(dynamill) 또는 초음파 파쇄 등의 방법을 사용할 수 있지만, 초음파 파쇄가 바람직하다. 예를 들면, 배양액 1ℓ로부터 수집한 균체의 경우, 물로 세정을 실시하고 최종적으로 50ml의 물에 현탁하며, 이러한 현탁액에 초음파를 조사하여 세포를 파쇄하며 12000rpm의 원심분리에 의해 침전물을 수득한다. 다시 수득된 침전물을 적당한 완충액, 예를 들면, 트리스 완충액, 인산염 완충액(농도는 2mM 내지 100mM, pH 6.0 내지 8.0)에 현탁하고, 여기에 계면활성제를 첨가하는 것으로 막효소를 추출할 수 있다. 계면활성제의 종류로는 TritonX-100
, Tween20
또는 Tween80
등을 예시할 수 있으며 이의 농도는 0.02% 내지 1.0%로 사용할 수 있지만, 바람직하게는 TritonX-10O을 0.6%의 농도로 사용하는 것이 바람직하다.
상기에서 수득되는 계면활성제를 가한 현탁액을 저온에서 1 내지 5시간 정도 항온처리함으로써 효소를 추출할 수 있다. 다음에 다시 원심분리하고 상등액에 가용화된 효소를 수득할 수 있다. 이와 같이 수득된 효소액은 이대로 실로-이노소스의 제조를 위해 사용할 수 있지만, 필요하면, 통상적인 효소의 농축에 사용되는 방법에 따라 효소를 농축하여, 사용할 수 있다. 효소의 농축방법에는 예를 들면, 황산암모늄 분획 및 한외 여과 등이 있다. 또한, 보다 고순도로 정제하기 위해서 다시 하기와 같이 처리하는 것이 바람직하다.
가용화된 효소는 칼럼 크로마토그래피 정제를 실시하는 것이 바람직하다. 칼럼 크로마토그래피로는 DEAE 칼럼 크로마토그래피 등을 들 수 있다. DEAE 칼럼은 DEAE 그룹을 갖고 있으면, 특별히 담체의 특성이 상이해도 사용할 수 있다. 바람직하게는 DEAE 도요펄(Toyopearl)(도소사제)이 예시된다. DEAE 도요펄을 사용하여 정제하는 경우, 상기한 효소액을 염 농도 20mM로 제조하여, 칼럼에 가할 수 있다. 이와 동일하게 하여 칼럼에 흡착시킨 단백질은 이어서 계면활성제를 함유하지 않는 20mM의 완충액(pH 6.0 내지 8.0)에 NaCl 또는 KCl의 직선 농도 구배를 건 용액을 통과시켜 단백질을 용출시킨다. NaCl의 경우 0mM 내지 500mM의 농도 구배, KCl의 경우, 0mM 내지 350mM의 농도 구배가 사용된다. 이어서, 이러한 칼럼을 다시 계면활성제를 함유하지 않는 20mM의 완충액(pH 6.0 내지 8.0)을 통하여 세정한 다음, 계면활성제를 함유하는 20mM의 완충액(pH 6.0 내지 8.0)에 NaCl 또는 KCl의 직선 농도 구배를 건 용액을 통과시켜 단백질을 용출시킨다. NaCl의 경우, 0mM 내지 500mM의 농도 구배, KCl의 경우, 0mM 내지 350mM의 농도 구배가 사용된다. 첨가되는 계면활성제는 TritonX-100, Tween20 및 Tween80 등을 예시할 수 있으며 이의 농도는 0.02% 내지 1.0%로 사용할 수 있지만, 바람직하게는 TritonX-100을 0.1%의 농도로 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 조건 중에서, 본 발명의 효소는 계면활성제를 함유하는 20mM 완충액에 100 내지 170mM의 NaCl을 함유하는 용액에 의해 칼럼으로부터 용출된다. 이와 같이 수득된 효소액은 이대로 실로-이노소스의 제조를 위해 사용할 수 있지만, 보다 고순도로 정제하기 위해 추가로 처리한다.
또한, 효소 활성을 지표로 하여 정제하는 경우, 효소 활성의 측정은 예를 들면, 단백질 용액을 100mM 인산염 완충액(pH 5.0), 미오-이노시톨 5mg 및 2,4-디클로로인도페놀(산화형 DCIP) 0.4mg으로 이루어진 1ml 용액에 가하며, 600nm의 흡수도 변화를 반응속도로 환산하여, 1분당 1μmol의 미오-이노시톨이 산화되는 활성을 1유닛으로서 측정할 수 있다.
본 발명의 효소를 다시 정제하는 경우, 본 발명의 효소액을 투석이나 한외 여과에 의해 탈염한 후에 예를 들면, 하이드록시아파타이트 칼럼에 첨가하는 것이 바람직하다. 이 경우, 하이드록시아파타이트 칼럼에 흡착된 단백질은 계면활성제를 함유하는 인산염 완충액(pH 7.0)의 직선 농도 구배를 작용시킨 용액을 통과시킴으로써 용출된다. 이때, 사용되는 인산염 완충액의 농도 구배는 0mM 내지 500mM이다. 또한, 첨가되는 계면활성제는 TritonX-100, Tween20 및 Tween80 등을 예시할 수 있으며 이의 농도는 0.02% 내지 1.0%로 사용할 수 있지만, 바람직하게는 TritonX-100을 0.1%의 농도로 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 조건 중에서, 본 발명의 효소는 계면활성제를 함유하는 210 내지 260mM의 인산염 완충액에 의해 칼럼으로부터 용출된다. 이와 같이 수득된 효소액은 거의 순수한 NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제를 함유하고 있으며 이대로 실로-이노소스의 제조를 위해 사용할 수 있다.
<2-3> 실로-이노소스 제조용 미생물의 스크리닝 방법
본 발명은 또한, 아세토박터 종의 AB10253주를 변이처리하며, 수득되는 변이주에서 NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제 활성을 지표로 하여 선별하는 것을 특징으로 하는 실로-이노소스 제조용 미생물의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
여기서, 지표로 되는 NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제 활성은 예를 들면, 미생물 균체로부터 수득된 막 분획을 100mM 인산염 완충액(pH 5.0), 미오-이노시톨 5mg 및 2,4-디클로로인도페놀(산화형 DCIP) 0.4mg으로 이루어진 1ml 용액에 가하며, 600nm의 흡수도 변화를 측정함으로써 측정할 수 있다. 선별의 기준으로서 예를 들면, 상기 방법에서 활성을 측정하여 비교하는 경우에 비-변이 AB10253주의 1.2배 이상, 바람직하게는 2배 이상의 NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제 활성을 나타내는 균주를 선별하는 것이 바람직하다.
아세토박터 종 AB10253주를 변이처리하는 방법은 통상적인 미생물의 변이방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, UV 조사, 방사선 조사 등의 물리적 변이방법 이외에 N-니트로소구아니딘, 메탄설폰산에틸, 아질산, 메탄설폰산메틸, 아크리딘 색소, 벤조피렌 및 황산디메틸 등의 변이제의 혼합에 의한 화학적 변이방법이 있다.
이들 변이처리를 실시한 아세토박터 종으로부터 실로-이노소스 제조용 미생물을 스크리닝하는 방법을 하기에 예시한다. 단, 스크리닝 방법은 NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제 활성을 지표로 하여 실시하는 한, 본 방법에 한정되지는 않는다.
변이처리한 AB10253주를 미오-이노시톨과 영양 성분을 함유하는 한천 배지에 9cm 직경의 접시 1장당 10 내지 300콜로니, 바람직하게는 100 내지 150콜로니가 형성되도록 도포한다. 여기서, 배지의 영양 성분으로서 첨가하는 탄소원, 질소원 및 기타 영양소로서는 종래부터 공지된 일반적인 미생물 배양에 사용되는 것을 사용할 수 있다. 예를 들면, 탄소원으로서 글루코스, 슈크로스, 말토스 또는 전분 등이 있다. 이의 농도는 0.1% 내지 20%, 보다 바람직하게는 0.3 내지 5% 첨가하는 것이 바람직하다. 질소원으로서는 펩톤, 효모 추출물, 카사미노산, 황산암모늄, 염화암모늄, 질산암모늄, 요소 또는 고기 추출물 등이 예시된다. 이의 농도는 0.01% 내지 5.0%, 바람직하게는 0.5% 내지 2.0% 첨가하는 것이 바람직하다.
기타 필요에 따라 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 코발트, 망간, 아연, 철, 구리, 몰리브덴, 인산 또는 황산 등의 이온을 생성할 수 있는 무기 염류를 배지중에 첨가하는 것이 효과적이다. 배양액 중의 수소이온 농도는 pH 3 내지 10, 바람직하게는 pH 5 내지 7로 조정하여 배양하면 효율적으로 본 발명의 효소를 유도할 수 있다.
배양은 콜로니가 충분하게 형성되는 시간 동안 배양할 수 있고, 약 3일에 콜로니가 형성된다. 배양온도는 바람직하게는 균의 생육 적정 온도인 25 내지 30℃에서 보다 바람직하게는 27℃에서 배양한다.
콜로니는 분리 배양하여, 개개에 NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제 활성을 측정하며, 활성이 강한 주를 선발할 수 있고, 또한 하기에 기재된 바와 같이 9cm 직경의 접시를 사용하여 한천 배지 위에서 효율적으로 선발할 수 있다.
배양후, 9cm 직경의 접시에 형성된 콜로니 위에 검정용 한천 배지를 10ml 천천히 주입한다. 검정용 한천 배지의 조성은 100mM 인산염 완충액, 1% 미오-이노시톨 및 0.4% 산화형 DCIP로 이루어진 조성에 0.5%로 한천을 가하고, 한천을 용해시킨 다음, 36℃까지 냉각하여, 한천이 굳어지지 않도록 제조한 점성 용액이다. 상기와 같이 제조된 검정용 한천 배지는 27℃로 천천히 냉각되어, 9cm 직경의 접시에 형성된 콜로니 위에 중층된 형으로 고형화한다.
처리후, 27℃에서 접시를 항온처리함으로써 NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제 활성의 크기에 따라 한천 배지 위에 한면으로 확대된 산화형 DCIP의 청색이 콜로니의 주위에만 서서히 투명해지기 시작하는 것이 관찰된다. 이때, 보다 빠르게 투명해진 장소의 콜로니를 새로운 배지에 계대(繼代)하여, NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제 활성이 높은 주를 수득할 수 있다.
또한, 여기서 수득된 실로-이노소스 생산 미생물에 다시 변이처리를 실시하고, 산소 호흡능력을 지표로 하여 스크리닝함으로써 산소를 전자 수용체로 하여 미오-이노시톨을 실로-이노소스로 변환하는 능력을 가진 균주를 육종할 수 있다. 여기서, 산소 호흡능력이란 저산소 조건에서 양호하게 생육하는 능력을 말하며 저산소 조건이란, 예를 들면, 산소 농도 3% 미만의 조건을 말한다. 아세토박터 종 AB10253주는 절대 호기성균이므로 저산소 조건에서 양호하게 생육되는 콜로니를 새로운 배지에 계대한 것으로 산소 호흡능력이 높은 균주를 수득할 수 있다.
또한, 상기한 스크리닝 방법은 천연의 미생물에 대하여도 실시할 수 있다. 즉, 본 발명의 또하나의 스크리닝 방법은 미생물을 함유하는 천연 시료 중에서 미생물을 분리하며, 분리된 미생물로부터 NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제 활성을 지표로 하여 선별하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법이다. 여기서 천연의 미생물을 함유하는 시료란, 예를 들면, 천연의 토양 등을 들 수 있다. 천연 시료 중에서 미생물을 분리하는 방법은 예를 들면, 천연 시료의 현탁액 또는 이의 희석액을 한천 배지에 도포하며, 천연 시료에 함유되는 미생물을 독립의 콜로니로 하여 한천 배지 위에 생육시키는 방법 등을 들 수 있다. 분리된 미생물 중에서 실로-이노소스 제조용 미생물을 스크리닝하는 방법은 배지의 pH를 3 내지 4, 바람직하게는 3.5로 하는 점을 제외하고, 아세토박터 종 AB10253주를 사용하는 경우와 동일한 조작을 적용할 수 있다.
<2-4> 실로-이노소스의 제조방법
본 발명은 또한, 미오-이노시톨에 NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제 또는 당해 효소의 고활성주(실로-이노소스 제조용 미생물)을 작용시키는 것을 특징으로 하는 실로-이노소스의 제조방법에 관한 것이다.
(i) NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제를 사용하는 실로-이노소스의 제조방법
본 발명의「NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제를 사용하는 실로-이노소스의 제조방법」은 NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제를 미오-이노시톨 및 전자 수용체를 함유하는 용액중에서 미오-이노시톨에 작용시켜 실로-이노소스를 생성시키며 생성된 실로-이노소스를 용액중에서 분리 정제하는 것을 특징으로 하는 제조방법이다. 여기서 NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제는 이미 기재된 방법에 따라 수득되는 것을 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 효소는 미오-이노시톨로부터 실로-이노소스를 생성하는 활성을 갖는 한, 이의 정제 정도는 임의의 정도일 수 있다.
여기서, 기질인 미오-이노시톨은 0.1% 내지 20%, 바람직하게는 5% 내지 10%의 농도로 사용한다. 본 발명의 반응에 사용되는 효소액은 상기된 조효소액 또는 고도로 정제된 효소액을 사용할 수 있다. 반응시의 pH는 바람직하게는 pH 5.0으로 유지되도록 하며, pH를 모니터하여, 알칼리성 용액 또는 산성 용액을 적절하게 첨가할 수 있는 이외에 적당한 완충액을 사용할 수 있다. 완충액의 예로서는 pH 5.0부근에서 완충 능력이 있는 것이면 특별히 한정되지 않고 사용할 수 있으며 바람직하게는 인산염 완충액이 사용된다.
이러한 효소를 사용하는 제조방법에서는 반응액 중에 전자 수용물질을 첨가하는 것이 필요하다. 여기서, 전자 수용물질로서는 산화형 DCIP 이외에 PMS(페나진메토설페이트, 메틸렌 블루 및 Fe3+ 이온 등이 예시되며, 이들을 배합하여 사용할 수 있지만, 바람직하게는 산화형 DCIP가 사용된다. 첨가되는 전자 수용물질의 양은 미오-이노시톨 1mol에 대해 1mol의 양이 필요하며, 이를 상응하는 미오-이노시톨의 mol수에 대하여 적절하게 가할 수 있다. 반응이 진행됨에 따라 이들 전자 수용물질의 농도가 높아질 때, 환원형 전자 수용물질이 석출되는 경우가 있지만, 그 경우에는 원심분리 또는 여과 등의 조작에 따라 제거할 수 있다. 본 발명의 반응은 전자 수용물질의 용해도에 따라 불균일계인 경우가 있으며 교반하에 반응을 실시하는 것이 바람직하다.
본 발명의 반응의 반응온도는 효소가 실활되지 않을 정도로 작용시키는 것이면 특별히 한정되지 않지만 바람직하게는 20℃에서 내지 40℃에서 작용시킬 수 있다. 반응시간은 바람직하게는 1 내지 72시간이며, 보다 바람직하게는 8 내지 12시간이다. 생성된 실로-이노소스는 예를 들면, 재결정법 등에 의해 분리 정제할 수 있다.
(ii) 미생물을 사용하는 실로-이노소스의 제조방법
본 발명은 또한, 상기 스크리닝 방법에 따라 수득되는 실로-이노소스 제조용 미생물을 미오-이노시톨을 함유하는 배지에서 배양함으로써 미오-이노시톨로부터 실로-이노소스를 생성시키며 생성된 실로-이노소스를 배지로부터 분리 정제하는 것을 특징으로 하는 미생물을 사용하는 실로-이노소스의 제조방법에 관한 것이다.
여기서 사용하는 액체 배지의 조성은 미생물이 미오-이노시톨로부터 실로-이노소스를 생성할 수 있는 한, 특별한 제한은 없으며 예를 들면, 실로-이노소스로의 변환 원료인 미오-이노시톨에 첨가하여 탄소원, 질소원 및 유기 영양원 및 무기 염류 등을 함유하는 배지를 들 수 있다. 합성배지 및 천연배지 어느 것이나 사용할 수 있다. 구체적으로는 미오-이노시톨을 0.1% 내지 40%, 보다 바람직하게는 10% 내지 30% 첨가하며, 탄소원으로서는 글리세롤, 슈크로스, 말토스 또는 전분을 0.1% 내지 20%, 보다 바람직하게는 0.3 내지 5%, 및 질소원으로서는 효모 추출물, 펩톤, 카사미노산, 황산암모늄, 염화암모늄, 질산암모늄 또는 요소 등을 0.01% 내지 5.0%, 바람직하게는 0.5% 내지 2.0% 함유하는 배지가 바람직하다.
기타 필요에 따라 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 코발트, 망간, 아연, 철, 구리, 몰리브덴, 인산 또는 황산 등의 이온을 생성할 수 있는 무기 염류를 배지중에 첨가하는 것이 효과적이다. 배양액 중의 수소이온 농도는 pH 4 내지 10, 바람직하게는 pH 5 내지 9로 조정하여 배양하면 효율적으로 실로-이노소스를 수득할 수 있다.
배양조건은 균주나 배지의 종류에 따라 상이하지만, 배양온도는 바람직하게는 12 내지 35℃에서 보다 바람직하게는 20 내지 27℃이며 또한, 배양은 액체 배지를 진탕하거나, 액체 배지중에 공기 또는 산소가스를 블로잉하는 등으로서 호기적으로 실시하는 것이 바람직하다. 배양기간은 배양액 중에 미오-이노시톨이 완전하게 소실되며 또한, 실로-이노소스가 최대의 축적량을 나타낼 때까지 실시하는 것이 바람직하며 통상적으로 1 내지 10일, 바람직하게는 3 내지 8일이다.
배양액에서 목적물을 분리 정제하는 방법은 통상적인 수용성 중성물질을 분리 정제하는 일반적인 방법을 응용할 수 있다. 예를 들면, 배양액으로부터 균체를 제거한 다음, 배양 상등액을 활성탄이나 이온교환 수지 등으로 처리함으로써 실로-이노소스 이외의 불순물을 거의 제거할 수 있다. 단, 강염기성 음이온 교환수지의 OH-형은 실로-이노소스를 화학변화시키므로 사용하지 않는 편이 바람직하다. 이어서, 재결정 등의 방법을 사용함으로써 목적 물질을 분리할 수 있다.
하기에 실로-이노소스의 분리 정제의 구체적 방법를 예시한다. 단, 분리 정제의 방법은 이들로 한정되지 않는다. 우선, 실로-이노소스가 축적된 배양 상등액을 목적하지 않는 성분을 제거할 목적으로 강산성 양이온 교환수지, 예를 들면, 듀오라이트 C-20(H+형)(스미토모가가쿠제)를 충전한 칼럼에 통과시켜 통과액을 수집한 다음, 이러한 칼럼에 탈이온수를 통과시켜 세정하여 세정액을 수집하고 수득된 통과액 및 세정액을 합한다. 이와 같이 수득된 용액을 약염기성 음이온 교환수지, 예를 들면, 듀오라이트 A368S(유리 염기형)을 충전한 칼럼에 통과시켜 통과액을 수집한 다음, 이러한 칼럼에 탈이온수를 통과시켜 세정하여 세정액을 수집하고 수득된 통과액 및 세정액을 혼합하여, 실로-이노소스를 함유하며 그 이외의 불순물을 거의 함유하지 않는 수용액을 수득한다. 이러한 수용액을 농축하여 수득되는 실로-이노소스의 농후 용액에 에탄올의 적당량을 가하며, 실온 또는 저온에서 밤새 방치하면 순수한 실로-이노소스의 결정을 결정 석출할 수 있다.
<2-5> 실로-이노시톨의 제조방법
본 발명은 또한, NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제 또는 당해 효소의 고활성주를 사용하여 미오-이노시톨로부터 실로-이노소스를 생성시켜 수득된 실로-이노소스를 환원시켜 실로-이노시톨을 수득하는 것을 특징으로 하는 실로-이노시톨의 제조방법에 관한 것이다.
이러한 제조방법에서 NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제 또는 당해 효소의 고활성주(실로-이노소스 제조용 미생물)을 사용하여 미오-이노시톨로부터 실로-이노소스를 생성시키는 공정은 이미 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다. 이러한 공정에 따라 수득되는 실로-이노소스는 분리 정제하여 환원공정에 사용할 수 있지만, 분리 정제하지 않고 환원공정에 사용할 수 있다. 실로-이노소스 제조용 미생물을 사용하여 실로-이노소스를 생성시키는 경우, 배양액 중에 실로-이노소스를 생성 축적시킨 다음, 실로-이노소스를 분리하지 않고 균체만을 분리 수득한 배양 여액을 환원공정에 사용할 수 있다.
반응액계 중에서 실로-이노소스를 실로-이노시톨로 환원할 수 있는 환원제로서는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 수소화붕소나트륨, 수소화붕소리튬, 수소화붕소칼륨, 수소화 트리메톡시붕소나트륨 및 시안화수소화붕소나트륨을 들 수 있다. 이들 환원제에 의해 실로-이노소스를 환원하면 실로-이노시톨 및 미오-이노시톨이 생성된다. 이의 생성비율은 반응온도, 환원 시약의 종류에 따라 상이하지만, 일반적으로는 약 4:6의 실로-이노시톨:미오-이노시톨 혼합물이 수득된다. 따라서 혼합물에서 실로-이노시톨을 분리 정제하는 것이 필요하다.
또한, 실로-이노소스로부터 실로-이노시톨로의 환원은 하기하는 바와 같은 본 발명이 제공하는 신규 실로-이노시톨 데하이드로게나제를 사용하여 실시할 수 있다.
환원 반응액에서 실로-이노시톨을 분리 정제하는 데는 통상적인 수용성 중성물질을 분리 정제하는 일반적인 방법을 응용할 수 있다. 예를 들면, 우선 반응액을 활성탄이나 이온교환 수지 등으로 처리함으로써 실로-이노시톨 및 미오-이노시톨을 함유하며 그 이외의 불순물을 거의 함유하지 않는 수용액을 수득한다. 이러한 수용액으로부터 실로-이노시톨 만을 수득하는 데는 주로 물에 대한 용해도의 차이를 이용하는 것이 효과적이다. 즉, 상기한 수용액을 농축하여, 물에 대한 용해도가 낮은 실로-이노시톨을 고체로서 석출시켜 수득하는 방법 등을 사용할 수 있다.
또한, 하기한 바와 같이 수득된 실로-이노시톨을 함유하는 용액에 붕산과 NaCl을 가하여 실로-이노시톨/붕산 복합체를 제조하고, 이를 여과 분리후에 산에 의해 붕산을 유리시켜 메탄올과 같은 유기용매를 첨가하는 것으로 결정화시키는 방법에 따라 실로-이노시톨을 분리 정제할 수 있다.
3.실로-이노시톨 데하이드로게나제 및 이를 사용하는 실로-이노시톨의 제조방법
본 발명의 다른 형태는 신규 효소 실로-이노시톨 데하이드로게나제 및 당해 효소를 사용하는 실로-이노시톨의 제조방법에 관한 것이다.
<실로-이노시톨 데하이드로게나제>
본 발명의 실로-이노시톨 데하이드로게나제는 하기의 반응식에 기재된 바와 같이 실로-이노시톨과 실로-이노소스 간의 산화-환원반응을 촉매하며, NADH 또는 NADPH 존재하에 실로-이노소스를 입체 특이적으로 실로-이노시톨로 환원한다.
실로-이노시톨 데하이드로게나제는 상기 반응활성을 갖는 한, 이의 유래는 한정되지는 않지만, 미생물 유래인 것이 바람직하며 이. 콜라이, 아세토박터속, 바실루스속, 아그로박테리움속 또는 크산토모나스속 등인 것이 특히 바람직하다. 또한, 이. 콜라이 K-12주 ATCC10798, 아세토박터 종 AB10281주 FERM BP-10119, 바실루스 서브틸리스 168주 ATCC23857, 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefacience) C58주 ATCC33970, 아그로박테리움 종 AB10121주 FERM P-17383 또는 크산토모나스 캄페스트리스 pv. 캄페스트리스 ATCC33913인 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 실로-이노시톨 데하이드로게나제는 하기의 생리학적 성질을 갖는 실로-이노시톨 데하이드로게나제가 포함된다.
반응: 하기의 반응식에 기재된 바와 같이 실로-이노시톨과 실로-이노소스 간의 산화-환원반응을 촉매하며, NADH 또는 NADPH 존재하에 실로-이노소스를 입체 특이적으로 실로-이노시톨로 환원한다.
실로-이노시톨 데하이드로게나제 활성의 측정방법은 환원 활성을 측정하는 방법과 산화 활성을 측정하는 방법 중 어느 방법으로도 측정할 수 있지만, 산화 활성의 측정은 공존하는 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제에 유래하는 활성에 의해 정밀도가 낮으며 또한, 산화 활성 자체가 미약하므로, 바람직하게는 환원 활성을 측정하는 편이 바람직하다.
환원 활성의 측정은 실로-이노소스를 기질로 하여 NADH 또는 NADPH를 공존시켜 NADH 또는 NADPH의 340nm의 흡수 감소를 측정하는 것으로 이루어진다. 또한, 반응후의 용액을 HPLC 또는 GLC 등의 분석장치로 생산물(실로-이노시톨이나 미오-이노시톨)을 판단할 수 있다.
본 발명의 실로-이노시톨 데하이드로게나제는 바람직하게는 추가로 하기의 생리학적 성질을 갖는다.
분자량 및 회합 특성: 38 내지 46kDa, 2 또는 3량체를 형성한다.
분자량은 SDS-PAGE(도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드 전기영동) 등의 결과로부터 또는 DNA의 전체 길이로부터 효소의 추정 분자량을 산출할 수 있다. 또한, 회합 특성은 겔 여과 칼럼(도소사: 2000SWXL)로 분획된 분획의 활성을 측정하여, 상당하는 분자량 분획에서 분자량을 계산하여, 이를 효소의 분자량으로 나눈 값을 정수화함으로써 구할 수 있다.
또한, 본 발명의 실로-이노시톨 데하이드로게나제는 바람직하게는 추가로 하기의 생리학적 성질을 갖는다.
보효소: NAD+ 또는 NADP+, 또는 NADH 또는 NADPH를 보효소로 한다.
보효소의 선택성은 반응액(200mM 트리스 완충액 pH 8.0, 2% NADPH 또는 NADH, 1% 실로-이노소스) 5㎕와 효소액 5㎕를 혼합하고, 36℃에서 30분 동안 반응시킨 직후, 500㎕의 물을 가하여 340nm의 흡광도를 측정하며, 효소액 대신에 물을 사용하는 시험액의 블랭크 값에서 340nm의 흡광도의 감소량을 측정하는 것으로 확인할 수 있다. 또한 %로 나타낸 값은 질량/체적(W/V)의 백분률을 나타내며, 농도를 %로 표시하는 경우 동일한 의미를 갖는다.
또한, 상기 측정법에 따라 보효소 상대활성도 확인할 수 있다. 당해 보효소 상대활성에 따라 예를 들면, NADPH:NADH가 10O:1 내지 10O:10의 그룹, 100:10 내지 100:30의 그룹, 100:30 내지 100:60의 그룹, 100:60 내지 100:120의 그룹으로 나눌 수 있다.
또한, 본 발명의 실로-이노시톨 데하이드로게나제는 바람직하게는 추가로 하기의 생리학적 성질을 갖는다.
활성화 중금속: Co2+ 이온의 존재하에 활성화된다. 또는 Mn2+, Zn2+ 또는 Ca2+ 이온의 존재하에 활성화되는 경우에도 있을 수 있다.
억제 중금속: Sn2+ 이온의 존재하에 억제된다. 또는 Zn2+ 이온의 존재하에 억제되는 경우에도 있을 수 있다.
당해 중금속에 의한 효과는 반응액(200mM 트리스 완충액 pH 8.0, 2% NADPH, 1% 실로-이노소스 및 2mM 금속염) 5㎕와 효소액 5㎕를 혼합하고, 36℃에서 30분 동안 반응시킨 직후, 500㎕의 물을 가하여 340nm의 흡광도를 측정하며, 효소액 대신에 물을 사용하는 시험액의 블랭크 값에서 340nm의 흡광도의 감소량을 측정하는 것으로 확인할 수 있다. 「활성화된다는 것」은 중금속을 첨가하지 않은 분획의 효소 활성을 100%로 할 때에 중금속 1mM 첨가한 분획의 효소 활성이 105% 이상, 바람직하게는 120% 이상인 경우를 의미한다. 한편, 「억제된다는 것」은 중금속을 첨가하지 않은 분획의 효소 활성을 100%로 할 때에 중금속 1mM 첨가한 분획의 효소 활성이 95% 이하, 바람직하게는 70% 이하인 경우를 의미한다.
또한, 본 발명의 실로-이노시톨 데하이드로게나제는 바람직하게는 추가로 하기의 생리학적 성질을 갖는다.
최적 pH: 본 발명의 효소는 pH 5 내지 9에서 활성을 갖는다.
최적 pH는 반응액(200mM 인산염 완충액 pH 5.0 내지 9.0, 2% NADPH, 1% 실로-이노소스) 5㎕와 효소액 5㎕를 혼합하고 36℃에서 30분 동안 반응시킨 직후, 500㎕의 물을 가하여 340nm의 흡광도를 측정하며, 효소액 대신에 물을 사용하는 시험액의 블랭크 값으로부터 340nm의 흡광도의 감소량을 측정하는 것으로 확인할 수 있다. 최적 pH란, 최대 활성의 90% 이상의 활성을 갖는 것을 의미한다. 본 발명의 효소는 예를 들면, 최적 pH의 범위에 의해 산성 영역에 최적 pH가 있는 그룹(최적 pH가 5.5 내지 6.5), 중성 영역에 최적 pH가 있는 그룹(최적 pH가 6.5 내지 7.5 또는 6.5 내지 8.5), 알칼리성 영역에 최적 pH가 있는 그룹(최적 pH가 7.0 내지 8.5 또는 7.5 내지 9.0)으로 나눌 수 있다.
또한, 본 발명의 실로-이노시톨 데하이드로게나제는 바람직하게는 추가로 하기의 생리학적 성질을 갖는다.
열안정성: 본 발명의 실로-이노시톨 데하이드로게나제는 60℃까지 안정적이다.
열안정성은 효소액을 소정의 온도로 10분 동안 처리한 다음, 냉각하고 이러한 효소액과 반응액(200mM 인산염 완충액 pH 5.0 내지 9.0, 2% NADPH, 1% 실로-이노소스) 5㎕를 혼합하여 36℃에서 30분 동안 반응시킨 직후, 500㎕의 물을 가하여 340nm의 흡광도를 측정하며, 효소액 대신에 물을 사용하는 시험액의 블랭크 값으로부터, 340nm의 흡광도의 감소량을 측정하는 것으로 확인할 수 있다. 「열안정적이다」라는 것은 20℃에서 10분 처리한 분획의 활성을 100%로 하여 상기 열처리한 효소의 활성이 90% 이상 잔존하는 것을 의미한다.
또한, 본 발명의 실로-이노시톨 데하이드로게나제는 바람직하게는 추가로 하기의 생리학적 성질을 갖는다.
실로-이노소스에 대한 Km 값: 실로-이노소스에 대한 Km 값은 2 내지 13mM을 나타낸다.
실로-이노소스에 대한 Km 값은 반응액(200mM 트리스 완충액 pH 8.0, 2% NADPH 및 0.001 내지 2.5% 실로-이노소스) 5㎕와 효소액 5㎕를 혼합하고 36℃에서 30분 동안 반응시킨 직후, 500㎕의 물을 가하여 340nm의 흡광도를 측정하며, 효소액 대신에 물을 사용하는 시험액의 블랭크 값에서 340nm의 흡광도의 감소량을 측정하는 것으로 확인할 수 있다. 측정값은 일정한 방법에 따라 역수 플롯하여, Km 값을 산출한다. 본 발명의 효소는 예를 들면, 실로-이노소스에 대한 Km 값이 4mM 미만의 그룹, 4mM 내지 10mM의 그룹, 10mM 내지 13mM의 그룹으로 나눌 수 있다.
또한, 본 발명의 실로-이노시톨 데하이드로게나제는 바람직하게는 추가로 하기의 생리학적 성질을 갖는다.
기질 특이성: 상대활성이 70% 이상인 기질은 실로-이노시톨(SI), 미오-이노시톨(MI), D-키로-이노시톨(DCI), 에피-이노시톨(EI) 및 L-키로-이노시톨(LCI)을 들 수 있다. 상대활성이 20% 내지 70%인 기질은 L-키로-이노시톨(LCI), 에피-이노시톨(EI), 뮤코-이노시톨(MuI), 미오-이노시톨(MI), D-키로-이노시톨(DCI), 알로-이노시톨(AI) 및 네오-이노시톨(NI)을 들 수 있다. 상대활성이 20% 미만인 기질은 알로-이노시톨(AI), 네오-이노시톨(NI), D-키로-이노시톨(DCI), L-키로-이노시톨(LCI), 에피-이노시톨(EI) 및 뮤코-이노시톨(MuI)을 들 수 있다.
기질 특이성은 산화 활성을 지표로 실로-이노시톨에 대한 반응성에 대한 상대활성을 측정하는 것으로 확인할 수 있다. 이노시톨 이성체로서는 실로-이노시톨(SI), 미오-이노시톨(MI), D-키로-이노시톨(DCI), L-키로-이노시톨(LCI), 에피-이노시톨(EI), 뮤코-이노시톨(MuI), 알로-이노시톨(AI) 및 네오-이노시톨(NI) 등을 들 수 있다. 본 발명의 실로-이노시톨 데하이드로게나제의 기질 특이성은 상대활성이 70% 이상의 그룹, 70% 미만 20% 이상의 그룹, 20% 미만의 그룹으로 나누어 나타낼 수 있다.
측정방법에서, 반응액[각종 이노시톨 이성체 1%(네오-이노시톨만 0.4%), 200mM 트리스 완충액 pH 8.0, 0.002% NADP+, 0.002% 디아포라제 및 0.01% 니트로테트라졸리움 블루) 50㎕와 효소액 50㎕를 혼합하고, 25℃에서 3분마다 545nm의 흡광도의 증가를 마이크로플레이트 판독기로 측정할 수 있다.
이들 생리학적 성질은 상기 임의의 생리학적 성질의 조합을 갖는 것이 바람직하다.
<실로-이노시톨 데하이드로게나제의 제조 및 정제>
실로-이노시톨 데하이드로게나제의 제조에 사용할 수 있는 미생물로서는 당해 효소의 생산능을 갖는 한, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 이. 콜라이 K-12주 ATCC10798(이하, 이. 콜라이 K-12주라고 한다), 아세토박터 종 AB10281주 FERM BP-10119(이하, AB10281주라고 한다), 바실루스 서브틸리스 168주 ATCC23857(이하, 바실루스 서브틸리스 168주 또는 비. 서브틸리스 168주라고 한다), 아그로박테리움 튜메파시엔스 C58주 ATCC33970(이하, 에이. 튜메파시엔스 C58주라고 한다), 아그로박테리움 종 AB10121주 FERM P-17383(이하, AB10121주라고 한다) 및 크산토모나스 캄페스트리스 pv. 캄페스트리스 ATCC33913(이하, X. camp.라고 한다)을 들 수 있다.
실로-이노시톨 데하이드로게나제를 제조할 목적으로 이들 미생물을 배양하기 위해 사용하는 배지는 종래부터 공지된 일반적인 미생물용 배지를 사용할 수 있다. 예를 들면, 아세토박터 종 AB10281주 FERM BP-10119, 바실루스 서브틸리스 168주 ATCC23857, 아그로박테리움 튜메파시엔스 C58주 ATCC33970, 아그로박테리움 종 AB10121주 FERM P-l7383 또는 크산토모나스 캄페스트리스 pv. 캄페스트리스 ATCC33913을 배양할 때의 배지 조성은 목적에 도달하는 한, 특별한 제한은 없으며, 실로-이노시톨로의 변환 원료인 미오-이노시톨에 추가하여, 탄소원, 질소원 및 유기 영양원, 무기 염류 등을 함유하는 배지일 수 있고, 합성배지 또는 천연배지 어느 것이나 사용할 수 있다. 미오-이노시톨을 0.1 내지 40%, 보다 바람직하게는 10 내지 30% 첨가하며, 탄소원으로서는 글리세롤, 슈크로스, 말토스 또는 전분을 0.1 내지 20%, 보다 바람직하게는 0.3 내지 5%, 질소원으로서는 효모 추출물, 펩톤, 카사미노산, 황산암모늄, 염화암모늄, 질산암모늄 또는 요소 등을 0.01 내지 5.0%, 바람직하게는 0.5 내지 2.0% 첨가하는 것이 바람직하다. 기타, 필요에 따라 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 코발트, 망간, 아연, 철, 구리, 몰리브덴, 인산 또는 황산 등의 이온을 생성할 수 있는 무기 염류를 배지중에 첨가할 수 있다. 배양액 중의 수소이온 농도는 특히 조절할 필요는 없지만, 바람직하게는 pH 4 내지 10, 보다 바람직하게는 pH 5 내지 9로 조정하여 배양하면 효율적으로 실로-이노시톨 데하이드로게나제를 함유하는 균체를 수득할 수 있다.
배양조건은 배지의 종류에 따라 상이하지만, 배양온도는 12 내지 38℃에서 바람직하게는 20 내지 27℃이며 또한, 배양은 액체 배지를 진탕하거나, 액체 배지중에 공기 또는 산소가스를 블로잉하는 등으로 호기적으로 실시할 수 있다. 배양기간은 실로-이노시톨 데하이드로게나제가 최대 또는 필요량의 활성량을 나타낼 때까지 실시할 수 있으며, 통상적으로 1 내지 10일, 바람직하게는 3 내지 8일이다.
한편, 이. 콜라이 K-12주 ATCC10798을 배양할 때의 배지의 조성도 목적에 도달하는 한, 특별한 제한은 없으며, 탄소원, 질소원, 유기 영양원 및 무기 염류 등을 함유하는 배지일 수 있고, 합성배지 또는 천연배지 어느 것이나 사용할 수 있다. 예를 들면, LB 배지나 TB 배지 이외에 YT 배지등이 있다. 또한, 이. 콜라이 K-12주 ATCC10798의 실로-이노시톨 데하이드로게나제의 고유 활성을 약 3배 증가시키는 물질로서, 배지에 소르보스를 0.05 내지 1%, 바람직하게는 0.5% 첨가하는 것이 바람직하다. 배양조건은 배지의 종류에 따라 상이하지만, 배양온도는 28 내지 38℃에서 바람직하게는 36℃이며 또한, 배양은 액체 배지를 진탕하거나, 액체 배지중에 공기 또는 산소가스를 블로잉하는 등으로 호기적으로 실시할 수 있다. 배양기간은 실로-이노시톨 데하이드로게나제가 최대 또는 필요량의 활성량을 나타낼 때까지 실시할 수 있으며, 통상적으로 1 내지 3일, 바람직하게는 1일이다.
이와 같이 배양한 균체 내지 효소를 분리 정제함으로써 실로-이노시톨 데하이드로게나제를 수득할 수 있다. 효소의 분리 정제는 통상적인 단백질 정제방법과 동일하게 하여 실시할 수 있다. 이하, 구체적으로 설명하지만, 분리 정제방법은 이들로 한정되지 않는다.
우선, 배양후에 수득된 균체를 수집하기 위해서는 원심분리나 막 농축 등의 방법을 사용할 수 있다. 필요하면, 이 단계에서 균체를 적당한 용액에 현탁하며, 다시 원심분리나 막 농축 등의 방법으로 균체를 수집하는 것으로 세정할 수 있다. 이와 같이 수득되는 균체는 다음에 오토 밀이나 초음파 등의 물리적 방법으로 파쇄하여, 균체내에 존재하는 본 발명의 효소를 추출할 수 있다.
파쇄된 균체를 포함하는 균체 파쇄액은 원심분리나 막 농축 등의 방법으로 가용물과 불용물으로 나누어진다. 다음에 가용물에서 당해 효소를 분리하므로 일반적인 효소 정제의 순서에 따라 정제할 수 있다. 즉, 블루도요펄(도소사) 등의 친화성 칼럼, DEAE 칼럼 또는 CM 칼럼으로 대표되는 이온교환 칼럼, 겔 여과 칼럼 또는 하이드록시아파타이트 칼럼 등의 칼럼 조작 이외에 황산암모늄 분획법 또는 등전점 침전법 등의 배치(batch)-단계 조작법도 사용할 수 있다.
실로-이노시톨 데하이드로게나제 활성의 측정방법은 환원 활성을 측정하는 방법 또는 산화 활성을 측정하는 방법 어느 측정방법으로도 측정할 수 있지만, 산화 활성의 측정은 공존하는 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제에 유래하는 활성에 의해 정밀도가 낮으며 또한, 산화 활성 자체가 미약하므로 바람직하게는 환원 활성을 측정하는 편이 바람직하다. 환원 활성은 실로-이노소스를 기질로 하여 NADH 또는 NADPH를 공존시켜 NADH 또는 NADPH의 340nm의 흡수 감소를 측정함으로써 측정된다. 또한, 반응후의 용액중의 생산물(실로-이노시톨 또는 미오-이노시톨)을 HPLC, GLC 등의 분석장치로 판단할 수 있다.
정제된 효소는 이의 정제도를 Native(네이티브) PAGE나, SDS(도데실황산나트륨) PAGE 등을 사용하는 전기영동에 의해 확인할 수 있고, PVDF막 등의 단백질 흡착성 막에 트랜스-블롯팅함으로써 상당하는 단백질을 보다 고도로 정제할 수 있다.
본 발명의 실로-이노시톨 데하이드로게나제로서 구체적으로는 하기의 (a) 또는 (b)의 단백질을 들 수 있다.
(a)서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 또는 28에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질.
(b)서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 또는 28에 기재된 아미노산 서열에서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 가지며 실로-이노시톨과 실로-이노소스 간의 산화-환원반응을 촉매하며, NADH 또는 NADPH 존재하에 실로-이노소스를 입체 특이적으로 실로-이노시톨로 환원시키는 효소 활성을 갖는 단백질.
이중에서 서열번호 28의 아미노산 서열을 갖는 실로-이노시톨 데하이드로게나제는 본 발명에 따라 제공되는 신규한 단백질이다.
상기 「1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 가지며 실로-이노시톨과 실로-이노소스 간의 산화-환원반응을 촉매하며, NADH 또는 NADPH 존재하에 실로-이노소스를 입체 특이적으로 실로-이노시톨로 환원시키는 효소 활성을 갖는 단백질」이란 실로-이노시톨과 실로-이노소스 간의 산화-환원반응을 촉매하며, NADH 또는 NADPH 존재하에 실로-이노소스를 입체특이적으로 실로-이노시톨로 환원시키는 효소 활성을 실질적으로 억제하지 않는, 1 또는 복수의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가를 가질 수 있는 것을 나타낸다.
즉, 천연에 존재하는 단백질에는 이를 암호화하는 DNA의 다형이나 변이 이외에 생성후의 단백질의 세포내 및 정제중의 개질반응 등에 의해 이의 아미노산 서열중에 아미노산의 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가 등의 변이가 일어날 수 있지만 이에 관계없이 변이를 갖지 않는 단백질과 실질적으로 동등한 생리학적 및 생물학적 활성을 갖는 것으로 공지되어 있다. 이와 같이 구조적으로 약간의 차이가 있어도 이의 기능에 관해서는 큰 차이가 확인되지 않는 것도, 본 발명의 단백질에 포함된다. 인위적으로 단백질의 아미노산 서열에 상기와 같은 변이를 도입하는 경우에도 동일하며 이 경우에는 보다 다양한 변이체를 작제할 수 있다. 또한, 특정 종류의 단백질은 활성에는 필수적이 아닌 펩타이드 영역을 갖고 있는 것이 공지되어 있다. 예를 들면, 세포외로 분비되는 단백질에 존재하는 시그널 펩타이드나, 프로테아제의 전구체 등에 보이는 프로(pro) 서열 등이 있으며, 이들 영역의 대부분은 번역후 또는 활성형 단백질로 전환할 때에 제거된다. 이러한 단백질은 상이한 1차 구조로 존재하고 있지만, 최종적으로는 동등한 기능을 갖는 단백질이며, 본 발명의 실로-이노시톨 데하이드로게나제에 포함된다.
또한 본 명세서에서 「복수의 아미노산」이란 본 발명의 효소의 활성을 잃지 않을 정도의 변이를 일으킬 수 있는 아미노산의 수를 나타내며, 예를 들면, 400아미노산 잔기로 이루어진 폴리펩타이드의 경우, 2 내지 20정도, 바람직하게는 2 내지 10, 보다 바람직하게는 2 내지 3의 수이다. 또한, 본 발명의 단백질과의 상동성이 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 98% 이상 정도의 수치를 나타내는 단백질은 본 발명의 실로-이노시톨 데하이드로게나제에 포함된다.
본 발명의 실로-이노시톨 데하이드로게나제로서는 또한, 하기의 DNA에 의해 암호화되는 것을 들 수 있다.
(a)서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 27에 기재된 염기서열의 암호화 영역을 함유하는 DNA.
(b)서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 27에 기재된 염기서열 또는 이의 염기서열에 상보적인 염기서열을 갖는 DNA와 엄격한 조건하에 하이브리드화하며, 실로-이노시톨과 실로-이노소스 간의 산화-환원반응을 촉매하며, NADH 또는 NADPH 존재하에 실로-이노소스를 입체 특이적으로 실로-이노시톨로 환원시키는 효소 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
이중에서 서열번호 27의 염기서열을 갖는 DNA는 본 발명에 따라 제공되는 신규한 실로-이노시톨 데하이드로게나제를 암호화하는 DNA이다.
여기서 말하는 「엄격한 조건하」란 소위 특이적인 하이브리드가 형성되며, 비특이적인 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 말한다[참조: Sambrook, J. et a1., Molecular C10ning A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]. 「엄격한 조건하」로서 구체적으로는 50% 포름아미드, 4×SSC, 50mM HEPES(pH 7.0), 10×덴하르트(Denhardt) 용액, 100μg/ml 연어 정자 DNA를 함유하는 용액중에서 42℃에서 하이브리드화시킨 다음, 실온에서 2×SSC, 0.1% SDS 용액, 50℃에서 이하에서 0.1×SSC, 0.1% SDS 용액으로 세정하는 조건을 들 수 있다. 별도의 방법으로는, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 갖는 DNA가 특이적으로 하이브리드화하는 조건을 들 수 있다. 즉, 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 27에 기재된 염기서열과의 상동성이 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 98% 이상인 DNA는 본 발명의 실로-이노시톨 데하이드로게나제를 암호화하는 DNA에 포함된다.
<실로-이노시톨 데하이드로게나제를 사용하는 실로-이노시톨의 제조방법>
본 발명은 또한, 실로-이노시톨 데하이드로게나제와 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제를 공존시킨 용액 중에서 NADH 또는 NADPH 존재하에(도 1을 참조), 염가인 미오-이노시톨을 기질로 하여 실로-이노소스를 경유하여 실로-이노시톨로 효소 변환반응시키는 것을 특징으로 하는 실로-이노시톨의 제조방법에 관한 것이다.
당해 제조방법에서 사용되는 실로-이노시톨 데하이드로게나제는 상기한 효소의 정제에 의해 제조된 효소일 수 있으며, 실로-이노시톨 데하이드로게나제를 암호화하는 DNA를 사용하는 유전자 조작에 따라 제조한 재조합 효소일 수 있다.
실로-이노시톨 데하이드로게나제를 암호화하는 DNA는 예를 들면, 미생물로부터 추출한 전체 게놈을 주형으로 하여 서열번호 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 27 등의 염기서열을 갖는 DNA를 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)으로 증폭함으로써 분리할 수 있다.
또한, 실로-이노시톨 데하이드로게나제를 암호화하는 DNA는 이의 상동성으로부터 검색되는 동종 DNA를 분리함으로써 수득할 수 있다. 여기서, ydgJ 유전자라고 호칭되는 일련의 상동성이 높은 유전자는 실로-이노시톨 데하이드로게나제를 암호화하는 DNA일 가능성이 높다.
이와 같이 수득된 DNA를 플라스미드 벡터에 삽입한다. 이 때에 사용하는 플라스미드는 바람직하게는 다중-클로닝 부위를 갖는 발현 플라스미드 벡터가 사용되지만, 효소를 발현시킬 수 있으며 또한, 적당한 제한효소 부위를 갖는 다른 플라스미드 벡터라도 사용할 수 있다. 미리 단편의 말단에 적절한 제한효소 부위를 설정하고 이를 플라스미드 벡터 위에 있는 동일한 제한효소 부위와 연결시킴으로써 플라스미드를 작제할 수 있다.
또한, 플라스미드에 삽입된 DNA를 발현시키기 위해 사용되는 프로모터는 숙주 미생물 속에서 DNA가 발현되면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, lac 프로모터 또는 tac 프로모터 등을 사용할 수 있다.
이와 동일하게 제조된 재조합 플라스미드 벡터는 숙주 미생물에 도입할 수 있다. 이 때, 사용되는 숙주 미생물로서는 재조합 플라스미드 벡터가 안정적이며 또한 자율적으로 증식할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않으며 통상적인 유전자 재조합에 사용되고 있는 것, 예를 들면, 에스케리키아(Escherichia)속 또는 바실루스속에 속하는 미생물 등이 바람직하게 사용되며, 보다 바람직하게는 이. 콜라이가 사용될 수 있다.
숙주 미생물에 재조합 플라스미드 벡터를 도입하는 방법으로는, 예를 들면 숙주 미생물이 에스케리키아속에 속하는 미생물의 경우에는 칼슘이온의 존재하에 재조합 DNA를 도입할 수 있으며 수용적격 세포법을 사용할 수 있고, 또한 바실루스속에 속하는 미생물의 경우에는 수용적격 세포, 세포벽완전제거법, 전기천공법 또는 미세주입법을 사용할 수 있다. 목적하는 재조합 DNA를 숙주 미생물로 도입했는지 유무의 선별은 재조합 플라스미드 벡터를 구성하는 벡터의 약제 내성 마커에 근거하는 선택 배지에서 당해 숙주 미생물을 배양하여, 생육하는 숙주 미생물을 선택함으로써 수행될 수 있다.
다음에 효소를 발현 유도하기 위해 사용되는 배지는 숙주 미생물이 안정적으로 증식되는 배지이면, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 영양 브로스(Nutrient Broth) 및 L-브로스 등이 있다. 또한, 플라스미드 벡터의 종류에 따라서는 배지중에 DNA를 발현시키기 위해 이소프로필티오갈라토피라노시드(IPTG)와 같은 유도인자(inducer)를 가할 수 있으며 배양 도중에 유도인자를 가할 수 있다.
이와 동일하게 제조된 DNA를 갖는 재조합 플라스미드 벡터를 도입한 숙주 미생물을 배양하여, 본 발명의 DNA를 발현시킨다. 발현된 본 발명의 효소를 갖는 미생물을 원심분리하여 배지를 제거한 다음, 펠렛으로 된 미생물을 물로 세정한 후, 원심분리하여 세정 균체를 수득할 수 있다. 이러한 세정 균체를 물 또는 적당한 용액에 현탁시켜 초음파에 의해 균을 파쇄한다. 파쇄후, 원심분리하며 상등액의 본 발명의 DNA 유래의 재조합 효소를 함유하는 용액을 수득할 수 있다.
재조합 효소를 발현한 균체는 세정후에 그대로 반응 용액에 가하여, 균체 현탁액으로서 반응시킬 수 있지만, 바람직하게는 균체를 파쇄하여, 균체내에 존재하는 효소를 추출한 용액을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 이러한 추출액을 정제하여 사용할 수 있다. 정제로서는 황산암모늄 분획처리 또는 이온교환 수지에 흡착한 다음, 염 농도에 의한 직선 농도 구배를 이용하는 칼럼 크로마토그래피 또는 온도처리 등에 의해 정제할 수 있다. 또한, 본 발명의 효소는 고정화 효소 또는 고정화 균체로서 사용할 수 있다. 고정화법으로서는 겔 포매(抱 埋)법, 이온교환 수지 흡착법 등의 일반적인 고정화 방법을 적용할 수 있다.
한편, 당해 방법에서 사용되는 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제는 NAD+ 또는 NADP+ 존재하에 미오-이노시톨을 산화하여 실로-이노소스를 생성하는 효소를 사용하는 것이 바람직하다.
본 제조방법에서는 공지된 NAD+ 또는 NADP+ 의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제를 사용할 수 있다. 예를 들면, 시판하는 효소, 바실루스 서브틸리스 또는 바실루스 할로듀란스 등의 배양 균체에서 정제함으로써 제조한 효소 또는 공지된 유전자 서열을 기준으로 유전자 조작에 따라 발현시킨 재조합 효소를 사용할 수 있다.
공지된 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제의 아미노산 서열로서는 예를 들면, NCBI(National Center for Biotechnobgy Information)의 단백질 데이터 베이스에 수탁번호 2636516, 17982589, 23464076, 10174936, 17742455, 50120397, 28853468 또는 13422633으로 등록되어 있으며 이들 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열 정보도 상기 수탁번호의 CDS를 참조함으로써 수득할 수 있다.
재조합 효소를 발현한 균체는 세정후에 그대로 반응 용액에 가하여, 균체 현탁액으로서 반응시킬 수 있지만, 바람직하게는 균체를 파쇄하여, 균체내에 존재하는 효소를 추출한 용액을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 본 추출액을 정제하여 사용할 수 있다. 정제로서는 황산암모늄 분획처리 또는 이온교환 수지에 흡착시킨 다음, 염 농도에 의한 직선 농도 구배를 이용하는 칼럼 크로마토그래피 또는 온도처리 등에 의해 정제할 수 있다. 또한, 본 발명의 효소는 고정화 효소 또는 고정화 균체로서 사용할 수 있다. 고정화법으로서는 겔 포매법 또는 이온교환 수지 흡착법 등의 일반적인 고정화 방법을 적용할 수 있다.
재조합 효소를 사용하는 경우, 유전자 조작에 따라 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제와 본 발명의 효소를 둘다 동시에 발현시킬 수 있으며 이와 같이 발현하여 제조된 효소액 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 반응계에서 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제와 실로-이노시톨 데하이드로게나제의 활성량(U)의 비율은 유닛수로 정의하면 36℃에서 기질을 실로-이노소스로 할 때, 1분동안에 1μmol의 NADH 또는 NADPH가 소비되는 것을 1U로 하는 경우, 상기 효소 둘다의 활성량(U)의 비율이 1:10 내지 10:1, 바람직하게는 1:2 내지 2:1이 되도록 하는 것이 바람직하다.
본 발명의 반응계에서는 보효소 NAD+ 또는 NADP+가 필요하며, 반응액 속에서 상기 보호소는 NADH 또는 NADPH로 변환되고, NADH 또는 NADPH는 NAD+ 또는 NADP+로 다시 변환되므로 재순환되는것으로 나타났다. NAD+ 또는 NADP+와 NADH 또는 NADPH는 용액중의 pH 안정성이 상이하며, NAD+ 또는 NADP+는 pH 8.0 이하에서 안정적이며, NADH 또는 NADPH 8.0 이상으로 안정적이다. 따라서 본 발명의 반응계의 pH는 약 pH 8.0으로 유지하는 것이 바람직하다.
본 발명의 효소반응에 사용되는 보효소는 NAD+, NADH, NADP+ 및 NADPH 어느 하나 또는 이들의 혼합물로서 이용할 수 있지만, 안정성을 고려하면 NAD+ 또는 NADP+가 바람직하며 이의 농도는 0.0001 내지 0.1%, 바람직하게는 0.004 내지 0.01% 첨가하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 반응계의 중간체인 실로-이노소스를 반응 용액에 첨가함으로써 본 발명의 반응의 반응속도는 현저하게 증대된다. 따라서 실로-이노소스를 0.01 내지 3%, 바람직하게는 0.2 내지 0.5%가 되도록 반응 용액에 첨가하는 것이 바람직하다.
또한, 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제와 실로-이노시톨 데하이드로게나제는 pH 8.0에서 반응시킬 수 있으므로 효소반응 용액의 pH를 6.0 내지 8.5의 범위로 조정하여 반응시키지만, NAD+ 또는 NADP+의 안정성 및 실로-이노소스의 안정성을 고려하여 바람직하게는 pH 7.7 내지 8.3, 보다 바람직하게는 pH 8.0이 바람직하다. 또한, 반응중에 이의 pH를 유지하기 위해 필요하면, 완충액을 가할 수 있다. 첨가하는 완충액의 종류는 특별히 한정되지 않지만, pH 8.0부근에서 완충 능력이 있는 완충액이 바람직하며, 보다 바람직하게는 인산염 완충액 또는 트리스 완충액 등이 예시된다.
또한, 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제는 Mg2+ 이온으로 활성화되며, 실로-이노시톨 데하이드로게나제는 Co2+ 이온으로 활성화되므로, 이들 금속이온을 첨가하는 것으로 반응속도는 증대된다. 따라서 Co염 및/또는 Mg염을 0.01 내지 5.0mM, 바람직하게는 0.2 내지 2.0mM이 되도록 반응 용액에 첨가하는 것이 바람직하다. 사용되는 Co염 또는 Mg염은 물에 용해되는 염이면 사용할 수 있으며, 예를 들어 염산염 및 황산염 등이 있다.
본 발명에 사용되는 기질인 미오-이노시톨의 반응 용액중의 농도는 1 내지 30%, 바람직하게는 5 내지 22%로 사용하는 것이 바람직하다. 반응이 진행되면 1.6%를 초과하는 과포화의 실로-이노시톨은 결정으로서 석출되므로 미오-이노시톨은 감소된다. 따라서 감소된 미오-이노시톨량을 반응 용액에 첨가하여, 미오-이노시톨 농도를 일정하게 유지하여, 반응을 연속적으로 실시할 수 있다.
반응온도는 반응이 진행되면, 특별히 한정되지 않지만, 기질의 용해도, NAD+ 또는 NADP+의 안정성 및 효소의 열-안정성을 고려하면 20 내지 50℃에서 바람직하게는 35 내지 40℃에서 반응시키는 것이 바람직하다. 균체를 현탁하는 방법은 불균일 반응 때문에 교반을 필요로 하지만, 추출 효소를 사용하는 경우에는 균일 용액이므로 교반할 필요는 없지만, 온도를 균일화하기 위해 교반하는 것이 바람직하다.
효소반응에서 반응물인 실로-이노시톨이 용해도 이상으로 되면, 결정성 실로-이노시톨로서 침전될 수 있으므로 여과 또는 경사배출 등의 고체-액체 분리를 사용하면, 반응을 정지시킬 필요가 없으며, 여과액 등의 용액에 다시 미오-이노시톨을 첨가하여 반응을 계속할 수 있다.
효소반응을 정지시킬 필요가 있는 경우, 효소반응 그 자체를 정지시킬 수 있으며, 가열, pH의 변화 또는 단백질 변성제의 첨가 등의 방법이 사용된다. 그러나, 다음 공정의 실로-이노시톨의 정제를 고려하면 가열이 바람직하다. 예를 들면, 반응 용액을 70 내지 120℃에서 바람직하게는 80 내지 90℃에서 10 내지 20분 동안 가열할 수 있다.
또한, 효소반응은 효소를 회수하여, 정지시킬 수 있다. 효소는 이온교환 수지 칼럼에 반응 용액을 통과시킴으로써 회수할 수 있다. 고정화된 효소를 사용하는 경우에는 반응 용액을 원심분리 또는 여과 조작함으로써 고정화 효소를 회수할 수 있다.
반응 정지후 또는 반응중에 과포화된 실로-이노시톨은 결정으로서 석출된다. 결정성 실로-이노시톨은 여과 분리 또는 원심분리 등의 조작으로 분리할 수 있다. 또한, 결정성 실로-이노시톨이 균체 및 불용성 변성 단백질과 공존하는 경우에는 물을 가하여 결정성 실로-이노시톨을 용해한 후에 여과 분리 또는 원심분리 등의 조작으로 균체 및 불용성 변성 단백질을 제거할 수 있다.
이와 같이 수득된 결정성 실로-이노시톨의 정제방법은 하기와 같이 실시할 수 있다. 이 단계에서 유의할 점은 결정성 실로-이노시톨 중에 함유되는 네오-이노시톨의 제거이다. 네오-이노시톨은 실로-이노시톨 데하이드로게나제에 의해 일부의 미오-이노시톨의 5위치가 산화되어 생기는 네오-이노소스가 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제에 의해 환원되어 생긴 물질이며 본 발명의 반응계에서 미량으로 생기는 물질이다. 또한, 네오-이노시톨은 수용해도가 O.5%로 낮으며, 실로-이노시톨과 함께 결정성의 침전을 일으키기 쉬운 물질이다.
그러나, 이러한 결정성 실로-이노시톨을 다시 물에 용해하여 수득한 실로-이노시톨 용액은 미오-이노시톨을 거의 함유하지 않으며, 재농축할 때에 생기는 결정성 실로-이노시톨을 여과 분리 또는 원심분리 등의 조작으로 미량의 네오-이노시톨을 함유하는 실로-이노시톨을 수득할 수 있다. 또한, 보다 고도로 정제하는 경우, 탈염 칼럼 또는 활성탄 칼럼을 통과시켜 정제한 다음, 액체를 농축하여 다시 결정화한 재결정 실로-이노시톨을 여과 분리 또는 원심분리 등의 조작으로 분리하여 네오-이노시톨을 함유하지 않는 순수 실로-이노시톨을 수득할 수 있다.
탈염 칼럼은 이온교환 수지를 사용하는 칼럼이 바람직하다. 이때에 사용되는 이온교환 수지는 강염기성 이온교환 수지 및 약염기성 이온교환 수지의 어느 하나 또는 둘다의 혼합물 또는 강산성 이온교환 수지 및 약산성 이온교환 수지의 어느 하나 또는 둘다의 혼합물을 사용할 수 있다. 이온교환 수지를 작용시키는 방법은 칼럼상에 채운 이온교환 수지중에 용액을 통과시키는 방법이 최적이지만, 배치식으로 교반 혼합하고, 여과하는 것으로 탈염할 수 있다.
활성탄 칼럼은 탈색 목적이며, 용액을 칼럼상에 채운 활성탄 중에 용액을 통과시키는 방법도 사용할 수 있지만, 배치식으로 교반 혼합하고, 여과하는 것으로 탈색할 수 있다.
이어서, 효소반응 정지후, 반응 용액중에 용해되어 있는 용해성 실로-이노시톨의 정제방법은 하기와 같이 실시할 수 있다. 이 단계에서 유의할 점은 결정성 실로-이노시톨의 경우와 상이한 미오-이노시톨과 네오-이노시톨의 제거이다.
용해성 실로-이노시톨을 원료인 미오-이노시톨 및 네오-이노시톨과 함께 용해시키고, 여과 분리 또는 원심분리 등의 조작으로 용액으로서 수득할 수 있다. 이들 용액은 또한 용해성 펩타이드 및 염을 함유하고 있으므로 탈염 칼럼 또는 활성탄 칼럼을 통과시켜 정제한 다음, 미오-이노시톨이 석출되지 않을 정도(미오-이노시톨이 21% 이상으로 되지 않도록)로 농축하여, 석출되는 결정성 실로-이노시톨을 여과 분리 또는 원심분리 등의 조작으로 분리할 수 있다. 필요하면, 물과 혼화성인 유기용매를 가하여 결정화시킬 수 있다. 유기용매로서는 메탄올, 에탄올 및 프로판올 등을 들 수 있다.
또한, 하기한 바와 같이 수득되는 실로-이노시톨을 함유하는 용액에 붕산과 NaCl을 가하여 실로-이노시톨/붕산 복합체를 제조하고, 이를 여과 분리한 후에 산에 의해 붕산을 유리시켜 메탄올과 같은 유기용매를 첨가하는 것으로 결정화시키는 방법에 따라 실로-이노시톨을 분리 정제할 수 있다.
4.실로-이노시톨 및 실로-이노시톨 이외의 중성당을 함유하는 혼합액으로부터 실로-이노시톨을 제조하는 방법
본 발명은 또한, 실로-이노시톨 및 실로-이노시톨 이외의 중성당을 함유하는 혼합액에서 실로-이노시톨을 제조하는 방법에 관한 것이다.
<4-1>
당해 방법의 1형태는 실로-이노시톨 및 실로-이노시톨 이외의 중성당을 함유하는 혼합액에 용해된 실로-이노시톨의 2배mol 이상의 양의 붕산 및 금속염을 가한 다음, 당해 혼합액의 pH를 8.0 내지 11.0으로 조정하여 실로-이노시톨/붕산 복합체를 형성시키는 제1 공정, 상기 복합체를 혼합액에서 분리하는 제2 공정, 분리된 복합체를 산에 용해시켜 실로-이노시톨과 붕산으로 절단시키는 제3 공정 및 제3 공정에서 수득한 산성 용액 또는 산성 현탁액으로부터 실로-이노시톨을 분리 정제하는 제4 공정을 포함하는 정제된 실로-이노시톨의 제조방법이다.
본 제조방법의 제1 공정은 실로-이노시톨 및 실로-이노시톨 이외의 중성당을 함유하는 혼합액에 용해된 실로-이노시톨의 2배mol 이상의 양의 붕산 및 금속염을 가하고, 당해 혼합액의 pH를 8.0 내지 11.0으로 조정하여 실로-이노시톨/붕산 복합체를 형성시키는 공정이다.
여기서 사용하는 「실로-이노시톨 및 실로-이노시톨 이외의 중성당을 함유하는 혼합액」은 용액 또는 현탁액일 수 있다. 또한, 「실로-이노시톨 및 실로-이노시톨 이외의 중성당」 이외의 물질을 함유하는 것일 수 있으며, 미리 소량의 실로-이노시톨/붕산 복합체를 함유하는 것일 수 있다. 혼합액 중에 함유되는 중성당으로서는 4탄당, 5탄당, 6탄당 및 7탄당의 중성당이 바람직하며 예를 들면, 글루코스, 프럭토스 및 갈락토스 등의 알도스, 케토스, 이노시톨의 각종 이성체, 및 글리세롤 및 에틸렌글리콜 등의 다가 알코올류를 들 수 있다. 여기서, 이노시톨의 이성체로서는 예를 들면, 미오-이노시톨, D-키로-이노시톨, L-키로-이노시톨, 에피-이노시톨, 뮤코-이노시톨, 알로-이노시톨, 시스-이노시톨 및 네오-이노시톨을 들 수 있다.
이들 중에서 미오-이노시톨을 특히 적합하게 사용할 수 있으며, 이 경우, 「실로-이노시톨 및 실로-이노시톨 이외의 중성당을 함유하는 혼합액」으로는 예를 들면, 하기에 기재된 바와 같이 실로-이노소스를 환원시키는 경우에 생긴 실로-이노시톨과 미오-이노시톨을 함유하는 혼합액을 들 수 있다.
환원반응에 사용되는 실로-이노소스는 예를 들면, 배지나 용액 중에서 미생물을 사용하여 미오-이노시톨을 산화함으로써 수득되는 것(일본 공개특허공보 2003-102492호)을 사용할 수 있다. 미생물 산화에 의해 수득되는 실로-이노소스는 정제한 후에 용해시켜 사용할 수 있지만, 배양 여액을 사용할 수 있다. 또한, 백금 촉매로 미오-이노시톨을 산화하여 제조한 실로-이노소스를 사용할 수 있다.
실로-이노소스를 실로-이노시톨로 환원하기 위해 사용되는 환원제는 수성 시스템 중에서 실로-이노소스를 실로-이노시톨로 환원할 수 있는 환원제이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 수소화붕소나트륨, 수소화붕소리튬, 수소화붕소칼륨, 수소화 트리메톡시붕소나트륨 및 시안화수소화붕소나트륨이 있다.
실로-이노소스의 환원반응은 예를 들면, 20%(w/v) 이하의 함량으로 실로-이노소스를 용해시킨 용액에 환원제를 분말 또는 수용액으로서 첨가함으로써 실시할 수 있다. 이 때에 용액을 교반하는 것이 바람직하다. 또한, 환원반응에 따라 반응열이 발생되는 경우가 있지만, 생성된 이노소스의 분해를 예방하기 위해 반응액을 50℃에서 이하로 제어하는 것이 바람직하다. 또한, 수소화붕소나트륨 등의 환원제를 사용하는 경우에는 환원제의 일부가 분해되어 수소가스가 발생되는 경우가 있지만, 수소가스의 발포를 감소시키기 위해 소포제 등을 첨가하는 것이 바람직하다.
실로-이노소스의 환원에 의해 수득되는 실로-이노시톨과 미오-이노시톨의 혼합액 중에서 실로-이노시톨은 농도가 약 1.6%(w/v)를 초과하면 서서히 결정화를 시작한다. 통상적으로 5%(w/v)의 실로-이노소스 수용액의 환원에 의해 약 3%(w/v) 미오-이노시톨 및 약 2%(w/v) 실로-이노시톨이 발생되지만, 실온에서 수시간 동안 방치하면 실로-이노시톨의 과포화 부분의 약 0.4%(w/v)가 결정화를 시작한다. 따라서 실로-이노소스의 환원에 의해 수득되는 실로-이노시톨과 미오-이노시톨의 혼합액을 사용하는 경우에는 이러한 실로-이노시톨 자체의 결정이 나오기 전에 실로-이노시톨/붕산 복합체를 형성시키는 공정을 실시하는 편이 바람직하다. 실로-이노소스의 환원 반응후, 즉시 실로-이노시톨/붕산 복합체를 형성시키는 공정을 실시하는 것이 보다 바람직하다.
제1 공정은, 상기와 같은 「실로-이노시톨과 미오-이노시톨을 함유하는 혼합액」등의 「실로-이노시톨 및 실로-이노시톨 이외의 중성당을 함유하는 혼합액」에 붕산 및 금속염을 각각 혼합액 중에 용해되어 있는 실로-이노시톨의 2배mol 이상, 바람직하게는 2배mol 이상 및 3배mol 이하의 양으로 가하여 용해시킨 다음, 혼합액의 pH를 8.0 내지 11.0, 바람직하게는 pH 9.0 내지 10.0의 알칼리성으로 조정함으로써 실시한다. 또한, 여기서 2배mol이란 2배의 mol수를 말한다. 반응액의 pH는 NaOH, KOH, Na2CO3 또는 K2CO3 등의 염기로 조정할 수 있다.
여기서, 첨가하는 금속염은 예를 들면, NaCl, NaHCO3, Na2CO3, Na2SO4, NaHSO4, NaH2PO4, Na2HPO4, Na3PO4, 붕사, KCl, KHCO3, K2CO3, K2SO4, KHSO4, KH2PO4, K2HPO4, K3PO4, MgCl2, MgCO3 및 MgSO4로 이루어진 그룹에서 선택되는 1종류 이상의 금속염을 사용할 수 있다. 또한, 첨가하는 붕산의 양은 혼합액 중에 이미 붕산이 함유되어 있는 경우에는 이의 양과 합쳐서 용해되어 있는 실로-이노시톨의 양의 2배 이상의 mol수, 바람직하게는 2배 이상이면서, 또한 3배 이하의 mol수이다.
제1 공정은 붕산이나 금속염을 혼합액 중에 효율적으로 용해시키기 위해 및 pH 조정할 때에 용액을 균일하게 하기 위해 교반하면서 실시하는 것이 바람직하다. 이러한 공정은 5℃에서 내지 85℃에서 바람직하게는 15 내지 40℃에서 범위의 온도로 실시하는 것이 바람직하다. 이러한 공정에 필요한 시간은 실로-이노시톨/붕산 복합체가 필요량으로 수득되는 한, 특별히 한정되지 않지만, 90% 이상의 회수율을 얻기 위해서는 12 내지 76시간이 바람직하다.
실로-이노시톨/붕산 복합체는 NMR에서 확인된 물에 대한 용해도가 0.01%(w/v) 이하이므로, 혼합액 중에서는 대부분이 침전물로서 존재한다. 제2 공정에서는 이 실로-이노시톨/붕산 복합체를 혼합액으로부터 분리한다. 이러한 공정에서는 통상적인 고체-액체 분리조작을 적용할 수 있으며 예를 들면, 여과 조작 또는 원심분리 조작 등을 적용할 수 있다. 또한, 본 공정에 따라 실로-이노시톨/붕산 복합체를 분리한 후 혼합액 중에 잔류되는 실로-이노시톨은 0.2%(w/v) 이하의 농도이므로 반응 개시전의 혼합액 중에 함유되어 있는 실로-이노시톨의 대부분을 실로-이노시톨/붕산 복합체의 형으로 회수할 수 있다. 한편, 미오-이노시톨 등의 중성당은 용액중에 용해된 상태로 존재하므로 여과 조작에서는 여액에 존재하므로, 이러한 공정에 따라서 중성당과 실로-이노시톨을 분리할 수 있다.
분리된 실로-이노시톨/붕산 복합체는 건조시켜 분말로서 분리할 수 있다. 또한, 필요하면 열수에서 재결정함으로써 결정으로서 분리할 수 있다.
다음에 제3 공정에서는 분리된 실로-이노시톨/붕산 복합체를 산에 용해한다. 이러한 용해에 의해 실로-이노시톨/붕산 복합체는 실로-이노시톨과 붕산으로 절단한 다음, 복합체에 결합되어 있는 금속이온도 용액중에 해리한다. 본 공정에서, 용해에 사용되는 산의 종류로서는 복합체를 용해할 수 있는 한, 특별히 한정되지 않지만, 금속이온의 종류에 따라 용해도적(積)이 낮은 염을 형성하지 않는 것이 바람직하다. 바람직하게는 염산, 황산, 질산 및 인산 등의 무기산을 사용할 수 있으며 보다 바람직하게는 염산을 사용할 수 있다. 이들 산은 용해에 의해 생기는 금속이온과 중화반응을 일으키므로 실로-이노시톨/붕산 복합체를 용해한 용액이 최종적으로 0.1N 이상의 산성 용액이 되도록 조정하는 것이 바람직하다. 또한, 실로-이노시톨/붕산 복합체를 효율적으로 용해시키기 위해서는 1N 이상의 산으로 복합체를 용해하고, 최종적으로 0.1N 이상의 산성 용액을 제조하는 것이 바람직하다.
제4 공정에서는 제3 공정에서 수득되는 산성 용액 또는 산성 현탁액에서 실로-이노시톨을 분리 정제한다. 산성 용액에서 실로-이노시톨을 분리 정제하는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 하기와 같은 이온교환 수지 등의 수지를 사용하는 방법 및 유기용매에 대한 용해도 차이를 이용하는 방법 등을 사용할 수 있다.
또한, 붕산을 유리시킨 다음, 저급 알코올을 가하여, 저급 알코올과 붕산의 에스테르로서 감압 증류 제거하는 방법[참조: Journal of Organic Chemistry, 23권, p.329 내지 330, 1958년]을 사용할 수 있다.
이들 방법중에서, 이온교환 수지를 사용하는 실로-이노시톨의 분리 정제방법은 하기와 같이 실시할 수 있다. 이 경우, 제3 공정에서 수득된 액체는 복합체가 완전하게 용해된 0.1N 이상의 산성 용액인 것이 바람직하다. 또한, 이러한 산성 용액은 유리된 실로-이노시톨이 석출되지 않도록 하기 위해 실로-이노시톨/붕산 복합체의 비율이 2.5(w/v)% 이하가 되는 용량으로 산을 가하여 제조하는 것이 바람직하다.
이러한 산성 용액을 우선, 금속이온을 제거하기 위해 강산성 이온교환 수지와 접촉시킨다. 사용되는 강산성 이온교환 수지는 금속이온을 흡착하는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 황산 그룹을 갖는 이온교환 수지를 들 수 있다. 예를 들면, 듀오라이트 C20 H+ 타입(스미토모가가쿠) 등을 들 수 있다. 접촉 방법은 배치적으로 일정량의 용액에 강산성 이온교환 수지를 가하여 교반하는 조작에 따라 실시할 수 있지만 칼럼상에 채운 강산성 이온교환 수지에 용액을 통과시켜 실시하는 편이 바람직하다.
강산성 이온교환 수지에 의해 금속이온이 제거된 용액은 이어서 붕산을 제거하기 위해 강염기성 이온교환 수지 또는 붕산 흡착수지와 접촉시킨다. 이들 수지는 붕산을 흡착하는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 강염기성 이온교환 수지로서는 4급 암모늄 그룹을 갖는 수지가 있고, 붕산 흡착수지로서는 N-메틸글루타민 그룹을 갖는 수지가 있다. 구체적으로는 강염기성 이온교환 수지로서 듀오라이트 A116 OH- 타입(스미토모가가쿠) 등을 들 수 있다. 또한, 붕산 흡착수지로서 구체적으로는 듀오라이트 ES371N(스미토모가가쿠) 등을 들 수 있다. 접촉 방법은 배치적으로 일정량의 용액에 이온교환 수지를 가하여 교반하는 조작에 따라 실시할 수 있지만, 칼럼상에 채운 이온교환 수지에 용액을 가하여 실시하는 편이 바람직하다.
수지에 접촉시키는 순번은 붕산과 실로-이노시톨이 산성 상태에서 해리되므로 무작위 순서가 아니며, 처음에 강산성 이온교환 수지, 다음에 강염기성 이온교환 수지 또는 붕산 흡착수지의 순서로 접촉시킨다.
이들 수지에 접촉시켜 금속이온 및 붕산이 제거된 용액에는 중성당인 실로-이노시톨만이 함유된다. 따라서 이러한 용액을 통상적인 방법에 따라 농축하여 실로-이노시톨을 석출시킴으로써 정제된 실로-이노시톨을 결정 또는 분말로서 분리할 수 있다.
또한, 제4 공정에서 유기용매에 대한 용해도 차이를 이용하여 실로-이노시톨을 분리 정제하는 경우에는 아래와 같이 실시할 수 있다. 또한, 본 방법에서는 용해한 다음, 유기용매 첨가까지의 사이에 이온교환 수지 등에 의한 정제조작을 실시하지 않으므로 제3 공정의 산에 의한 용해에 따라 수득되는 액체는 용해액일 수 있지만, 현탁액일 수도 있다. 또한, 제3 공정에서는 용해후에 실로-이노시톨이 석출되기 쉽게 하기 위해 실로-이노시톨/붕산 복합체의 비율이 2.5%(w/v) 이상, 바람직하게는 3.0% 내지 10%(w/v), 보다 바람직하게는 4.0% 내지 6.0%(w/v)가 되는 용량으로 산을 첨가하는 것이 바람직하다.
우선, 유리 실로-이노시톨을 석출시키기 위해 수득된 산성 용액 또는 현탁액에 수용성 유기용매를 가한다. 사용되는 유기용매는, 붕산이 용해되며, 산과 염을 형성한 금속염이 용해된 상태에서 실로-이노시톨을 석출시킬 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않지만 예를 들면, 에탄올 및 메탄올을 들 수 있다.
유기용매의 양은 예를 들면, 에탄올을 사용하는 경우, 산성 용액에 대해 0.3 내지 3배 용적의 에탄올을 첨가하는 것이 바람직하며 0.6 내지 1.5배 용적의 에탄올을 첨가하는 것이 보다 바람직하다. 메탄올을 사용하는 경우, 산성 용액에 대해 0.3 내지 5배 용적의 메탄올을 첨가하는 것이 바람직하며 0.9 내지 2배 용적의 메탄올을 첨가하는 것이 보다 바람직하다. 특히 실로-이노시톨/붕산 복합체를 형성시킬 때에 사용하는 금속염이 NaCl, NaHCO3 및 Na2C03 중의 어느 하나 또는 2종류 이상인 경우에는 상기 용량으로 유기용매를 첨가하는 것이 효과적이다. 또한, 수용성 유기용매를 가한 후의 혼합액이 0.1N 이상의 산성 용액이 되도록 조정하는 것이 바람직하다.
제4 공정에서 혼합물이 균일 용액인 경우에는 반드시 교반할 필요는 없지만, 현탁액의 경우에는 교반하는 편이 바람직하다. 또한, 혼합하는 온도는 실로-이노시톨만이 석출되는 온도이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 -10℃에서 내지 50℃에서 보다 바람직하게는 4℃에서 내지 35℃로 한다. 혼합하는 시간은 10분 내지 24시간이 바람직하며 3 내지 5시간이 보다 바람직하다.
이러한 조작에 따라 실로-이노시톨 만을 석출시킬 수 있다. 석출된 실로-이노시톨을 여과 또는 원심분리 등의 통상적인 고체-액체 분리조작에 따라 용액에서 분리할 수 있다. 수득되는 실로-이노시톨은 순수한 것이지만, 필요하면 재결정 등의 방법에 따라 결정으로서 수득할 수 있다. 보다 순도를 올리기 위해 석출된 실로-이노시톨을 물에 용해한 다음, 이온교환 수지 등에 의해 다시 정제할 수 있다.
<4-2> 실로-이노소스로부터 실로-이노시톨/붕산 복합체를 경유하지 않고 실로-이노시톨을 제조하는 방법
다음에 실로-이노시톨 및 실로-이노시톨 이외의 중성당을 함유하는 혼합액으로부터 실로-이노시톨을 제조하는 방법의 또하나의 형태에 관해서 설명한다.
본 방법은 실로-이노소스를 함유하는 용액중의 실로-이노소스를 수소화붕소 금속염을 사용하여 환원시켜 미오-이노시톨 및 실로-이노시톨을 함유하는 혼합액을 수득하는 제1 공정, 상기 혼합액에 산을 가하여 혼합액 중에 실로-이노시톨/붕산 복합체를 용해시키고, 동시에 용액을 0.01N 이상의 산성 용액으로 조정하는 제2 공정 및 산성 용액에 수용성 유기용매를 미오-이노시톨이 석출되지 않는 양으로 가하여, 실로-이노시톨 만을 석출시키는 제3 공정을 포함하는 실로-이노시톨의 제조방법이다.
실로-이노소스를 함유하는 용액에서 실로-이노소스를 수소화붕소 금속을 사용하여 환원한 경우, 용액중에는 환원되어 생긴 실로-이노시톨과 미오-이노시톨 이외에 붕산 및 금속이온이 존재하므로 실로-이노시톨의 일부는 물에 불용성인 실로-이노시톨/붕산 복합체를 형성하며, 용액 성분만으로부터 실로-이노시톨을 정제하는 경우, 수율이 저하된다. 제2 발명은 실로-이노소스의 환원에 의해 수득되는 미오-이노시톨 및 실로-이노시톨을 함유하는 혼합액에서 소량 생성되는 실로-이노시톨/붕산 복합체를 산에 용해하여 수득한 산성 용액에서 실로-이노시톨 만을 석출시켜 정제하는 것을 목적으로 한다.
제1 공정에서, 「실로-이노소스를 함유하는 용액」은 예를 들면, 배지나 용액중에서 미생물을 사용하여 미오-이노시톨을 산화함으로써 수득되는(일본 공개특허공보 2003-102492호) 것을 사용할 수 있다. 미생물 산화에 의해 수득되는 실로-이노소스는 정제한 후에 용해하여 사용할 수 있지만, 배양 여액을 사용할 수도 있다. 「실로-이노소스를 함유하는 용액」은 이러한 배양 여액과 같이 실로-이노소스 이외의 물질을 함유하는 것일 수 있다. 또한, 백금 촉매로 미오-이노시톨을 산화하여 제조한 실로-이노소스를 용해하여 사용할 수 있다.
환원에 사용하는 수소화붕소 금속은, 수성 시스템 중에서 실로-이노소스를 실로-이노시톨로 환원할 수 있고, 붕소를 유리할 수 있는 환원제이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 수소화붕소나트륨, 수소화붕소리튬 및 수소화붕소칼륨이 있다.
실로-이노소스의 환원반응은 예를 들면, 20%(w/v) 이하의 함량으로 실로-이노소스를 용해한 용액에 환원제를 분말 또는 수용액으로서 첨가할 수 있다. 이 때에 용액을 교반하는 것이 바람직하다. 또한, 환원반응에 따라 반응열이 발생하는 경우가 있지만, 생성된 이노소스의 분해를 예방하기 이해 반응액을 50℃이하로 제어하는 것이 바람직하다. 또한, 환원제의 일부가 분해되어 수소가스가 발생하는 경우가 있지만, 수소가스의 발포를 감소시키기 위해 소포제 등을 첨가하는 것이 바람직하다.
이와 동일하게 하여, 실로-이노소스는 실로-이노시톨과 미오-이노시톨로 환원되며, 실로-이노시톨과 미오-이노시톨은 용액중에 혼합 상태로 존재한다. 이 때, 실로-이노시톨은 농도가 약 1.6%(w/v)를 초과하면 서서히 결정화를 시작한다. 통상적으로 5%(w/v)의 실로-이노소스 수용액의 환원에 의해 약 3%(w/v) 미오-이노시톨 및 약 2%(w/v) 실로-이노시톨이 생기지만, 실온에서 수시간 동안 방치하면 실로-이노시톨의 과포화 부분의 약 0.4%(w/v)가 결정화를 시작한다. 또한, 실로-이노소스의 환원에 의해 수득된 실로-이노시톨과 미오-이노시톨의 혼합액에는 붕산이 함유되므로 실로-이노시톨의 일부가 실로-이노시톨/붕산 복합체를 형성하기 시작한다. 제2 발명의 제조방법에서는 제1 공정 후, 즉시 제2 공정을 실시할 수 있지만, 실로-이노시톨/붕산 복합체는 산처리에 의해 용해되므로, 제1 공정 후, 잠시 방치한 후에 제2 공정을 실시할 수 있다.
제2 공정은 제1 공정에 따라 수득된 「미오-이노시톨 및 실로-이노시톨을 함유하는 혼합액」에 산을 가하여, 혼합액 중의 실로-이노시톨/붕산 복합체를 용해하고, 용액을 0.01N 이상의 산성 용액으로 조정한다. 이 때, 사용되는 산은 염산, 황산, 질산 또는 인산 등의 무기산을 사용할 수 있지만, 바람직하게는 염산 또는 황산이 사용된다.
제3 공정에서는 제2 공정에서 수득되는 산성 용액에 미오-이노시톨을 석출시키지 않고 실로-이노시톨 만을 석출시키는 양의 수용성 유기용매를 가한다. 이 때, 사용되는 수용성 유기용매는 실로-이노시톨을 석출시켜 미오-이노시톨을 용해시킨 상태를 만족하는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 에탄올, 메탄올 또는 1-프로판올이 바람직하다.
미오-이노시톨을 석출시키지 않고 실로-이노시톨 만을 석출시키는 양이란, 예를 들면, 산성 용액에 대해 에탄올의 경우, 0.2 내지 0.4배 용적, 메탄올의 경우, 0.2 내지 0.8배 용적, 1-프로판올의 경우 0.2 내지 0.4배 용적이며, 바람직하게는 산성 용액에 대해 에탄올의 경우, 0.35 내지 0.45배 용적, 메탄올의 경우, 0.45 내지 0.55배 용적, 1-프로판올의 경우, 0.35 내지 0.45배 용적이다.
수용성 유기용매를 혼합할 때에는 혼합물이 균일 용액인 경우에는 반드시 교반할 필요는 없지만, 현탁액의 경우, 교반하는 것이 바람직하다. 혼합할 때의 온도는 실로-이노시톨 만이 석출되는 온도이면, 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 -10℃에서 내지 50℃에서 보다 바람직하게는 4℃에서 내지 35℃이다. 혼합하는 시간은 바람직하게는 15 내지 76시간, 보다 바람직하게는 20시간 내지 24시간이다.
이러한 조건에서 수성 유기용매를 혼합하는 경우, 실로-이노시톨 만이 석출된다. 석출된 실로-이노시톨을 여과 또는 원심분리 등의 통상적인 고체-액체 분리조작에 따라 고체로서 수득할 수 있다. 이러한 고체는 거의 순수한 실로-이노시톨 만 으로 이루어지지만 필요하면, 재결정 등의 방법에 따라 결정으로서 수득할 수 있다. 보다 순도를 올리기 위해 석출된 실로-이노시톨을 물에 용해한 후, 이온교환 수지 등에 의해 다시 정제할 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 기재하여 본 발명을 구체적으로 설명한다.
실시예 1
<실로-이노시톨의 제조방법(소규모)>
미오-이노시톨 10.0%, 효모 추출물 1.0% 및 슈크로스 1.0%를 함유하는 액체 배지 3ℓ를 1N NaOH를 사용하여 pH 7.0으로 제조하며, 100ml씩 500ml 용적의 배플(baffle) 부착 삼각 플라스크 30개에 분주(分注)하여, 오토클레이브를 사용하여 멸균하였다. 각각의 삼각 플라스크에 아세토박터 종 AB10281주(FERM BP-10119)의 경사 배양물을 1백금이 접종하여 27℃에서 5일 동안 회전 진탕기에서 배양하였다. 배양후, 각각의 삼각 플라스크에 물을 250ml씩 가하여 1시간 동안 회전 진탕기에서 교반하고, 배양액에 존재하는 결정성의 실로-이노시톨을 용해하였다. 이러한 배양액을 수집하여 원심분리(8,000rpm 20분 동안)하고, 상등액을 배양 상등액(10.2L)으로 하였다.
이러한 배양 상등액을 고속 액체 크로마토그래피에 의해 하기의 조건으로 분석하였다. 그 결과, 배양 상등액 중에는 실로-이노시톨이 12.6mg/ml(129g, 변환율 43%) 생성됨을 알았다. 이 때의 배양 상등액 중에는 실로-이노소스가 2.1mg/ml 잔존되며, 미오-이노시톨은 검출되지 않았다.
고속 액체 크로마토그래피의 분석조건은 하기와 같다.
칼럼: Wakosil 5NH2(4.6×250mm)
칼럼온도: 40℃
검출기: RI DETECTER ERC-7515A(ERMA CR. INC.)
주입량: 5㎕
용매: 아세토니트릴-물= 4:1
유량: 2ml/분
용출시간: 실로-이노소스; 11.6분
미오-이노시톨; 17.8분
실로-이노시톨; 18.2분
또한, 상기한 실로-이노시톨의 변환율은 하기 수학식에 의해 구한다.
[수학식 1]
변환율(%)= {(배양 상등액 중의 실로-이노시톨 mol수)/(배양전 미오-이노시톨의 mol수)} ×100
다음에 배양 상등액을 강산성 양이온교환 수지 듀오라이트 C-20(H+형)(스미토모가가쿠사제) 500ml를 충전한 칼럼(내부직경 5cm, 길이 40cm)과 활성탄 200ml를 충전한 칼럼(내부직경 5cm, 길이 16cm)를 연결한 칼럼에 통과시킨 다음, 이러한 칼럼에 500ml의 이온교환수를 통과시켜 세정하였다. 이러한 통과액 및 세정액을 강염기성 음이온 교환수지 듀오라이트 A116(OH-형)(스미토모가가쿠사제) 1000ml를 충전한 칼럼(내부직경 7cm, 길이 40cm)에 통과시킨 다음, 이러한 칼럼에 1000ml의 이온교환수를 통과시켜 세정하였다. 이와 같이 수득된 통과액 및 수 세정액 중에는 실로-이노시톨 이외의 불순물은 거의 존재하지 않았다.
상기에 의해 수득한 수용액을 감압하에 약 700ml까지 농축하고, 에탄올을 3배량 가하여 5℃에서 밤새 방치하여 수득한 순수한 실로-이노시톨의 무색 결정을 여과하고, 건조시켜 118g 수득하였다. 이 때의 정제 회수 수율은 92%이며 미오-이노시톨로부터 실로-이노시톨의 전체 회수율은 39%이었다.
실시예 2
<실로-이노시톨의 제조방법(대규모)>
미오-이노시톨 10.0%, 효모 추출물 1.0% 및 슈크로스 1.0%를 함유하는 액체 배지 40ℓ를 50L 용적 발효시험기에 도입하고, 1N NaOH를 사용하여 pH 7.0으로 제조하며, 오토클레이브 멸균하였다. 동일 조성의 배지(삼각 플라스크)에서 배양한 아세토박터 종 AB10281주(FERM BP-10119)를 400ml 접종하며, 27℃에서 5일 동안 통기량 1vvm, 회전수 200rpm에서 배양하였다. 배양후, 수거된 배양액 약 40L에 약 50℃의 온수를 60L 가하여, 1시간 동안 교반하며 배양액에 존재하는 결정성의 실로-이노시톨을 용해하였다. 이러한 배양액을 연속 원심분리(8,000rpm)하여, 균체를 제거한 액을 배양 균 제거액(약 100L)으로 하였다.
이러한 배양 균 제거액을 고속 액체 크로마토그래피에 의해 하기의 조건으로 분석하였다. 그 결과, 배양 균 제거액 중에는 실로-이노시톨이 16.8mg/ml(1.68kg, 변환율 42%) 생성되어 있음을 알았다. 이 때의 배양 균 제거액 중에는 실로-이노소스가 2.9mg/ml 잔존하며, 미오-이노시톨은 검출되지 않았다. 또한, 고속 액체 크로마토그래피의 분석조건은 실시예 1과 동일하다.
이어서, 수득되는 100L의 용액에 수산화나트륨 400g을 가하여, 교반하에 가열하며 98℃에서 1시간 동안 처리하였다. 다음에 액체가 뜨거운 동안에 수산화나트륨 560g, 붕산 1340g 및 NaCl 1260g을 가하여 용해시켰다. 교반을 중지하여 이러한 용액을 방열시켜 23℃가 될 때까지 방치하였다(약 24시간).
다음에 액체중에 형성된 실로-이노시톨/붕산 복합체의 결정을 분리하기 위해 이러한 용액을 여과하여, 결정을 물로 백색이 될 때까지, 세정하였다. 수득된 결정(약 3.9kg)은 별도의 용기에 수거하고, 여기에 물 5.9L, 37% 염산 1.95L를 가하여, 교반한다. 30분후, 이러한 조작으로 붕산을 유리된 실로-이노시톨을 다시 침전시키기 위해 메탄올을 9.4L 가한 다음, 1시간 동안 교반한다.
다음에 액체중에 결정화된 실로-이노시톨을 분리하기 위해 이러한 용액을 여과하여, 결정을 50% 메탄올 1L로 세정하였다. 수득된 미세 분말의 결정(약 1.8kg)은 별도의 용기에 수거하며 여기에 물 10L를 가하여 교반하면서, 온도를 올려 1시간 동안 끓였다. 다음에 이러한 용액을 교반하면서 20℃로 냉각하고, 여과하여 실로-이노시톨 미세 결정을 수득하였다. 건조된 다음, 순수한 실로-이노시톨의 무색 결정을 1.35kg 수득하였다. 이때의 정제 회수 수율은 80%이며 미오-이노시톨로부터 실로-이노시톨의 전체 회수율은 34%이었다.
실시예 3
<16SrRNA 염기서열에 의한 실로-이노시톨 생성균의 동정>
미오-이노시톨을 실로-이노시톨로 변환하는 능력을 갖는 3개의 자연 분리균주, AB10285주, AB10286주, AB10287주 및 AB10253주에서 육종된 AB10281주 4개 균주의 16SrRNA 염기서열을 통상적인 방법에 따라서 해석하였다. 즉, 배양후의 균체 내지 게놈 DNA를 추출한 다음, 16SrRNA의 약 1.6kbp가 증폭될 수 있도록 설계된 프라이머를 사용하여 PCR법에 따라 상당하는 DNA 단편을 제조하고, 약 1.3kbp 상당의 서열을 해석하였다(홋카이도시스템사이언스사). 이의 서열결과를 바탕으로 데이타 베이스와 대조하여, 관련 종을 동정하였다.
표 2에 조합 결과, 상동성, 실시예 1과 동일하게 배양할 때의 실로-이노시톨에 대한 변환율을 기재하고 있다.
[표 2]
16SrRNA 염기서열 해석에 의한 균주 동정
본 결과에서, 미오-이노시톨을 실로-이노시톨로 변환하는 능력을 갖는 4종류의 균주는 크게 2 그룹으로 나눌 수 있음을 알았다. 제1 그룹으로서, AB10281주와 AB10285주는 아세토박터 세레비지애 또는 아세토박터 말로룸으로서 동정되고, 또한 제2 그룹으로서 AB10286주와 AB10287주는 부르크홀데리아 안드로포고니스로서 동정되었다.
실시예 4
<아세토박터 종 AB10253주에서 NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제의 분리>
500ml 용적 배플 부착 삼각 플라스크에 미오-이노시톨 3g, 효모 추출물(FNI205: Lallemand BI사제) 1g 및 글루코스 0.5g을 가하여, 100ml가 되도록 물에 용해하고, pH 5.0으로 조정하여, 오토클레이브에 의해 멸균된 배지를 4개 작제하며 여기에 아세토박터 종 AB10253주를 경사로 각각 1백금이 가하여, 2일 동안 27℃에서 회전 진탕기를 사용하여 초기 배양하였다.
다음에 50ℓ 용적 발효시험기에 미오-이노시톨 1.2kg, 효모 추출물(FNI205: Lallemand BI사제) 0.4kg 및 글루코스 0.2kg을 가하여, 40ℓ가 되도록 물에 용해하고, pH 5.0으로 조정하고, 오토클레이브에 의해 멸균하였다. 여기에 초기 배양된 아세토박터 종 AB10253주의 균액 약 400ml를 가하여, 3일 동안 27℃에서 통기량 1vvm, 회전수 200rpm에서 배양하였다.
배양후, 연속 원심기를 사용하여, 균체를 침전물로서 수득하였다. 수득된 균체는 물 2ℓ에 재현탁하며 원심분리에 의해 세정 균체를 수득한 후에 20mM 트리스 완충액 pH 7.0 2ℓ에 현탁하였다. 다음에 이러한 현탁액에 초음파를 조사하고, 균체를 파쇄하였다. 균체 파쇄액은 파쇄된 균체를 침전시키기 위해 원심분리하고, 침전물로서 파쇄 균체를 수득하였다. 이러한 침전물에 20mM 트리스 완충액 pH 7.0, 0.6% TritonX-100(Kodak사제) 500ml를 가하여 현탁하며 3시간, 15℃에서 효소를 추출하였다. 다음에 원심분리하고 상등액의 조효소액 420ml를 수거하였다.
조효소액 420ml는 한외 여과장치(MW 30000 컷오프)에 의해 150ml까지 농축하고, 이러한 농축액을 20mM의 트리스 완충액(pH 7.0)으로 평형화한 DEAE 도요펄 칼럼 400ml를 통과시켜 단백질을 흡착시킨다. 칼럼에 흡착시킨 단백질은 다음에 계면활성제를 함유하지 않는 20mM의 트리스 완충액(pH 7.0)에 NaCl 0mM 내지 500mM의 직선 농도 구배를 작용시킨 용액(총량 1.6ℓ)를 1분 동안에 10ml의 속도로 통과시켜 단백질을 용출시켰다. 용출액은 40ml씩의 분획으로 분획하였다. 다음에 이러한 칼럼을 다시 계면활성제를 함유하지 않는 20mM의 트리스 완충액(pH 7.0) 600ml를 통해서 세정한 다음, 0.1% TritonX-100을 함유하는 20mM의 트리스 완충액(pH 7.0)에 NaCl 0mM 내지 500mM의 직선 농도 구배를 작용시킨 용액(총량 1.6ℓ)를 1분 동안에 10ml의 속도로 통과시켜 단백질을 용출시켰다. 용출액은 40ml씩의 분획으로 분획하였다.
각 분획의 효소 활성은 표준적인 방법으로서, 단백질 용액 50㎕에 100mM 인산염 완충액(pH 5.0), 미오-이노시톨 5mg 및 2,4-디클로로인도페놀(산화형 DCIP) 0.4mg으로 이루어진 1ml 용액의 600nm의 흡수도 변화를 반응속도로 환산하여, 1분당 1μmol의 미오-이노시톨이 산화되는 활성을 1유닛으로서 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 효소는 0.1% TritonX-100을 함유하는 20mM의 트리스 완충액(pH 7.0), NaCl 100 내지 170mM의 용액 분획에 용출되는 것을 알았다. 다음에 이러한 분획(240ml)을 수집하여 한외 여과장치(MW 30000 컷오프)에 의해 30ml까지 농축하고, 0.1% TritonX-10O을 함유하는 20mM의 트리스 완충액(pH 7.0) 100ml를 가하여 다시 농축하고, 30ml까지 농축된 용액에 20mM의 트리스 완충액(pH 7.0)을 70ml 가하여, 탈염시켰다.
이와 동일하게 하여 제조된 효소액은 다음에 0.1% TritonX-100을 함유하는 20mM의 트리스 완충액(pH 7.0)으로 평형화한 하이드록시아파타이트 칼럼 100ml를 통과시켜 단백질을 흡착시켰다. 칼럼에 흡착시킨 단백질은 다음에 0.1% TritonX-100을 함유하는 트리스 완충액(pH 7.0)에 인산염 완충액(pH 7.0)을 0mM 내지 500mM의 직선 농도 구배를 작용시킨 용액(총량 400ml)을 1분 동안에 3ml의 속도로 통과시켜 단백질을 용출시켰다. 용출액은 10ml씩의 분획으로 분획하여, 각 분획의 효소 활성을 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 효소는 0.1% TritonX-100을 함유하는 20mM의 트리스 완충액(pH 7.0), 인산염 완충액 100 내지 170mM의 용액 분획에 용출되는 것을 알았다. 이와 같이 수득되는 효소액은 거의 순수한 NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제를 함유하고 있다. 다음에 이러한 분획(40ml)을 수집하여 한외 여과장치(MW 30000 컷오프)에 의해 5ml까지 농축하고, 20mM의 트리스 완충액(pH 7.0) 100ml를 가하여 다시 5ml까지 농축하여 탈염시켰다.
이와 동일하게 하여 제조된 당해 농축액을 다시 0.1% TritonX-100을 함유하는 20mM의 트리스 완충액(pH 7.0)으로 평형화한 DEAE 도요펄 칼럼(도소사제) 20ml를 통과시켜 단백질을 흡착시켰다. 칼럼에 흡착시킨 단백질은 다음에 0.1% TritonX-100을 함유하는 20mM의 트리스 완충액(pH 7.0)에 NaCl 50mM 내지 250mM의 직선 농도 구배를 작용시킨 용액(총량 160ml)을 1분 동안에 1ml의 속도로 통과시켜 단백질을 용출시켰다. 용출액은 4ml씩의 분획으로 분획된다. 분획후, 각 분획의 효소활성 측정과, 활성이 있는 각 분획의 SDS 전기영동하였다.
그 결과, 본 발명의 효소의 효소 활성과 상관성이 있는 단백질의 밴드가 SDS 전기영동에서 명백해졌다. 전후의 활성이 없는 분획에 유래하는 단백질의 밴드를 제거하면 본 발명의 효소는 적어도 분자량 약 76kDa과 약 46kDa의 단백질을 함유하는 효소인 것이 판명됐다.
또한, 효소의 활성이 있는 분획은 적색의 색깔을 가지며 UV 스펙트럼 패턴에서 사이토크롬C를 함유하는 것을 알았다. 또한 목적 단백질의 함유량과, 사이토크롬 C의 흡광도에서 본 발명의 효소 1mol에는 1mol의 사이토크롬 C가 함유되어 있는 것이 판명됐다.
최적 pH의 측정은 효소 활성을 측정할 때, 완충액 및 pH를 변경하여 측정하였다. 완충액은 100mM 인산염 완충액(pH 3 내지 8), 100mM 트리스 완충액(pH 7 내지 8) 및 100mM 탄산 완충액(pH 8 내지 11)을 사용하였다. 그 결과, 본 발명의 효소는 pH 4.5 내지 5.5에서 극대활성을 갖는 것을 알았다. 또한, 표준적 효소 활성을 측정할 때[100mM 인산염 완충액(pH 5.0)]에 각종 중금속 이온(Sn2+, Mn2+, Mg2+, Cu2+, Fe, Zn2+, Co2+, Pb2+, Ca2+, Cd2+ 및 Ni2+)을 가하여 측정한 결과, 본 발명의 효소는 Sn2+ 이온에 의해 특이적으로 억제되는 것을 알았다. 효소 활성은 1mM의 Sn2+ 이온 존재하에서 Sn2+ 이온 부재하의 활성의 1% 이하까지 억제되었다.
또한, 본 발명의 효소는 막 분획에서 TritonX-100에 의해 추출되는 효소이며, 추출 효소는 환원형 DClP 존재하에 미오-이노시톨을 산화하지만, 환원형 DCIP 부재하에서는 산소 흡수는 일어나지 않음을 확인했다. 이는, 생체속에서 세포막 전자전달계와 공동 작용하여 미오-이노시톨로부터 전자를 탈취함으로써 실로-이노소스를 생성함을 의미한다.
본 발명의 효소의 기질 특이성은 미오-이노시톨 대신에 각종 당을 최종 농도 50mM 함유하는 용액으로 효소 활성을 측정하였다. 또한, 활성이 있는 당에 관해 당의 농도를 변경하여 효소 활성을 측정하며 Km 값을 측정하였다. 또한, 산화 반응물을 HPLC에서 분석하여, 어떠한 물질이 생성되는가를 측정하였다. HPLC 조건은 칼럼에 Wakosil 5NH2 칼럼 Φ4.6×250mm(칼럼온도 40℃), 이동상에 80% 아세토니트릴(유속 2ml/분) 및 검출기로서 RI 검출기를 사용하여 측정하였다.
결과적으로 본 발명의 효소는 D-키로-이노시톨(상대활성 10O%:Km= 8.8mM), 뮤코-이노시톨(상대활성 68%:Km= 14.5mM, 미오-이노시톨(상대활성 53%:Km= 20mM)에 반응하고 D-키로-1-이노소스, L-키로-2-이노소스, 실로-이노소스로 각각 변환된다. 알로-이노시톨, 실로-이노시톨, L-키로-이노시톨, 글루코스에는 반응하지 않는 것을 알았다.
실시예 5
<NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제에 의한 미오-이노시톨의 실로-이노소스로의 변환>
실시예 4와 동일하게 하여, 40L 발효시험기로부터 정제하고 도중에 하이드록시아파타이트 칼럼 100ml에 의해 정제, 탈염시킨 5ml의 효소 용액을 효소액으로 하여 하기의 변환반응을 실시하였다.
400ml 용적의 원심튜브에 미오-이노시톨 30g(166.7mmol), 1M 인산염 완충액(pH 5.0) 15ml를 가하고, 물을 사용하여 30Oml로 희석하여 미오-이노시톨을 용해시켰다. 여기에 30℃에서, 효소액 1ml를 가하여 교반하면서, 환원형 DCIP(Na염) 8g을 서서히 가하였다. 환원형 DCIP에 유래하는 청색이 소실된 다음, 청색의 소실과 함께 생기는 백색의 불용물(산화형 DCIP)을 원심분리로 침전시켜 상등액을 신규한 400ml 용적의 원심튜브에 옮켰다. 또한 본 용액을 1N 인산에 의해 pH를 5.0으로 제조하며 교반하면서, 추가로 환원형 DCIP(Na염)을 8g씩 가하였다. 이러한 조작을 6회 반복하여, 합계 48g의 환원형 DCIP(Na염)를 가하여, 청색이 소실된 단계에서, 최후로 3g의 환원형 DCIP(Na염)을 가하여, 1시간 동안 방치한 다음, 원심분리에 의해 상등액을 수거한다. 이러한 조작에 따라 상등액 292ml를 수득하였다. 조작시간은 8시간 걸렸다.
다음에 수득된 상등액은 칼럼에 채운 강산성 이온교환 수지(듀오라이트 C20, H+ 타입) 100ml에 용해액을 1분 동안에 1.5ml의 유속으로 통과시켜 수득된 용출액을 칼럼에 채운 약염기성 이온교환 수지(듀오라이트 368S, OH- 타입) 150ml에 통과시킨 다음, 수득되는 용출액을 칼럼에 채운 활성탄 50ml에 통과시켰다. 수득된 용출액을 농축하고, 백색 분말 26.5g(148.9mmol)을 수득하였다(수율 89%). 본 물질을 NMR과 HPLC에 의해 분석한 결과, 본 물질에는 실로-이노소스가 99%, 미오-이노시톨 1%가 함유되어 있다.
실시예 6
<NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제 활성을 지표로 하여 아세토박터 종 AB10253주 변이주로부터 스크리닝>
시험관에 투입한 효모 추출물(Difco사제) 1%, 글루코스 0.5%를 함유하는 pH 5.0의 액체 배지 5ml를 멸균하고, 여기에 경사로부터 아세토박터 종 AB10253주를 1백금이 가하여 27℃에서 16시간 동안, 진탕 배양하였다. 배양액 2.5ml를 멸균 튜브에서 수거하고 3000×g의 원심분리하고 균체를 집균한다. 상등액을 버리고, 200mM 인산염 완충액(pH 8.0) 2.5ml에 다시 현탁하여, 3000×g의 원심분리하고 균체를 집균하였다. 상등액을 버리고, 200mM 인산염 완충액(pH 8.0) 2.5ml에 다시 현탁하고, 이 중에서 2.0ml를 멸균한 100ml 용적의 삼각 플라스크에 투입하고, 0.5ml의 40% 글루코스 용액과, 7.5ml의 200mM 인산염 완충액(pH 8.0)을 가하여 혼합하며, 여기에 20㎕의 메탄설폰산에틸을 가하여 30℃에서 45분 동안 진탕 배양하였다. 처리후, 1ml를 멸균 튜브에서 수거하며, 3000×g의 원심분리하고 균체를 집균하였다. 상등액을 버리고, 200mM 인산염 완충액(pH 7.0) 2.5ml에 현탁하여, 3000×g의 원심분리하고 균체를 집균하였다. 상등액을 버리고, 200mM 인산염 완충액(pH 7.0) 2.5ml에 다시 현탁하여 변이 처리균액을 수득하였다.
이들 변이처리한 아세토박터 종 AB10253주는 다음에 3% 미오-이노시톨, 효모 추출물(Difco사제) 1%, 글루코스 0.5%, 1.5% 한천을 함유하는 pH 5.0의 배지를 멸균하며, 9cm 직경의 접시속에서 고화시킨 한천 배지에 접시 1장당, 변이 처리균액 0.12ml를 도말하여 27℃에서 2일 동안 배양하였다. 이러한 조작에 따라 생균수는 약 1.6%로 감소되었다. 또한, 접시 1장당 약 95 내지 125콜로니가 형성되었다.
배양후, 9cm 직경의 접시에 형성된 콜로니 위에 100mM 인산염 완충액, 1% 미오-이노시톨, 0.4% 산화형 DCIP로 이루어진 조성액을 여과 멸균하고, 여기에 오토클레이브 멸균한 1% 한천을 뜨거울 동안에 등량 혼합하며 36℃까지 냉각한 다음, 한천이 굳어지지 않도록 제조한 점성 용액을 10ml 천천히 주입한다. 이러한 처리를 한 한천 배지는 27℃에서 천천히 냉각되어, 9cm 직경의 접시에 형성된 콜로니 위에 중층된 형으로 고화되었다.
처리후, 27℃에서 접시를 항온처리함으로써 서서히 NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제 활성의 크기에 따라 한천 배지 위에서 한쪽면으로 확대된 산화형 DCIP의 청색이 콜로니 주위에만, 투명해지기 시작하는 것이 관찰되었다. 이 때, 보다 빠르고, 투명해진 장소의 콜로니를 멸균한 바늘로 쿡쿡 찔러, 새로운 배지에 계대하며 1차 선발로 전체 콜로니수 2154콜로니에서 NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제 활성이 높은 주를 22주 수득할 수 있었다.
다음에 시험관에 투입된 3% 미오-이노시톨, 효모 추출물(Difco사제) 1%, 글루코스 0.5%를 함유하는 pH 5.0의 액체 배지 5ml를 멸균한 배지에 2차 선발로서, 상기에서 수득한 22주의 콜로니를 형성한 균을 각각 식균하였다. 27℃에서 3일 동안 진탕 배양한 다음, 배양액 1ml를 시험관에 수거하고, 3000×g의 원심분리하고 균체를 집균하였다. 상등액을 버리고 균체가 투입된 시험관에 10% 미오-이노시톨, 50mM 인산염 완충액(pH 5.0)을 함유하는 용액을 1ml 가하여, 27℃에서 4시간 동안 진탕 배양한 다음, 16000×g의 원심분리하고 상등액에 함유된 미오-이노시톨로부터 실로-이노소스의 변환율을 HPLC에서 측정하였다. 한편, 배양액 5ml 중에서 0.5ml를 멸균 튜브에 수거하며, 3000×g의 원심분리하고 상등액을 버리고, 침전된 균체는 물로 세정한 다음, NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제 활성을 측정하였다.
그 결과, 22주의 변이주중에서 변이전의 균과 비교하여 NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제 활성이 1.3배 이상으로 증가된 균주는 3주(계통 No. E6-55, H2-68, B7-14)있으며 각각, 1.6배, 2.2배, 2-8배에 증가하였다. 또한 이들의 미오-이노시톨로부터 실로-이노소스의 변환율은 각각, 1.1배, 1.4배, 1.5배로 증가하고 있으며 NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제 활성이 1.3배 이하인 주의 미오-이노시톨로부터 실로-이노소스의 변환율은 변이전의 균과 동등하다. 이로부터, NAD+ 비의존형 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제 활성을 지표로 하는 스크리닝은 미오-이노시톨로부터 실로-이노소스의 변환율의 증가와 상관성이 있음을 알았다.
실시예 7
<변이 균주(B7-14)를 사용한 미오-이노시톨로부터 실로-이노소스의 변환에 따른 실로-이노소스의 제조>
500ml 용적 배플 부착 삼각 플라스크에 미오-이노시톨 10g, 효모 추출물(FNI205: Lanemand BI사제) 1g, 글루코스 0.5g을 가하여, 100ml가 되도록 물에 용해하고, pH 5.0으로 조정하며 오토클레이브에 의해 멸균한 배지를 20개(2ℓ 상당: 미오-이노시톨 200g(1.11mol) 작제하여, 여기에 변이 균주(B7-14)를 경사로부터, 각각 1백금이 가하며, 3일 동안 27℃에서 회전 진탕기로 배양하였다.
배양후, 배양액을 원심분리하여, 수득된 상등액은 칼럼에 채운 강산성 이온교환 수지(듀오라이트 C20, H+타입) 500ml에 용해액을 1분 동안에 10ml의 유속으로 통과시켜 수득된 용출액을 칼럼에 채운 약염기성 이온교환 수지(듀오라이트 368S, OH- 타입) 900ml에 통과시킨 다음, 수득되는 용출액을 칼럼에 채운 활성탄 50ml에 통과시켰다. 수득된 용출액을 농축하고, 백색 분말 162g(0.91mol)을 수득하였다(수율 82%). 본 물질을 NMR과 HPLC에 의해 분석한 결과, 본 물질에는 실로-이노소스가 91%, 미오-이노시톨 3%, 실로-이노시톨 6%가 함유되어 있었다(실로-이노소스 순도 91%)
실시예 8
<변이 균주(B7-14)를 사용한 미오-이노시톨로부터 실로-이노소스의 변환과 화학 환원에 의한 실로-이노시톨의 제조>
500ml 용적 배플 부착 삼각 플라스크에 미오-이노시톨 10g, 효모 추출물(FNI205: Lallemand BI사제) 1g, 글루코스 0.5g을 가하여, 100ml가 되도록 물에 용해하고, pH 5.0으로 조정하여, 오토클레이브에 의해 멸균된 배지를 20개[2ℓ 상당 미오-이노시톨 200g(1.11mol)] 작제하며 여기에 변이 균주(B7-14)를 경사로부터, 각각 1백금이 가하여, 3일 동안 27℃에서 회전 진탕기로 배양하였다.
배양후, 배양액을 8000×g에서 원심분리하여, 수득된 상등액 약 2ℓ를 5N NaOH 용액을 사용하여 pH 7.5로 조정한다. 여기에 교반하면서, NaBH4 9.2g을 가하여 환원 반응시켰다. 반응열로 반응액의 온도는 37℃로 상승하였다. 30분후, 불용물이 서서히 나타나며 여기에 1.2ℓ의 물을 가하여 발생되는 불용물을 거의 용해하였다. 이러한 용액을 여과하여, 불용물을 제거한 여액은 칼럼에 채운 강산성 이온교환 수지(듀오라이트 C20, H+ 타입) 500ml에 용해액을 1분 동안에 10ml의 유속으로 통과시켜 수득된 용출액을 칼럼에 채운 강염기성 이온교환 수지(듀오라이트 A116, OH- 타입) 900ml에 통과시킨 다음, 수득된 용출액을 칼럼에 채운 활성탄 300ml에 통과시켰다. 수득되는 용출액을 농축하여, 백색 분말 145g을 수득하였다. 본 물질을 HPLC에 의해 분석한 결과, 본 물질에는 실로-이노시톨이 36%, 미오-이노시톨 64%가 함유되어 있다.
수득된 백색 분말을 물로 470ml가 되도록 현탁하여 70℃로 가열하고, 미오-이노시톨을 충분하게 용해시켰다. 30℃까지 교반하면서 냉각하며, 백탁된 용액을 여과하여 불용물을 수집하였다. 불용물은 소량의 물로 세정하고, 건조된 다음, 44.2g의 분말로서 수득되었다. 본 물질을 HPLC에 의해 분석한 결과, 본 물질에는 실로-이노시톨이 98%, 미오-이노시톨 2%가 함유되어 있다. 또한, 수득된 분말에 700ml의 물을 가하여, 85℃로 가열하며 모두 용해시켜 서서히 교반하면서, 30℃까지 냉각하여, 여기에 에탄올을 700ml 가하였다. 밤새, 실온에서 방치한 다음, 수득되는 결정을 여과하여 수집하고, 건조된 다음, 40.1g(222.8mmol)의 결정을 수득하였다(수율 20%). 결정을 NMR 및 HPLC에 의해 분석한 결과, 본 물질은 99.9% 이상의 순도의 실로-이노시톨이었다.
실시예 9
<아세토박터 종 AB10281주 FERM BP-10119가 생성하는 실로-이노시톨 데하이드로게나제의 정제>
미오-이노시톨 10.0%, 효모 추출물 1.0%, 슈크로스 1.0%를 함유하는 액체 배지 3ℓ를 1N NaOH를 사용하여 pH 7.0으로 제조하며 100ml씩 500ml 용적의 배플 부착 삼각 플라스크 30개에 분주하고, 오토클레이브 멸균하였다. 각각의 삼각 플라스크에 아세토박터 종 AB10281주 FERM BP-10119의 경사 배양물을 1백금이 접종하여, 27℃에서 5일 동안 회전 진탕기(180rpm)를 사용하여 배양하였다. 배양후, 각각의 삼각 플라스크에 물을 250ml씩 가하여, 1시간 동안 회전 진탕기로 교반하며 배양액에 존재하는 결정성의 실로-이노시톨을 용해하였다. 상기 배양액을 수집하여 원심분리(8,000rpm 20분 동안)하여, 균체(습중량 75g)를 수득하였다.
이러한 균체를 300ml의 물에 현탁하며 10℃에서 이하에서 초음파로 파쇄하였다. 파쇄 용액은 pH 4.8을 나타내며, 이러한 용액을 1N의 NaOH에서 pH 7.0으로 제조된 후에 원심분리(16,000rpm 20분 동안)에 의해 상등액을 분리하였다. 다음에 상등액이 2mM Mg2+가 되도록 MgSO4를 가하여, 블루도요펄 칼럼(도소사: 20ml)에 충전하며 2mM Mg2+가 되도록 첨가된 20mM 트리스 완충액 pH 7.0 50ml를 통과시키고, 칼럼을 세정하였다. 다음에 1M KCl이 되도록 첨가한 20mM 트리스 완충액 pH 7.0 50ml를 통과시켜 흡착 단백질을 용출시켰다. 다음에 용출액을 MW 30000 컷오프리의 한외 여과장치로 농축하고 농축액에 20mM 트리스 완충액 pH 7.0 50ml를 가하여, 다시 농축하여, 탈염 농축액을 수득하였다. 다음에 이러한 탈염 농축액을 DEAE 도요펄 칼럼(도소사: 20ml)에 충전하고 20mM 트리스 완충액 pH 7.0로부터, 500mM NaCl이 되도록 첨가한 20mM 트리스 완충액 pH 7.0의 직선 농도 구배를 작용시킨 용액으로 용출하며 용출액을 분획별로 분획하였다. 분획된 용액별로 실로-이노시톨 데하이드로게나제 활성을 측정한 바, 흡착되지 않은 분획(SIDH1), 200mM NaCl로 용출된 분획(SIDH2), 300mM로 용출된 분획(SIDH3)의 3가지 분획으로 각각 활성이 있었다.
활성 측정은 반응액(200mM 트리스 완충액 pH 8.0, 2% NADPH, 1% 실로-이노소스) 5㎕와 효소액 5㎕를 혼합하고 36℃에서 30분 반응시킨 직후, 500㎕의 물을 가하여 340nm의 흡광도를 측정하며, 효소액 대신에 물을 사용하는 시험액의 블랭크 값으로부터, 340nm의 흡광도의 감소량을 측정하였다. 필요하면, 효소액은 희석하였다.
상기 칼럼 비흡착 분획은 또한, CM도요펄 칼럼(도소사: 20ml)에 충전하고, 20mM 트리스 완충액 pH 7.0으로부터, 500mM NaCl이 되도록 첨가한 20mM 트리스 완충액 pH 7.0의 직선 농도 구배를 작용시킨 용액으로 용출하고, 용출액을 분획별로 분획하였다. 분획된 용액마다 실로-이노시톨 데하이드로게나제 활성을 측정한 결과, 흡착되지 않은 분획에 활성이 있다. 200mM NaCl로 용출된 분획, 300mM로 용출된 분획은 각각 따로따로 다시 한외 여과장치로 탈염하며, DEAE 도요펄 칼럼(도소사: 20ml)에 충전하며 200mM NaCl이 되도록 첨가된 20mM 트리스 완충액 pH 7.0에서, 300mM NaCl이 되도록 첨가된 20mM 트리스 완충액 pH 7.0의 직선 농도 구배를 작용시킨 용액으로 용출하며, 용출액을 분획별로 분획하고, 정제한다. 또한, 이들 3가지 실로-이노시톨 데하이드로게나제 활성을 갖는 효소액을 각각, 한외 여과장치로 농축하며 겔 여과 칼럼(도소사: 2000SWXL)에 충전하며, 용출액에 200mM NaCl이 되도록 첨가한 20mM 인산염 완충액 pH 7.0을 사용하여, 정제한다. 이와 같이 정제된 효소액을 석판(slab)-겔 SDS 전기영동하며, 전기영동한 다음, 겔을 수거하고 코마시 브릴리언트(Coomassie brilliant) 블루 염색액(Rapid CBB KANTO: 간토가가쿠사제)로 염색한 후, 탈색하며 청색으로 염색하는 단백질의 밴드를 밀도측정기(densitometer)(ATTO사제)로 측정하며, 목적하는 밴드의 순도를 측정한 바, 어느 것이나 순도 85% 이상이었다.
실시예 10
<이. 콜라이 K12주 ATCC10798이 생성하는 본 발명의 효소의 정제와 N 말단 분석>
L-소르보스 0.5%를 함유하는 LB 브로스 배지(1% 박토트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% NaCl, pH 7.0) 3ℓ를 100ml씩 500ml 용적의 경사구 플라스크 30개에 분주하고, 오토클레이브 멸균하였다. 각각의 삼각 플라스크에 이. 콜라이 K12주의 경사 배양물을 1백금이 접종하고, 36℃에서 1일 동안 분액여두 진탕기(recipro shaker) (135rpm)로 배양하였다. 배양후, 배양액을 수집하여 원심분리(8,000rpm 20분 동안)하여, 균체(습중량 32g)를 수득하였다. 이러한 균체를 100ml의 물에 현탁하여, 10℃에서 이하에서 초음파로 파쇄하였다. 파쇄 용액은 pH 6.8을 나타내며 이러한 용액을 1N의 NaOH 용액으로 pH 7.0으로 제조한 후에 원심분리(16,000rpm 20분 동안)에 의해 상등액을 분리하였다. 다음에 상등액이 2mM Mg2+이 되도록 MgSO4를 가하여, 블루도요펄 칼럼(도소사: 20ml)에 충전하며 2mM Mg2+가 되도록 첨가한 20mM 트리스 완충액 pH 7.0 50ml를 통과시켜 칼럼을 세정하였다. 다음에 1M KCl이 되도록 첨가한 20mM 트리스 완충액 pH 7.0 50ml를 통과시켜 흡착 단백질을 용출시켰다. 다음에 용출액을 MW 30000 컷오프의 한외 여과장치로 농축하고 농축액에 20mM 트리스 완충액 pH 7.0 50ml를 가하여, 다시 농축하여, 탈염 농축액을 수득하였다. 다음에 이러한 탈염 농축액을 DEAE 도요펄 칼럼(도소사: 20ml)에 충전하고, 20mM 트리스 완충액 pH 7.0으로부터, 500mM NaCl이 되도록 첨가된 20mM 트리스 완충액 pH 7.0의 직선 농도 구배를 작용시킨 용액으로 용출하고, 용출액을 분획별로 분획하였다. 분획된 용액별로 실로-이노시톨 데하이드로게나제 활성을 측정한 바, 300mM로 용출한 분획에 활성이 있었다.
활성 측정은 실시예 9에서 상기한 방법과 동일하며, 340nm의 흡광도의 감소량을 측정하였다. 필요하면, 효소액은 희석하였다.
300mM NaCl로 용출한 분획은 다시 한외 여과장치로 탈염하여, DEAE 도요펄 칼럼(도소사: 20ml)에 충전하며 250mM NaCl이 되도록 첨가된 20mM 트리스 완충액 pH 7.0으로부터, 350mM NaCl이 되도록 첨가한 20mM 트리스 완충액 pH 7.0의 직선 농도 구배를 작용시킨 용액으로 용출하며, 용출액을 분획별로 분획하는 조작을 3회 실시하고 오염 단백질을 제거하고, 정제하였다. 또한, 이러한 실로-이노시톨 데하이드로게나제 활성을 갖는 효소액을 각각 한외 여과장치로 농축하며, 겔 여과 칼럼(도소사: 2000SWXL)에 충전하며 용출액에 200mM NaCl이 되도록 첨가한 20mM 인산염 완충액 pH 7.0을 사용하여 정제하였다.
이와 같이 정제된 효소액을 석판-겔 SDS 전기영동한 후, 겔을 수거하고 겔과 동일한 크기의 PVDF막(Immobilon PSQ: 밀리포어사제)에 반건조 전기플롯 장치(semidry electroplotter)(프나코시사제)로 흡착시킨 다음, 이러한 PVDF막을 수거하고 코마시 브릴리언트 블루 염색액(Rapid CBB KANTO: 간토가가쿠사제)으로 염색한 후, 탈색하고 실시예 9에 기재된 방법과 동일하게 밀도측정기로 순도를 측정한 결과 순도가 40%이었다. 또한, 전후에 존재하는 불필요한 단백질을 제거하여 상당하는 단백질 부분을 절단하여 수득하고, 순도가 높은 본 발명의 효소를 수득하였다.
다음에 PVDF막에 있는 순도가 높은 본 발명의 효소를 N 말단 아미노산 분석장치(Hewlett Packard사)에 의해 분석하였다. 그 결과, 세린-아스파라긴산-아스파라긴-이소로이신-아르기닌의 서열이 검출되며, 이러한 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA를 이. 콜라이 전체 염기서열 데이터 베이스(데이타 베이스명 「colibri」)에서 검색한 바, ydgJ 유전자(또는 b1624 유전자)가 일치하였다. 본 유전자 산물은 산화 환원효소의 일종이라고 예상되고 있지만, 기질 및 생산물은 전혀 불명의 단백질이었다.
실시예 11
<이. 콜라이 K12주 ATCC10798 유래의 본 발명의 DNA의 분리와 발현>
본 발명의 효소를 암호화하고 있다고 생각되는 ydgJ 유전자를 수득하기 위해 우선, 주형으로서 이. 콜라이 K12주의 전체 게놈을 하기와 같이 추출한다. LB 플라스크 배지 10Oml(1% 박토트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% NaCl, pH 7.0)에 LB 경사 배지(1% 박토트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% NaCl, pH 7.0, 1.5% 한천)으로 배양한 이. 콜라이 K12주를 1백금이 접종하여, 8시간, 36℃에서 호기적으로 배양하며 이를 집균하였다. 이러한 균체 펠렛에 15ml의 염수-EDTA 용액(0.15M NaCl, 0.1M EDTA, pH 8.0)과 리소자임 50mg을 가하여 현탁하며, 37℃에서 2시간 동안 작용시켰다. 처리후, 이러한 용액에 25% SDS 용액을 O.5ml 가하여 완전하게 용균시켜 페놀을 3ml 가하여, 단백질을 변성시킨 후에 원심분리하며 상등액을 수거하고 이러한 용액에 20ml의 2-프로판올을 가하여 조 게놈 DNA를 석출시켰다. 석출된 조 게놈 DNA를 원심분리하여 침전시키고 상등액을 제거한 다음, 감압하에 건조시켰다. 건조된 조 게놈 DNA는 다시 3ml TE 용액(10mM 트리스-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0)에 용해한 다음, 0.01mg의 RNAase를 가하며 36℃에서 2시간 동안 반응시켜 RNA를 분해시킨다. 또한, 0.01mg의 프로테이나제 K를 가하여, 36℃에서 2시간 동안 반응시키고, 단백질을 분해시켰다. 다음에 1ml의 페놀-클로로포름(1:1) 혼합액을 가하여, 천천히 교반하며 RNAase와 프로테이나제 K를 변성시켜 원심분리하여 2상으로 분리하고, 상층(수성층)을 수거하고 여기에 3M 아세트산나트륨 용액을 0.3ml 가하여 pH 5.2로 제조한다. 여기에 3ml의 2-프로판올을 가하여, 게놈 DNA를 석출시켰다. 석출된 게놈 DNA를 원심분리하여 침전시키고, 상등액을 제거한 다음, 감압하에 건조시켰다. 건조된 게놈 DNA는 3ml TE 용액에 용해시키고, 여기에 1ml의 페놀-클로로포름(1:1) 혼합액을 첨가하는 조작에서 3ml TE 용액에 용해시키는 과정까지를 다시 반복하여, 원심분리하고, 동일하게 pH 5.2로써 상등액에 등량의 2-프로판올을 가하여 이. 콜라이 K12주의 게놈 DNA 용액을 제조하였다. 이와 같이 수득되는 게놈 DNA를 PCR 반응을 위한 주형 DNA 용액으로 사용하였다.
이. 콜라이 K12주 유래이며 ydgJ 유전자의 리보솜 결합 부위(RBS)를 포함하는 단편을 클로닝하고, 하기의 서열을 갖는 프라이머를 사용하여 PCR 반응을 실시하여 재조합 효소로서 발현시켰다.
서열번호 15: ydgj-F 5'-cattcaagcttaatgagaggcaatgacatgagcg-3'
서열번호 16: ydgj-R 5'-tcggaattcttcatgcaaggcacaaagtcgc-3'
PCR 반응은 다카라슈조사의 Ex taq 반응 용액을 사용하고, 다카라 ExTaq 완충액×10배액 5㎕, dNTP 혼합물 4㎕, 주형 DNA 30ng, 10μM 프라이머 용액 각 1㎕, 다카라 ExTaq 0.5㎕의 조성을 갖는 용액을 50㎕가 되도록 물을 가하며, 30㎕의 미네랄 오일을 중층하여 제조하였다. 반응조건은 PCR 증폭장치(ASTEC사 PC-700)를 사용하며, 변성을 94℃에서 30초, 어닐링을 55℃에서 1분, 신장을 72℃에서 1분의 3단계의 반응을 35회 반복하였다. 상기한 PCR 반응에 따라 약 1.0kbp 크기의 DNA 단편이 증폭되었다. 반응후, 중층한 미네랄 오일을 0.3ml의 헥산으로 추출하며, 헥산층을 제거하는 조작을 3회 반복하고, 1분 동안 감압하는 것으로 미네랄 오일을 제거하였다. 이와 같이 수득된 반응액 50㎕에서 진클린(Geneclean)(Bio101사)를 사용하여 PCR 단편을 정제하였다. 즉, 키트 첨부된 NaI 용액을 300㎕ 가하여 혼합하며, 10㎕ 유리 비드 용액을 가하여 혼합하며 4℃에서 15분 동안 정치한 후에 원심분리하여, DNA 단편이 흡착된 유리 비드를 침전시켜 상등액을 제거하였다. 또한, 키트 첨부된 새로운 세척액 500㎕를 가하여, 유리 비드를 현탁시켜 원심분리하며 상등액을 제거하였다. 이러한 새로운 세척액에 의한 세정 조작은 3회 반복한다. 다음에 유리 비드를 감압하에 건조시킨 후, 15㎕의 멸균수를 가하여 현탁하며, 55℃에서 15분 동안 가온한 후, 원심분리하여, DNA 단편을 함유하는 상등액 12㎕를 수득하였다.
정제된 DNA 단편을 발현 벡터에 삽입하는 조작은 하기와 같이 실시하였다. 즉, DNA 단편 용액 10㎕에 발현용 플라스미드(pUC119: 다카라슈조사제)를 0.5μg, 다카라슈조사의 제한효소 HindIII과 EcoRI를 각 1㎕, 다카라슈조사의 제한효소용 완충액인 K 완충액×10배액 2㎕를 가하여, 20㎕가 되도록 멸균수를 가하여, 혼합한다. 이러한 반응액을 36℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 제한효소 반응후, 진클린을 사용하여, DNA 단편과 발현 벡터를 분리하며 이들을 연결시켰다. 즉, 제한효소 반응액 20㎕에 키트 첨부된 NaI 용액을 300㎕ 가하여 혼합하며, 10㎕ 유리 비드 용액을 가하여 혼합하며, 4℃에서 15분 동안 정치한 후에 원심분리하고, DNA 단편과 발현 벡터가 흡착된 유리 비드를 침전시켜 상등액을 제거하였다. 또한, 키트 첨부된 새로운 세척액 500㎕를 가하여, 유리 비드를 현탁시켜 원심분리하여, 상등액을 제거하였다. 이러한 새로운 세척액에 의한 세정 조작은 3회 반복한다. 다음에 유리 비드를 감압하에 건조시킨 후, 15㎕의 멸균수를 가하여, 현탁하며 55℃에서 15분 동안 가온한 후, 원심분리하여, DNA 단편과 발현 벡터를 함유하는 상등액 12㎕를 수득하였다. 이러한 조작에 따라 제한효소에 의해 생긴 약 50bp 이하의 작은 DNA 단편은 제거되며, 목적하는 DNA 단편과 발현 벡터가 수득되었다.
이와 동일하게 제조된 용액 10㎕에 다카라 연결 키트-I 용액(다카라슈조사)를 10㎕ 가하여, 16℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이러한 용액을 수용적격 세포(다카라슈조사: DH5α)로 형질전환시켰다. 즉, 4℃에서 해동된 수용적격 세포 용액 60㎕에 연결 반응 용액을 5㎕ 가하여 혼합하고, 0℃에서 30분후, 42℃에서 45초, 0℃에서 2분 동안 처리하고, 여기에 500㎕ SOC 용액(2% 박토트립톤, 0.5% 효모 추출물, 10mM NaCl, 20mM 글루코스, 10mM MgSO4, 10mM MgCl2)을 가하여 36℃에서 1시간 동안 회복 배양시키고 이러한 배양액 100㎕를 50μg/ml 암피실린, 40μg/ml X-gal(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드), 1mM IPTG(티오갈락토피라노시드를 함유하는 LB 한천 배지(1% 박토트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% NaCl, pH 7.0, 1.5% 한천)에 도포하였다. 다시 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 이러한 배양에 따라 백색으로 발색된 콜로니로서 상기한 플라스미드의 도입으로 형질전환된 이. 콜라이가 수득되므로 이를 선택하였다. 이와 같이 분리된 형질전환 이. 콜라이 콜로니를 암피실린(50μg/ml)를 함유하는 LB 액체 배지에서 배양하였다. 증식된 형질전환 이. 콜라이의 균체로부터 플라스미드 정제 키트(QIA fiter Plasmid Midi Kit, QIAGEN사)에 의해 플라스미드 DNA를 분리하고 정제하였다. 이와 같이 수득된 플라스미드 DNA는 목적하는 ydgJ 유전자에 상당하는 약 1.0kbp의 DNA 단편을 갖는 것이 확인되었다.
다음에 실로-이노시톨 데하이드로게나제 활성을 확인하기 위해 콜로니로서 분리된 균주를 50μg/ml 암피실린을 함유하는 100ml LB 배지(1% 박토트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% NaCl, pH 7.0)에 이식하며 36℃에서 7시간 동안 배양하고, 이러한 배양액에 200mM 티오갈락토피라노시드 용액을 0.3ml 가한 다음, 36℃에서 3시간 동안 배양하였다. 배양 종료후, 원심분리에 의해 균체를 수집하고 이를 생리식염수로 1회 세정하였다. 또한, 세정 균체를 0.6% Triton X100 용액 3ml에 현탁하며 4℃에서 초음파에 의해 균을 파쇄하였다. 이러한 용액을 원심분리하고, 상등액의 효소 용액 2.8ml를 수거하고 상등액에 1.2g 황산암모늄을 가하며, 4℃에서 단백질을 염석시켰다. 염석된 단백질을 원심분리(15,000rpm, 20분)로 수집하고 상등액을 제거하고, 이러한 침전물을 2.5ml의 20mM 트리스 완충액 pH 7.0에 용해시켜 다시 원심분리(15,000rpm, 20분)하고, 상등액을 20mM 트리스 완충액 pH 7.0으로 평형화한 Sephadex G-25 칼럼(파마시아사: 14ml)에 적용하고, 20mM 트리스 완충액 pH 7.0에서 용출시켜 탈염시켰다. 이러한 조작에 따라 ydgJ 유전자 산물의 조효소액 3.5ml를 수득하였다.
실로-이노시톨 데하이드로게나제의 활성은 반응액(200mM 트리스 완충액 pH 8.0, 2% NADPH, 1% 실로-이노소스) 5㎕와 효소액 5㎕를 혼합하고 36℃에서 30분 동안 반응시킨 직후, 500㎕의 물을 가하여 340nm의 흡광도를 측정하며, 효소액 대신에 물을 사용하는 시험액의 블랭크 값에서 340nm의 흡광도의 감소량을 측정하였다. 필요하면, 효소액은 희석하였다.
또한, 효소반응 생산물은 실로-이노소스 10mg, NADPH 40mg, 효소 10U 상당을 함유하는 100mM 트리스 완충액(pH 8.0) 1.0ml로 36℃에서 4시간 동안 반응시킨 후, 80℃에서 10분의 가열 처리하고 냉각한 다음, 강염기성 양이온 교환수지 100㎕, 강산성 음이온 교환수지 100㎕, 활성탄 10mg을 가하여 교반하며 원심분리한 후, 상등액을 2배 희석하고, HPLC(Shodex Asahipak NH2BP-50 4E Φ4.6×250mm: Shodex사)를 사용하여, 칼럼온도 40℃에서 이동상 유속 1.5ml(80% 아세토니트릴)의 조건하에 RI 검출기로 측정하였다. 그 결과, ydgJ 유전자 산물은 높은 실로-이노시톨 데하이드로게나제 활성을 나타내며, 이의 생산물은 100% 실로-이노시톨로 환원된 것이며 이성체인 미오-이노시톨은 검출되지 않는다. 결과적으로 ydgJ 유전자 유래의 재조합 효소 용액은 높은 실로-이노시톨 데하이드로게나제 활성을 가지며 이러한 유전자 산물이 실로-이노시톨 데하이드로게나제인 것을 확인하였다. 또한, 실로-이노소스로부터의 환원 반응물은 실로-이노시톨만 검출되며, 입체 특이적으로 실로-이노시톨로 환원되는 효소였다. 또한, ydgJ 유전자의 서열은 서열번호 1에 기재하고, 아미노산 서열은 서열번호 2에 기재하였다.
실시예 12
<이. 콜라이 ydgJ 유전자의 상동성으로부터 추정되는 동종 DNA의 분리와 발현 및 이의 성질>
이. 콜라이 ydgJ 유전자 산물의 아미노산 서열로부터 삼차원 구조를 추정하면 글루코스-프럭토스 옥시도리덕타제의 패밀리에 속하는 것으로 추정되었다. 이러한 패밀리에는 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제(EC1.1.1.18)도 포함되며, 아미노산 서열 중에서 NAD 결합에 관여하는 서열은 상동성이 높은 것을 알았다. 또한, 글루코스-프럭토스 옥시도리덕타제의 X선 구조 해석으로부터 기질 결합에 관여하는 부위의 아미노산 서열을 동정하며, 부분적으로 동일한 아미노산 서열을 갖고 ydgJ 유전자 산물에 상동인 단백질을 검색한 결과, 그램 음성균 및 양성균의 많은 세균에 상동인 단백질이 있는 것이 판명됐다.
이들 세균 중에서, 이. 콜라이 ydgJ 유전자의 상동성으로부터 추정되는 동종 DNA를 검색한 결과, 아그로박테리움 튜메파시엔스 C58주 ATCC33970 게놈중의 Atu4375 유전자 및 Atu3234 유전자와, 바실루스 서브틸리스 168주 ATCC23857 게놈중의 BC14057 유전자와, 크산토모나스 캄페스트리스 pv. 캄페스트리스주 ATCC33913 게놈중의 Xcc3438 유전자와, 및 미오-이노시톨로부터 직접 실로-이노시톨로 변환하는 능력이 있는 미생물로서 공지되어 있는 아그로박테리움 종 AB10121주 FERM BP-17383 게놈중의 Atu4375 유전자 및 Atu3234 유전자와 이. 콜라이 ydgJ 유전자와의 상동성이 확인되었다. 따라서 각각의 DNA를 분리하고 발현시켰다.
상기한 후보 DNA를 수득할 목적으로 주형으로서 아그로박테리움 튜메파시엔스 C58주 ATCC33970, 바실루스 서브틸리스 168주 ATCC23857, 크산토모나스 캄페스트리스 pv. 캄페스트리스주 ATCC33913 및 아그로박테리움 종 AB10121주 FERM P-17383의 전체 게놈을 하기와 같이 추출하였다. 박테리움 튜메파시엔스 C58주, 크산토모나스 캄페스트리스 pv. 캄페스트리스주 및 아그로박테리움 종 AB10121주는 LB 플라스크 배지 100ml(1% 박토트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% NaCl, pH 7.0)에 LB 경사 배지(1% 박토트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% NaCl, pH 7.0, 1.5% 한천)에서 배양한 아그로박테리움 튜메파시엔스 C58주, 크산토모나스 캄페스트리스 pv. 캄페스 트리스주 및 아그로박테리움 종 AB10121주를 각각, 1백금이 접종하며 18시간, 27℃에서 호기적으로 배양하여, 이를 집균하였다. 이러한 균체 펠렛에 15ml의 염수-EDTA 용액(0.15M NaCl, 0.1M EDTA, pH 8.0)과 리소자임 50mg을 가하여 현탁하며 37℃에서 2시간 동안 작용시켰다. 처리후, 이러한 용액에 25% SDS 용액을 0.5ml 가하여 완전하게 용균시키고, 페놀을 3ml 가하여 단백질을 변성시킨 후에 원심분리하여, 상등액을 수거하고 이러한 용액에 20ml의 2-프로판올을 가하여, 조 게놈 DNA를 석출시켰다. 석출된 조 게놈 DNA를 원심분리하여 침전시키고, 상등액을 제거한 다음, 감압하에 건조시켰다. 건조된 조 게놈 DNA는 다시 3ml TE 용액(10mM 트리스-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0)에 용해한 다음, 0.01mg의 RNAase를 가하며 36℃에서 2시간 동안 반응시켜 RNA를 분해시켰다. 또한, 0.01mg의 프로테이나제 K를 가하여 36℃에서 2시간 동안 반응시켜 단백질을 분해시켰다. 다음에 1ml의 페놀-클로로포름(1:1) 혼합액을 가하여, 천천히 교반하며 RNAase와, 프로테이나제 K를 변성시켜 원심분리하며 2상으로 분리시킨 후, 상층(수성층)을 수거하고, 여기에 3M 아세트산나트륨 용액을 0.3ml 가하여 pH 5.2로 제조하였다. 여기에 3ml의 2-프로판올을 가하여, 게놈 DNA를 석출시켰다. 석출된 게놈 DNA를 원심분리하여 침전시키고, 상등액을 제거한 다음 감압하에 건조시켰다. 건조된 게놈 DNA는 3ml TE 용액에 용해시키고, 여기에 1ml의 페놀-클로로포름(1:1) 혼합액을 첨가하는 조작으로부터, 3ml TE 용액에 용해시키는 과정까지를 다시 반복하여, 원심분리하고, 동일하게 pH 5.2로써 상등액에 등량의 2-프로판올을 가하여, 아그로박테리움 튜메파시엔스 C58주, 크산토모나스 캄페스트리스 pv. 캄페스트리스주 및 아그로박테리움 종 AB10121주의 게놈 DNA 용액을 각각 제조하였다. 이와 같이 수득된 게놈 DNA를 PCR 반응을 위한 주형 DNA 용액으로 하였다.
바실루스 서브틸리스 168주 ATCC23857은 LB 플라스크 배지 100ml(1% 박토트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% NaCl, pH 7.0)에 LB 경사 배지(1% 박토트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% NaCl, pH 7.0, 1.5% 한천)에서 배양한 바실루스 서브틸리스 168주를 1백금이 접종하여, 18시간, 36℃에서 호기적으로 배양한 다음, 이 중에서 1ml를 동일하게 제조한 LB 플라스크 배지 100ml에 가하여, 4시간 동안 배양하여 집균하였다. 집균후의 전체 게놈의 추출방법은 아그로박테리움으로 사용하는 방법과 동일하다.
이어서, 모두 RBS를 포함하는 아그로박테리움 튜메파시엔스 C58주 게놈중의 Atu4375 유전자, Atu3234 유전자, 아그로박테리움 종 AB10121주 게놈중의 Atu4375 유전자, Atu3234 유전자, 크산토모나스 캄페스트리스 pv. 캄페스트리스주 게놈중의 Xcc3438 유전자를 클로닝하기 위해, 하기 서열을 갖는 프라이머를 사용한 PCR 반응을 실시하여 재조합 효소로서 발현시켰다.
서열번호 17: Atu4375-F 5'-ggcggatcctttgaaagggatagtcatgtcct-3'
서열번호 18: Atu4375-R 5'-attggaagcttcgattggctgcgacctag-3'
서열번호 19: Atu3234-F 5'-ttgggatcctttcaggggaaatattatggc-3'
서열번호 20: Atu3234-R 5'-gccgcaagcttgttttacagcttcac-3'
서열번호 23: Xcc3438-F 5'-tcggaattcgcgttgcggtgaatcgttttcaatg-3'
서열번호 24: Xcc3438-R 5'-ataagaagcttgctcagtcgctgctgttgccttc-3'
RBS를 함유하는 바실루스 서브틸리스 168주 게놈중의 BG14057 유전자를 클로닝하기 위해 하기의 서열을 갖는 프라이머를 사용한 PCR 반응을 실시하여 재조합 효소로서 발현시켰다. 단, 5'말단에서 10번째의 a는 원래 t이지만 이. 콜라이에서의 발현을 위해 a로 변경하였다.
서열번호 21: BG14057-F 5'-aggaattcgatgataacgcttttaaaggggagaa-3'
서열번호 19: Atu3234-F 5'-ttgggatcctttcaggggaaatattatggc-3'
서열번호 20: Atu3234-R 5'-gccgcaagcttgttttacagcttcac-3'
서열번호 23: Xcc3438-F 5'-tcggaattcgcgttgcggtgaatcgttttcaatg-3'
서열번호 24: Xcc3438-R 5'-ataagaagcttgctcagtcgctgctgttgccttc-3'
RBS를 포함하는 바실루스 서브틸리스 168주 게놈중의 BC14057 유전자를 클로닝하기 위해 하기 서열을 갖는 프라이머를 사용한 PCR 반응을 실시하여 재조합 효소로서 발현시켰다. 단, 5' 말단에서 10번째의 a는 본래 t이지만 이. 콜라이에서의 발현을 위해 a로 변경한다.
서열번호 21: BG14057-F 5'-aggaattcgatgataacgcttttaaaggggagaa-3'
서열번호 22: BG14057-R 5'-tttctgcagtttagtgctccagcataatggttcg-3'
PCR 반응은 다카라슈조사의 Ex taq 반응 용액을 사용하고, 다카라 ExTaq 완충액×10배액 5㎕, dNTP 혼합물 4㎕, 주형 DNA 30ng, 10μM 프라이머 용액 각 1㎕, 다카라 ExTaq 0.5㎕의 조성을 갖는 용액을 50㎕가 되도록 물을 가하며, 30㎕의 미네랄 오일을 중층하여 제조하였다. 반응조건은 PCR 증폭장치(ASTEC사 PC-700)를 사용하며, 변성을 94℃에서 30초, 어닐링을 52℃에서, 55℃에서 또는 58℃(표 3 참조)에서 1분, 신장을 72℃에서 1분의 3단계의 반응을 35회 반복하였다. 상기한 PCR 반응에 따라 약 1.lkbp의 크기의 DNA 단편이 증폭되었다.
[표 3]
어닐링 온도 나열
반응후, 중층된 미네랄 오일을 0.3ml의 헥산으로 추출하며 헥산층을 제거하는 조작을 3회 반복하며 1분 동안 감압하는 것으로 미네랄 오일을 제거하였다. 이와 같이 수득된 반응액 50㎕에서 진클린(Bio101사)를 사용하여 PCR 단편을 정제하였다. 즉, 키트 첨부된 NaI 용액을 300㎕ 가하여 혼합하며 10㎕ 유리 비드 용액을 가하여 혼합하며 4℃에서 15분 동안 정치한 후에 원심분리하여, DNA 단편이 흡착된 유리 비드를 침전시키고, 상등액을 제거하였다. 또한, 키트 첨부된 새로운 세척액 500㎕를 가하여, 유리 비드를 현탁시켜 원심분리하고 상등액을 제거하였다. 이러한 새로운 세척액에 의한 세정 조작은 3회 반복하였다. 다음에 유리 비드를 감압하에 건조시킨 후, 15㎕의 멸균수를 가하여, 현탁하며 55℃에서 15분 동안 가온한 후, 원심분리를 하며 DNA 단편을 함유하는 상등액 12㎕를 수득하였다.
정제된 DNA 단편을 발현 벡터에 삽입하는 조작은 각각 하기에 기재된 조합으로 실시하였다. 즉, DNA 단편 용액 10㎕에 발현용 플라스미드(pUC118: 다카라슈조사제)를 0.5μg, 다카라슈조사의 제한효소 2종류를 각 1㎕, 다카라슈조사의 제한효소용 완충액 완충액×10배액 2㎕를 가하며, 20㎕가 되도록 멸균수를 가하여 혼합하였다. 이러한 반응액을 36℃에서 2시간 동안 반응한다. AB10121주의 Atu3234 유전자는 HindIII 부위를 가지므로, 제한효소 처리하지 않으며 분리한 후, pT7Blue 벡터(Novagen사제)와 연결시켰다.
[표 4]
발현용 플라스미드 및 사용된 제한효소 나열
제한효소 반응후, 진클린을 사용하여 DNA 단편과 발현 벡터를 분리하고, 이들을 연결시켰다. 즉, 제한효소 반응액 20㎕에 키트 첨부된 NaI 용액을 300㎕ 가하여 혼합하며 10㎕ 유리 비드 용액을 가하여 혼합하며 4℃에서 15분 동안 정치한 후에 원심분리하여, DNA 단편과 발현 벡터가 흡착된 유리 비드를 침전시켜 상등액을 제거하였다. 다시 키트 첨부된 새로운 세척액 500㎕를 가하여, 유리 비드를 현탁시켜 원심분리하고, 상등액을 제거하였다. 이러한 새로운 세척액에 의한 세정조작은 3회 반복한다. 다음에 유리 비드를 감압하에 건조시킨 후, 15㎕의 멸균수를 가하여, 현탁하며 55℃에서, 15분 동안 가온한 후, 원심분리하여, DNA 단편과 발현 벡터를 포함하는 상등액 12㎕를 수득하였다. 이러한 조작에 따라 제한효소에 의해 생긴 약 50bp 이하의 작은 DNA 단편은 제거하며, 목적하는 DNA 단편과 발현 벡터가 수득되었다.
이와 동일하게 제조된 용액 10㎕에 다카라 연결 키트-I 용액(다카라슈조사)를 10㎕ 가하여, 16℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이러한 용액을 사용하여 수용적격 세포(다카라슈조사: DH5α)를 형질전환시켰다. 즉, 4℃에서 해동된 수용적격 세포 용액 60㎕에 연결 반응 용액을 5㎕ 가하여 혼합하고, 0℃에서 30분후, 42℃에서 45초, 0℃에서 2분 동안 처리하고, 여기에 500㎕ SOC 용액(2% 박토트립톤, 0.5% 효모 추출물, 10mM NaCl, 20mM 글루코스, 10mM MgSO4, 10mM MgCl2)을 가하여 36℃에서 1시간 동안 회수 배양시키고 이러한 배양액 100㎕를 50μg/ml 암피실린, 40μg/ml X-gal(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드), 및 1mM IPTG(티오갈락토피라노시드)를 함유하는 LB 한천 배지(1% 박토트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% NaCl, pH 7.0, 1.5% 한천)에 도말하였다. 또한 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 이러한 배양에 의해 백색으로 발색한 콜로니로서 상기한 플라스미드의 도입으로 형질전환된 이. 콜라이가 수득되므로 이를 선택하였다. 이와 같이 분리된 형질전환 이. 콜라이 콜로니를 암피실린(50μg/ml)를 함유하는 LB 액체 배지에서 배양하였다. 증식된 형질전환 이. 콜라이의 균체로부터 플라스미드 정제 키트(QIA filter Plasmid Midi Kit, QIAGEN사)에 의해 플라스미드 DNA를 분리 및 정제하였다. 이와 같이 수득된 플라스미드 DNA는 각각, 목적하는 DNA에 상당하는 약 1.0 내지 1.1kbp의 DNA 단편을 갖는 것이 확인되었다.
다음에 실로-이노시톨 데하이드로게나제 활성을 확인하기 위해 콜로니로서 분리된 균주를 50μg/ml 암피실린을 함유하는 100ml LB 배지(1% 박토트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% NaCl, pH 7.0)에 이식하며 36℃에서 7시간 동안 배양하고, 이러한 배양액에 200mM 티오갈락토피라노시드 용액을 0.3ml 가한 다음, 36℃에서 3시간 동안 배양하였다. 배양 종료후, 원심분리에 의해 균체를 수집하고, 이를 생리식염수로 1회 세정하였다. 또한, 세정 균체를 0.6% Triton X100 용액 3ml에 현탁하여 4℃에서 초음파에 의해 균을 파쇄하였다. 이러한 용액을 원심분리하고, 상등액의 효소 용액 2.8ml를 수거하고 상등액에 1.2g 황산암모늄을 가하여, 4℃에서 단백질을 염석시켰다. 염석한 단백질을 원심분리로 수집하고 상등액을 제거하고, 이러한 침전물을 2.5ml의 20mM 트리스 완충액 pH 7.0에 용해시켜 다시 원심분리하고, 상등액을 20mM 트리스 완충액 pH 7.0으로 평형화한 Sephadex G-25 칼럼(14ml)에 적용하고, 20mM 트리스 완충액 pH 7.0으로 용출시켜 탈염시켰다. 이러한 조작에 따라 각각의 유전자 산물의 조효소액 3.5ml를 수득하였다.
실로-이노시톨 데하이드로게나제의 활성은 반응액(200mM 트리스 완충액 pH 8.0, 2% NADPH, 1% 실로-이노소스) 5㎕와 효소액 5㎕를 혼합하며 36℃에서 30분 반응시킨 직후, 500㎕의 물을 가하여 340nm의 흡광도를 측정하며, 효소액 대신에 물을 사용하는 시험액의 블랭크 값에서 340nm의 흡광도의 감소량을 측정하였다. 필요하면 효소액은 희석하였다.
또한, 효소반응 생산물은 실로-이노소스 10mg, NADPH 40mg, 효소 10U 상당을 함유하는 100mM 트리스 완충액(pH 8.0) 1.0ml로 36℃에서 4시간 동안 반응시킨 후, 80℃에서 10분 가열 처리하고 냉각한 다음, 강염기성 양이온 교환수지 100㎕, 강산성 음이온 교환수지 100㎕, 활성탄 10mg을 가하여 교반하며, 원심분리후, 상등액을 2배 희석하고, HPLC(Shodex Asahipak NH2BP-50 4E Φ4.6×250mm: Shodex제)로써 칼럼온도 40℃에서 이동상 유속 1.5ml(80% 아세토니트릴), RI 검출기로 측정하였다. 그 결과, 아그로박테리움 튜메파시엔스 C58주의 Atu4375 유전자 산물과, Atu3234 유전자 산물, 바실루스 서브틸리스 168주의 BG14057 유전자 산물, 크산토모나스 캄페스트리스 pv. 캄페스트리스주의 Xcc3438 유전자 산물 및 AB10121주의 Atu4375 유전자 산물과, Atu3234 유전자 산물은 높은 효소 활성을 나타내며, 이의 생산물은 모두 100% 실로-이노시톨로 환원된 것이며 이성체인 미오-이노시톨은 검출되지 않았다. 결과적으로 상기한 유전자 유래의 재조합 효소는 모두 높은 실로-이노시톨 데하이드로게나제 활성을 가지며 이의 유전자 산물이 실로-이노시톨 데하이드로게나제인 것을 확인했다. 또한, 실로-이노소스로부터의 환원 반응물은 실로-이노시톨만 검출되며, 입체 특이적으로 실로-이노시톨로 환원되는 효소였다.
아그로박테리움 튜메파시엔스 C58주 유래의 Atu4375 유전자 서열은 서열번호 3에 기재하고, 상당하는 아미노산 서열은 서열번호 4에, Atu3234 유전자 서열은 서열번호 5에, 상당하는 아미노산 서열은 서열번호 6에 기재하였다. 또한, 바실루스 서브틸리스 168주 유래의 BG14057 유전자 서열은 서열번호 7에, 상당하는 아미노산 서열은 서열번호 8에, AB10121주 유래의 Atu4375 유전자 서열은 서열번호 9에, 상당하는 아미노산 서열은 서열번호 10에, Atu3234 유전자 서열은 서열번호 11에, 상당하는 아미노산 서열은 서열번호 12에, 크산토모나스 캄페스트리스 pv. 캄페스트리스주 유래의 Xcc3438 유전자 서열은 서열번호 13에, 상당하는 아미노산 서열은 서열번호 14에 기재하였다. 또한, AB10121주의 Atu4375 유전자와 Atu3234 유전자를 함유하는 플라스미드의 염기서열을 해석(홋카이도시스템사이언스사)한 결과, 아그로박테리움 튜메파시엔스 C58주의 Atu4375 유전자와 AB10121주의 Atu4375 유전자의 염기서열 위의 상동성은 89%, 아미노산 서열 위의 상동성은 96%이며, 아그로박테리움 튜메파시엔스 C58주의 Atu3234 유전자와, AB10121주의 Atu3234 유전자의 염기서열 위의 상동성은 87%, 아미노산 서열 위의 상동성은 95%이었다.
실시예 13
<아세토박터 종 AB10281주 FERM BP-10119가 생산하는 SIDH1을 암호화하는 DNA의 분리>
정제된 효소 중에서 SIDH1를 함유하는 효소액을 PVDF막(Immobilon PSQ: 밀리포아사제)를 통과시켜 PVDF막에 흡착시켰다. 이러한 PVDF막을 수거하며, 코마시 브릴리언트 블루 염색액(Rapid CBB KANTO: 간토가가쿠사제)로 염색한 후 탈색하며, 건조한 다음, N 말단 아미노산 분석장치(Hewlett Packard사)에 의해 분석하였다. 그 결과, N 말단에서, 메티오닌-라이신-아르기닌-라이신-로이신아르기닌-이소로이신-글라이신-로이신-이소로이신-글라이신-세린-글라이신-페닐알라닌-메티오닌-글라이신-아르기닌-트레오닌-히스티딘-알라닌-페닐알라닌-글라이신-티로신-세린의 서열이 검출되며, 이러한 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열을 상정하여, 하기의 2종류의 프라이머를 작제한다.
서열번호 29: SIDH1-F1 atgaarcgnaarytncgiatyggyytiatygg
서열번호 30: SIDH1-F2 ggyttyatgggycgnacicaygcittyggyta
다음에 실시예 10 내지 12에서 수득되는 각종 실로-이노시톨 데하이드로게나제의 염기서열을 바탕으로 서열 내 고도의 공통 영역을 포함하는 하기의 2종류의 프라이머를 작제한다.
서열번호 31: SIDH1-B1 ggyttrtcrmmgayracrtgrstrcc
서열번호 32: SIDH1-B2 artgwrirtgrttgggigt
또한, 주형으로서 AB10281주의 게놈 DNA는 실시예 9에서 제조된 균체 펠렛(습중량 약 400mg)을 사용하여 실시예 12에 기재한 DNA 제조방법과 동일한 방법으로 제조하였다.
PCR 반응은 다카라슈조사의 Ex taq 반응 용액을 사용하며, 다카라 ExTaq 완충액×10배액 5㎕, dNTP 혼합물 4㎕, 주형 DNA 30ng, 10μM 프라이머 용액 각 1㎕(SIDH1-F1과 SIDH1-B1), 다카라 ExTaq 0.5㎕의 조성을 갖는 용액을 50㎕가 되도록 물을 가하고, 30㎕의 미네랄 오일을 중층하여 제조하였다. 반응조건은 PCR 증폭장치(ASTEC사 PC-700)를 사용하며 변성을 94℃에서 30초, 어닐링을 50℃에서 30초, 신장을 72℃에서 1분의 3단계의 반응을 35회 반복하였다. 상기한 PCR 반응에 따라 전기영동한 후, 약 0.3kbp 크기의 DNA 단편이 증폭된 것을 확인하였다. 또한, 이러한 0.3kbp의 밴드를 겔로부터 절단 수거하며, 겔 파쇄 용액의 일부를 주형(2㎕)으로 하고, 프라이머의 조합을 SIDH1-F2와 SIDH1-B2로 하는 이외에는 동일한 PCR 반응액 조성으로 반응액을 제조하며 반응조건은 PCR 증폭장치(ASTEC사 PC-700)를 사용하고, 변성을 94℃에서 30초, 어닐링을 46℃에서 30초, 신장을 72℃에서 1분의 3단계의 반응을 35회 반복하였다. 이러한 PCR 반응에 따라 전기영동한 후, 약 0.25kbp 크기의 DNA 단편이 증폭된 것을 확인하였다.
약 0.25kbp 크기의 DNA 단편은 이 부분을 겔로부터 절단 수거하고, 진클린(Bio101사제)를 사용하여 PCR 단편을 정제하였다. 즉, 겔을 NaI 용액에 용해시키는 이외에는 실시예 12에 기재된 정제방법과 동일한 방법으로 DNA 단편 용액 12㎕를 수득하였다.
다음에 정제된 DNA 단편을 pT7Blue 벡터와 연결시킨다. 즉, DNA 단편 용액 10㎕에 pT7Blue 벡터를 0.5μg, 다카라 연결 키트-I 용액(다카라슈조사)를 10㎕ 가하여, 16℃에서 1시간 동안 반응시킨다. 이러한 용액을 수용적격 세포(다카라슈조사 DH5α)로 형질전환시켰다. 형질전환 조작 및 형질전환체에서 플라스미드의 분리는 실시예 12와 동일한 방법으로 실시하였다.
수득된 플라스미드를 유니버셜 프라이머(R-20량체와 U-19량체)를 사용하여 염기서열을 해석(홋카이도시스템사이언스사)한 결과, 이러한 효소를 암호화하는 유전자의 염기서열의 전반(前半) 약 1/3이 명백해졌다.
또한, 완전 길이의 염기서열을 결정하기 위해 AB10281주의 게놈 DNA를 제한효소 BamHI로 완전하게 분해시켜 수득된 DNA 단편 용액을 진클린(Bio101사제)를 사용하여 정제하며, 이러한 단편을 자가 연결시켰다. 즉, DNA 단편 용액 10㎕에 다카라Ligation kit-I 용액(다카라슈조사)을 10㎕ 가하고 16℃에서 1시간 동안 반응시킨다. 반응후, 진클린(Bio101사제)를 사용하여 DNA를 정제하고, 역 PCR용의 주형 DNA 용액으로서 사용하였다.
다음에 명백해진 전반 약 1/3의 염기서열을 바탕으로 하기의 3종류의 프라이머를 작제하여, 역 PCR 반응을 실시하였다.
서열번호 33: SIDH1-INV-F gctcgtcaacgatcctgaaattgat
서열번호 34: SIDH1-INV-B ttcgctgcagcttcatcggaaatat
서열번호 35: SIDH1-INVF3 cccttcaatttccgggcgggt
역 PCR 반응은 다카라슈조사의 Ex taq 반응 용액을 사용하며, 다카라 ExTaq 완충액×10배액 5㎕, dNTP 혼합물 4㎕, 주형 DNA 30ng, 10μM 프라이머 용액 각 1㎕(SIDH1-INV-F1와 SIDH1-INV-B의 조합, SIDH1-INV-F와 SIDH1-INV3의 조합), 다카라 ExTaq 0.5㎕의 조성을 갖는 용액을 50㎕가 되도록 물을 가하며, 30㎕의 미네랄 오일을 중층하여 제조하였다. 반응조건은 PCR 증폭장치(ASTEC사 PC-700)를 사용하며 변성을 94℃에서 30초, 어닐링을 50℃에서 1분, 신장을 72℃에서 2분의 3단계의 반응을 35회 반복하였다. 상기한 PCR 반응에 따라 전기영동한 후, 약 2.7kbp와 약 1.8kbp 크기의 DNA 단편이 증폭되었다. 이러한 약 2.7kbp와, 약 1.8kbp의 밴드를 겔로부터 절단 수거하며, 진클린(Bio101사제)를 사용하여 PCR 단편을 정제하며, DNA 단편 용액 10㎕를 수득하였다. PCR에서 사용된 프라이머를 사용하여, 수득된 2종류의 DNA 단편의 염기서열을 해석(홋카이도시스템사이언스사)하였고, 이러한 효소를 암호화하는 유전자의 전체 염기서열을 결정하였다.
다음에, RBS 부위를 포함하는 AB10281주가 생산하는 SIDH1 유전자를 클로닝하기 위해, 하기 서열을 갖는 프라이머를 사용한 PCR 반응을 실시하여 재조합 효소로서 발현시켰다.
서열번호 36: 281SIDH1-F gctggatcccgcccttattgtgaata
서열번호 37: 281SIDH1-R tatgaattcgttatgccttctcatgctgtcg
PCR 반응은 다카라슈조사의 Ex taq 반응 용액을 사용하며, 다카라 ExTaq 완충액×10배액 5㎕, dNTP 혼합물 4㎕, 주형 DNA 30ng, 10μM 프라이머 용액 각 1㎕, 다카라 ExTaq 0.5㎕의 조성을 갖는 용액에 50㎕가 되도록 물을 가하며, 30㎕의 미네랄 오일을 중층하여 제조하였다. 반응조건은 PCR 증폭장치(ASTEC사 PC-700)를 사용하며 변성을 94℃에서 30초, 어닐링을 55℃에서 1분, 신장을 72℃에서 1분의 3단계의 반응을 35회 반복하였다. 상기한 PCR 반응에 따라 전기영동한 후, 약 1.2kbp 크기의 DNA 단편이 증폭되었다.
약 1.2kbp의 크기의 DNA 단편은 진클린(Bio101사제)를 사용하여 정제되며, DNA 단편 용액 12㎕를 수득하였다. 이러한 DNA 단편을 발현 벡터에 삽입하는 조작은 DNA 단편 용액 10㎕에 발현용 플라스미드를 0.5μg(pUC119), 다카라슈조사의 제한효소(BamHI, EcoRI)를 각 1㎕, 다카라슈조사의 제한효소용 완충액K 완충액×10배액 2㎕를 가하여, 20㎕가 되도록 멸균수를 가하여 혼합하였다. 이러한 반응액을 36℃에서 2시간 동안 반응시켰다.
반응 용액에서의 DNA 단편의 회수, 정제, 연결 반응 및 수용적격 세포(다카라슈조사 DH5α)로의 형질전환은 실시예 12와 동일한 방법으로 실시하였다. 또한, 실로-이노시톨 데하이드로게나제 활성을 확인하기 위한, 효소의 발현과, 활성 측정방법도 실시예 12와 동일한 방법으로 실시하고, 본 유전자 산물이 실로-이노시톨 데하이드로게나제인 것을 확인하였다.
결과적으로, AB10281주가 생산하는 SIDIH1을 암호화하는 유전자의 염기서열을 서열번호 27에, 또한 아미노산 서열을 서열번호 28에 기재하였다.
실시예 14
<본 발명의 효소인 각종 실로-이노시톨 데하이드로게나제의 제반 성질의 검토>
실시예 9의 효소 정제에 의해 수득된 AB10281주 유래의 SIDH1, SIDH2, SIDH3과, 실시예 11의 재조합 효소로서 수득된 이. 콜라이 유래의 ydgJ 유전자 산물과, 실시예 12의 재조합 효소로서 수득된 아그로박테리움 튜메파시엔스 C58주의 Atu4375 유전자 산물과, Atu3234 유전자 산물, 바실루스 서브틸리스 168주의 BG14057 유전자 산물, 크산토모나스 캄페스트리스 pv. 캄페스트리스주의 Xcc3438 유전자 산물 및 AB10121주의 Atu4375 유전자 산물과, Atu3234 유전자 산물의 효소로서 제반 성질을 하기에 기재된 방법으로 검토하여, 그 결과를 표 5에 기재하였다.
또한, 표 6은 아미노산 서열의 상동성을 나타낸 표이며, 전체에 공통된 아미노산 만의 상동성은 약 5%로 낮은 상동성이지만 유사한 성질을 갖는 아미노산까지 함유하면 특히 N 말단의 전반 약 30%의 NAD 또는 NADP 결합 도메인은 상동성이 높은 것을 알았다. 또한 NAD 또는 NADP의 산화 환원작용 부위인 니코틴아미드의 결합에 관여하는 서열 중앙 전반(前半) 가까이의 라이신-프롤린 서열은 양호하게 보존되어 있다. 라이신-프롤린 서열로부터 C 말단측으로 27번째의 아스파라긴과, 서열 중앙 부근의 아스파라긴산-(3아미노산)-히스티딘 서열도 양호하게 보존되어 있으며 추정 삼차원 구조로부터 기질 결합에 관여하는 중요한 서열이라고 생각된다. 표중에서 공통된 서열은 「*」표시, 성질이 유사한 아미노산은「:」표시 또는 「.」표시로 표시하며 또한, 라이신-프롤린 서열, 라이신-프롤린 서열로부터 C 말단측으로 27번째의 아스파라긴, 서열 중앙 부근의 아스파라긴산-(3아미노산)-히스티딘 서열은 평행성 표시로 나타낸다.
분자량의 비교에서, AB10281주 유래의 본 발명의 효소는 분자량 마커(프레스틴?스탠다드(광범위한 타입): 바이오레드사제)를 지표로 하는 SDS-PAGE의 결과를 근거로 계산하는 반면, 다른 본 발명의 효소는 유전자의 전체 길이로부터 추정되는 효소의 분자량을 산출하였다. 그 결과, 효소 정제에 의해 수득되는 AB10281주 유래의 본 발명의 효소 SIDH1, SIDH2, SIDH3의 분자량은 각각 46kDa, 42kDa, 40kDa이었다. 또한, 실시예 11의 재조합 효소로서 수득된 이. 콜라이 K-12주 유래의 ydgJ 유전자 유래의 본 발명의 효소의 분자량은 38.2kDa, 실시예 12의 재조합 효소로서 수득된 아그로박테리움 튜메파시엔스 C58주의 Atu4375 유전자, Atu3234 유전자 유래의 본 발명의 효소의 분자량은 각각 41.3kDa, 42.4kDa, 바실루스 서브틸리스 168주의 BG14057 유전자, 크산토모나스 캄페스트리스 pv. 캄페스트리스주의 Xcc3438 유전자 및 AB10121주의 Atu4375 유전자, Atu3234 유전자 유래의 본 발명의 효소의 분자량은 각각 40.1kDa, 38.5kDa, 41.4kDa, 42.5kDa이었다. 요컨대, 본 발명의 효소인 각종 실로-이노시톨 데하이드로게나제는 38 내지 46kDa의 분자량을 갖는 것으로 판명됐다.
본 발명의 효소의 회합 특성은 겔 여과 칼럼(도소사: 2000SWXL)로 분획된 분획물의 활성을 측정하고, 상응하는 분자량 분획물로부터 분자량을 계산하며, 이를 효소의 분자량으로 나눈 값을 정수화하였다. 그 결과, 본 발명의 효소인 각종 실로-이노시톨 데하이드로게나제는 80k 내지 110kDa의 분자량을 나타내며, 미변성 상태에서는 2 또는 3량체를 형성한다고 생각된다.
본 발명의 효소의 보효소의 선택성은 반응액(200mM 트리스 완충액 pH 8.0, 2% NADPH 또는 NADH, 1% 실로-이노소스) 5㎕와 효소액 5㎕를 혼합하고 36℃에서 30분 동안 반응시킨 직후, 500㎕의 물을 가하여 340nm의 흡광도를 측정하며, 효소액 대신에 물을 사용하는 시험액의 블랭크 값에서 340nm의 흡광도의 감소량을 측정하였다. 필요하면, 효소액은 희석하였다. 그 결과, 본 발명의 효소인 각종 실로-이노시톨 데하이드로게나제는 NADPH, NADH 둘다 보효소로서 사용할 수 있지만, 표 5에 기재된 바와 같은 보효소 상대활성을 나타낸다. NADPH에 대하여 양호하게 작용하는 효소가 많은 것을 알았다.
본 발명의 효소의 최적 pH는 반응액(200mM 인산염 완충액 pH 5.0 내지 9.0, 2% NADPH, 1% 실로-이노소스) 5㎕와 효소액 5㎕를 혼합하고 36℃에서 30분 동안 반응시킨 직후, 500㎕의 물을 가하여 340nm의 흡광도를 측정하며, 효소액 대신에 물을 사용하는 시험액의 블랭크 값에서 340nm의 흡광도의 감소량을 측정하였다. 필요하면, 효소액은 희석하였다. 그 결과, 본 발명의 효소인 각종 실로-이노시톨 데하이드로게나제는 표 5에 기재된 바와 같은 최적 pH를 나타내었다. 요컨대, 본 발명의 효소는 pH 5 내지 9의 광범위한 범위로 작용하는 것을 알았다. 또한, 최대 활성이 산성 영역의 pH 6부근의 효소와, 중성 영역 pH 6.5 내지 7.5부근의 효소와, 알칼리성 영역의 pH 7.5 내지 9부근에 어떤 효소가 있는 것도 알았다.
본 발명의 효소의 열안정성은 효소액을 소정의 온도로 10분간 처리한 다음, 냉각하고, 본 발명의 효소액과 반응액(200mM 인산염 완충액 pH 5.0 내지 9.0, 2% NADPH, 1% 실로-이노소스) 5㎕를 혼합하며 36℃에서 30분 동안 반응시킨 직후, 500㎕의 물을 가하여 340nm의 흡광도를 측정하며, 효소액 대신에 물을 사용하는 시험액의 블랭크 값으로부터 340nm의 흡광도의 감소량을 측정하였다. 필요하면, 효소액은 희석하였다. 20℃에서 10분 처리 그룹의 활성을 100%로 하여 상대활성을 비교하였다. 그 결과, 본 발명의 효소인 각종 실로-이노시톨 데하이드로게나제의 열안정성은 표 5에 기재된 바와 같이 각 효소에 따라 상이하며, 효소에 의해 이의 안정성은 40 내지 60℃까지 상이한 것을 알았다.
본 발명의 효소의 중금속 효과는 반응액(200mM 트리스 완충액 pH 8.0, 2% NADPH, 1% 실로-이노소스, 2mM 금속염) 5㎕와 효소액 5㎕를 혼합하고 36℃에서 30분 동안 반응시킨 직후, 500㎕의 물을 가하여 340nm의 흡광도를 측정하며, 효소액 대신에 물을 사용하는 시험액의 블랭크 값에서 340nm의 흡광도의 감소량을 측정하였다. 필요하면, 효소액은 희석하였다. 금속염의 종류는 CaCl2, CoCl2, ZnSO4, MgSO4, SnCl2, NiCl2, MnSO4를 사용하여, 첨가하지 않은 분획의 활성을 100%로 하여 상대활성을 비교하였다. 그 결과, 본 발명의 효소인 각종 실로-이노시톨 데하이드로게나제는 표 5에 기재된 바와 같이 적어도, Co2+ 이온의 존재하에 활성화되어, Sn2+ 이온의 존재하에 억제되었다. 대부분의 효소는 Zn2+ 이온의 존재하에 억제되지만, 바실루스 서브틸리스 168주 유래의 효소는 반대로 Zn2+ 이온의 존재하에 활성화되었다.
본 발명의 효소의 실로-이노소스에 대한 Km 값은 반응액(200mM 트리스 완충액 pH 8.0, 2% NADPH, 0.001 내지 2.5% 실로-이노소스) 5㎕와 효소액 5㎕를 혼합하고 36℃에서 30분 반응시킨 직후, 500㎕의 물을 가하여 340nm의 흡광도를 측정하며, 효소액 대신에 물을 사용하는 시험액의 블랭크 값에서 340nm의 흡광도의 감소량을 측정하였다. 필요하면, 효소액은 희석하였다. 값은 역수 플롯되며, Km 값을 산출하였다. 그 결과, 본 발명의 효소인 각종 실로-이노시톨 데하이드로게나제의 Km 값은 표 5에 기재된 바와 같이 2.6 내지 12.6mM의 범위를 나타내었다.
본 발명의 효소의 기질 특이성은 산화 활성을 지표로 실로-이노시톨에 대한 반응성에 대한 상대활성을 측정하였다. 사용되는 이노시톨 이성체는 실로-이노시톨(SI), 미오-이노시톨(MI), D-키로-이노시톨(DCI), L-키로-이노시톨(LCI), 에피-이노시톨(EI), 뮤코-이노시톨(MuI), 알로-이노시톨(AI), 네오-이노시톨(NI)이었다. 표 5에는 상대활성이 70% 이상의 효소, 70% 미만 20% 이상의 효소, 20% 미만의 효소로 표시하였다.
기질 특이성의 측정방법은 반응액[각종 이노시톨 이성체 1%(네오-이노시톨 만 0.4%), 200mM 트리스 완충액 pH 8.0, 0.002% NADP+, 0.002% 디아포라제, 0.01% 니트로테트라졸리움 블루) 50㎕와 효소액 50㎕를 혼합하고, 25℃에서 3분마다 545nm의 흡광도의 증가를 마이크로플레이트 판독기로 측정하였다. 시간마다 흡광도의 증가분으로부터 반응속도를 산출한 결과, 효소의 종류별로 기질 특이성은 약간 상이하며, 이노시톨 이성체 구조와의 상관관계에서 적어도 이들 효소가 실로-이노시톨 데하이드로게나제 활성과, 미오-이노시톨 5-데하이드로게나제 활성을 갖고 있는 것도 판명됐다.
[표 5]
[표 6a]
[표 6b]
실시예 15
<본 발명의 효소를 사용한 실로-이노시톨의 제조>
본 제조방법에서 사용하는 효소는 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제 및 본 발명의 효소의 2종류가 필요하다. 여기서는 바실루스 서브틸리스 168주 ATCC23857 유래의 BG10669 유전자 산물인 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제의 재조합 효소와, 본 발명의 DNA에 의해 암호화되는(이. 콜라이 K12주 유래 ydgJ 유전자: 서열번호 1) 본 발명의 효소의 재조합 효소를 사용하는 실시예를 기재하였다.
처음에 바실루스 서브틸리스 168주 ATCC23857 유래의 BG10669 유전자 산물인 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제의 재조합 효소를 수득하기 위해 하기의 실험을 실시하였다. 바실루스 서브틸리스 168주 유래의 BG10669 유전자를 클로닝하기 위해, 하기의 서열을 갖는 프라이머를 사용한 PCR 반응을 실시하여 재조합 효소로서 발현시켰다.
서열번호 25: BG10669-F 5'-ttgggatccgatgagtttacgtattggcgtaattg-3'
서열번호 26: BG10669-R 5'-aaactgcagttagttttgaactgttgtaaaagattgata-3'
PCR 반응은 다카라슈조사의 Ex taq 반응 용액을 사용하고, 다카라 ExTaq 완충액×10배액 5㎕, dNTP 혼합물 4㎕, 주형 DNA 30ng, 10μM 프라이머 용액 각 1㎕, 다카라 ExTaq 0.5㎕의 조성을 갖는 용액에 50㎕가 되도록 물을 가하며, 30㎕의 미네랄 오일을 중층하여 제조하였다. 반응조건은 PCR 증폭장치(ASTEC사 PC-700)를 사용하며, 변성을 94℃에서 30초, 어닐링을 53℃에서 1분, 신장을 72℃에서 1분의 3단계의 반응을 35회 반복하였다. 상기한 PCR 반응에 따라 약 1.0kbp의 크기의 DNA 단편이 증폭되었다. 반응후, 중층된 미네랄 오일을 0.3ml의 헥산으로 추출하며, 헥산층을 제거하는 조작을 3회 반복하여, 1분 동안 감압하는 것으로 미네랄 오일을 제거하였다. 이와 같이 수득된 반응액 50㎕에서 진클린(Bio101사)를 사용하여 PCR 단편을 정제하였다. 즉, 키트 첨부의 NaI 용액을 300㎕ 가하여 혼합하며, 10㎕ 유리 비드 용액을 가하여 혼합하며, 4℃에서 15분 동안 정치한 후에 원심분리하여, DNA 단편이 흡착된 유리 비드를 침전시키고, 상등액을 제거하였다. 다시 키트 첨부된 새로운 세척액 500㎕를 가하여, 유리 비드를 현탁시켜 원심분리하여, 상등액을 제거하였다. 이러한 새로운 세척액에 의한 세정조작은 3회 반복하였다. 다음에 유리 비드를 감압하에 건조시킨 후, 15㎕의 멸균수를 가하여, 현탁하며 55℃에서 15분 동안 가온한 다음, 원심분리하여, DNA 단편을 함유하는 상등액 12㎕를 수득하였다.
정제된 DNA 단편을 발현 벡터에 삽입하는 조작은 하기와 같이 실시하였다. 즉, DNA 단편 용액 10㎕에 발현용 플라스미드(pUC118: 다카라슈조사제)를 0.5μg, 다카라슈조사의 제한효소 BamHI, PstI를 각 1㎕, 다카라슈조사의 제한효소용 완충액인 K 완충액×10배액 2㎕를 가하며, 20㎕가 되도록 멸균수를 가하여 혼합하였다. 이러한 반응액을 36℃에서 2시간 동안 반응하였다. 제한효소 반응후, 진클린을 사용하여 DNA 단편과 발현 벡터를 분리하며, 이들을 연결시켰다. 즉, 제한효소 반응액 20㎕에 키트 첨부된 NaI 용액을 300㎕ 가하여 혼합하며, 10㎕ 유리 비드 용액을 가하여 혼합하며, 4℃에서 15분 동안 정치한 후에 원심분리하고 DNA 단편과 발현 벡터가 흡착된 유리 비드를 침전시켜 상등액을 제거하였다. 다시 키트 첨부된 새로운 세척액 500㎕를 가하여 유리 비드를 현탁시켜 원심분리하여, 상등액을 제거하였다. 이러한 새로운 세척액에 의한 세정 조작은 3회 반복하였다. 다음에 유리 비드를 감압하에 건조시킨 후, 15㎕의 멸균수를 가하여 현탁하고, 55℃에서 15분 동안 가온한 후, 원심분리하고, DNA 단편과 발현 벡터를 함유하는 상등액 12㎕를 수득하였다. 이러한 조작에 따라 제한효소에 의해 생긴 약 50bp 이하의 작은 DNA 단편은 제거되며, 목적하는 DNA 단편과 발현 벡터가 수득되었다.
이와 같이 제조된 용액 10㎕에 다카라 연결 키트-I 용액(다카라슈조사)를 10㎕ 가하고, 16℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이러한 용액을 수용적격 세포(다카라슈조사: DH5α)로 형질전환시켰다. 즉, 4℃에서 해동된 수용적격 세포 용액 60㎕에 연결 반응 용액을 5㎕ 가하여, 혼합하고 0℃에서 30분후, 42℃에서 45초, 0℃에서 2분의 처리하고, 여기에 500㎕ SOC 용액(2% 박토트립톤, 0.5% 효모 추출물, 10mM NaCl, 20mM 글루코스, 10mM MgSO4, 10mM MgCl2)를 가하며 36℃에서 1시간 동안 회복 배양시켜 이러한 배양액 100㎕를 50μg/ml 암피실린, 40μg/ml X-gal(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드), 1mM IPTG(티오갈락토피라노시드)를 함유하는 LB 한천 배지(1% 박토트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% NaCl, pH 7.0, 1.5% 한천)에 도포하였다. 다시 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 이러한 배양에 의해 백색으로 발색된 콜로니로서 상기한 플라스미드의 도입으로 형질전환된 이. 콜라이가 수득되므로 이를 선택한다. 이와 같이 분리된 형질전환 이. 콜라이 콜로니를 암피실린(50μg/ml)를 함유하는 LB 액체 배지에서 배양하였다. 증식된 형질전환 이. 콜라이의 균체로부터 플라스미드 정제 키트(QIA filter Plasmid Midi Kit, QIAGEN사)에 의해 플라스미드 DNA를 분리 및 정제하였다. 이와 같이 수득된 플라스미드 DNA는 목적하는 BC10669 유전자에게 상응하는 약 1.0kbp의 DNA 단편을 갖는 것이 확인된다.
다음에 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제 활성을 확인하기 위해 콜로니로서 분리된 균주를 50μg/ml 암피실린을 함유하는 100ml LB 배지(1% 박토트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% NaCl, pH 7.0) 30개에 이식하며 36℃에서 7시간 동안 배양하고, 이러한 배양액 100ml마다 200mM 티오갈락토피라노시드 용액을 0.3ml 가한 다음, 36℃에서 3시간 동안 배양하였다. 배양 종료후, 원심분리에 의해 균체를 수집하고 이를 생리식염수로 1회 세정하였다. 또한, 세정 균체를 0.6% Triton X100 용액 3ml에 현탁하며 4℃에서 초음파에 의해 균을 파쇄하였다. 이러한 용액을 원심분리하여, 상등액의 효소 용액 84ml를 수거하고 상등액에 36g 황산암모늄을 가하여, 4℃에서 단백질을 염석시켰다. 염석된 단백질을 원심분리로 수집하고 상등액을 제거하며 이러한 침전물을 75ml의 20mM 트리스 완충액 pH 7.0에 용해시켜 다시 원심분리하고, 상등액을 20mM 트리스 완충액 pH 7.0으로 평형화한 Sephadex G-25 칼럼(파마시아제)(400ml)에 적용하며, 20mM 트리스 완충액 pH 7.0으로 용출시켜 탈염시켰다. 이러한 조작에 의해 BG10669 유전자 산물인 조효소액을 수득하였다.
미오-이노시톨 2-데하이드로게나제 환원 활성은 아래와 같이 측정하였다. 반응액(200mM 트리스 완충액 pH 8.0, 2% NADH, 1% 실로-이노소스) 5㎕와 효소액 5㎕를 혼합하며 36℃에서 30분 반응시킨 직후, 500㎕의 물을 가하여 340nm의 흡광도를 측정하며, 효소액 대신에 물을 사용하는 시험관의 블랭크 값에서 340nm의 흡광도의 감소량을 측정하였다. 필요하면 효소액은 희석하고, 실로-이노소스의 환원 활성이 있는 것을 확인하였다. 한편, 산화 활성은 반응액(미오-이노시톨 또는 실로-이노시톨 1%, 200mM 트리스 완충액 pH 8.0, 0.002% NAD+, 0.002% 디아포라제, 0.01% 니트로테트라졸리움 블루) 50㎕와 효소액 50㎕를 혼합하며 25℃에서 3분마다, 545nm의 흡광도의 증가를 마이크로플레이트 판독기로 측정하였다. 시간마다 흡광도의 증가분 내지 반응속도를 산출하며, 제조된 효소의 산화 활성이 미오-이노시톨에 활성을 나타내며, 실로-이노시톨에 활성을 나타내지 않는 것을 확인하였다.
이와 같이 제조된 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제효소 용액과, 실시예 11에서 조정된 실로-이노시톨 데하이드로게나제 조효소 용액(30배 규모인 3L 배양액에서 제조된 효소액 105ml)을 사용하여, 미오-이노시톨로부터 실로-이노시톨로의 변환반응을 실시하였다. 반응 용액은 미오-이노시톨 200g, 5% 실로-이노소스 70ml, CoCl2 130mg, MgSO4?7H2O 250mg과 물을 가하여 750ml로 하며 50℃까지 가열하여, 미오-이노시톨을 용해시켰다. 이를 36℃까지 냉각하여 1N NaOH 수용액으로 pH 8.0으로 제조하며 790ml가 되도록 물을 가하였다. 여기에 36℃에서 미오-이노시톨 2-데하이드로게나제의 조효소액 105ml, 실로-이노시톨 데하이드로게나제 조효소 용액 105ml, NADP+ 70mg을 가하여, 약 1L가 되는 용액을 36℃에서 보온하여, 천천히 교반하면서 반응시켰다. 반응액은 pH가 서서히 산성이 되므로 1N NaOH로 pH 8.0이 되도록 제조하였다. 42시간 후, 반응액 중에 실로-이노시톨의 결정이 생기며 백탁된 반응액이 수득되었다. 이러한 용액을 여과지로 여과하고, 결정성 실로-이노시톨(습중량 73g)을 회수하였다. 이러한 고체에 3L의 물을 가하여 50℃에서 용해시켜 4.5L가 되도록 물을 가하여 실온까지 냉각하고 수득된 용액을 원심분리(8000rpm 20분 동안)하여 미량의 불용물을 제거한 상등액을 강염기성 양이온 교환수지 100ml 칼럼, 강산성 음이온 교환수지 100ml 칼럼 및 활성탄 50ml 칼럼의 순으로 통과시킨 각각의 용출액을 수득한 후에, 칼럼 세정을 위해 500ml의 물을 순차적으로 통과시켜 각각의 세정액을 수득하였다. 세정액과 용출액을 함께 농축하였다.
농축으로 인해 용액의 양이 적어지면 실로-이노시톨의 미세 결정이 석출되기 시작하며 내용물이 130g으로 될 때까지 농축하고, 이를 4℃까지 냉각한 다음, 밤새 방치하였다. 방치후, 슬러리상으로 된 물질을 여과하고, 여과지 위의 실로-이노시톨의 결정을 소량의 물로 세정한 다음, 105℃에서 3시간 건조시켰다. 수득된 실로-이노시톨은 백색의 결정(61g)이며 NMR 분석 및 HPLC 분석으로는 이외로 불순물은 확인되지 않으며 순도 99% 이상의 것이었다. 미오-미노시톨로부터의 수율은 31%이었다. 또한 여과 분리된 반응액은 아직 사용할 수 있으며 미오-이노시톨을 64g 용해시키면 다시 결정성 실로-이노시톨이 석출되었다.
실시예 16
<실로-이노시톨/붕산 복합체의 형성 및 형성조건의 검토>
분말인 실로-이노소스 100g을 500ml의 열수에 용해하고 실온까지 냉각한 다음, 900ml가 되도록 물을 가하였다. 이러한 용액을 5N Na0H 수용액을 사용하여, pH 7.5로 맞춘 다음, 1ℓ가 되도록 물을 가하였다.
이러한 용액에 NaBH4 5.9g의 분말을 교반하면서 서서히 15분에 걸쳐 가하여, 환원 반응시켰다. 반응 용액은 반응열에 의해 38℃까지 온도가 상승하였다. 30분후, 32℃까지 냉각된 반응액에 붕산 67.5g과 NaCl 72.2g을 용해시키고, 복합체가 형성된 용액을 제조하였다. 이러한 용액의 pH는 5.9였다.
다음에 8N NaOH 수용액을 사용하여 pH 6.0으로 조정한 복합체 형성 용액을 200ml 용적의 뚜껑 부착 플라스틱 용기에 100ml 나누어 담고 다시 8N NaOH 수용액을 사용하여 pH 7.0으로 조정한 복합체 형성 용액을 동일한 조작으로 100ml 나누어 담고, 다시 pH 8.0, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 12.0 및 12.8이 되도록 조정한 복합체 형성 용액도 순차적으로 10Oml 나누어 담았다.
이와 같이 pH 조정된 용액은 서서히 침전물이 형성되기 시작하였다. 하루 걸러서 침전물을 여과 분리하고, 여액은 8N NaOH 수용액을 사용하여 소정의 pH로 조정한 후에 원래 용기에 복귀시키고, 수득된 침전은 건조후, 중량을 측정하였다. 본래 환원에 의해 생성되는 실로-이노시톨이 모두 실로-이노시톨/붕산 복합체가 되며 또한, 전체가 침전물로서 수득된 경우, 침전물의 중량은 61.8g이 되므로 각 pH 조정된 용액으로부터 수득된 침전의 중량을 하루 걸러서 합산하고, 이를 이론 수득량의 61.8g으로 나눈 값을 실로-이노시톨/붕산 복합체 침전의 회수율로 하였다.
이와 같이 수득된 수치를 표에 정리하면 하기와 같다.
표중의 회색 부분은 회수율이 90%를 초과한 시험 그룹을 나타낸다.
[표 7]
표 7에 기재된 바와 같이 처리 pH 9.5의 시험 그룹이 가장 실로-이노시톨/붕산 복합체 침전 형성에 적합한 것을 알았다. 또한, pH 9.0, pH 9.5, pH 10.0의 시험 그룹은 4일째까지 90% 이상의 회수율을 나타내며, 회수율은 연장되어도 94%로 일정해지는 것을 알았다.
pH 9.5의 시험 그룹의 7일째의 여액의 NMR 분석에서 용액중에는 5.9%(w/v)의 미오-이노시톨과 약 0.2%(w/v)의 실로-이노시톨이 잔류되어 있는 것이 판명됐다. 요컨대, 0.2%(w/v) 이상의 농도의 실로-이노시톨/붕산 복합체는 본 방법에 따라 침전물로서 수거할 수 있음을 알았다.
실시예 17
<실로-이노소스 환원 혼합액으로부터 실로-이노시톨/붕산 복합체를 형성시키고, 복합체를 용해한 후 이온교환 수지로 실로-이노시톨을 유리 및 탈염하는 방법>
분말의 실로-이노소스 10g(56mmol)을 50ml의 열수에 용해하며, 실온까지 냉각한 다음, 90ml가 되도록 물을 가하였다. 이러한 용액을 5N NaOH 수용액을 사용하여, pH 7.5에 맞추고 다시 100ml가 되도록 물을 가하였다.
이러한 용액에 NaBH4 0.59g의 분말을 교반하면서 서서히 15분에 걸쳐 가하여, 환원 반응시켰다. 반응 용액은 반응열에 의해 36℃까지 온도가 상승하였다. 30분후, 31℃까지 냉각된 반응액에 붕산 6.75g과 NaCl 7.22g을 용해시키고, 복합체가 형성된 용액을 제조하였다. 다음에 이러한 복합체 형성 용액을 5N NaOH 수용액을 사용하여, pH 9.5로 조정하여, 교반하면서 pH 통계 장치를 장치하고, 5N NaOH 수용액을 사용하여, pH 9.5를 유지하도록 한다. 3일 후에 복합체 형성 용액중에 석출된 침전물을 여과하여, 소량의 물로 세정하고 건조한 다음, 5.71g(20.5mmol)의 실로-이노시톨/붕산 복합체를 수득하였다.
수득된 실로-이노시톨/붕산 복합체 5.71g에 1.05N의 염산 용액을 230ml 가하고, 실로-이노시톨/붕산 복합체를 용해하여 용해액을 수득하였다. 이러한 용해액은 0.2N의 산성 용액이었다. 다음에 칼럼에 채운 강산성 이온교환 수지(듀오라이트 C20, H+ 타입, 스미토모가가쿠) 200ml에 용해액을 1분 동안에 2ml의 유속으로 통과시켜 수득된 용출액을 칼럼에 채운 강염기성 이온교환 수지(듀오라이트 A116, OH- 타입, 스미토모가가쿠) 400ml에 통과시켰다. 수득된 용출액을 농축하고, 백색 분말 3.52g(19.5mmol)을 수득하였다. 이러한 백색 분말은 NMR에 의한 분석으로 실로-이노시톨인 것을 알았다. 또한, 실로-이노소스로부터의 수율은 35%이었다.
실시예 18
<실로-이노소스 환원 혼합액에서 실로-이노시톨/붕산 복합체를 형성시키고, 복합체를 용해시킨 다음 유기용매 침전으로 실로-이노시톨을 유리 및 결정화하는 방법>
분말의 실로-이노소스 10g(56mmol)으로부터 실시예 17에 기재된 방법과 동일한 방법으로 제조한 5.71g(20.5mmol)의 실로-이노시톨/붕산 복합체를 원료로 사용하였다.
실로-이노시톨/붕산 복합체 5.71g을 100ml 용적의 뚜껑 부착 삼각 플라스크에 교반기와 함께 투입하고, 22.8ml의 1.83N의 염산 용액을 가하여 현탁 용액을 제조하였다. 교반 1시간 후, 메탄올을 23ml 가하여 다시 교반하였다. 5시간후, 현탁 용액을 여과하고, 고체를 소량의 메탄올로 세정하며 건조시키고, 조 실로-이노시톨 3.58g(20.0mmol)을 수득하였다.
또한, 수득된 조 실로-이노시톨 3.58g을 230ml의 물에 용해하며 강산성 이온교환 수지(듀오라이트 C20?H+ 타입) 20ml, 강염기성 이온교환 수지(듀오라이트 A116?OH- 타입) 40ml를 가하여 교반하였다. 교반 30분 후에 이온교환 수지를 여과 분리하여, 수득된 여액을 농축하고, 백색 분말 3.41g(18.9mmol)을 수득하였다. 이러한 백색 분말은 NMR에 의한 분석으로 실로-이노시톨인 것을 알았다. 또한, 실로-이노소스로부터의 수율은 34%이었다.
실시예 19
<실로-이노소스를 환원한 후, 직접 실로-이노시톨을 유리 및 결정화시키는 방법>
분말의 실로-이노소스 5g(28mmol)을 40ml의 열수에 용해하고, 실온까지 냉각한 다음, 이러한 용액을 5N NaOH 수용액을 사용하여, pH 7.5에 맞추고 45ml가 되도록 물을 가하였다.
이러한 용액에 NaBH4 0.29g의 분말을 교반하면서 서서히 15분에 걸쳐 가하여, 환원 반응시켰다. 반응 용액은 반응열에 의해 37℃까지 온도가 상승하였다. 30분후, 30℃까지 냉각된 반응액을 5N 염산을 사용하여, pH 1.0으로 조정하였다. 다음에, 50ml가 되도록 물을 가하고, 0.1N의 산성 용액으로 제조하였다. 다음에 이러한 용액에 메탄올 25ml를 교반하면서 가한 결과, 용액은 10분후로부터 서서히 탁해지기 시작하고, 다시 이러한 현탁 용액을 24시간 동안 교반하였다. 24시간 후, 현탁 용액을 여과하고, 소량의 메탄올로 세정하고, 건조한 다음, 1.55g(8.6mmol)의 조 실로-이노시톨을 수득하였다.
또한, 수득된 조 실로-이노시톨 1.55g을 120ml의 물에 용해하며, 강산성 이온교환 수지(듀오라이트 C20?H+ 타입) 10ml, 강염기성 이온교환 수지(듀오라이트 A116?OH- 타입) 20ml를 가하여 교반하였다. 교반 30분 후에 이온교환 수지를 여과 분리하여, 수득된 여액을 농축하고, 백색 분말 1.51g(8.3mmol)을 수득하였다. 이러한 백색 분말은 NMR에 의한 분석으로 실로-이노시톨인 것을 알았다. 또한, 실로-이노소스로부터의 수율은 30%이었다.
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Claims (12)
- 실로-이노시톨 및 실로-이노시톨 이외의 중성당을 함유하는 혼합액에 용해된 실로-이노시톨의 2배mol 이상의 양의 붕산 및 금속염을 당해 혼합액 중에 가한 다음, 당해 혼합액의 pH를 8.0 내지 11.0으로 조정하여 실로-이노시톨과 붕산의 복합체를 형성시키는 제1 공정, 상기 복합체를 혼합액으로부터 분리하는 제2 공정, 분리된 복합체를 산에 용해시켜 실로-이노시톨과 붕산을 절단시키는 제3 공정, 및 제3 공정에서 수득되는 산성 용액 또는 산성 현탁액으로부터 실로-이노시톨을 분리 정제하는 제4 공정을 포함하는 정제된 실로-이노시톨의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 제1 공정에서 첨가하는 붕산 및 금속염의 양이 상기 혼합액 중에 용해된 실로-이노시톨의 2배mol 이상 또한 3배mol 이하인 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제1항에 있어서, 제1 공정에서 상기 혼합액의 pH를 9.0 내지 10.0으로 조정하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제1항에 있어서, 금속염이 NaCl, NaHCO3, Na2CO3, Na2SO4, NaHSO4, NaH2PO4, Na2HPO4, Na3PO4 및 붕사로 이루어진 그룹에서 선택되는 하나 이상의 금속염인 제조방법.
- 제1항에 있어서, 실로-이노시톨 및 실로-이노시톨 이외의 중성당을 함유하는 혼합액이, 실로-이노소스를 함유하는 용액중에서 실로-이노소스를 환원시킴으로써 수득되는 미오-이노시톨 및 실로-이노시톨을 함유하는 혼합액인 제조방법.
- 제1항에 있어서, 제3의 공정에서 상기 복합체를 산에 용해시켜 수득한 용액을 0.1N 이상의 산성으로 조정하고, 제4 공정에서 산성 용액을 강산성 이온교환 수지, 및 강염기성 이온교환 수지 또는 붕산 선택적 흡착수지에 접촉시킨 다음, 당해 산성 용액으로부터 실로-이노시톨을 석출시키는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제1항에 있어서, 제4 공정에서 산성 용액 또는 산성 현탁액에 수용성 유기용매를 가하여 실로-이노시톨을 석출시키는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제7항에 있어서, 수용성 유기용매가 에탄올 또는 메탄올이며, 산성 용액 또는 산성 현탁액에 대해 에탄올을 0.3 내지 3배 용적 또는 메탄올을 0.3 내지 5배 용적으로 첨가하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제7항에 있어서, 수용성 유기용매가 에탄올 또는 메탄올이며, 산성 용액 또는 산성 현탁액에 대해 에탄올을 0.6 내지 1.5배 용적 또는 메탄올을 0.9 내지 2배 용적으로 첨가하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
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