ES2404554T3 - Método para producir escilo-inositol - Google Patents
Método para producir escilo-inositolInfo
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Abstract
Un método para producir un escilo-inositol purificado que comprende: una primera etapa de precipitación de un complejo escilo-inositol/ácido bórico agregando ñacido bórico y un sal metálicaa una mezcla líquida que contiene escilo-inositol y un azúcar neutro diferente a escilo-inositol en una cantidad dos veceso más veces el número de moles de escilo-inositol disuelto en la mezcla líquida, y ajustando el pH de la mezcla líquida a8.0 hasta 11.0; una segunda etapa de separación del complejo a partir de la mezcla líquida; una tercera etapa de disolución del complejo separado en ácido para escindirlo en escilo-inositol y ácido bórico; y una cuarta etapa para aislar y purificar el escilo-inositol a partir de la solución ácida o suspensión ácida obtenidad en latercera etapa, en donde la sal metálica que se va a gregar es de una o más clases de sales metálicas selecciondas delgrupo consistente de NaCl, NaHCO3, Na2CO3, Na2SO4, NaHSO4, NaH2PO4, Na2HPO4, Na3PO4, borax, KCl, KHCO3,K2CO3, K2SO4, KHSO4, KH2PO4, K2HPO4, K3PO4, MgCl2, MgCO3, y MgSO4.
Description
Método para producir escilo-inositol Campo Técnico La presente invención se relaciona con un método para producir eficientemente escilo-inositol a partir de una mezcla
5 líquida que contiene escilo-inositol y azúcares neutros diferentes a escilo-inositol.
El escilo-inositol se puede utilizar como un agente terapéutico para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, como materia para la síntesis de sustancias bioactivas, o como materia prima para la síntesis de compuestos de cristal líquido. Técnica Anterior El escilo-inositol es una sustancia conocida de origen natural representada por la siguiente formula estructural estérica
escilo-inososa es una sustancia conocida representada por la fórmula estructural estérica (B).
Adicionalmente, el escilo-inositol es una sustancia conocida representada por la siguiente formula estructural estérica
El escilo-inositol es uno de los estéreo isómeros del mio-inositol y es una sustancia ampliamente encontrada entre animales y plantas. La escilo-inososa es un compuesto que tiene una estructura en la cual un grupo hidroxilo axial en la segunda posición del mio-inositol se oxida, y existe generalmente como un compuesto natural.
20 El escilo-inositol es una sustancia esperada para aplicaciones tales como un agente terapéutico para enfermedad de Alzheimer (ver Documento no Patente 1), materia prima para la síntesis de sustancias bioactivas (Documento de Patente 1), o una materia prima para la síntesis de compuestos de cristal líquido (Documento de Patente 2).
Ejemplos de un método de producir escilo-inososa o escilo-inositol por medio de un procedimiento químico sintético incluye: (I) un método para obtener escilo-inositol al reducir el exahidroxibenceno con nickel Raney (documento de 25 patente 2); (II) un método para obtener escilo-inositol al reducir la escilo-inososa obtenida de un derivado de glucofuranosa a través de una reacción que involucra cinco etapas (documento de patente 3); (III) un método para obtener escilo-inositol utilizando como materia prima cis-trioxa-tris-homobenceno a través de una reacción que involucra cuatro etapas o más (documento de patente 4); y (IV) un método para obtener escilo-inositol que incluye oxidar mioinositol con catalizador de platino para obtener de esta manera escilo-inososa, y someter la escilo-inososa a
30 esterificación seguida por reducción e hidrólisis (ver Documento de Patente 2).
Como un método para convertir el mio-inositol en escilo-inositol utilizando un microorganismo, se conoce un método utilizando una bacteria que pertenece al género Agrobacterium (Documento de Patente 3). Sin embargo, este método no es aplicable para una producción a escala industrial por el bajo rendimiento del escilo-inositol y la generación de otros productos convertidos. Mientras tanto, una bacteria que pertenece al género Acetobacter (ver documento no patente 5) es conocida por actuar sobre el mio-inositol para absorber oxigeno, para oxidar de esta manera el mio-inositol en escilo-inososa. Sin embargo, no ha sido estudiado su mecanismo detallado.
La enzima que oxida el mio-inositol en escilo-inososa (Io-inositol-2-deshidrogenasa) se ha reportado en numerosos organismos tales como animales, algas, levaduras y bacterias, y es una enzima que existe ampliamente en la naturaleza. Ejemplos de microorganismo típicos que tienen la enzima incluyen Aerobacter aerogenes (ver documento no patente 6), bacteria que pertenece al género Bacillus (Documento no Patente 7 y 8; documentos de patente 4-6), y bacterias que pertenecen al género Pseudomonas (Documento no Patente 9 y 10).
Sin embargo, la mio-inositol 2-deshidrogenadas en aquellos reportes son enzimas dependientes-NAD+, por lo tanto ellas requieren NAD+ o NADP+ para oxidación. Cuando la enzima se somete a una reacción a escala industrial, se debe emplear producción fermentativa con el fin de reciclar aquellas coenzimas, que resultan en la descomposición de parte de substratos. Además, ha habido problema a producción a escala industrial de tal manera que la concertación del substrato se debe mantener baja.
Mientras tanto, existe un reporte de la presencia de escilo-inositol deshidrogenasa en cerebro bovino y un tejido graso de cucaracha (Documento no Patente 11). Cuando la escilo-inososa como un substrato se reduce mediante esta enzima con NADPH, tanto el escilo-inositol como el mio-inositol son reportados por ser generados. Sin embargo, la enzima tiene especificidad de substrato baja, y no se utilizó enzima altamente purificada, y otras propiedades son desconocidas, por lo tanto la enzima puede ser un alcohol deshidrogenasa que tiene una especificidad de substrato baja. Por lo tanto, la enzima no se ha descrito en el Handbook of Enzymes (publicada hasta Askura Shoten). Como se describió anteriormente, aunque existen reportes en animales, no se tiene certeza de si estos reportes son ciertos.
Adicionalmente, existe un método conocido de producir escilo-inositol al reducir químicamente la escilo-inososa producida mediante oxidación microbiana (Documento de Patente 7). En razón a que la sustancia obtenida mediante reducción química de la escilo-inososa es una mezcla de escilo-inositol y mio-inositol, la mezcla se ha desalinizado y purificado, seguida por la separación de escilo-inositol que tiene baja solubilidad de la solución concentrada mediante cristalización. Así, aquí los métodos han requerido muchas operaciones y así ha habido espacio para mejorar con respecto al rendimiento del escilo-inositol. Bajo tales circunstancias, el desarrollo de un método para producir esciloinositol purificado de una mezcla de escilo-inositol y mio-inositol que se obtiene mediante la reducción de escilo-inososa,
o similar, se ha esperado con el fin de producir escilo-inositol conveniente y eficientemente.
Cuando la escilo-inososa se reduce utilizando NaBH4 en una solución, la solución después de la reacción contiene mioinositol, escilo-inositol, y una pequeña cantidad de un complejo de escilo-inositol/ácido bórico. Para tal complejo de de escilo-inositol/ácido bórico, se ha conocido un método para obtener escilo-inositol que involucra: filtrar el complejo como un precipitado; disolver el precipitado en ácido sulfúrico diluido; agregar a este metanol para someterlo a azeotropía con ácido bórico; remover el ácido bórico; y desalinizar la solución restante utilizando una resina de intercambio de guión (Documento no Patente 12).
El complejo de escilo-inositol/ácido bórico es una sustancia representada por la siguiente formula estructural estérica (D).
Sin embargo, en el método anteriormente descrito de reducir escilo-inososa utilizando NaBH4, la proporción de complejo de escilo-inositol/ácido bórico generada es baja, y el escilo-inositol también se genera en la solución. Por lo tanto, el complejo y los componentes en la solución tenían que ser reparados para obtener de esta manera escilo-inositol de cada uno de aquellos. Adicionalmente, una gran cantidad de disolvente orgánico se ha requerido para obtener escilo
inositol del complejo, ha habido espacio para mejorar desde el punto de vista económico. Así, ha habido demanda de un método para producir escilo-inositol conveniente y eficientemente, en producción escala industrial. [Documento de patente 1] Patente US 5, 412,080 [Documento de patente 2] DE 3, 405,663 [Documento de patente 3] JP09-140388A [Documento de patente 4]JP04-126075A [Documento de patente 5]JP05-192163A [Documento de patente 6]JP06-007158A [Documento de patente 7]JP2003-102492A. [Documento no patente 1] The Journal of Biological Chemistry (US), 200, vol. 175, p. 18495-18502 [Documento no patente 2] Journal of the American Chemical Society (US), 1948, vol. 70, p.2931-2935) [Documento no patente 3] Journal of the American Chemical Society (US), 1968, vol. 90, p.3289-3290 [Documento no patente 4]Angewandte Chemie (Alemania), 1973, vol.85 p. 1110-1111 [Documento no patente 5] The Journal of Biological Chemistry (US), 1948, vol. 174,p.173-188 [Documento no patente 6]Archives of Biochemistry and Biophysics (US), 1956, J, Larner tl al., vol.60, p. 352-363 [Documento no patente 7] The Journal of Biological Chemistry (US),1979, vol.254, p.7684-7690 [Documento no patente 8] Microbiology (US), 1994, vol.140, p.2289-2298 [Documento no patente 9] Monatshefte fur Chemine (Alemania), 1969, vol. 100, p.1327-1337 [Documento no patente 10] Journal of Bacteriology (US), 1977, vol. 100, p. 1327-1337 [Documento no patente 11] Biochemical and Biophysical Research Communications (US), vol.68, p.1133, 1976 [Documento no patente 12] Journal of Organic Chemistry (US), 1958, vol.23, p. 359-330
DIVULGACIÓN DE LA INVENCIÓN Es un objeto de la presente invención suministrar un método para producir eficientemente escilo-inositol de alta pureza a partir de una mezcla líquida que contiene escilo-onositol y azúcares neutros diferentes al escilo-inositol.
Más aún, los inventores de la presente invención han considerado que con el fin de producir el escilo-inositol eficientemente a partir de una mezcla líquida que contiene escilo-inositol y azúcares neutros tales como mio-inositol que se obtiene mediante la reducción de escilo-inososa, es ventajoso formar un complejo de escilo-inositol/ácido bórico. Sobre la base de tal consideración, los inventores de la presente invención han estudiado extensamente un método de llevar eficientemente solo el escilo-inositol en una mezcla líquida que contiene escilo-inositol y mio-inositol en tal complejo de escilo-inositol/ácido bórico. Como resultado, ellos han encontrado que el complejo de escilo-inositol/ácido bórico que consiste de escilo-inositol, ácido bórico, y un ión metálico tiene una asociación específica y es un complejo que tiene baja solubilidad que es diferente de otros complejos de azúcares neutros. Adicionalmente, los inventores han encontrado que el complejo de escilo-inositol/ácido bórico se forma efectivamente y se precipita al: agregar ácido bórico y una sal metálica en cantidades de dos veces moles o más, preferiblemente dos veces a tres veces más que aquellas del escilo-inositol disuelto en una mezcla líquida; y mantener la solución en un condición alcalina de pH 8.0 a 11.0, preferiblemente pH 9.0 a 10.0. Bajo tales condiciones, el complejo de escilo-inositol/ácido bórico se forma de una mezcla líquida que contiene escilo-inositol y azúcares neutros tal como mio-inositol. Luego, el complejo se disuelve en un ácido, seguido mediante la purificación utilizando una resina de intercambio de ión o un disolvente orgánico soluble en agua, y de esta manera se produce eficientemente el escilo-inositol.
Así, se ha completado la presente invención.
Esto es, la presente invención suministra lo siguiente.
(1) Un método para producir un escilo-inositol purificado que comprende:
Una primera etapa de precipitación de un complejo escilo-inositol/ácido bórico agregando ñacido bórico y un sal metálica a una mezcla líquida que contiene escilo-inositol y un azúcar neutro diferente a escilo-inositol en una cantidad dos veces o más veces el número de moles de escilo-inositol disuelto en la mezcla líquida, y ajustando el pH de la mezcla l´iiquida a 8.0 hasta 11.0;
una segunda etapa de separación del complejo a partir de la mezcla líquida;
una tercera etapa de disolución del complejo separado en ácido para escindorlo en escilo-inositol y ácido bórico; y
una cuarta etapa para aislar y purificar el escilo-inositol a partir de la solución ácida o suspensión ácida obtenidad en la tercera etapa, en donde la sal metálica que se va a gregar es de una o más clases de sales metálicas selecciondas del grupo consistente de NaCl, NaHCO3, Na2CO3, Na2SO4, NaHSO4, NaH2PO4, Na2HPO4, Na3PO4, borax, KCl, KHCO3, K2CO3, K2SO4, KHSO4, KH2PO4, K2HPO4, K3PO4, MgCl2, MgCO3, y MgSO4.
- (2)
- El método de acuerdo con (1), en donde, en la primera etapa, las cantidades de ácido bórico y sal metálica que van a ser añadidas es no menor de dos veces, y no más de tres veces el número de moles del escilo-inositol disuelto en la mezcla líquido.
- (3)
- El método de acuerdo con (1), en donde, en la primera etapa, el pH de la mecla líquida se ajusta de 9.0 a 10.0.
- (4)
- El método de acuerdo con (1), en donde la mezcla líquida que contiene el escilo-inositol y el azúcar neutro deiferente al escilo-inositol es una mezcl líquida que contiene mio-inositol y escilo-inositol obtenido reduciendo la escilo-inososa en uan solución que contiene escilo-inososa.
- (5)
- El método de acuerdo con (1), en donde, en la tercera etapa, la solución ob tenida por disolución del complejo en ácido se ajusta a una solución ácida de 0.1 N o superior; y, en la cuarta etapa, la solución ácida se pone en contacto con una resina de intercambio iónico ácida fuerte, y con una resina de intercambio iónico básica fuerte, y con una resina de absorción selectiva de ácido bórico, y luego el escilo-inositol es precipitado desde la solución ácida.
- (6)
- El método de acuerdo con (1), en donde, en la cuarta etapa, el escilo-inositol es precipitado agregando un solvente orgánico acuoso a la solución ácida o a la suspensión ácida.
- (7)
- El método de acuerdo con (6), en donde el solvente orgánico acuoso es etanol o metanol; y el etanol se agrega en un volumen de 0.3 a 3 veces mayor, o el metanol se agrega en un volumen de 0.3 a 5 veces mayor, que el de la solución ácida o la suspensión ácida.
- (8)
- El método de acuerdo con (6), en donde el solvente orgánico acuoso es etanol o metanol; y el etanol se agrega en un volumen de 0.6 a 1.5 veces mayor, o el metanol se agrega en un volumen de 0.9 a 2 veces mayor, que el de la solución ácida o la suspensión ácida.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Fig. 1 muestra una lista esquemática del principio de producción del escilo-inositol mediante combinación de enzimas.
Descripción de las realizaciones preferidas
Se puede obtener un cristal de escilo-inositol puro mediante otro método de purificación, tal como el descrito posteriormente, que comprende: preparar un complejo de escilo-inositol/ácido bórico al agregar ácido bórico NaCl a la solución que contiene escilo-inositol obtenido mediante cultivo; filtrar y separa el complejo de escilo-inositol/ácido bórico. Permitir que el ácido bórico sea liberado al agregar un ácido; y cristalizar el escilo-inositol al agregar un disolvente orgánico tal como metanol.
Método para producir escilo-inositol de una mezcla líquida que contiene escilo-inositol y azúcares neutros diferentes al escilo-inositol.
La presente invención se relaciona con un método para producir escilo-inositol de una mezcla líquida que contiene escilo-inositol y azúcares neutros diferentes de escilo-inositol.
<4-1>
Una realización del método de la presente invención es un método para producir escilo-inositol purificado, que comprende: una primera etapa de forma un complejo de escilo-inositol/ácido bórico al agregar ácido bórico y una sal metálica en un cantidad de dos veces o más aquella del escilo-inositol disuelto en un mezcla líquida que contiene el escilo-inositol y ácido neutro diferente del escilo-inositol y ajustar el pH de la mezcla líquida a 8.0 a 11.0; una segunda etapa de separar el complejo de una mezcla líquida; una tercera etapa de equilibrar el escilo-inositol y el ácido bórico al disolver el complejo separado en un ácido ; y una cuarta etapa de aislar y purificar el escilo-inositol de una solución ácido o una suspensión ácida obtenida de la tercera etapa.
La primera etapa del método de producción es una etapa de formar un complejo de escilo-inositol/ácido bórico al albergar ácido bórico y una sal metálica en una cantidad de dos veces o más que aquella escilo-inositol disuelto en un mezcla líquida que contiene el escilo-inositol y el ácido neutro diferente del escilo-inositol; y ajustar el pH de la mezcla líquida 8.0 a 11.0.
Como se utiliza aquí, la “mezcla líquida que contiene el escilo-inositol y los azúcares neutros diferente del escilo-inositol” puede ser una solución o una suspensión. Además, puede ser aquella que contiene además sustancias diferentes “scilo-inositol y el azúcar neutro diferente del escilo-inositol”, o puede ser aquella que ya contiene una pequeña cantidad del complejo escilo-inositol/ácido bórico. Preferiblemente, los azúcares neutros a ser contenidos en la mezcla líquida incluyen azúcares neutros tales como: terrosa, pentosa, hexosa y heptosa.
Ejemplos de estos incluyen: aldosa tales como glucosa, fructuosa, y la lactosa; cetosa; varios isómeros de inositol; y poli alcoholes tales como glicerol y etilenglicol. Aquí, ejemplos de isómeros de inositol incluyen: mio-inositol. D-quiro-inositol, L-quiro-inositol, epi-inositol, muco-inositol, allo-inositol, cis-inositol, y neo-inositol.
De aquellos, puede ser preferiblemente utilizado mio-inositol. En este caso, la “mezcla líquida que contiene el esciloinositol y los azúcares neutro diferente del escilo-inositol” incluye, por ejemplo, una mezcla líquida que contiene el escilo-inositol y mio-inositol que se obtiene mediante la reducción de escilo-inososa como se describe adelante.
Para la escilo-inososa que va a ser utilizada para la reacción de reducción, por ejemplo, se puede utilizar una obtenida al oxidar mio-inositol utilizando un microorganismo en un medio o una solución (JP-A-2003-102492). La escilo-inososa obtenida mediante oxidación microbiana se puede utilizar al disolver el purificador o un filtrado o cultivo de este. Mientras tanto, se puede utilizar la escilo-inososa preparada al oxidar el mio-inositol utilizando un catalizador de platino.
Un agente reductor ha sido utilizado para la reducción de la escilo-inososa en el escilo-inositol no está particularmente limitado en tanto que este sea un agente reductor capaz de reducir la escilo-inososa en escilo-inositol en agua. Ejemplos de estos incluyen borohidruro de sodio, borohidruro de litio, borohidruro de potasio, borohidruro de trimetoxi sodio, y borohidruro de sodio cianado.
La reacción de reducción de la escilo-inososa se puede detectar, por ejemplo, al agregar un polvo o una solución de un agente reductor a una solución que contiene escilo-inososa disuelta a una concertación de 20% o menos (p/b). La solución se agita preferiblemente en este momento. El calor se puede generar debido a la acción de reducción, por lo tanto la solución de su reacción se controla preferiblemente por tener una temperatura de 50° C o inferior con el fin de evitar la descomposición de la inososa generada. Adicionalmente, cuando se utiliza un agente reductor tal como borohidruro de sodio, una parte del agente reductor se puede descomponer para generar gas hidrógeno. Por lo tanto, se agrega un agente antiespumante o similar preferiblemente para reducir la formación de espuma del gas hidrógeno.
Una mezcla líquida que contiene el escilo-inositol y escilo-inositol obtenido de la reducción de la escilo-inososa, el escilo-inositol inicia cristalizar gradualmente cuando su concertación excede aproximadamente 1.6% (p/b). En general, la reducción del 5% (p/b) de la solución de escilo-inososa genera aproximadamente 3% (p/b) de mio-inositol y aproximadamente 2% (p/b) de escilo-inositol. Sin embargo, cuando la solución se deja a temperatura ambiente durante varias horas, aproximadamente 0.4% de una parte sobre saturada del escilo-inositol comienza a cristalizar. Por lo tanto, cuando la mezcla líquida de escilo-inositol y el mio-inositol obtenida de la reducción de la escilo-inososa se utiliza, la etapa de formar un complejo de escilo-inositol/ácido bórico se sitúa preferiblemente antes de la generación del cristal del escilo-inositol mismo. La etapa de formar el complejo de escilo-inositol ácido bórico se efectúa preferiblemente inmediatamente después de la reacción de reducción de la escilo-inososa.
La primera etapa se efectúa al agregar ácido bórico y sales de metal en “mezcla líquida que contiene el escilo-inositol y los azúcares neutro diferente del escilo-inositol” tal como la anteriormente descrita “mezcla líquida que contiene esciloinositol y mio-inositol” en una cantidad de dos veces o más moles, preferiblemente dos veces o más moles pero tres veces o menos moles mayores que el escilo-inositol disuelto en la mezcla líquida, con respectivamente, y después de
que ellos se han disuelto, ajustando la mezcla líquida para ser alcalina a pH de 8.0 a 11.0., preferiblemente pH de 9.0 a
10.0. El término “dos veces moles” como se utiliza aquí se refiere a un número de moles de dos veces el pH de la solución de reacción se puede ajustar utilizando una base tal como NaOH, KOH, Na2CO3 o K2CO3.
Aquí, ejemplos de sales metálicas a ser agregadas incluyen una o más clases de sales metálicas seleccionadas del grupo que consisten en NaCl, NaHCO3, Na2CO3, Na2SO4, NaHSO4, NaH2PO4, NaHPO4, Na3PO4, bórax KCL, KHCO3, K2CO3, K2SO4, KHSO4, KH2PO4, K2PO4, K3PO4, MgCl2, MgCO3, y MgSO4. La cantidad de ácido bórico a ser agregada si la mezcla líquida ya contiene ácido borico, es de dos veces más moles, preferiblemente dos veces o más pero tres veces
o menos moles que el escilo-inositol disuelto
La primera etapa se lleva acabo preferiblemente con agitación para disolver eficientemente el ácido bórico y las sales de metal en la mezcla líquida y elaborar la solución homogénea luego del ajuste del pH. La etapa se efectúa preferiblemente a una temperatura que baria de 5°C a 85°C, preferiblemente 15° a 40° C. El tiempo necesario para la etapa no está particularmente limitado en tanto que la cantidad requerida del complejo de escilo-inositol/ácido bórico se forma, sin embargo, 12 a 76 horas son preferibles con el fin de recolectarla con un rendimiento del 90% o mayor.
La mayor parte del complejo de escilo-inositol/ácido bórico existe como un precipitado en la mezcla líquida en la zona este tiene una solubilidad de 0.01% (p/b) o menos en agua como se confirmo por medio de RMN. En la segunda etapa, el complejo de escilo-inositol/ácido bórico se separa de la mezcla líquida. Una operación de separación sólida general se puede aplicar a la etapa, por ejemplo, se puede aplicar una operación de filtración u operación separación centrífuga. El escilo-inositol dejado en la mezcla líquida en la cual el complejo de escilo-inositol/ácido bórico se ha separado por medio de la etapa anterior tienen una concentración 0.2% (p/b) o menos. Por lo tanto, la mayor parte del escilo-inositol en la mezcla líquida antes de la iniciación de la reacción se puede recolectar en una forma de complejo de esciloinositol/ácido bórico. Mientras tanto, los azúcares neutros tal como el mio-inositol existe en un estado disuelto en una solución. Por lo tanto, los azúcares neutros existen en un filtrado luego de una operación de filtración, y así lo azúcares neutros y el escilo-inositol se puede separar mediante la etapa.
El complejo de escilo-inositol/ácido bórico separado se puede secar y aislar como a un polvo. Si es necesario, este también se puede aislar como un cristal por medio de recristalización utilizando agua caliente.
Luego, la tercera etapa involucra la disolución del complejo de escilo-inositol/ácido bórico separado en un ácido. La disolución enciende el complejo de escilo-inositol/ácido bórico en escilo-inositol y ácido bórico, y los Iones de metal unidos al complejo también se disocian de este en una solución. La clase de un ácido que va ser utilizada para disolución en la etapa no está particularmente limitada en tanto en que este se pueda disolver el complejo, sin embargo un ácido que no forma una sal que tiene una baja solubilidad dependiendo de la clase de ión metálico es deseable. Preferiblemente, los ácidos minerales tales como el ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico se pueden utilizar y el ácido clorhídrico puede ser utilizado más preferiblemente. En razón a que aquellos ácidos dan cada uno origen a una reacción de neutralización con los Iones de metal generados mediante la disolución, este es preferiblemente ajustado de tal manera que una solución que contiene el complejo de escilo-inositol/ácido bórico se vuelve se convierte finalmente en una solución ácida de 0.1 N o mayor. También, para disolver eficientemente el complejo de escilo-inositol/ácido bórico, el complejo es disuelto preferiblemente con un ácido de 1 N o mayor para finalmente hacer una solución ácida de 0.1 N o mayor.
La cuarta etapa involucra el aislamiento y la purificación del escilo-inositol de la solución ácida o la suspensión ácida obtenida de la tercera etapa. El método de aislar y purificar el escilo-inositol de la solución ácida no esta particular mente limitado. Sin embargo, por ejemplo, un método que comprende utilizar una resina tal como una resina de intercambio de ión como se describe adelante o un método que utiliza la diferencia el solubilidad, se puede utilizar un disolvente orgánico.
Adicionalmente se puede usar un método que comprende la destilación en vació como un Ester de un alcohol inferior y ácido bórico al agregar un alcohol inferior después de liberar ácido bórico (Journal of Chemistry, vol.23, p.329-330, 1958).
De estos métodos, el método de aislar y purificar el escilo-inositol utilizando una resina de intercambio de guión. Se puede efectuar como sigue. En este caso, la solución obtenida de la tercera etapa es preferiblemente una solución ácida de 0.1 N o mayor en la cual el complejo se disuelve completamente en este. También, la solución ácida se prepara preferiblemente al agregar un ácido en una cantidad tal que la proporción del complejo de escilo-inositol/ácido bórico en esta se vuelve 2.5 (p/b) % o menos, con el fin de no precipitar el escilo-inositol libre.
Primero, la solución ácida es puesta en contacto con una resina de intercambio de ión ácido fuerte para remover de esta manera los Iones de metal. La resina de intercambio de ión de ácido fuerte a ser utilizada no está particularmente limitada en tanto en que esta absorba los iones de metal y un ejemplo de esta incluye una resina de intercambio de ión que tiene un grupo sulfato. Un ejemplo de esta incluye el tipo Duolite C20H+ (elaborado por Sumitomo Chemical Co., Ltd.). El contacto se puede efectuar mediante una operación que comprende la visión en forma de tanda de resina de
intercambio de ión de ácido fuerte en una cantidad dada de la solución luego agitada. Sin embargo, es preferible que la solución se pase a través de la resina de intercambio de ión de ácido fuerte cargada en un columna.
Luego, la solución de la cual se remueven los iones de metal por medio de la resina de intercambio de ión de ácido fuerte se pone en contacto con la resina de intercambio de ión de base fuerte o una resina absorbedora de ácido bórico con el fin de remover el ácido bórico. Aquellas resinas no están particularmente limitadas en tanto que ellas absorban ácido bórico. Un ejemplo de resina de intercambio de ión de base fuerte incluye una resina que tiene un grupo de amonio cuaternario, y un ejemplo de resina que absorbe ácido bórico incluye una resina que tiene un grupo Nmetilglucamina. Un ejemplo específico de la resina de intercambio de ión de base fuerte incluye el tipo Duolite A 116 OH- (elaborada por Sumitomo Chemical Co., Ltd.). Un ejemplo específico de resina que absorbe ácido bórico incluye escilo-inositol Duolite ES371N (elaborada por Sumitomo Chemical Co., Ltd.). El contacto se puede efectuar mediante una operación que comprende la edición en forma tanda de una resina de intercambio ión en una cantidad dada de la solución y luego agitarla. Sin embargo, es preferible que la solución se agregue a la resina de intercambio de ión cargada en una columna.
El orden de las resinas con la cual la solución es puesta en contacto no es aleatorio por que el ácido bórico y el esciloinositol se disocian uno del otro en un estado ácido. Las soluciones son puestas en contacto con la resina de intercambio de ión de ácido fuerte, la resina de intercambio de ión de ácido fuerte, y la resina de absorción de ácido bórico, en este orden.
Una solución en la cual los iones de metal y el ácido bórico son removidos al ser puestos en contacto con aquellas resinas contienen solamente escilo-inositol que es un azúcar neutro. Por lo tanto, al concentrar la solución utilizando un método real para precipitar el escilo-inositol, se puede aislar un cristal o polvo del escilo-inositol purificado.
Además, en una cuarta etapa, en un caso donde el escilo-inositol se aísla y purifica utilizando la diferencia en solubilidad a un disolvente orgánico, se puede efectuar como sigue. En el método, se obtiene una solución mediante la disolución con el ácido utilizado en la tercera etapa puede ser una solución disuelta o una suspensión porque la operación de purificación que utiliza las resinas de intercambio o similares no se efectúa hasta la adición del disolvente orgánico después de la disolución. En la tercera etapa con el fin de facilitar que el escilo-inositol se precipite después de la disolución, el ácido se agrega preferiblemente en tal cantidad que la proporción del complejo escilo-inositol/ácido bórico 2.5% (p/v) o más, preferiblemente 3.0% a 10% (p/v), más preferiblemente 4.0% a 6.0% (p/v).
Primero, un disolvente orgánico soluble en agua se agrega a la solución o suspensión de ácido obtenida para permitir que el escilo-inositol libre o se precipite. El disolvente orgánico al ser utilizado muestra particularmente delimitado en tanto que este sea un disolvente que le permita a un escilo-inositol precipitarse mientras que el ácido bórico se disuelve y las sales de metal que consisten del ácido y la sal se disuelven. Ejemplos de tal disolvente orgánico incluyen etanol y metanol.
La cantidad del disolvente orgánico es como sigue: cuando se utiliza etanol, el etanol se agrega preferiblemente en una cantidad de 0.3 a 3 veces más, más preferiblemente 0.6 a 1.5 veces más que la solución ácida. Cuando se utiliza metanol el metanol se agrega preferiblemente en una cantidad de 0.3 a 5 veces más, más preferiblemente 0.9 a dos veces más que aquella de la solución ácida. En particular, el disolvente orgánico se agrega deficientemente en la cantidad anterior cuando la sal de metal a ser utilizada para formar el complejo de escilo-inositol/ácido bórico, es una o más NaCL, NaHCO3 y Na2CO3. Además, se ajusta una mezcla agregada con el disolvente orgánico acuoso preferiblemente para ser una solución ácida de 0.1 N o más.
En la cuarta etapa, cuando una mezcla es una solución homogénea, no es necesario efectuar agitación, sino cuando una mezcla es una suspensión, es preferible efectuar agitación. La temperatura de mezclar no está particularmente delimitada en tanto que esta sea una temperatura en la cual solamente el escilo-inositol se precipita, sin embargo una temperatura de -10°C a 50°C es preferible y una temperatura de 4°C a 35°C es más preferible. El tiempo de mezclar es preferiblemente 10 minutos a 24 horas, más preferiblemente 3 a 5 horas.
Tal operación permite que solamente el escilo-inositol se precipite. El escilo-inositol precipitado se puede separar de la solución por medio de filtración o una operación de separación solido-liquido general tal como una separación centrífuga. Así el escilo-inositol obtenido es puro, sin embargo, el escilo-inositol se puede obtener como un cristal por medio de un método tal como re cristalización si es necesario. El escilo-inositol precipitado puede además ser purificado utilizando un intercambio de resina de ión o similar después de ser disuelto en agua, para implementar de esta manera su pureza.
Ejemplos
En lo sucesivo, la presente invención será descrita específicamente en referencia a los ejemplos.
Ejemplo 1 (Comparativo)
<Método para producir escilo-inositol (escala pequeña)>
3 L de u medio líquido que contiene 10.0% de mio-inositol, 1.0% de extracto de levadura, y 1.0% de sacarosa se ajusta a un pH 7.0 con 1N NaOH, y el medio se dispenso en alícuotas de 100 ml en 30 piezas de recipientes cónicos con volumen de 500 ml, seguido por esterilización utilizando una autoclave. Un ciclo de platino de un cultivo inclinado de una cepa Aceto bacteria sp. AB 10281 (FERM BP-10119) inoculo a cada uno de los recipientes cónicos, y el microorganismo se cultiva a 27°C durante 5 días en un agitador rotatorio. Después del cultivo, se agregan 250 ml de agua a uno de los recipientes cónicos, y la mezcla se agita durante 1 hora en un agitador rotatorio para disolver el escilo-inositol cristalino generado en la solución del cultivo. La solución de cultivo se recolecta y centrifugo (8,000 rpm 20 minuto), y el sobrenadante obtenido se definió como una solución sobrenadante de cultivo (10.2 L).
La solución sobrenadante del cultivo se analiza mediante cromatografía líquida de alto desempeño bajo las siguientes condiciones. El resultado revela que 12.6 mg/ml (129 g, tasa de conversión 43%) de escilo-inositol se genera en la solución sobrenadante de cultivo. En la solución sobrenadante del cultivo, 2.1 mg/ml de escilo-inososa permaneció, mientras que el mio-inositol no se detecta.
Las condiciones de análisis de la cromatografía líquida de alto desempeño son como sigue.
Columna: Wakosil 5NH2 (4.6 250 mm)
Temperatura de Columna: 40°C
Detector: RI DETECTOR ERC-7515 A (ERMA CR.INC.)
Volumen de inyección: 5 µl
Solvente: Acetonitrilo-agua = 4:1
Tasa de flujo: 2 ml/min
Tiempo de elución: escilo-inososa; 11.6 minutos
Mio-inositol; 17.8 minutos
Escilo-inositol; 18.2 minutos
La tasa de conversión anteriormente descrita de escilo-inositol se calcula mediante la siguiente ecuación.
Tasa de conversión (%) = {(Número de moles de escilo-inositol en sobrenadante de cultivo)/(Número de moles de mioinositol antes de cultivo)} x 100
Luego, la solución de sobrenadante de cultivo se pasa a través de una columna formada al conectar una columna (diámetro interno 5 cm, longitud 40 cm) rellena por 500 ml de una resina de intercambio de catión de ácido fuerte, Duolite (marca registrada) C-20 (tipo H+) (elaborada por Sumitomo Chemical Co., Ltd.) con una columna (diámetro interno 5 cm, longitud 16 cm) rellena con 200 ml de carbón activado, y luego 500 ml de agua intercambiada con ión se pasa a través de la columna para lavarla. La solución de flujo de paso y la solución de lavado se pasaron entonces a través de una columna (diámetro interno 7 cm, longitud 40 cm) rellena con 1,000 ml de una resina de intercambio de anión básica fuerte, Duolite (marca registrada) A116 (tipo OH+) (elaborada por Sumitomo Chemical Co., Ltd.), y luego 1,000 ml de agua con intercambio de ión se pasa a través de la columna para lavarla. Se encontró que la solución de flujo pasante obtenida y la solución de lavado de agua incluyo pocas impurezas diferentes del escilo-inositol descrito anteriormente.
La solución obtenida se concentra hasta aproximadamente 700 ml bajo presión reducida, y 3 veces el volumen de etanol se agrega a esta. Luego, a la mezcla se le permite estar a 5°C durante toda la noche y en los cristales incoloros resultantes de escilo-inositol puro se filtraron y secaron, para de esta manera dar un rendimiento de 118 g de esciloinositol. El rendimiento de recuperación de purificación fue del 92% y la tasa de recuperación total del escilo-inositol proveniente del mio-inositol fue del 39%.
Ejemplo 2 (Comparativo)
<Método para producir escilo-inositol (gran escala)>
40 L de medio líquido que contiene 10.0% de mio-inositol, 1.0% de extracto de levadura, y 1.0% de sacarosa se vertieron en un fermentador con jarro de 50-L y el pH se ajusta a 7.0 con 1N NaOH, seguido por la esterilización utilizando una autoclave. 400 ml de Acetobacter sp. AB 10281 (FERM BP-10119), que se había cultivado en un medio que tiene la misma composición (recipiente cónico), se inoculo y cultivo a 27°C durante 5 días a una tasa de aeración de un vvm y una agitación de 200 rpm. Después el cultivo, 60 L de agua caliente (aproximadamente 50°C) se agrega a aproximadamente 40 L de la solución de cultivo recolectada, y la mezcla se agita durante 1 hora para disolver el esciloinositol cristalino que había estado presente en la solución de cultivo. La solución de cultivo se sometió a centrifugación continua (8,000 rpm) para remover las células, y la solución resultante se definió como una solución de la cual el microorganismo cultivado se había removido (aproximadamente 100 L).
La solución de la cual el microorganismo cultivado se había removido se analiza mediante cromatografía líquida de alto desempeño. El resultado revela que 16.8 mg/ml (1.68 kg, tasa de conversión 42%) de escilo-inositol se genera en la solución de la cual el microorganismo cultivado se había removido. En la solución de la cual el microorganismo cultiva se había removido, 2.9 mg/ml de escilo-inososa permanecieron, mientras que no se detecta mio-inositol. La condición de análisis de la cromatografía líquida de alto desempeño es la misma que aquella del ejemplo 1.
Luego, 400 g de hidróxido de sodio se agregan a 100 L de la solución obtenida, y la mezcla se calentó con agitación a 98°C durante 1 hora. Posteriormente, 560 g de hidróxido de sodio, 1,340 g de ácido bórico, 1,260 g NaCl se agregaron y se disolvieron mientras que la mezcla estaba caliente. Después se detuvo la agitación, el calor de la solución se libero, y la solución se le permite permanecer hasta que la temperatura alcanzo 23°C (aproximadamente 24 horas).
Luego, la solución se filtró para aislar los cristales de un complejo de escilo-inositol/ácido bórico formado en el líquido, y los cristales fueron lavados con agua hasta que ellos se volvieron blancos. Los cristales resultantes (aproximadamente
3.9 kg) fueron llevados a otro recipiente, y se agregan a este 5.9 L de agua y 1.95 L de ácido clorhídrico al 37%, seguido por agitación. 30 minutos más tarde, para precipitar el escilo-inositol que fue liberado del ácido bórico mediante tal procedimiento, 9.4 L de metanol se agregaron, y la mezcla se agita adicionalmente durante 1 hora.
Luego, la solución se filtró para aislar el escilo-inositol/ácido bórico del líquido, y los cristales fueron lavados con 1 L de metanol al 50%. Los cristales de polvo fino resultantes (aproximadamente 1.8 kg) se llevaron a otro recipiente, y se agrega a este 10 L de agua seguido por ebullición con agitación durante 1 hora. Posteriormente, la solución se enfría a 20°C con agitación y luego se filtra, para producir de esta manera cristales finos de escilo-inositol. Después de secar
1.35 kg de cristales incoloros de escilo-inositol puro se obtuvieron. El rendimiento de recuperación fue de 80%, mientras que la tasa de recuperación total de escilo-inositol proveniente de mio- inositol fue de 34%.
Ejemplo 3 (Comparativo)
Identificación de los microorganismos que producen escilo-inositol basada en la secuencia de nucleótido del 16SrARN
Las secuencias de nucleótidos de 16SrARN se analizaron para 4 cepas microbianas que consisten de 3 cepas naturales aisladas, AB 10285, AB 10286, y AB 10287, que tienen cada una la capacidad de convertir el mio-inositol en esciloinositol, y AB10281 obtenido de AB10253, de acuerdo con el método convencional. Más específicamente, se extrajo un ADN genómico de las células cultivadas, y luego los fragmentos de ADN correspondientes se prepararon mediante PCR utilizando cultivadores que fueron diseñados con el fin de amplificar 1.6 kbp de 16SrARN, seguido por análisis de aproximadamente 1.3 kbp de las secuencias (HokkaidoSystem Science Co., Ltd.). Los resultados de las secuencias fueron comprobados contra la base de datos para identificar las especies relacionadas.
La tabla 2 muestra los resultados comparados, las homologías, y las tasas de conversión en escilo-inositol al cultivar los microorganismos de la misma manera que el ejemplo 1.
Identificación de cepas microbianas mediante análisis de la secuencia de nucleótido
Tabla 2
- Nombre de la cepa
- Nombre de los microorganismos identificados Homología Tasa de conversión
- AB10281
- Acetobacter cerevisiae, Acetobacter malorum 99.93% 40.0%
- AB10285
- Acetobacter cerevisiae, Acetobacter malorum 99.78% 4.5%
(continuación)
- AB10286
- Burkholderia andropogonis 98.12% 2.6%
- AB10287
- Burkholderia andropogonis 98.04% 1.4%
Los resultados revelaron que las 4 cepas microbianas que tiene cada una la habilidad de convertir mio-inositol en esciloinositol se pueden dividir ampliamente en 2 grupos. Como el primer grupo, AB 10281 y AB 10285 se identificaron como Acetobacter cerevisiae o Acetobacter malorum, mientras que el segundo grupo, AB 10286 y AB 10287, se identificaron como Burkholderia andropogonis.
Ejemplo 4
<Aislamiento de mio-inositol 2-dehidrogenasa independiente de ADN+ proveniente de Acetobacter sp. AB10253>
3 g de mio-inositol, 1 g de extracto de levadura (FNI205: elaborado por Lallemand BI), y 0.5 g de glucosa se agregan a un recipiente cónico con un volumen de 500 ml y se disolvieron en agua de tal manera que la mezcla tiene un volumen de 100ml, y la solución se ajusta a un pH de 5.0, seguido por esterilización utilizando una autoclave. De acuerdo con tales procedimientos, 4 piezas de los recipientes de medio se prepararon. Un ciclo de platino de Acetobacter sp. AB10253 proveniente de un cultivo inclinado se agrega a cada medio, y el microorganismo se precultiva a 27°C durante 2 días utilizando un agitador rotatorio.
Luego, 1.2 kg de mio-inositol, 0.4 kg de extracto de levadura (FNI205: elaborado por Lallemand BI), y 0.2 g de glucosa se agregan a un jarro fermentador de 50 L y se disolvieron en agua de tal manera que la mezcla tiene un volumen de 40
L. la solución se ajusta a un pH de 5.0, seguido por esterilización utilizando una autoclave. Aproximadamente 400 ml de una solución microbiana de Acetobacter sp. AB10253 precultivada se agrega a este, y el microorganismo se cultiva a 27°C durante 3 días a una tasa de aeración de 1wm y una agitación de 200 rpm.
Después del cultivo, las células fueron obtenidas como precipitadas utilizando un centrifugador continuo. Las células obtenidas fueron re suspendidas en 2 L de agua, y las células lavadas se obtuvieron mediante centrifugación y se suspendieron en 2 L de 20 mM de amortiguador Tris (pH 7.0). Luego, se aplicaron ondas ultrasónicas a la suspensión para romper las células. La solución de lisis de célula se centrifuga para precipitar las células rotas, y las células rotas se obtuvieron como precipitadas. Los precipitados se suspendieron al agregar 500 ml de 20 mM de amortiguador Tris (pH 7.0), 0.6% Triton X-100 (elaborado por Kodak), y las enzimas se extrajeron a 15 °C durante 3 horas. Después de eso, la suspensión fue centrifugada, y se tomaron 420 ml del sobrenadante (solución de enzima cruda).
420 ml de la solución de enzima cruda se concentraron a 150 ml utilizando un ultra filtro (MW 30,000 corte), y la solución concentrada se pasa a través de una columna Toyopearl de 400 ml-DEAE equilibrada con 20mM de amortiguador Tris (pH 7.0) para absorber proteínas. Luego una solución con un gradiente de concentración lineal de 0 mM a 500 mM de NaCl en 20 mM de amortiguador Tris (pH 7.0) que no contiene en su activo (volumen total 1.6 L) se pasa a través de una columna adsorbida con proteínas a una tasa de 10ml/min para eluir las proteínas. En la eluida se fracciona en fracciones de 40 ml. Luego, 600 ml de 20 mM de amortiguador Tris (pH 7.0) que no contiene surfactante se pasa a una columna de nuevo para lavado, y luego una solución con un gradiente de concentración lineal de 0 mM a 500 mM de NaCl en 20 mM de amortiguador Tris (pH 7.0) que contiene 0.1% de Triton X-100 (volumen total 1.6 L) se pasa a través de una columna de una tasa de 10 ml/min para eluir las proteínas. El eluido se fracciona en fracciones de 40 ml.
La actividad de la enzima de cada fracción se mide mediante un método estándar: esto es, el cambio en la absorbancia a 600 nm de 1 ml de una solución que contiene 50 µl de la solución de proteína, 100 ml de amortiguador de fosfato (pH 5.0), 5 mg de mio-inositol, y 0.4 mg de 2,4-dicloroindofenol (DCIP oxidado) fue calculado en una tasa de reacción, y la actividad para oxidar 1 µmol de mio-inositol por minuto se definió como una unidad.
Los resultados revelaron que la enzima blanco fue eluida en fracciones de solución que contienen 20 mM de amortiguador Tris (pH 7.0) que contiene 0.1% de Triton X-100 y 100 a 170 mM de NaCl. Luego, estas fracciones (249 ml) se recolectaron y se concentraron a 30 ml utilizando un ultra filtro (MW 30,000 corte), y 100 ml de 20 mM de amortiguador Tris (pH 7.0) que contiene 0.1% de triton X-100 se agregan a esta. La solución se concentra adicionalmente a 30 ml, y 70 ml de 20 mM de amortiguador Tris (pH 7.0) se agrega a la solución concentrada para desalinización.
Luego, la solución de enzima así preparada se pasa a través de una columna de 100 ml de hidroxiapatita equilibrada con 20 mM de amortiguador Tris (pH 7.0) que contiene 0.1% de triton X-100 para adsorber las proteínas. Posteriormente una solución con un gradiente de concentración lineal de 0 mM a 500 mM de amortiguador de fosfato (pH 7.0) en amortiguador Tris (pH 7.0) que contiene 0.1% de triton X-100 (volumen total 400 ml) se pasa a través de la
columna con proteína adsorbida a una tasa de 3 ml/min para eluir las proteínas. El eluado se fracciona en cada una de las fracciones de 10 ml, y se mide la actividad de la enzima de cada fracción.
Los resultados revelaron que la enzima blanco se diluye en fracciones en fracciones de solución que contienen 20 mM de amortiguador Tris (pH 7.0) que contiene 0.1% de Triton X-100 y 100 a 170 mM de amortiguador de fosfato. A la solución de enzima así obtenida se encontró que contiene escino-inositol 2-dehidrogenasa independiente de ADN+ casi pura. Luego, las fracciones (40 ml) se recolectaron y se concentraron en 5 ml utilizando un ultra filtro (MW 30,000 corte), y 100 ml de 20 mM de amortiguador Tris (pH 7.0) se agrega. La solución se concentra adicionalmente a 5 ml, seguido por desalinización.
La solución concentrada así preparada se pasa de nuevo a través de una columna de Toyopearl de 20 ml-DEAE (elaborada por Tosoh Corporation) equilibrada con 20 mM de amortiguado Tris (pH 7.0) que contiene 0.1% Triton X-100 para adsorber proteínas. Luego, una solución con un gradiente de concentración lineal de 50 mM a 250 mM de NaCl en 20 mM de amortiguador Tris (pH 7.0) que contiene 0.1% Triton X-100 (volumen total 160 ml) se pasa a través de una columna adsorbida a una tasa de 1 ml/min para eluir las proteínas. El eluado se fracciona en fracciones cada una de 4 ml. Después del fraccionamiento, la actividad de la enzima de cada fracción se midió, y cada fracción que tiene la actividad se sometió a electroforesis SDS.
Como resultado, la electroforesis SDS revela las bandas de proteínas que se co relacionan con la actividad de la enzima de la enzima blanco. La remoción de las bandas de proteínas derivada de las fracciones que no tienen actividad revelaron que la enzima blanco fue la enzima que contiene al menos pesos moleculares de 76 k Dalton y aproximadamente 46 k Dalton.
Mientras tanto, las fracciones que tienen la actividad de enzima tuvieron color rojo, y el patrón de espectro UV revela que las fracciones contenían citocromos C. más aún, el contenido de la proteína blanco y la absorbancia del citocromo se reveló que 1 mol de la enzima blanco contiene un mol de citocromo C.
Para medición del pH optimo, la actividad de enzima se mide mientras cambio un amortiguador y el valor de pH. Como el amortiguador, se utiliza 100 mM de amortiguador de fosfato (pH 3 a 8), 100 mM de amortiguador Tris (pH 7 a 8), y 100 mM de amortiguador de carbonato (pH 8 a 11). Los resultados revelaron que la enzima blanco tiene la actividad máxima a pH 4.5 a 5.5. más aún, al medir la actividad estándar (100 mM de amortiguador de fosfato (pH 5.0)), varios iones de metal pesado (Sn2+, Mn2+, Mg2+, Cu2+, Fe, Zn2+, Co2+, Pb2+, Ca2+, Cd2+, y Ni2+) se agregaron, y se reveló que la enzima blanco se inhibió específicamente por el ión Sn2+. La actividad de la enzima se inhibió en la presencia de 1 mM de ión Sn2+ a 1% o menos de la actividad de la absencia de ión Sn2+.
Mientras tanto, se confirmó que la enzima blanco es una enzima extraída con Triton X-100 de una fracción de membrana, y que la enzima extraída oxida al mio-inositol en la presencia de DCIP reducido, mientras que no ocurre absorción de oxigeno en la ausencia de DCIP. Los hechos significan que la enzima se acopla al sistema de transporte de electrón de la membrana de célula en un cuerpo vivo para quitar los electrones del mio-inositol para generar el escilo-inositol.
La especificidad del sustrato de la enzima blanco se determinó al medir la actividad de la enzima en una solución que contiene varios azúcares en lugar de mio-inositol a una concentración final de 50 mM. Mientras tanto, el valor –km se mide al medir la actividad de enzima para cada azúcar al cual esta enzima muestra la actividad que mientras está cambiando la concentración de azúcar. Más aún, la reacción de oxidación los productos de reacción de oxidación fueron analizados mediante HPLC para determinar que sustancias fueron generadas. La medición se efectuó mediante las siguientes condiciones de HPLC: se utiliza una columna de Wacosil 5NH2 < 4.6 x 250 mm (temperatura de columna 40°C) como una columna, 80% de acetonitrilo como una fase móvil (tasa de flujo 2 ml/min), y un detector RI como detector.
Como resultado, se encontró que la enzima blanco reacciona con D-quiro-inositol (actividad relativa 100%: Km =8.8 mM), muco-inositol (actividad relativa 68%: Km = 14.5 Mm), y mio-inositol (actividad relativa 53%: Km = 20mM) para convertirlos a D-quiro-1-inososa, L-quiro-2-inososa, y silo-inososa, respectivamente. Se encontró que la enzima no reacciona con allo-inositol, escilo-inositol, L-quiro-inositol, L-quiro-inositol, y glucosa.
Ejemplo 5 (Comparativo)
Conversión de mio-inositol en escilo-inososa mediante mio-inositol 2-deshidrogenasa independiente de NAD +.
De la misma manera que en ejemplo 4, se efectuó la purificación utilizando un fermentador con jarro de 40 L, y 5ml de una solución de enzima obtenida mediante la purificación y desalinización con una columna de hidroxiapatita de 100 ml se definió como una solución de enzima, que se utiliza en la siguiente reacción de conversión.
30g de mio-inositol (166.7 m mol) y 15 ml de amortiguador de fosfato 1M (pH 5.0) se agregan a un tubo centrífugo de 400 ml, y la mezcla se diluye a 300 ml con agua para disolver el mio-inositol. 1 ml de enzima a 30°C y 8 g de DCIP reducido (sal Na) se agrega gradualmente a la solución con agitación. Después de la desaparición del color azul derivada del DCIP reducido, materia blancas insolubles generadas con la desaparición del color azul (DCIP oxidado) se precipitaron mediante centrifugación, y el sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo microcentrífugo de 400 ml. Luego, la solución se ajusta a un pH de 5.0 con ácido fosfórico 1 N, y 8 g de DCIP reducido (sal de Na) se agrega adicionalmente con agitación. El procedimiento se repite 6 veces para agregar un total de 48 g de DCIP reducido (sal de Na), y al tiempo de la desaparición del color azul se agregaron finalmente 3 g de DCIP reducido (sal de Na). A la mezcla se le permite permanecer durante una hora y se centrifuga y se tomo el sobre nadante. Tales procedimientos produjeron 292 ml de sobrenadante. Los procedimientos tomaron 8 horas.
Luego, el sobrenadante resultante se pasa a través de una columna llena con 100 ml de resina de intercambio de ión de ácido fuerte (duolite C20, tipo H+) una tasa de flujo de 5 ml/min, y eluato resultante paso a través de una columna llena con 150 ml de resina de intercambio de ión de base de (Duolite 368S, tipo - OH). Más aun el eluado resultante se pasa a través de una columna llena con 50 ml de carbono activado. El eluado resultante se concentro, para producir de esta manera 26.5 g (148.9 m mol) de polvo blanco (rendimiento 89%). La sustancia se analiza mediante RMN y HPLC, y se encontró que la sustancia contiene 99% de escilo-inositol y 1% de mio-inositol.
Ejemplo 6 (Comparativo)
Selección de acetobacter sp. AB 10253 de mutantes basados en la actividad mio-inositol 2-dehirogenasa independiente de NAD+.
5 ml de un medio líquido (pH 5.0) que contiene 1% de extracto de levadura (fabricado por Difco laboratorios) y 0.5 % de glucosa en un tubo de ensayo se esteriliza, y un ciclo de platino de acetobacter sp. AB 10253 de un cultivo inclinado se agregan a este, seguido mediante agitación del cultivo a 27°C durante 6 horas. 2.5 ml de una solución de cultivo se tomo a un tubo esterilizado y se centrifuga a 3.000 x g para recolectar las células. El sobrenadante se descarta de las células, fueron re suspendidas en 2.5 ml de 200 mM de solución de amortiguador de fosfato (pH 8.0). 2 ml de la suspensión se vertieron en un recipiente esterilizado, y 0.5 ml de expulsión de glucosa 40% y 7.5 ml de amortiguador de fosfato 200 mM (pH 7.0), se agregan y se mezclan. A la mezcla, se agregan 20 µl de etilmetalosulfonato y se expone la agitación de un cultivo a 30°C durante 45 minutos. Después del tratamiento, se lleva 1 ml de la mezcla a un tubo esterilizado y se centrifuga a 3.000 x g para recolectar las células. El sobrenadante se descarta, y las células fueron suspendidas en 2.5 ml de 200 mM de amortiguador de fosfato (pH 7.0), seguido por la centrifugación a 3.000 x g para recolectar las células. El sobrenadante se descarta y las células fueron re suspendidas en 2.5 ml de 200 mM de amortiguador de fosfato (pH 7.0), para producir de esta manera una solución que contienen un microorganismo tratado con mutación.
Luego, el acetobacter sp. AB 10253 es tratado con mutación se inoculo al rociar 0.12 ml de la solución que contiene el microorganismo tratado con mutación sobre medio de agar preparado al solidificar un medio esterilizado (pH 5.0) que contiene 3% de mio-inositol, 1% de extracto de levadura (elaborado por Difco laboratorios), 0.5% de glucosa y 1.5 % de agar en un plato de 9 cm, y el cultivo se efectuó a 27°C durante 2 días. Aquellos procedimientos redujeron el conteo viable a aproximadamente 1.6%. Mientras tanto, se formaron aproximadamente 95 a 125 colonias por disco.
Después del cultivo, sobre las colonias formadas en un plato de 9 cm, se vertieron 10 ml de una solución viscosa lentamente las cuales se habían preparado al esterilizar por filtración una solución que tienen como composición de 100 mM de amortiguador de fosfato, 1% de mio-inositol, y 0.4% de DCIP oxidado y se agrega a este un volumen igual de 1% de solución de agar esterilizada con un autoclave muestras este estuvo caliente, enfriamiento a 36°C con el fin de inhibir la solidificación del agar. En medio de agar que se había sometido a tales tratamientos se enfrió lentamente a 27°C para ser solidificado y puesto en capas sobre las colonias conformadas en un disco de 9cm.
Después del tratamiento el disco se incubó a 27°C y luego se observó que el color azul del DCIP oxidado que se había esparcido todo sobre el medio de agar comenzó gradualmente a volverse transparente solo alrededor de las colonias que dependen del grado de actividad del mio-inositol 2-deshidrogenasa independiente de NAD+. En ese momento, las colonias en la posición donde el color se volvió más rápidamente transparente fueron peladas mediante una aguja esterilizada y subcultivadas en un medio fresco. Todas las 2154 colonias se sometieron a una solución primaria, para obtener de esta manera 22 cepas que tienen alta actividad de mio-inusitol 2-hidrogenasa independiente de NAD+.
Luego, para la selección secundaria, las 22 cepas así obtenidas que formaron las colonias fueron individualmente inoculadas a 5 ml de un medio líquido esterilizado (pH 5.0) que contiene 3% de mio-inositol, 1% de extracto de levadura (fabricada por Difco laboratorios), y 0.5% de glucosa en un tubo de ensayo. La agitación del cultivo se efectuó a 27°C durante 3 días y luego 1 ml de la solución del cultivo se lleva a un tubo de ensayo seguido por centrifugación a 3.000 x g para recolectar las células. El sobrenadante se descarta, y 1 ml de una solución que contiene 10% de mio-inositol, 50mM de amortiguador de fosfato (pH 5.0) se agregaron al tubo de ensayo que contiene las células seguido por la agitación del cultivo a 27°C durante 24 horas. Luego, la centrifugación se efectuó a 16.000 x g y la tasa de conversión del mio-inositol en escilo-inososa en el sobrenadante se mide mediante HPLC. De otra parte, 0.5 ml de la solución del
cultivo (5 ml) se lleva a un tubo esterilizado y se centrifuga a 3.000 x g, y se descarta el sobrenadante. Las células obtenidas como precipitados fueron lavados con agua, y se mide la actividad de mio-inositol 2-deshidrogenasa independiente de NAD+.
Como resultado, en tres cepas (cepa No. E6-55, H2-68, y B7-14) entre las 22 cepas mutantes, la actividad del mioinositol 2-hidrogenasa independiente de NAD+ se incrementa unas 3 veces o más después de la mutación y la actividad se incrementa 1.6 veces, 2.2 veces y 2.8 veces respectivamente. Mientras tanto, la tasa de conversión del mio-inositol en escilo-inososa se incrementa 1.1- veces, 1.4 veces, 1.5 veces, respectivamente, y la tasa de conversión del mioinositol en escilo-inososa de las cepas que tienen 1.3 veces o menos de actividad de mio-inositol 2-deshidrogenasa independiente de NAD+ fue igual a aquella de los microorganismos antes de mutación. Los resultados revelaron que la selección basada en la actividad de mio-inositol 2-deshidrogenasa independiente de NAD+ se correlaciona con el incremento en la tasa de conversión del mio-inositol en escilo-inososa.
Ejemplo 7 (Comparativo)
Producción de esilo-inososa mediante conversión de mio-inositol en escilo-inososa utilizando la cepa mutante (B7-14).
10 g de mio-inositol, 1 g de extracto de levadura (FNI1205: fabricado por Lallemand BI), y 0.5 g de glucosa se agregan a un recipiente cónico con un volumen de 500 ml y se disolvieron en agua de tal manera que la mezcla tiene un volumen de 100 ml y la solución se ajusta a un pH de 5.0, seguido por esterilización ocupando un autoclave. De acuerdo con tales procedimientos, 20 recipientes de un medio (que corresponde a 2 L: mio-inositol 200 g (1.11 m mol)) se prepararon. Un ciclo de platino de la cepa mutante (B7-14) de un cultivo inclinado se agregan a cada medio, y la bacteria se cultiva a 27°C durante tres días utilizando un agitador rotatorio.
Después del cultivo, la solución del cultivo se centrifuga, y el sobrenadante resultante fue pasado a través de una columna llena con 500 ml de un ácido fuerte de una resina de intercambio de ácido fuerte (Duolite C20, tipo H+) a una tasa de flujo de 10 ml/min. El eluado obtenido se pasa a través de una columna llena con 900 ml de resina de intercambio de ión de base débil (Duolite C368S, tipo OH-), y el eluado resultante se pasa adicionalmente a través de una columna llena con 50 ml de carbón activado. El eluado resultante se convierte en un centro, para producir de esta manera 162 g (0.91 mol) de polvo blanco (rendimiento 82%). La sustancia se analiza mediante RMN y HPLC, y se encontró que la sustancia contenía 91% de escilo-inososa, 3% de mio-inositol, y 6% de escilo- inositol (ecilo-inososa de pureza de 91%).
Ejemplo 8 (Comparativo)
La producción de escilo-inositol mediante conversión y reducción química de mio-inusitol en escilo-inososa utilizando la cepa mutante (B7-14).
10g de mio-inositol 1g de extracto de levadura (FNI1205: fabricado por Lllemand BI), y 0.5 g de glucosa se agregan a un recipiente cónico con un volumen de 500 ml y se disolvieron en agua de tal manera que la mezcla tiene un volumen de 100 ml, y la solución se ajusta a un pH de 5.0, seguido por esterilización utilizando un autoclave. De acuerdo con tales contenidos, 200 recipientes de un medio (que corresponden a 2 L: mio-inositol 200 g (1.11 m mol)) se prepararon. En un ciclo de platino de la cepa mutante (B7-14) de un cultivo inclinado se agregan a cada medio y la bacteria se cultiva a 27°C durante 3 días utilizando un agitador rotatorio.
Después del cultivo, la solución de cultivos se centrifuga a 8.000 x g, y aproximadamente 2 L del sobrenadante resultante se ajustaron a un pH de 7.5 con una solución de NaOH 5N. 9.2 g de NaBH4 se agregan a la solución con agitación para efectuar una reacción de reducción. La temperatura de la solución de reacción se eleva a 37°C mediante el calor de la reacción. 80 minutos más tarde apareció materia insoluble gradualmente, y 1.2 L de agua se agregan a este para disolver casi toda la materia insoluble generada. La solución se filtró para remover la materia insoluble, y el filtrado se pasa a través de una columna llena con 500 ml de una resina de intercambio de ión de ácido fuerte (Duolite C20, tipo H+) a una tasa de flujo de 10 ml/min. El eluído resultante se pasa a través de una columna llena con 900 ml de una resina de intercambio de iones de base fuerte (Duolite A 116, tipo OH), y el eluado resultante se pasa a través de una columna llena con 300 ml de carbón activado. El eluado resultante se concentra para producir de esta manera 145 g de polvo blanco. La sustancia se analizó mediante HPLC, y se encontró que la sustancia contenía 36% de esciloinositol y 64% de mio-inositol.
El polvo resultante blanco se suspendió en agua con el fin de tener un resultado de 470 ml, y la suspensión se calienta a 70°C para disolver completamente en mio-inositol. La suspensión se enfrió a 30°C con agitación, y la solución blanca se filtró para recuperar la materia insoluble. La materia insoluble se lavo con una cantidad pequeña de agua y se seco, para rendir de esta manera con 44.2 g de polvo. La sustancia se analiza mediante HPLC, y se encontró que la sustancia contenía 98% de escilo-inositol y 2 % de escilo-inositol. Adicionalmente, 700 ml de agua se agregaron al polvo resultante, y la mezcla se calienta a 85°C para disolverse toda ella. La mezcla fue enfriada a 30°C con agitación, y 700 ml de etanol se agregan a esta. A la mezcla se le permite permanecer durante toda la noche a temperatura ambiente, y
luego los cristales resultantes se recolectaron mediante filtración y se secan, para rendir de esta manera 40.1 g (222.8 m mol) de cristales (rendimiento 20%). Los cristales fueron analizados mediante RMN y HPLC, y se encontró que la sustancia obtenida fue escilo-inositol que tiene una pureza del 99.9% o más.
Ejemplo 9 (Comparativo)
Purificación de escilo-inositol deshidrogenasa producida mediante Acetobacter sp. AB10281 FERM BP-10119.
3 L de un medio líquido que contiene 10.0% de mio-inositol, 1.0% de extracto de levadura, y 1.0% de sacarosa se ajustaron a un pH de 7.0 con NaOH con 1N, y el medio se dispenso en alícuota de 100 ml en 30 piezas de un recipiente cónico con volumen de 500 ml, seguido por esterilización utilizando una autoclave. Un ciclo de platino de un cultivo inclinado de acetobacter sp. AB1028 FERM BP-10119 de inoculo a cada recipiente cónico, y el microorganismo se cultiva a 27°C durante 5 días utilizando un agitador rotatorio (120 RPM). Después el cultivo, 250 ml de agua se agrega a cada recipiente cónico, y la mezcla se agita durante 1 hora utilizando un agitador rotatorio para disolver el escilo-inositol cristalino que había estado presente en la solución del cultivo. La solución del cultivo se recolecta y se centrifuga (8000 rpm, 20 minutos), para de esta manera producir células (peso húmedo 75 g).
Las células fueron suspendidas en 300 ml de agua y destruidas mediante onda ultrasónica a 10°C o menos. La solución de lisis indica un pH de 4.8, y la solución se ajusta a un pH de 7.0 con NaOH con 1N. Luego, la solución se centrifuga
(16.000 rpm, 20 minutos) para separar el sobrenadante. Luego, se agrega MgSO4 de tal manera que el sobrenadante contiene 2 mM Mg2 y la solución se cambia a una columna blue-Toyopearl (fabricado por Tosoh corporation: 20 ml). Luego, 50 ml de amortiguador de 20 mM de amortiguador (pH 7.0) y complementado con 2mM de Mg2+ se pasa a través de la columna para lavarla. Posteriormente 500 ml de 20 mM de un amortiguador (pH 7.0) complementado con 1 M de KCl se pasó a través de la columna para eluir las proteínas absorbidas. Luego, el eluado se concentra utilizando un ultra filtro (MW 30,000 cortes), y 50 ml de 20 mM de amortiguador Tris (pH 7.0) se agrega a la solución concentrada seguido por concentración de nuevo, para producir de esta manera una solución concentrada desalinizada. Posteriormente, la solución concentrada desalinizada se carga sobre una columna de DEAE Toyopearl (Tosoh corporation: 20ml), y la elusión se efectuó con una solución con un gradiente de concentración general de 0 mM a 500 mM NaCl en 20 mM de amortiguador Tris (pH 7.0). Luego, el eluado se fraccione fracciones. La actividad de la escilo-inositol deshidrogenasa de cada una de las soluciones fraccionadas se midió, y 3 fracciones, 1 fracción no absorbida (SIDH1), una fracción diluida con 200 mM de NaCl (SIDH2), y una fracción diluida con 300 mM (SIDH3), se encontró que tienen la actividad.
La actividad se mide como sigue: 5 µL de una solución de reacción (200 mM de amortiguador Tris (pH 8.0), 2% de NADPH, y 1% de escilo-inososa) y 5 µl de una solución de enzima se mezclaron y se les deja reaccionar a 36°C durante 30 minutos, y luego 500 ml de agua se agregaron inmediatamente, seguido por la medición de la absorbancia a 340 mM. La disminución en la absorbancia a 340 mM se mide con base en el valor blanco de la solución de prueba obtenida al utilizar agua en lugar de la solución de enzima. La solución de enzima, se diluye como se requería.
La fracción no absorbida de columna anteriormente descrita se carga adicionalmente sobre una columna CM Toyopearl (Tosoh corporation: 20 ml), y se efectuó la elusión con una solución con una gradiente de concentración lineal de o mM a 500 mM de NaCl in 20 mM de amortiguador Tris (pH 7.0). Luego, el eluado se fracciona en fracciones. La actividad de la escilo-inositol deshidrogenasa en cada una de las soluciones se midió, y la fracción no absorbida se encontró que tiene la actividad. La fracción diluida con 200 mM de NaCl y la fracción eluida con 300 mM se desalinizaron separadamente con un ultra filtro de nuevo, y se efectuó la dilución con una solución con un gradiente de concentración lineal de 200 mM de NaCl en 20 mM de amortiguador Tris (pH 7.0). Luego el eluado se fracciona en fracciones y se purifica. Luego, aquellas 3 soluciones de enzima que tienen la actividad de escilo-inositol deshidrogenasa se concentraron separadamente utilizando un ultrafiltro, y las soluciones concentradas se cargaron sobre una columna de filtración de gel (Tohso corporation: 2000 SWXL), respectivamente. Los eluados fueron purificados con 20mM de amortiguador de fosfato (pH 7.0) complementado con 200 mM de NaCl. Las soluciones de enzima así purificadas fueron sometidas a electroforesis de gel SDS, y el gel después de la electroforesis se tiño con una solución de teñido de azul brillante Coomasie (Rapid CBB KANTO: fabricado por Kanto chemical co., inc.), y luego se decolora. La pureza de las bandas se mide al medir las bandas azules de las proteínas utilizando un densitómetro (elaborado por ATTO corporation), y se encuentra que la pureza de cada fracción fue de 85% o más.
Ejemplo 10 (Comparativo)
Purificación de la enzima de la presente invención producida por Escherichia coli K12 ATCC 10798 y el análisis de su Nterminal.
3 L de un medio de caldo LB (1% Bacto-tripton, 0.5% de extracto de levadura, 1% de NaCl, pH 7.0) que contienen 0.5% de L-sorbosa se dispersaron en 100 ml de alícuotas en 30 piezas de recipientes Sakaguchi de 500 ml, seguido por esterilización utilizando un autoclave. El ciclo de platino de un cultivo inclinado de Escherichia coli K 12 se inoculó a cada recipiente cónico, y el microorganismo se cultiva a 36°C durante un día utilizando un agitador recipro (135 rpm). Después del cultivo, el medio de cultivos se recolecta y se centrifuga (8.000 rpm, 20 minutos), para producir de esta
manera células (de peso 32 g). Las células se re suspendieron en 100 ml de agua y se rompieron mediante ondas ultrasónicas 10°C. La solución de lisis indica pH 6.8, y la solución se ajusta a pH 7.0 con una solución de NaOH de 1N y luego se centrifuga (16000 rpm, 20 minutos) para separar el sobrenadante. Luego se agrega el MgSO4 de tal manera que el sobrenadante contiene 2 mM Mg2+, la solución se carga sobre una columna de Blue-Toyopearl (Tosoh corporation: 20 ml). Luego 50 ml de 20 mM amortiguador Tris (pH 7.0) complementado con 2 mM de Mg2+ se pasó a través de la columna para lavarla. Posteriormente, 50 ml de 20 mM de amortiguador Tris (pH 7.0) complementado con 1M de KCl se pasa por a través de la columna para eluir las proteínas absorbidas, luego, el eluado se concentra dando un ultra filtro (MW 30.000 cortes), y 50 ml de 20 mM de amortiguador Tris (pH 7.0), se agregan a la solución concentrada, seguido por concentración de nuevo, para reducir de esta manera una solución concentrada desalinizada. Luego, la solución concentrada desalinizada se carga sobre una columna de DEAE Toyopearl (Tosoh corporation: 20 ml), y la elusión se detecta con una solución con un gradiente de concentración lineal de 0 mM a 500 mM de NaCl en 20 mM Tris (pH 7.0). El eluado se fracciona en fracciones. La actividad del escilo-inositol deshidrogenasa de cada una de las soluciones fraccionadas se midió, y se encontró que la presión diluida con 300 mM tenía la actividad.
La medición de la actividad se efectuó de la misma manera que en el ejemplo 9 anterior, y la disminución en la absorbancia a 340 mM se mide. La solución de enzima se diluye según se requiera.
La fracción eluida con 300 mM de NaCl se desaliniza utilizando un ultra filtro de nuevo, y el resultante se recarga sobre una columna de DEAE Toyopearl (Tosoh corporation: 20 ml). Luego, la elusión se detecta por una solución por un gradiente de concentración lineal de 250 mM a 350 mM de NaCl en 20 mM de amortiguador Tris (pH 7.0), y la purificación se efectúa, al repetir la operación de fraccionar el eluado 3 veces para remover las proteínas contaminantes. Adicionalmente la solución de enzima que tiene una actividad de escilo-inositol deshidrogenasa se producen utilizando un ultrafiltro, y la solución concentrada se carga sobre una columna de filtración de gel (Tosoh corporation: 2000 SWXL). El eluado se purifica con 20 mM de amortiguador de fosfato (pH 7.0) complementado con 200 mM de NaCl.
La solución de enzima así purificada se sometió a electroforesis de slab-gel SDS, y luego el gel se extrae y las proteínas se transfirieron a una membrana PVDF (immobilon PSQ: fabricado por Millipore corporation) que tienen el mismo tamaño que aquella de gel que utiliza semielectroplotter (elaborado por Funakoschi Co., Ltd.). Luego, la membrana PVDF se saca y se tiñe con una solución de teñido azul brillante, (Rapid CBB KANTO: fabricado por Kanto chemical Co., inc.), y luego esta se descolora. La pureza se mide utilizando un densitómetro de la misma manera que el ejemplo 9, y la pureza fue del 40%. Más aún, la porción que corresponde a la proteína blanco se corta para remover las proteínas no deseadas alrededor de la porción, para de esta manera reproducir una enzima de la presente invención que tiene una alta pureza.
Luego, la enzima de la presente invención que tiene una alta pureza que existe sobre la membrana de PVDF se analiza utilizando un analizador de aminoácido N-terminal (Hewlett-packard company). Como resultado, una secuencia de serila- ácido aspartico-asparaginina-isoleucina-arginina se detecta. El ADN que codifica una proteína tiene tal secuencia se investigo de la base de datos sobre la secuencia completa de Escherichia coli (nombre de la base de datos “colibrí”), y el ydgj (o b1624 gen) coincidió. El producto del gen ydgj se había predicho como una de las oxidoreductasas, pero el sustrato y el producto eran desconocidos.
Ejemplo 11 (Comparativo)
Aislamiento y expresión del ADN de la presente invención derivado de Escherichia coli K12 ATCC10798.
Para obtener el gen ydgJ que se asumió que codifica la enzima de la presente invención, primero, el genoma completo de Escherichia coli 12 para ser utilizado como plantillas fue extraído como sigue. Un siclo de platino de Escherichia coli 12, que había sido cultivado en un medio de cultivo inclinado (1% bacto-tripton, 0.5% de extracto de levadura, 1% de NaCl, pH 7.0, 1.5% agar), se inoculo a 100 ml de un medio de un recipiente LB (1% de bacto-tripton, 0.5% de extracto de levadura, 1% de NaCl, pH 7.0) y se cultiva aeróbicamente por 8 horas a 36°C, seguido por recolección de células. Al glóbulo de células se agregan 15 ml de solución salina-EDTA (0.15 M de NaCl, 0.1 M de EDTA, pH 8.0) y 50 mg de lizosima, y las células fueron suspendidas, seguidas por reacción a 37°C durante 2 horas. Después del tratamiento 0.5 ml de una solución SDS de 25% se agrega a la solución para lizar completamente las células, y se agregaron 3 ml de fenol a las proteínas desnaturalizadas, seguidas por centrifugación. El sobrenadante se saca y se agregaron 20 ml de 2propanol a una solución para producir el ADN genómico crudo. El ADN genómico crudo producido se precipita mediante centrifugación, y el sobrenadante se remueve seguido por secado bajo presión reducida. El ADN genómico crudo seco se disolvió adicionalmente en 3 ml de solución T (10 mM Trish-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0), luego 0.01 Mg y luego se agrega 0.01 mg de RNasa, seguido por reacción a 36°C durante 2 horas para degradar el ARN. Luego, se agrega 0.01 mg de proteinasa K y a la mezcla se le deja reaccionar a 36°C durante 2 horas para degradar las proteínas. Luego, 1 ml de una solución mezclada de la unión cloro formo (1:1) se agrega y la mezcla se agita lentamente para desnaturalizar la ARNasa y la proteinasa K. la mezcla se separa en dos fases mediante centrifugación, y la capa superior (fase acuosa) se saca y se ajusta a un pH de 5.2 al agregar 0.3 ml de una solución de acetato de sodio 3M. Para la solución se agrega 3 ml de 2-propanol para producir ADN genómico. El ADN genómico obtenido se precipita mediante centrifugación y el sobrenadante se remueve, secado bajo presión reducida. El ADN genómico seco se disuelve en 3 ml de solución T, y el proceso de la operación de agregar 1 ml de una solución mezclada de fenol-cloroformo (1:1) a la operación de disolver
ADN en 3 ml de solución TE se repite de nuevo seguido por centrifugación. De la misma manera que anteriormente, se agrega un volumen igual de 2-propanol al sobrenadante a un pH de 5.2, para preparar de esta manera una solución de ADN genómico de Escherichia coli K 12. El ADN genómico así obtenido se utiliza como una solución de ADN plantilla para PCR.
Un fragmento de Escherichia coli K12 y contiene un sitio de unión de ribosoma (RBS) del gen ydgj se clona, y se efectuó PCR utilizando cebadores que tienen las siguientes secuencias para expresar el gen, una enzima recombinante.
SEQ ID No. 15: ydgj-F 5’-cattcaagcttaatgagaggcaatgacatgagcg-_3’
SEQ ID No. 16: ydgj-R 5’-tcggaaHcttcatgcaaggcacaaajcgc-3’
Para el PCR, la solución de reacción es Ex taq de Takara Shuzo co., Ltd. se utiliza y una solución que tiene una composición de 5 µl de 10 x Takara amortiguador Ex Taq, 4 µl de una mezcla de dNTP, 30 ng de un ADN plantilla, 1 µl de 10 µl de solución cebadora y 0.5 µl de Takara Ex Taq se prepararon al agregar agua de tal manera que esta tiene un volumen de 50 µl, seguido por capas de 30 µl de aceite mineral. Para la reacción, un ciclo de las 3 etapas: desnaturalización (94°C, 30 segundos), recocido (55°C, 1 minuto) y elongación (72°C, 1 minuto) se repite 35 veces utilizando un amplificador de PCR (ASTEC Co., Ltd., PC-_700). El PCR anteriormente descrito amplifica un fragmento de ADN que tiene un tamaño de aproximadamente 1.0 kbp. Después de la reacción, el aceite mineral en capas se extrae con 0.3 ml de hexano, y la capa de hexano se remueve. Este procedimiento se repite 3 veces, seguido por la reducción de la presión durante 1 minuto, para remover de esta manera el aceite mineral. Desde 50 µl de la solución de reacción así obtenida, el fragmento de PCR se purifica utilizando GENECLEAN (Bio 101). Específicamente, 300 µl de solución Nai incluida en el kit se agrega y se mezcla, y 10 µl de solución de glóbulos de vidrio se agregan y se mezclan. La mezcla se le permite permanecer a 4°C durante 15 minutos y se centrifuga para precipitar los glóbulos de vidrio al que el fragmento de ADN se absorbe, y se remueve el sobrenadante. 500 µl de una solución de lavado nueva incluida en el kit se agregaron adicionalmente para suspender los glóbulos de vidrio, y la mezcla se centrifuga aparte para remover el sobrenadante. La operación de lavado utilizando la solución de lavado nueva se repite 3 veces. Luego, los glóbulos se secan bajo presión reducida, y después del secado, se dejaron 15 µl de agua esterilizada para suspenderlos. La mezcla se calienta a 554°C durante 15 minutos y se centrifuga, para producir de esta manera 12 µl de sobrenadante que contiene el fragmento de ADN.
Una operación de insertar el fragmento de ADN purificado en un vector de expresión se efectuó como sigue. Específicamente, 0.5 µg de un plásmido de expresión (pUC 119: fabricado por Takara Shuzo co., ltd.), 1 µl de enzimas de restricción Hind III y EcoRI de Tajara Shuzo Co., ltd., y 2 µl de 10 x K de amortiguador de k, que es una enzima de restricción de Takara Shuzo co., ltd., se agregan a 10 µl de una solución de fragmento de ADN, y se agrega agua esterilizada de tal manera que la mezcla tenga un volumen de 20 µl, seguido por mezcla. La solución de reacción se le deja reaccionar a 36°C durante 2 horas. Después de la reacción que las enzimas de restricción, el fragmento de ADN y el vector de expresión fueron aisladas con GENECLEAN y ligadas uno al otro. Específicamente, 300 µl de la solución de NaI incluida en el kit se agrega y se mezcla en 20 µL de la solución de reacción de la enzima de restricción, y 10 µl de la solución de glóbulos de vidrio se agregan a esta y se mezclan. La mezcla se le permite permanecer a 14°C durante 15 minutos y luego se precipita para centrifugar los glóbulos de vidrio a los cuales el fragmento de ADN y el vector de expresión fueron absorbidos, y se remueve el sobrenadante. Luego, 500 µl de una solución de lavado nueva incluidos en el kit se agregan para suspender los glóbulos de vidrio y la suspensión se centrifuga para el sobrenadante. La operación de lavado utilizando una solución de lavado nueva se repite 3 veces. Luego, los glóbulos de vidrio se secan bajo presión reducida, y después del secado, 15 µl de agua esterilizada se agregan para suspenderlas. La mezcla se calienta a 55°C durante 15 minutos y se centrifuga, para producir 12 µl de sobrenadante que contiene y el vector de expresión. El procedimiento removió los fragmentos de ADN pequeños que tienen un tamaño de aproximadamente 50 bp o menos y fueron generados mediante enzimas de restricción, para producir de esta manera un fragmento de ADN de interés del vector de expresión.
10 µl de una solución del kit-1 Takara Ligation (Takara Shuzo Co., Ltd.) se agregan a 10 µl de la solución así preparada, y a la mezcla se le deja reaccionar a 164°C durante 1 hora. La solución se utiliza para transformar las células competentes (Takara Shuzo Co., Ltd.: DH5a). Específicamente, 5 µl de la solución de reacción de ligación se agregan a esta y se mezclaron en 60 µl de una solución de célula competente descongelada a 4°C, y dejada a 0°C durante 30 minutos, y luego a 42°C durante 45 segundos y a 0°C durante 2 minutos. 500 µl de una solución SOC (2% bactotriptona, 0.5% de extracto de levadura, 10 mM NaCl, 20 mM de glucosa, 10 mM de MgSO4, y 10 mM de MgCl2) se agregan a esta, seguido por el cultivo de recuperación a 36°C durante 1 hora. 100 µl de la solución de cultivo se aplico a un medio de agar LB (1.5% de bacto-triptona, 0.5% de extracto de levadura, 1% de NaCl, pH 7.0, 1.5% de agar) que contiene 50 µg/ml de ampicilina, 40 µg/ml X-gal (5-Bromo-4-Cloro-3-Indolil-�-D-Galactosido), y 1 mM de IPTG (tiogalactopiranosido). El cultivo se efectuó a más de 37°C durante 16 horas. El cultivo produjo Escherichia Coli transformada durante introducir el plásmido anteriormente descrito como colonias blancas, y fueron seleccionadas las colonias. Las colonias así separadas de la Escherichia Coli transformada en un medio de cultivo LB que contiene ampicilina (50 µg/ml). De las células cultivadas de la Escherichia Coli transformada, se separa un plásmido de ADN y se purifica utilizando un kit de purificación de plásmido (QIA filter Plasmid Midi Kit, QIAGEN). El ADN del plásmido así
obtenido se confirmo que tenía un fragmento de ADN que tenía un tamaño de aproximadamente 1.0 kbp, que corresponde a un gen ydgj de interés.
Luego, para confirmar la actividad del escilo-inositol deshidrogenasa, las cepas microbianas aisladas como colonias se transfirieron a 100 µl de un medio ofLB (1% de bacto-triptono, 0.5% de extracto de levadura, 1% NaCl, pH 7.0) que contienen 50 µg/ml de ampicilina, y ellos se cultivan a 36°C durante 7 horas. 0.3 ml de 200 mM de solución de tiogalactopiranosido se agrega a la solución de cultivo, y las células fueron adicionalmente cultivadas a 36°C durante 3 horas. Después de completar el cultivo, las células fueron recolectadas mediante centrifugación y lavadas con solución salina fisiológica una vez. Luego, las células lavadas fueron suspendidas en 3 ml de de 0.6% de solución de Tritón X100, y las células fueron rotas mediante ondas ultrasónicas a 4°C. La solución se centrifuga, y se sacaron 2.8 ml del sobrenadante (solución de enzima). 1.2 de sulfato de amonio se agregaron al sobrenadante para salinizar las proteínas a 4°C. Las proteínas salinizadas fueron recolectadas mediante centrifugación (15,000 rpm, 20 min), y se remueve el sobrenadante. Los precipitados fueron disueltos en 2.5 ml de 20 mM de amortiguador de Tris (pH 7.0), y la solución se centrifuga (15,000 rpm, 20 min) de nuevo. El sobrenadante se aplico sobre una columna de Sefadex G-25 (farmacia K.K.: 14 ml) equilibrada con 20 mM de amortiguador Tris (pH 7.0). La elución se efectuó con 20 mM de amortiguador Tris (pH 7.0), y el eluado se desaliniza. Los procedimientos produjeron 3.5 ml de una solución de enzima cruda del producto de gen ydgj.
La actividad de la escilo-inositol deshidrogenasa se mide como sigue: 5 µl de solución de reacción (200 mM de amortiguador Tris (pH 8.0), 2% NADPH, y 1% de escilo-inososa) y 5 µl de una solución de enzima se mezclaron y se les deja reaccionar a 36°C durante 30 minutos, y luego 500 ml de agua se agregaron inmediatamente, seguido por la medición de la absorbancia a 340nm. La disminución en la absorbancia a 340 nm se mide con base en un valor blanco para la solución de prueba obtenida al utilizar agua en lugar de solución de enzima. La solución de enzima se diluye como se requería.
Mientras tanto, el producto de la reacción de enzima se mide como sigue: 10 mg de escilo-inososa, 40 mg de NADPH, y 10U de enzima se les deja reaccionar en 1.0 ml de 100 mM de amortiguador Tris (pH 8.0) a 36°C durante 4 horas, y el tratamiento con calor se efectuó a 80°C durante 10 min, seguido por enfriamiento. Luego, 100 µl de una resina de intercambio de catión de base fuerte, 100 ml de una resina de intercambio de anión de ácido fuerte, y 10 µg de un carbón activado, se agregaron, y la mezcla se agita y se centrifuga. Luego, el sobrenadante se diluye 2 veces, y se efectuó la medición mediante HPLC (Shodex Asahipak NH2P-50 4E F 4.6 250 mm: Shodex) utilizando un detector RI bajo la condición de una columna de 40°C y una tasa de flujo de fase móvil de 1.5 ml (80% de acetonitrilo). Como un resultado, el producto de gen ydgj se encontró que tiene una actividad alta de escilo-inositol dehidrogenasa, y 100% del producto fue escilo-inositol obtenido mediante reducción, mientras el mio-inositol que es un isómero de este no se detecta. Como resultado, la solución de una enzima recombinante derivada del gen ydgj se encontró que tiene una alta actividad de escilo-inositol dehidrogenasa, y el producto del gen fue escilo-inositol dehidrogenasa. Mientras tanto, en el producto obtenido mediante la solución de reacción de escilo-inososa, solamente se detecta escilo-inositol, y se encontró que la enzima reduce estéreo específicamente la escilo-inososa en escilo-inositol. Mientras tanto, la secuencia del gen ydgj se muestra en la SEQ ID NO: 1, y la secuencia del amino ácido que corresponde a este se muestra en la SEQ ID NO: 2.
Ejemplo 12 (Comprativo)
<Aislamiento y expresión del ADN homologo estimado de homología con el gen ydgj de Escherichia Coli, y propiedades de esta>
De la estimación de la estructura tridimensional del gen ydgj producto del Escherichia Coli basado en la secuencia de amino ácido, el producto se estimo que pertenece a la familia de las oxidoreductasas glucosa-fructosa. La familia también incluye mio-inositol 2-dehidrogenasa (EC 1.1.1.18), y la secuencia involucrada en una unión de NAD en la secuencia de amino ácido se encontró que tiene alta homología. Más aún, la identificación de la secuencia de amino ácido de un sitio involucrado en el sustrato que según el análisis de estructura de rayos X de la oxidoreductasa de glucosa-fructosa y la investigación de las proteínas que tienen parcialmente la misma secuencia de aminoácido y son homólogas con el producto de gen ydgj revelaron que hay proteínas homólogas en muchas bacterias gran-negativas y bacterias gran-positivas.
De aquellas bacterias, los ADN homólogos fueron investigados con base en la homología del gen ydgj de Escherichia Coli. Como resultado, el gen ydgj de Escherichia Coli se encontró que tiene homología con el gen Atu4375 y el Atu3234 en el genoma de Agrobacterium tumefacience C58 ATCC33970, BG14057 en el genoma del Bacillus subtilis 168ATCC238S7, Xcc3438 en el gen de genoma de Xanthomonas campestris pv. campestris ATCC33913, y el gen Atu4375 y el gen Atu3234 el gen en genoma de Agrobacterium sp. AB 10121 FERM P-17383 este es conocido como un microorganismo que tiene la capacidad de convertir directamente mio-inositol en escilo-inositol. Por lo tanto, aquellos ADN fueron aislados y expresados.
Para obtener los ADN candidatos anteriormente descriptos, los genomas totales de Agrobacterium tumefacience C58 ATCC33970, Bacillus subtilis 168 ATCC23857, Xanthomonas campestris pv. campestris ATCC33913, y Agrobacterium
sp. AB10121 FERM P-17383 a ser utilizados como plantillas fueron extraídos como sigue. Para el Agrobacterium tumefacience C58, Xanthomonas campestris pv. campestris, y Agrobacterium sp. AB10121, un ciclo de platino de cada Agrobacterium tumefacience C58, Xanthomonas campestris pv campestris, y Agrobacterium sp. AB 10121 que habían sido cultivado en el medio de cultivo inclinado LB (1% bacto-triptona, 0.5% extracto de levadura, 1% NaCl, pH 7.0, 1.5% de agar) se inocularon en 100 ml de un medio de recipiente LB (1% bacto-triptona, 0.5% extracto de levadura, 1% NaCl, pH 7.0) y cultivado aeróbicamente durante 18 horas a 27°C y recolectados. 15 ml de solución salina EDTA (0.15 M NaCl, 0.1 M EDTA, pH 8.0) y 50 mg de lisozima se agregan a los glóbulos de célula para suspenderlos, seguidos por reacción a 374°C durante 2 horas. Después del tratamiento, 0.5 ml de una solución al 25% de SDS se agregan a la solución para lisar completamente las células, y se agregaron 3 ml de fenol para desnaturalizar las proteínas. Posteriormente, se centrifuga la solución, y el sobrenadante se saco. se agrega 20 ml de 2-propanol a la solución para producir un ADN genómico crudo. El ADN genómico crudo producido se precipita mediante centrifugación, y el sobrenadante se remueve, seguido por secado bajo presión reducida. Posteriormente, el ADN genómico crudo seco se disolvió adicionalmente en 3 ml de solución TE (10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0), y luego 0.01 mg de ARNasa se agrega a este para permitir la reacción a 36°C durante 2 horas para degradar el ARN. Más aún, 0.01 mg de proteinasa K se agrega y se le deja reaccionar a 36°C durante 2 horas para degradar las proteínas. Luego, 1 ml de solución mezclada fenol-cloroformo (1:1) se agrega, y la mezcla se agita lentamente para desnaturalizar la ARNasa y la proteinasa K. La mezcla se separa en dos fases mediante centrifugación, y la capa superior (fase acuosa) se saca y se ajusta a un pH 5.2 al agregar 0.3 ml de una solución de acetato de sodio 3 M. 3 ml de 2-propanol se agregan a la solución para producir ADN genómico. El ADN genómico se obtenido se precipita mediante centrifugación, y el sobrenadante se remueve, seguido por secado bajo presión reducida. El ADN genómico seco se disuelve en 3 ml de Solución TE, y el proceso de la operación de agregar 1 ml de la solución mezclada de fenol-cloroformo (1:1) a la operación de disolver ADN en 3 ml de la solución TE se repite de nuevo, seguido por centrifugación. Luego, de la misma manera que anteriormente, un volumen igual de 2-propanol se agrega al sobrenadante a un pH 5.2, para preparar de esta manera soluciones de ADN genómicos de Agrobacterium tumefacience C58, Xanthomonas campestris pv. campestris, y Agrobacterium sp. AB 10121, respectivamente. Los ADN genómicos así obtenidos fueron utilizados como soluciones de ADN plantillas para PCR.
Un ciclo de platino de Bacillus subtilis 168 ATCC23857 que se había cultivado en un medio de cultivo inclinado LB (1% bacto-triptona, un 0.5% extracto de levadura, 1% NaCl, pH 7.0, 1.5% de agar) se inocularon en 100 ml de un medio de recipiente LB (1% bacto-triptona, 0.5% extracto de levadura, 1% NaCl, pH 7.0) y se cultiva aeróbicamente a 36°C durante 18 horas. Luego, 1 ml de medio se agregan a 100 ml de medio de frasco LB preparado como anteriormente, y los microorganismos se cultivaron durante 4 horas, seguido por recolección. Después de recolección, se extrajo el genoma total de la misma manera que en el método utilizado para Agrobacterium.
Luego, se efectuó PCR utilizando los cebadores que tiene las siguientes secuencias para clonar el gen Atu4375 y el gen Atu3234 en el genoma del Agrobacterium tumefacience C58, gen Atu4375 y gen Atu3234 en el genoma del
Agrobacterium sp. AB10121, y el gen Xcc3438 en el genoma de Xanthomonas campestris pv. campestris (incluyendo todos los RBS), para expresarlos como enzimas recombinantes.
SEQ ID No. 17: Atu4375-F 5’-ggcggatccmgaaagggatagtcatgtcct-3’
SEQ ID No. 18: Atu4375-R 5’-attggaagcttcgaggctgcoacctag-3’
SEQ ID No. 19: Atu3234-F 5’-ttgggatccmcaggggaaatanatggc-3’
SEQ ID No. 20: Atu3234-R 5’-gccgcaagcttgttttacagcttcac-3’
SEQ ID No. 23: Xcc3438-F 5’-tcggaattcgcgttgcggtgaatcgttttcaatg-3’
SEQ ID No. 24: Xcc3438-R 5’-ataagaagcttgctcagtcgctgctgttgccttc-3’
Se efectuó PCR utilizando cebadores que tienen la siguientes secuencia para clonar el gen BG14057 en el genoma de Bacillus subtilis 168 (incluyendo RBS) para expresarlo como una enzima recombinante. La "a" en la posición 10 del terminal 5’- es originalmente "t" pero es alterada a "a" para expresión en Escherichia coli.
SEQ ID No. 21: BG14057-F 5’-aggaattcgatgataacgcttttaaaggggagaa-3’
SEQ ID No. 22: BG14057-R 5’-tttctgcagmagtgctccagcataatggttcg-3’
Para PCR, la solución de reacción Ex taq deTakara Shuzo Co., Ltd. se utilizo, y la solución que tiene una composición de 5 µl de 10 X amortiguado Takara ExTaq, 4 µl de una mezcla dNTP, 30 ng de Un ADN plantilla, 1 µl de 10 µM de solución cebadora, y 0.5 µl de Takara ExTaq se prepara al agregar agua de tal manera que esta tiene un volumen de 50 µl, seguido por capas de 30 µl de aceite mineral. Para la reacción, un ciclo de tres etapas: desnaturalización (94°C, 30 segundos), recocido (52°C, 55°C, o 58°C (Ver Tabla 3), 1 minuto), y elongación (72°C, 1 minuto), se repite 35 veces utilizando amplificador PCR (ASTEC Co., Ltd., PC-700). El PCR anteriormente descrito amplifica un fragmento ADN que tiene un tamaño de aproximadamente 1.1 kbp.
- Tabla 3: Lista de temperatura de recocido
- Genes blancos
- Temperatura de recocido
- Para el gen Atu4375 de Agrobacterium tumefacience C58 ATCC33970
- 55°C
- Para el gen Atu4375 de Agrobacterium AB 10121 FERM P-17383
- 55°C
- Para el gen Atu3234 de Agrobacterium tumefacience C58 ATCC33970
- 52°C
- Para el gen Atu3234 de Agrobacterium AB 10121 FERM P-17383
- 52°C
- Para el gen BG 14057 de Bacillus subtilis 168 ATCC23857
- 55°C
- Para el gen Xcc3438 de Xanthomonas compestris pv. Campestris ATCC33913
- 58°C
5 Después de la reacción, el aceite mineral en capas se extrae con 0.3 ml de hexano, y la capa de hexano se remueve. Este procedimiento se repite tres veces, seguido por reducción de la presión durante un minuto, para remover de esta manera el aceite mineral. De 50 µl de una solución de reacción así obtenida, se purificaron Fragmentos de PCR utilizando GENE-CLEAN (Bio101). Específicamente, 300 µl de una solución Nal incluido en el kit se agrega y se mezcla, y 10 µl de solución de glóbulos de vidrio se agregan y se mezclan. La mezcla se permitió permanecer a 4°C durante 15
10 minutos y se centrifuga para precipitar los glóbulos de vidrio a los cuales se adsorbieron los fragmentos de ADN, y el sobrenadante se remueve. 500 µl de una solución de lavado nueva incluido en el kit se agrega adicionalmente para suspender los glóbulos de vidrio, y la mezcla se centrifuga para remover el sobrenadante. La operación de lavado utilizando una solución de lavado nueva se repite tres veces. Luego, los glóbulos de vidrio se secan bajo presión reducida, y después del secado, se agregan 15 µl de agua esterilizada para suspenderlos. La mezcla se calienta a 55°C
15 durante 15 minutos y se centrifuga, para producir de esta manera 12 µl de un sobrenadante que contiene fragmentos ADN.
Una operación de insertar el fragmento de ADN purificado en un vector de expresión se efectúa en cada una de las combinaciones como sigue. Específicamente, 0.5 µg de un plásmido o de expresión (pUC118: elaborado por Takara Shuzo Co.,Ltd.)), 1 µl de dos clases de enzimas de restricción de Takara Shuzo Co., Ltd., y 2 µl de 10 X amortiguador K,
20 que es una solución de amortiguador de enzima de restricción de Takara Shuzo Co., Ltd., se agregan a 10 µl de una solución de fragmento de ADN, y se agrega agua esterilizada de tal manera que la mezcla tiene un volumen de 20 µl, seguido por la mezcla. La solución de reacción se le deja reaccionar a 36°C durante 2 horas. Como el gen Atu3234 y la cepa AB10121 contienen el sitio HindIII, el tratamiento con enzimas de restricción no se condujo, y después el aislamiento, se liga a un vector pT7Blue (elaborado por Novagen).
- Tabla 4: Lista de plásmidos de expresión y enzimas de restricción utilizadas
- Genes blancos
- plásmidos de expresión Enzimas de restricción utilizadas
- Gen Atu4375 de A.tume.C58
- pUC118 BamH I, Hind III/K amortiguado
- Gen Atu4375 de AB10121
- pUC 118 BamH I, Hind III/K amortiguado
- Gen Atu3234 de A.tume.C58
- pUC 118 BamH I, Hind III/K amortiguado
- Gen Atu3234 de AB 10121
- pT7Blue No utilizado
- Gen BG14057 de B.sub.168
- pUC118 EcoR I, Pst I/H amortiguado
- Gen Xcc3438 de X. camp.
- pUC118 EcoR I, Hind III/K amortiguado
Después la reacción de las enzimas de restricción, fragmento ADN y vector de expresión fue aislados con GENE-CLEAN y se ligaron una al otro. Específicamente, 300 µl de una solución de Nal incluido en el kit se agregan a 20 µl de la solución de reacción de enzima de restricción y se mezclo, y 10 µl de la solución de glóbulos de vidrio se agrega y se mezcla. La mezcla se deja permanecer a 4°C durante 15 minutos y luego y se centrifuga para precipitado los glóbulos de vidrio a los cuales el fragmento ADN y vector de expresión fueron absorbidos, y el sobrenadante se remueve. Más aún, 500 µl de una solución de lavado nueva incluido en el kit se agregan para suspender los glóbulos de vidrio, y la suspensión se centrifuga para remover el sobrenadante. La operación de lavado utilizando la solución de lavado nueva se repite tres veces. Luego, los glóbulos de vidrio fueron secaron bajo presión reducida, y después del secado, se agregan 15 µl de agua esterilizada para suspenderlos. La mezcla se calienta a 55°C durante 15 minutos y se centrifuga, para producir de esta manera 12 µl de un sobrenadante que contiene un fragmento ADN y vector de expresión. El procedimiento removió los fragmentos de ADN pequeños generados por las enzimas de restricción que tienen tamaños de aproximadamente 50 bp o menos, para producir de esta manera un fragmento ADN de interés y vector de expresión.
10 µl de una solución kit 1 Takara Ligation (Takara Shuzo Co., Ltd.) se agrega a 10 µl de una solución así preparada, y la mezcla se le deja reaccionar a 16°C durante 1 hora. La solución se utiliza para transformar las células competentes (Takara Shuzo Co., Ltd.: DH5a). Específicamente, 5 µl de solución de reacción de ligación se agregan a 60 µl de una solución de célula competente descongelada a 4°C y mezclada, y se dejaron a 0°C 30 minutos, luego a 42°C durante 45 segundos y 0°C durante 2 minutos. 500 µl de una solución SOC (2% bacto-triptona, 0.5% extracto de levadura, 10 mM NaCl, 20 mM glucosa, 10 mM MgSO4 y 10 mM MgCl2) se agregan a esta, seguido por cultivo de recuperación a 36°C durante 1 hora. 100 µl de solución de cultivo se aplico a un medio agar LB (1% bacto-triptona, 0.5% extracto de levadura, 1% NaCl, pH 7.0, 1.5% de agar) que contiene 50 µg /ml de ampicilina, 40 µg /ml X-gal (5-Bromo-4-Cloro-3Indolil--D-Galactosido), y 1 mM IPTG (tiogalactopiranosido). El cultivo se efectuó adicionalmente a 37°C durante 16 horas. El cultivo produjo Escherichia coli transformada al introducir el plásmido anteriormente descrito como colonias blancas, y las colonias se seleccionaron. Las colonias así separadas de Escherichia coli transformadas fueron cultivadas en un medio líquido LB que contiene ampicilina (50 µg /ml). De las células cultivadas de la Escherichia coli transformada, el ADN del plásmido se separa y purifico utilizando un kit de purificación de plásmido (QIA filter plasmid Midi Kit, QIAGEN). El ADN de plásmido así obtenido se confirmo porque cada uno tenía un fragmento de ADN que tiene un tamaño de aproximadamente 1.0 a 1.1 kbp, que corresponde al ADN de interés.
Luego, para confirmar la actividad escilo-inositol deshidrogenasa, las cepas microbianas aisladas como colonias se transfirieron a 100 ml de un medio LB (1% bacto-triptona, 0.5% extracto de levadura, 1% NaCl, pH 7.0) que contiene 50 µg /ml de ampicilina, y ellas se cultivan a 36°C durante 7 horas. 0.3 ml de 200 mM de solución de tiogalactopiranosida se agrega a la solución de cultivo, y las células fueron además cultivadas a 36°C durante 3 horas. Después completar el cultivo, las células se recolectaron mediante centrifugación y se lavaron con solución salina una vez. Luego, las células lavadas fueron suspendidas en 3 ml de 0.6% de solución Triton X-100, y las células fueron rotas mediante ultrasónica a 4°C. La solución se centrifuga, y se sacaron 2.8 ml de sobrenadante (solución de enzima). 1.2 g de sulfato de amonio se agrega al sobrenadante para salar las proteínas a 4°C. Las proteínas saladas fueron recolectadas mediante centrifugación, y se removió el sobrenadante. Los precipitados fueron disueltos en 2.5 ml de 20 mM de amortiguador Tris (pH 7.0), y a la solución se centrifuga de nuevo. Se aplico el sobrenadante sobre una columna de Sephadex G-25 (14 ml) equilibrada con 20 mM de Amortiguador Tris (pH 7.0). La elución se efectuó con 20 mM De solución de amortiguador Tris (pH 7.0), y el eluado se desalinea. Los procedimientos dieron un rendimiento de 3.5 ml de solución de enzima cruda del producto gen ydgJ.
La actividad de la escilo-inositol deshidrogenasa se mide como sigue: 5 µl de una solución de reacción (200 mM de Amortiguador Tris (pH 8.0), 2% de NADPH, y 1% de escilo-inososa) y 5 µl de una solución de enzima se mezclaron para permitirle reacción a 36°C durante 30 minutos, y luego 500 µl de agua se agregaron inmediatamente, seguido por la medición de la absorbencia a 340 nm. La disminución en la absorbencia a 340 nm se mide con base en un valor blanco para una solución de prueba obtenida al utilizar agua en lugar de la solución de enzima. La solución de enzima cómo se requirió.
Mientras tanto, el producto de reacción de enzima se midió como sigue: 10 mg de escilo-inososa, 40 mg de NADPH, y 10U de la enzima se les deja reaccionar en 1.0 ml de 100 mM de Amortiguador Tris (pH 8.0) a 36°C durante 4 horas, y el tratamiento con calor se efectúa a 80°C durante 10 min, seguido por enfriamiento. Luego, 100 µl de una resina de intercambio de catión de base fuerte, 100 µl de una resina de intercambio de anión de ácido fuerte, y 10 mg de carbono activado se agregaron, y la mezcla se agita y se centrifuga. Luego, el sobrenadante se diluye 2-veces, y se efectuó la medición mediante HPLC (Shodex Asahipak NH2P-50 4E F 4.6 250 mm: Shodex) utilizando un detector RI o condiciones de una temperatura de columna de 40°C y una tasa de flujo de fase móvil de 1.5 ml (80% acetonitrilo). Como resultado, el producto del gen Atu4375 y el producto del gen Atu3234 de Agrobacterium tumefaciens C58, el producto del gen BG 14057 de Bacillus subtilis 168, el producto del gen Xcc3438 de Xanthomonas campestris pv. campestris, y el producto del gen Atu4375, y el producto del gen Atu3234 de la cepa AB 10121 se encontraron que tienen una alta actividad de enzima, y 100% del producto fue escilo-inositol obtenido mediante reducción, mientras que mio-inositol que es un isómero de este no se detecta. Como resultado, las enzimas recombinantes derivadas de los genes anteriormente mencionados se encontró que tiene una alta actividad de escilo-inositol deshidrogenasa, y los productos del gen fueron escilo-inositol deshidrogenasa. Mientras tanto, los productos obtenidos mediante la reacción
de reducción de escilo-inososa, solo se detecta escilo-inositol, y las enzimas se encontró que las enzimas reducen estéreo específicamente la escilo-inososa en escilo-inositol.
La secuencia del gen Atu4375 derivado de Agrobacterium tumefacience C58 se muestra en SEQ ID NO: 3, la correspondiente secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 4, La secuencia del gen Atu3234 se muestra en SEQ ID NO: 5, y la correspondiente secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 6. Mientras tanto, La secuencia del gen BG14057 derivado de Bacillus subtilis 168 se muestra en SEQ ID NO: 7, la correspondiente secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 8, La secuencia del gen Atu4375 derivado de AB10121 se muestra en SEQ ID NO: 9, la correspondiente secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 10, La secuencia del gen Atu3234 se muestra en SEQ ID NO: 11, la correspondiente secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 12, La secuencia del gen Xcc3438 derivado de Xanthomonas campestris pv. campestris se muestra en SEQ ID NO: 13, y la correspondiente secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 14. Mientras tanto, de los resultados del análisis de secuencia de nucleótido de un plásmido incluyendo gen Atu4375 y gen Atu3234 de AB10121 (Hokkaido System Science Co., Ltd.), la homología entre el gen Atu4375 de Agrobacterium tumefacience C58 y gen Atu4375 de AB10121 fue 89% para la secuencia del nucleótido, y 96% para la secuencia del aminoácido, mientras que la homología entre el gen Atu3234 de Agrobacterium tumefacience C58 y gen Atu3234 de AB10121 fue 87% para la secuencia del nucleótido y 95% para la secuencia del aminoácido .
Ejemplo 13 (Comparativo)
<El aislamiento del ADN que codifica SIDH1 que se produce de Acetobacter sp. AB10281 FERM BP-10119>
De las enzimas purificadas, una solución de enzima que contiene SIDH1 se aplicó sobre una membrana de PVDF (Immobilon PSQ: elaborado por Millipore Corporation), y absorbida a la membrana PVDF. La membrana de PVDF se saco, tino con tinte azul brillante Coomassie (Rapid CBB KANTO: elaborado por KANTO CHEMICAL CO., INC.), decolorada, y secada, seguida por análisis con un analizador de aminoácido N-terminal (elaborado por Hewlett-Packard Development Company). Como resultado, del N-terminal, se identificó una secuencia:
Met-Lys-Arg-Lys-Leu-Arg-Ile-Gly-Leu-Ile-Gly-Ser-Gly-Phe-Met-Gly-Arg-Thr-His-Ala-Phe-Gfy-Tyr-Se .Luego la secuencia de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos se predijo, y se construyeron las siguiente dos clases de cebadores.
SEQ ID NO: 29: SIDH1-F1 atgaarcgnaarytncgiatyggyytiatygg
SEQ ID NO: 30: SIDH1-F2 ggyttyatgggycgnacicaygcittyggyta
Luego, con base en las secuencias de nucleótidos de varias escilo-inositol deshidrogenasas obtenidas en los ejemplos 10 a 12, se prepararon los siguientes dos cebadores que incluyen regiones de alto consenso con las secuencias
SEQ ID NO: 31: SIDH1-B1 ggyttrtcrmmgayracrtgrstrcc
SEQ ID NO: 32: SIDH1-B2 artgwrirtgrttgggigt
Mientras tanto, como ADN genómico de AB10281 va a ser utilizado como una plantilla, una solución de ADN genómico de AB10281 se prepara utilizando un glóbulo de célula (peso húmedo aproximadamente 400 mg) preparado en Ejemplo 9 de la misma manera que el método de preparar ADN descrito en el Ejemplo 12.
Para PCR, La solución de reacción Ex taq de Takara Shuzo Co., Ltd. se utilizó, en la solución que tiene una composición de 5 µl de 10 X amortiguado Takara ExTaq, 4 µl de mezcla dNTP, 30 ng de un ADN plantilla, 1 µl de cada de los10 µM de las regiones cebadora (SIDH1-F1 y SIDH1-B1), y 0.5 µl de Takara ExTaq se prepararon al agregar agua de tal manera que esta tiene un volumen de 50 µl, seguido por capas 30 µl de aceite mineral. Para la reacción, se utiliza el Amplificador PCR (ASTEC Co., Ltd., PC-700), y un ciclo de tres etapas: desnaturalización (94°C, 30 segundos), recocido (50°C, 30 segundos), y elongación (72°C, 1 minuto), se repite 35 veces.
La electroforesis revela que el PCR anteriormente descrito amplifica un fragmento ADN que tiene un tamaño de aproximadamente 0.3 kbp. Más aún, la banda de la posición de 0.3 kbp se excedió del gel, una parte de una solución de gel homogenizado se utiliza como una plantilla (2 µl), y se prepara una solución de reacción que tiene la misma composición que se describió anteriormente excepto que una combinación de los cebadores se cambia a SIDH1-F2 y SIDH1-B2. Para la reacción, se utiliza el amplificador PCR (ASTEC Co., Ltd.,PC-700), y un ciclo de tres etapas: desnaturalización (94°C, 30 segundos), recocido (46°C, 30 segundos), y elongación (72°C, 1 minuto), se repite 35 veces. La electroforesis revela que el PCR amplifica un fragmento ADN que tiene un tamaño de aproximadamente 0.25 kbp.
El Fragmento ADN que tiene un tamaño de aproximadamente 0.25 kbp se excedió del gel, y el fragmento de PCR se purifica utilizando GENE-CLEAN (elaborado por Bio101). Específicamente, de la misma manera que el método de
purificación descrito en el Ejemplo 12 excepto que el gel se disuelve en solución NaI, se obtuvieron 12 µl de una solución del Fragmento ADN.
Luego, el fragmento de ADN purificado se ligó a un vector pT7Blue. Específicamente, 0.5 µg del vector pT7Blue y 10 µl de una solución de kit-I Takara Ligation (Takara Shuzo Co., Ltd.) se agregan a 10 µl de solución de fragmento de ADN, y la mezcla se le deja reaccionar a 16°C durante 1 hora. La solución se utiliza para transformar las células competentes (DH5a, Takara Shuzo Co., Ltd.). La operación de la transformación y el aislamiento del plásmido de los transformantes se efectuaron de la misma manera que en el Ejemplo 12.
El plásmido obtenido se sometió a análisis de secuencias de nucleótidos (Hokkaido System Science Co., Ltd.) utilizando cebadores universales (R-20mero y U-19mero), y aproximadamente un tercio de la región media anterior de la secuencia de nucleótido de un gen que codifica la enzima se revela.
Luego, para determinar la longitud completa de la secuencia de nucleótido, el ADN genómico de AB10281 se digirió completamente con una enzima de restricción BamHI, y la solución de Fragmento ADN resultante se purifica utilizando GENE-CLEAN (elaborado por Bio101), seguido por una auto ligación del fragmento. Específicamente, 10 µl de una solución kit-I Takara Ligation (Takara Shuzo Co., Ltd.) se agrega a 10 µl de solución de fragmento del ADN, y la mezcla fue se le deja reaccionar a 16°C durante 1 hora. Después de la reacción, el ADN se purifica utilizando GENE-CLEAN (elaborado por Bio101), y a la solución se utiliza como una solución de plantilla ADN para PCR inverso.
SEQ ID No: 33: SIDH1-INV-F gctcgtcaacgatcctgaaattgat
SEQ ID No: 34: SIDH1-INV-B ttcgctgcagcttcatcggaaatat
SEQ ID No: 35: SIDH1-INVF3 cccttcaatttccgggcgggt
Para PCR inverso, se utilizó la solución de reacción Ex taq de Takara Shuzo Co., Ltd., y la solución que tiene una composición de 5 µl de 10 X amortiguado Takara ExTaq, 4 µl de mezcla dNTP, 30 ng de un ADN plantilla, 1 µl de cada 10 µM de solución cebadora (una combinación de SIDH1-INV-F y SIDHI-INV-B, o una combinación de SIDH1-INV-F y SIDH1-INV3), y 0.5 µl de Takara ExTaq se prepara al agregar agua de tal manera que esta tiene un volumen de 50 µl, seguido por capas 30 µl de aceite mineral. Para la reacción, se utiliza un amplificador PCR (ASTEC Co., Ltd., PC-700), y un ciclo de tres etapas: desnaturalización (94°C, 30 segundos), recocido (50°C, I minuto), y elongación (72°C, 2 minutos), se repite 35 veces. La electroforesis revela que los fragmentos de ADN amplificados con PCR anteriormente descrito tienen tamaños de aproximadamente 2.7 kbp y aproximadamente 1.8 kbp. Luego, las bandas en las posiciones de aproximadamente 2.7 kbp y aproximadamente 1.8 kbp se escindieron del gel, y los fragmentos de PCR se purifica utilizando GENE-CLEAN (elaborado por Bio101), para producir de esta manera 10 µl de Soluciones de fragmento de ADN. Los dos fragmentos de AND resultantes se sometieron a análisis de secuencia de nucleótido (Hokkaido System Science Co., Ltd.) utilizando los cebadores utilizados en PCR para determinar la secuencia de nucleótido completa de los genes que codifica la enzima.
Luego, se efectuó el PCR utilizando los cebadores que tienen las siguientes secuencias para clonar el gen SIDH1 (que incluye un sitio RBS) derivado de la cepa AB10281 para expresarla como una enzima recombinante.
SEQ ID No: 36: 281SIDH1-F gctggatcccgcccttattgtgaata
SEQ ID No: 37: 281SIDH1-R tatgaattcgttatgccttctcatgctgtcg
Para PCR, se utilizó la solución de reacción Ex taq de Takara Shuzo Co., Ltd., y la solución que tiene una composición de 5 µl de 10 X amortiguado Takara ExTaq, 4 µl de mezcla dNTP, 30 ng de un ADN plantilla, 1 µl de cada 10 µM de la solución cebadora, y 0.5 µl de Takara ExTaq se prepararon al agregar agua de tal manera que esta tiene un volumen de 50 µl, seguido por capas 30 µl de aceite mineral. Para la reacción, un ciclo de tres etapas: desnaturalización (94°C, 30 segundos), recocido (55°C, 1 minuto), y elongación (72°C, 1 minuto), se repite 35 veces utilizando amplificador PCR (ASTEC Co., Ltd., PC-700). El PCR anteriormente descrito amplifica un fragmento de ADN que tiene un tamaño de aproximadamente 1.2 kbp.
El fragmento de ADN que tiene un tamaño de aproximadamente 1.2 kbp se purifica utilizando GENE-CLEAN (elaborado por Bio101), para producir de esta manera 12 µl de una solución de fragmento de ADN. Para un procedimiento para insertar el fragmento de ADN en un vector de expresión, 0.5 µg de un plásmido de expresión (pUC119), 1 µl de enzimas de restricción (BamHI, EcoRI) de Takara Shuzo Co., Ltd., y 2 µl de 10 X amortiguador K para enzimas de restricción de Takara Shuzo Co., Ltd. se agregan a 10 µl de la solución de fragmento de ADN, y se agrega agua esterilizada con el fin de tener un volumen de 20 µl, seguido por la mezcla. La solución de reacción fue se le deja reaccionar a 36°C durante 2 horas.
La recolección del fragmento de ADN de la solución de reacción, purificación, reacción de ligación, y transformación de las células competentes (DH5a, Takara Shuzo Co., Ltd.) se efectuaron de la misma manera que en el Ejemplo 12. Más aún, la expresión de escilo-inositol deshidrogenasa y la medición de la actividad se efectuaron de la misma manera que en el Ejemplo 12, y y el producto del gen se identificó como escilo-inositol deshidrogenasa.
Como resultado, la secuencia de nucleótido de un gen que codifica SIDH1 derivado de La cepa AB10281 mostrada en SEQ ID NO: 27, aunque su secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 28.
Ejemplo 14 (Comparativo)
<Estudio de las propiedades de la enzima de la presente invención, varias clases de escilo-inositol deshidrogenasa>
El siguiente método se efectuó para estudiar las propiedades enzimáticas del SIDH1, SIDH2, y SIDH3 derivado decepa AB 10281, que se había obtenido mediante purificación de enzima en el Ejemplo 9; el producto del gen ydgJ derivado de Escherichia coli, que se había obtenido de la enzima recombinante en el Ejemplo 11; y los productos de Atu4375 y gen Atu3234 de Agrobacterium tumefacience C58, el producto del gen BG14057 de Bacillus subtilis 168, el producto del gen Xcc3438 de Xanthomonas campestris pv. campestris, y el producto del gen Atu4375 y el producto del gen Atu3234 de la cepa AB10121, todos los que se había obtenidos as las enzimas recombinantes en el Ejemplo 12, y los resultados se muestran en Tabla 5.
Tabla 6 muestra la homología en la secuencia del aminoácido. La homología de solamente los aminoácidos común en toda la secuencia fue baja (aproximadamente 5%), pero la homología que incluyen los aminoácidos que tienen propiedades similares fue particularmente alta en NAD o NADP que une los dominios en aproximadamente 30% de La secuencia de N-terminal. Más aún, la secuencia de lisineprolina localizada adelante del centro de la secuencia involucrada en la unión de la nicotinamida, que es un sitio de reacción de oxidoreducción del NAD o NADP, fue altamente conservada. La asparagina en la posición 27 adelante del C-terminal de la secuencia de lisina-prolina y la secuencia ácido aspártico-(3 aminoácidos)-histidina cerca al centro de la secuencia también estuvieron altamente conservadas, de tal manera que ellas se consideran como secuencias importantes involucradas en la unión del sustrato para las estructuras tridimensionales estimadas. En la tabla, las secuencias comunes son representadas con el símbolo "*", y los aminoácidos que tienen propiedades similares son representados por el símbolo ":" o el símbolo ".", y asparagina en la posición 27 hacia el C-terminal de la secuencia de lisina-prolina y la secuencia ácido aspártico-(3 aminoácidos)-histidina cerca al centro de la secuencia es representado por sombreado.
En la comparación de los pesos moleculares, el peso molecular de la enzima de la presente invención derivado de AB10281 se calcula con base en los resultados de SDS-PAGE utilizando un marcador de peso molecular (preteñido estándar (tipo amplio rango): elaborado por Bio-Rad Laboratories, Inc.), aunque que los pesos moleculares de otras enzimas de la presente invención se estimaron de las longitudes completas de los genes. Como resultado, los pesos moleculares de las enzimas de la presente invención (SIDH1, SIDH2, y SIDH3) derivado de AB10281, que se había obtenido mediante la purificación de enzimas, fueron 46 k Dalton, 42 k Dalton, y 40 k Dalton, respectivamente. Mientras tanto, el peso molecular de la enzima de la presente invención derivado de ydgJ de Escherichia coli K-12, que se había obtenidas como enzima recombinante en el Ejemplo 11, fue 38.2 k Dalton; los pesos moleculares de las enzimas de la presente invención derivados del gen Atu4375 y gen Atu3234 de Agrobacterium tumefacience C58, que se había obtenidas como enzimas recombinantes en el Ejemplo 12, fueron 41.3 k Dalton y 42.4 k Dalton, respectivamente; los pesos moleculares de las enzimas de la presente invención derivado del gen BG14057 de Bacillus subtilis 168, el gen Xcc3438 de Xanthomonas campestris pv. campestris, y gen Atu4375 y gen Atu3234 de AB 10121 fueron 40.1 k Dalton,
38.5 k Dalton, 41.4 k Dalton, y 42.5 k Dalton, respectivamente. Esto es, las enzimas de la presente invención, escilioinositol deshidrogenasa, se encontraron que tienen un peso molecular de 38 a 46 k Dalton.
Las propiedades de asociación de las enzimas de la presente invención se determinaron mediante: medición de la actividad de la fracciones obtenidas por fraccionamiento utilizando una columna de filtración de gel (Tosoh Corporation: 2000SWXL); calcular el peso molecular de las correspondientes fracciones de peso molecular; y dividir los valores calculados por los pesos moleculares de la enzima. Los valores resultantes se representaron como enteros. Como resultado, de la enzima de presente invención, escilo-inositol deshidrogenasas, que tiene un peso molecular de 80 k a 110 k Dalton, y se considero que forman dímeros o trímero en las condiciones no desnaturalizadas.
La selectividad de la coenzima de la enzima de presente invención se determino mediante: mezclar 5 µl de la solución de reacción (200 mM de amortiguador Tris (pH 8.0), 2% de NADPH o NADH, y 1% de escilo-inososa) con 5 µl de una solución de enzima; y permitirle a la mezcla reaccionar a 36°C durante 30 min. Después de la reacción, 500 µl de agua se agregaron inmediatamente a este, y de la absorbencia a 340 nm se mide. Del valor blanco, se prepara una solución de prueba al utiliza agua en lugar de solución de enzima, se mide la disminución en la absorbencia a 340 nm. La solución de enzima cómo se requirió. Los resultados indicaron que escilo-inositol deshidrogenasas de las enzimas de presente invención fueron capaces de utilizar tanto NADPH y NADH como coenzimas, pero tienen la actividad relativa de coenzima como se muestra en Tabla 5. Se revelos que muchas enzimas tienen alta reactividad con NADPH.
El pH optimo de las enzimas de presente invención se determino al: mezcla 5 µl de la solución (200 mM de amortiguado de fosfato (pH 5.0 a 9.0), 2% de NADPH, y 1% de escilo-inososa) con 5 µl de una solución de enzima; y permitirla mezcla reaccionar a 36°C durante 30 min. Después de la reacción, 500 µl de agua se agregaron inmediatamente a este, y se mide la absorbencia a 340 nm. El valor blanco de la solución de prueba preparado utilizando agua en lugar de la solución de enzima, se mide la disminución en de la absorbencia a 340 nm. La solución de enzima se diluye según se requería. Como resultado, las enzimas de presente invención, escilo-inositol deshidrogenasa, se encontró que tiene un pH optimo como se muestra en Tabla 5. Esto es, las enzimas de presente invención se encontraron que reaccionan en rango amplio de pH 5 a 9. Mientras tanto, también se revela que habían enzimas que tienen una actividad máxima en el lado ácido (aproximadamente pH 6), enzimas que tienen una actividad máxima en la región neutra (aproximadamente pH 6.5 a 7.5), y enzimas que tienen una actividad máxima en el lado alcalino (aproximadamente pH 7.5 a 9).
La termoestabilidad de las enzimas de la presente invención se determinó así: se trata una solución de enzima a una temperatura determinada de 10 min; enfriar la solución; mezclar la solución de enzima con 5 µl desde una solución de reacción (200 mM de amortiguador fosfato (pH 5.0 a 9.0), 2% de NADPH, y 1% de escilo-inososa); y permitir en la mezcla reaccionar a 36°C durante 30 min. Posteriormente, 500 µl de agua se agregaron inmediatamente este, y de la absorbencia a 340 nm se mide. Del valor blanco de una solución de prueba preparada al utilizar agua en lugar de la solución de enzima, la disminución en de la absorbencia a 340 nm se mide. La solución de enzima se diluye según se requería. La actividad de a grupo tratado a 20°C durante 10 min se definió como 100%, y las actividades relativas se compararon. Como resultado, la termoestabilidad de las enzimas de la presente invención, escilo-inositol deshidrogenasa, se encontró que varían dependiendo de las enzimas como muestran en la Tabla 5, y se encontró que la estabilidad varía en el rango de 40 a 60°C dependiendo de las enzimas.
Se determinan los efectos de metal pesado en las enzimas de la presente invención: mezclar 5 µl de una solución de reacción (200 mM de amortiguador Tris (pH 8.0), 2% de NADPH, 1% de escilo-inososa, y 2 mM de de metal pesado) con 5 µl de una solución de enzima ; y permitir en la mezcla reaccionar a 36°C durante 30 min. Después de la reacción, 500 µl de agua se agregaron inmediatamente este, y se mide la absorbencia a 340 nm. Del valor blanco de una solución de prueba preparada al utilizar agua en lugar de la solución de enzima, se mide la disminución en de la absorbencia a 340 nm. La solución de enzima se diluye según se requería. Se utilizaron CaCl2, CoCl2, ZnSO4, MgSO4, SnCl2, NiCl2, y MnSO4 como sales metálicas. La actividad del grupo sin adición se definió como 100%, y las actividades relativas se compararon. Como resultado, como se muestra en la Tabla 5, las enzimas de la presente invención, escilo-inositol deshidrogenasa, fueron activadas al menos en la presencia del ión Co2+ y la mayoría de las encimas se inhibieron en la presencia del ión Sn2+. En contraste, la enzima derivada de Bacillus subtilis 168 se activa en la presencia del Zn2+.
Los valores Km de las enzimas de la presente invención para escilo-inososa se determinaron por: mezclar 5 µl de una solución de reacción (200 mM de Amortiguador Tris (pH 8.0), 2% de NADPH, y 0.001 a 2.5% de escilo-inososa) con 5 µl de una solución de enzima; y permitir a la mezcla reaccionar a 36°C durante 30 min. Después de la reacción, 500 µl de agua se agregaron inmediatamente a esta, y se mide la absorbancia a 340 nm. A partir del valor negro de una solución de prueba preparada utilizando agua en lugar de la solución de enzima, se mide la disminución en la absorbancia a 340 nm. La solución de enzima se diluye según se requiera. Se calculan los valores Km mediante la gráfica de recíproca. Como un resultado, como se muestra en la Tabla 5, las enzimas de la presente invención, escilo-ionositol deshidrogenasa, se encuentra que tienen valores Km en el rango de 2.6 a 12.6 mM.
La especificidad al sustrato de las enzimas de la presente invención se determina al medir la actividad relativa de oxidación con respecto a la reactividad a el escilo-inositol. Los isómeros de inositol incluyen escilo-inositol (SI), mioinositol (MI), D-quiro-inositol (DCI), L-quiro-inositol (LCI), epi-inositol (EI), muco-inositol (MuI), alo-inositol (AI), y neoinositol (NI). La Tabla 5 muestra el grupo de isómeros a los cuales la enzima muestra una actividad relativa de no menos de 70%, un grupo de isómeros a los cuales la enzima muestra una actividad relativa de menos de 70% y no menos de 20%, y un grupo de isómeros a los cuales la enzima muestra una actividad relativa de menos de 20%.
La especificidad al sustrato se determina al: mezclar 50 1l de una solución de reacción (1% de isómeros de inositol (o 0.4%: solo para neo-inositol), 200 mM de amortiguador Tris (pH 8.0), 0.002% de NADP+, 0.002% de diaforasa, y 0.01% de azul de nitrotetrazolio) con 50 1l de una solución de enzima; y medir el incremento en la absorbancia a 545 nm a 25° C cada tres minutos utilizando un lector de microplaca. El índice de reacción se calcula a partir de los incrementos de absorbancia en los tiempos respectivos. Como un resultado, se encuentra que la especificidad del sustrato varía levemente dependiendo de las clases de las enzimas y de la correlación con las estructuras de los isómeros de inositol, también se encuentra que aquellas enzimas tienen por lo menos actividad de escilo-inositol deshidrogenasa y actividad mio-inositol deshidrogenada.
Tabla 5: Lista de propiedades de escilo-ionositol deshidrogenasa(continuación)
- Cepas
- E. coli Acetobacter sp. Bacillus sub.
- Cepa
- K12 (ATCC10798) AB10281 (FERM P-18868) cepa 168 (ATCC23857)
- Nombre del gen o nombre de laenzima
- Gen ydgJ SIDH1 SIDH2 SIDH3 Gen BG14057
- Peso molecular k Dalton
- 38.2k 46k (SDS- PAGE) 42k (SDS- PAGE) 40k (SDS- PAGE) 40.1k
- Propiedad de asociación
- Dímero Trímero Dímero Dímero Dímero
- Termoestabilidad
- Estable a 45° C o menos Estable a 45° C o menos Estable a 60° C o menos Estable a 60° C o menos Estable a 40° C o menos
- Actividad relativa de coenzima
- NADPH: NADH =100: 9 NADPH: NADH =100: 112 NADPH: NADH =100: 1 NADPH: NADH =100: 3 NADPH: NADH =100: 52
- PH óptimo
- pH 7.5-9.0 pH 5.5-6.5 pH 5.5-6.5 pH 5.5-6.5 pH 7.0-8.5
- Efectos de metal pesado: activación
- Co Co Co Co, Mn Co, Mn.Zn
- Efectos de metal pesado: inhibición fuerte
- Sn, Zn Sn, Zn Sn, Zn Sn, Zn Sn
- Producto de reacción de reducción
- Solo SIS SI Solo SIS SI Solo SIS SI Solo SIS SI Solo SIS SI
- Valores Km para escilo-inososa
- 3.9 mM 7.6 mM 10.6 mM 12.6 mM 3.5 mM
- Actividad relativa específica a sustrato (70% o más)
- SI, MI, DCI SI SI SI SI, MI
- Actividad relativa específica a sustrato (20 a 70%)
- LCI, EI, MuI MI MI MI DCI, EI, AI, NI
- Actividad relativa específica a sustrato (menos de 20%)
- AI, NI DCI, LCI, EI, MuI, AI, NI DCI, LCI, EI, MuI, AI, NI DCI, LCI, EI, MuI, AI, NI LCI, MuI
- Cepa
- C58 (ATCC33970) AB10121 (FERM P-17383) pv.Campestris (ATCC33913)
- Nombre del gen o nombre de laenzima
- Gen Atu4375 Gen Atu3234 Gen Atu4375 Gen Atu3234 Gen Xcc3438
- K Dalton
- 41.3k 42.4k 41.4k 42.5k 38.5k
- Propiedad de asociación
- Dímero Dímero Dímero Dímero Dímero
- Termoestabilidad
- Estable a 50° C o menos Estable a 40° C o menos Estable a 50° C o menos Estable a 40° C o menos Estable a 40° C o menos
- Actividad relativa de coenzima
- NADPH: NADH =100: 9 NADPH: NADH =100: 18 NADPH: NADH =100: 6 NADPH: NADH =100: 20 NADPH: NADH =100: 34
- PH óptimo
- pH 6.5-8.5 pH 7.0-8.5 pH 6.5-8.5 pH 7.0-8.5 pH 6.5-7.5
- Efectos de metal pesado: activación
- Co, Mn Co, Mn, Ca Co, Mn Co, Mn, Ca Co
- Efectos de metal pesado: inhibición fuerte
- Sn, Zn Sn, Zn Sn, Zn Sn, Zn Sn, Zn
- Producto de reacción de reducción
- Solo SIS SI Solo SIS SI Solo SIS SI Solo SIS SI Solo SIS SI
- Valores Km para escilo-inososa
- 9.2 mM 2.6 mM 9.8 mM 3.1 mM 9.1 mM
- Actividad relativa específica a sustrato (70% o más)
- SI, MI, DCI, EI SI, MI, DCI, EI, LCI SI, MI, DCI, EI SI, MI, DCI, EI, LCI SI, DCI
- Actividad relativa específica a sustrato (20 a 70%)
- LCI, MuI MuI LCI, MuI MuI MI
- Actividad relativa específica a sustrato (menos de 20%)
- AI, NI AI, NI AI, NI AI, NI EI, LCI, MuI, AI, NI
- Abreviaturas SIS: escilo-inososa, SI: escilo-inositol, MI: Mio-inositol, DCI: D-quiro-inositol, LCI: L-quiro-inositol, EI: Epi-inositol, Mul: Muco-inositol, AI: Alo-inositol, NI: Neoinositol
Tabla 6. Homología en las secuencias de aminoácido de varias escilo-ionositol desidrogenasa
Producción de escilo-inositol utilizando una enzima
El método de producción de la presente invención requiere de dos clases de enzimas, mio-inositol 2-deshidrogenasa y la enzima de la presente invención. Aquí, se mostrará un ejemplo utilizando una enzima recombinante de mio-inositol 2
deshidrogenasa que es un producto del gen BG10669 derivado de Bacillus subtilis 168 ATCC23857 y un enzima recombinante de la enzima de la presente invención codificada mediante ADN de la presente invención (gen ydgJ derivado de Escherichia coli K12: SEQ ID NO:1).
Primero, para obtener una enzima recombinante de la mio-inositol 2-deshidrogenasa que es un producto del gen BG10669 derivado de Bacillus subtilis 168 ATCC23857, se efectuó el siguiente experimento. Se efectuó PCR utilizando cebadores que tienen la siguiente secuencia para clonar el gen BG10669 derivado de Bacillus subtilis 168 para expresarla como una enzima recombinante
SEQ ID NO: 25: BG10669-F 5’-ttgggatccgatgagtttacgtattggcgtaattg-3’
SEQ ID NO: 26: BG10669-R 5’-aaactgcagttagttttgaactgttgtaaaagattgata-3’
Para PCR, la solución de reacción Ex taq de Takara Shuzo Co., Ltd. Se utilizo, y la solución que tiene una composición de 5 µl de 10 X amortiguador Takara Ex Taq, 4 µl de la mezcla dNTP, 30 ng de un ADN plantilla, 1 µl de cada 10 µM de solución cebadora, y 0.5 µl de Takara Ex Taq se prepararon al agregar agua de tal manera que esta tiene un volumen de 50 µl, seguido por capas de 30 µl aceite mineral. Para la reacción, un ciclo de tres etapas: desnaturalización (94°C, 30 segundos), recocido (53°C, 1 minuto), y elongación (72°C, 1 minuto), se repito 35 veces utilizando un amplificador de PCR (ASTEC Co., Ltd., PC-700). El PCR se amplifica un fragmento de ADN que tiene un tamaño de aproximadamente
1.0 kbp. Después de la reacción, el aceite mineral en capas se extrae con 0.3 ml de hexano, y una operación para remover la capa de hexano se repite tres veces, seguido por reducción de presión durante 1 minuto, para remover de esta manera el aceite mineral. De 50 µl de la solución de la reacción si obtenida, se purifica el fragmento de PCR utilizando GENECLEAN (Bio101). Específicamente, 300 µl de la solución NaI incluida en el kit se agregó y se mezclo, 10 µl de la solución de glóbulos de vidrios se agrega y se mezcla. A la mezcla se le permite permanecer a 4°C durante 15 minutos y se centrifuga para precipitar los glóbulos de vidrio a los cuales se absorbió el fragmento de ADN, y luego el sobrenadante se remueve. 500 µl de la solución de lavado nueva incluida en el kit se agrega además para suspender los glóbulos de vidrio, de la mezcla se centrífugo para remover el sobrenadante. La operación de lavado utilizando la solución de lavado nueva se repite tres ves. Luego, los glóbulos de vidrio se secan bajo presión reducida, en 15 µl de agua esterilizada se agrega para suspenderlas. La mezcla se calienta a 55°C durante 15 minutos y se centrífugo, para producir de esta manera 12 µl de sobrenadante que contiene el fragmento de ADN.
A una operación de insertar el fragmento de ADN purificado en un vector de de expresión se efectuó como sigue. Específicamente, 0.5 µg de un plasmado de expresión (pUC118: elaborado por Takara Shuzo Co., Ltd.)), 1 µl de cada de las enzimas de restricción BamHI PstI de Takara Shuzo Co., Ltd., y 2 µl de 10 X amortiguador K, que es un amortiguador de enzima de restricción de Takara Shuzo Co., Ltd., se agregan a 10 µl de la solución del fragmento de ADN, y se agrega agua esterilizada de tal manera que la mezcla tiene un volumen de 20 µl, seguido por mezcla. La solución de reacción se le deja reaccionar a 36°C durante 2 horas. Después de la reacción de las enzimas de restricción, el fragmento de ASN y el vector de expresión se aislaron con GENECLEAN y se ligaron uno al otro. Específicamente, 300 µl de la solución de NaI incluida en el kit se agregan a 20 µl de la solución de reacción de enzima de restricción y se mezclaron, y luego 10 µl de la solución de glóbulos de vidrio se agregan y se mezclan. La mezcla se le permite permanecer a 4°C durante 15 minutos luego se centrifuga para precipitar los glóbulos de vidrio a los cuales el fragmento de ADN y el vector de expresión fueron adsorbidos, y se remueve el sobrenadante. Entonces, 500 µl de la solución de lavado nueva incluida en el kit se agrega para suspender los glóbulos de vidrio, y la suspensión se centrifuga para remover el sobrenadante. La operación de lavado utilizando la solución de lavado nueva se repite tres veces. Luego, los glóbulos de vidrio se secan bajo presión reducida, y después del secado, 15 µl de agua esterilizada se agrega para suspenderlos. La mezcla se calienta a 55°C durante 15 minutos y se centrifuga, para producir de esta manera 12 µl del sobrenadante que contiene el fragmento de ADN y el vector de expresión. El procedimiento removió fragmentos de ADN pequeña generados mediante las enzimas de restricción que tienen tamaño de aproximadamente 50 bp o menos, para producir de esta manera un fragmento de ADN de interés y el vector de expresión.
10 µl de la solución del kit 1 de Takara Ligation (Takara Shuzo Co., Ltd.) se agrega a 10 µl de la solución así preparada, y la mezcla se le deja reaccionar a 16°C durante 1 hora. La solución se utiliza para transformar células competentes (Takara Shuzo Co., Ltd.: DH5a). Específicamente, 5 µl de la solución de reacción de ligación se agregan a 60 µl de la solución de célula competente no congelada a 4°C y mezclada, y se dejo de 30 minutos a 0°C, a 42°C durante 45segundos y 0°C durante 2 minutos. 500 µl de la solución SOC (2% Bacto-triptona, 0.5% de extracto de levadura, 10 mM de NaCl, 20 mM de glucosa, 10 mM de MgSO4, y 10 mM de MgCl2) se agregan a esta, seguida por cultivo de recuperación a 36°C durante 1 hora, 100 µl de solución de cultivo se aplico sobre un medio de agar LB (1 % Bactotriptona, 0.5% de extracto de levadura, 1% de NaCl, pH 7.0, 1.5% de agar) que contiene 50 µg/ml de ampicilina, 40 µg/ml de X-gal (5-Bromo-4-Cloro-3-Indolil--D-Galactosido), y I mM IPTG (tiogalactopiranosido). El cultivo se efectuó adicionalmente a 37°C durante 16 horas. El cultivo produjo Escherichia coli formado al introducir los plasmados anteriormente descritos como colonias blancas, y se seleccionaron las colonias. Las colonias así separadas de la Escherichia coli formadas se cultivaron en un medio líquido LB que contiene ampicilina (50 µg/ml). De las células cultivadas de la Escherichia coli transformada, se separa el ADN y el plásmido se purifica y se utiliza un kit de purificación de plásmido (QIA filter Plasmad Midi Kit, QIAGEN). El ADN del plásmido así obtenido se confirmo que tiene
un fragmento de ADSN que tiene un tamaño de aproximadamente 1.0 k bp, que corresponde al gen BG10669 de interés.
Luego, para confirmar la actividad del escilo-inositol 2-deshidrogenasa, las células aisladas como colonias se transfirieron a 30 botellas de 100 ml de un medio LB (1% Bacto-triptona, 0.5% de extracto de levadura, 1% de NaCl, pH 7.0) que contiene 50 µg/ml de ampicilina, y ellas se cultivan a 36°C durante 7 horas. 0.3 ml de 200 mM de solución de tiogalactopiranosido se agrega a cada una de 100ml de solución de cultivo, y las células fueron adicionalmente cultivadas a 36°C durante 3 horas. Después de completar el cultivo, las células fueron recolectadas mediante centrifugación y lavadas con solución salina fisiológica una vez. Luego, las células lavadas fueron suspendidas en 3 ml de 0.6% de Triton de solución de X-100, y las células fueron rotas mediante onda ultrasónica a 4°C. La solución se centrifuga, y se sacaron 84 ml de sobrenadante (solución de enzima). 36 g de sulfato de amonio se agregaron al sobrenadante para salar las proteínas a 4°C. Las proteínas resultantes se recolectaron mediante centrifugación, y se remueve el sobrenadante. Los precipitados se disolvieron en 75 ml de 20 mM de amortiguador Tris (pH 7.0), y la solución se centrifuga de nuevo. El sobrenadante se aplico sobre una columna Sephadex G-25 (Farmacia K.K.) (400ml) equilibrada con 20 mM de amortiguador Tris (pH 7.0), y la elusión se efectuó con 20 mM de amortiguador Tris (pH 7.0). La elusión se efectuó con 20 mM de amortiguador Tris (pH 7.0), y el eluado se desanilizo. Los procedimientos produjeron 105 ml de una solución de enzima cruda del producto del gen BG10669.
La actividad reductora de la mio-inositol 2-deshidrogenasa se mide como se describe adelante. 5 µl de la solución de reacción (200 mM de amortiguador Tris (pH 8.0), 2% de NADH, 1% escilo-inososa) se mezclo con 5 µl de solución de enzima, y la mezcla se le deja reaccionar a 36°C durante 30 min. Inmediatamente después de la reacción, 500 µl de agua se agrega, y se le dio la absorbancia de 340 nm. Del valor blanco de un tubo de ensayo preparado al utilizar agua en lugar de la solución de enzima, se mide la disminución en la absorbancia a 340 nm. La solución de enzima se diluye como según se requería, y la enzima se confirmo por tener una actividad para reducir la escilo-inososa. De otra parte, para medir una actividad oxidación, 50 µl de una solución de reacción (1% mio-inositol o escilo-inositol, 200 mM de amortiguador Tris (pH 8.0), 0.002% de NAD+, 0.002% de diaforasa, y 0.01% de azul nitrotetrasolido) se mezclaron con 50 µl de una solución de enzima, y el incremento en la absorbancia a 545 nm se mide a 25°C cada tres minutos utilizando un lector de micro placa. La tasa de reacción se calcula de los incrementos en la absorbancia en los respectivos tiempos. Como resultado, la enzima preparada se confirmo por tener una actividad para oxidar el mioinositol pero que no tiene actividad para oxidar el escilo-inositol.
La solución de enzima mio-inositol 2-deshidrogenasa así preparada y la solución de enzima cruda de escilo-inositol deshidrogenasa preparada en el ejemplo 11 (105 ml de solución de enzima preparada de 3 L de una solución de cultivo (escala de 30 veces)) se utilizaron para efectuar una reacción para convertir el mio-inositol en escilo-inositol. Para preparar una solución de reacción, 200 g de mio-inositol, 70 ml de 5% escilo-inososa, 130 mg de CoCl2, y 250 mg de MgSO4·7H2O se mezclaron, y el volumen se ajustó a 750 ml al agregar agua, seguido por calentar hasta 50°C para disolver el mio-inositol. La solución se activa a 36°C y se ajustó a un pH de 8.0 con una solución acuosa de NaOH 1N, y el volumen se ajustó a 790 ml al agregar agua. 105 ml de solución de enzima cruda de mio-inositol 2-deshidrogenasa, 105 ml de solución de enzima cruda de escilo-inositol deshidrogenasa, 70 mg de NADP+ fueron agregados a este a 36°C, y la temperatura de la solución que tiene un volumen de aproximadamente IL se mantuvo 36°C, seguido por reacción con agitación lenta. La solución de reacción realmente se volvió acida, de tal manera que se ajustó a un pH de
8.0 con NaOH 1N. 42 horas más tarde, los cristales de escilo-inositol fueron generados en la solución de reacción, de tal manera que se obtuvo la solución de reacción blanca. La solución se filtró utilizando un papel de filtro para recolectar escilo-inositol cristalino (peso húmedo 73 g). 3 L de agua se agrega al sólido, y el sólido se disolvió a 50°C. El volumen de la mezcla se ajustó 4.5 L al agregar agua, y la mezcla se enfrió a temperatura ambiente. La solución de reacción se centrifuga (8,000 rpm, 20 minutos) para remover las materias insolubles, el sobrenadante se paso a través de una columna llena con 100 ml de resina de intercambio de catión de base fuerte, una columna llena con 100 ml de resina de intercambio de catión de ácido fuerte, y una columna llena con 50 ml de carbón activado, en este orden, para producir de esta manera cada uno de un eluado. Posteriormente, 500 ml de agua se pasaron a través de cada una de las columnas y se lavaron, para producir de esta manera cada una de las soluciones de lavado. El eluado y la solución de lavado se mezclaron y se concentraron.
Como resultado de la concentración, los microcristales comenzaron a ser cristalizados en la medida en que el volumen de la solución se volvió más pequeña, la solución se concentra hasta el peso de los contenidos se convirtió en 130 g. la solución concentrada se enfrió a 4°C se le permite permanecer durante toda la noche. Posteriormente, la sustancias de suspensión se filtraron, y los cristales de escilo-inositol sobre papel de filtro se lavaron con una cantidad pequeña de agua, seguido al secarse 105°C durante 3 h. la escilo-inositol resultante fue de cristales blancos (61 g), y el análisis de RMN y los análisis de HPLC revelaron que los cristales no contienen otras impurezas y tienen una pureza del 99% o más. El rendimiento de mio-inositol fue del 31 %. Mientras tanto, la solución de reacción que se había separado mediante filtración podría ser también utilizada, y cuando se disolvieron allí 64 g de mio-inositol, se cristalizó adicionalmente escilo-inositol cristalino.
Ejemplo 16
Formación de complejo escilo-inositol/ácido bórico y estudio sobre la condición de formación.
100 g de polvo de escilo-inososa se disuelve en 500 ml de agua caliente, y la solución se enfrió a temperatura ambiente. Posteriormente, se agrega agua de tal manera que la solución tiene un volumen de 900 ml. La solución se ajustó a un pH de 7.5 con una solución acuosa de NaOH 5N, y el agua se agrega adicionalmente con el fin de tener un volumen de 1 L.
5.9 g de polvo de NaBH4 se agrega gradualmente a la solución durante 15 minutos con agitación para efectuar una reacción de reducción. La temperatura de la solución de reacción se incrementa hasta 38°C debido al calor de la reacción. 30 minutos más tarde, 67.5 g de ácido bórico y 72.2 g de NaCl se disolvieron en la solución de reacción que se había enfriado a 32°C, para preparar de esta manera una solución en la cual se forma el complejo. El pH de la solución fue de 5.9
Luego, 100 ml de la solución, en la cual se forma el complejo y se ajustó a pH 6.0 con una solución acuosa de NaOH 8N, se suministro en un recipiente plástico de 200 ml con una cubierta, y 100 ml de la solución, en la cual se forma el complejo y se ajustó a pH 7.0 con una solución acuosa de NaOH 8N, se suministro de la misma manera que anteriormente. Adicionalmente, se dispersaron cada uno de los 100 ml de la solución en la cual se forma el complejo y cada uno de los cuales se ajustó a pH 8.0, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 12.0, o 12.8.
En aquellas soluciones a las que se le ajustó el pH, se inició la formación gradual de precipitados. Los precipitados se separaron mediante filtración cada tercer día, y el filtrado se ajustó a un pH predeterminado con una solución acuosa de NaOH 8N y luego se regresó al recipiente original. Los precipitados resultantes se secaron y luego pesados. Si todo los escilo-inositol generado mediante reducción forma un complejo de escilo-inositol/ácido bórico y se obtienen como precipitados, el peso de los precipitados seria de 61.8 g. por lo tanto, los pesos de los precipitados obtenidos de las respectivas soluciones ajustadas a pH se integraron cada tercer día, los valores obtenidos al dividir los valores integrados por rendimiento teórico (61.8 g) se definieron como las tasas de recuperación de los precipitados del complejo de escilo-inositol/ácido bórico.
Los valores así obtenidos se muestran adelante.
Las partes grises en la tabla muestran el grupo de prueba de la tasa de recuperación de más del 90%.
Tabla 7
pH de tratamiento Tasa de recuperación del complejo de escilo-inositol/ ácido bórico
- Día 1
- Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7
- 6
- 9.4% 17.9% 25.5% 32.4% 38.6% 44.2% 49.2%
- 7
- 21.7% 38.4% 51.2% 61.1% 68.7% 74.6% 79.1%
- 8
- 42.4% 65.7% 78.6% 85.6% 89.5% 91.6% 92.8%
- 9
- 66.9% 86.3% 91.9% 93.6% 93.6% 94.2% 64.2%
- 9.5
- 82.9% 92.9% 94.1% 94.2% 94.2% 94.2% 94.2%
- 10
- 57.5% 79.9% 88.6% 92.1% 93.4% 93.9% 94.1%
- 10.5
- 41.5% 64.7% 77.7% 85.0% 89.0% 91.3% 92.6%
- 11
- 36.8% 59.2% 72.8% 81.2% 86.3% 89.4% 91.3%
- 12
- 29.2% 49.4% 63.3% 72.9% 79.5% 84.1% 87.2%
- 12.8
- 25.4% 44.0% 57.6% 67.5% 74.7% 80.0% 83.8%
Como se muestra en la Tabla 7, el grupo de prueba del tratamiento a pH de 9.5 fue el más adecuado para la formación de precipitación del complejo de escilo-inositol/ácido bórico. Las tasas de recuperación de los grupos de prueba del pH 9.0, pH 9.5, y pH 10.0 alcanzaron una tasa de recuperación del 90% o más en el día 4, y se encontró que la tasa de recuperación se volvió constante del 94% a un si se extendía el periodo de prueba.
El análisis RMN del filtrado del grupo de prueba de pH 9.5 en el día 7 revela que 5.9% (p/v) mio-inositol de aproximadamente 0.2% (p/v) de mio-inositol permaneció en la solución. Esto es, se encontró que el complejo fue
sacado como precipitado mediante el método de la presente invención en el caso donde la concentración del complejo de escilo-inositol/ácido bórico es de 0.2% (p/v).
Ejemplo 17
Método para formar complejo de escilo-inositol/ácido bórico de la mezcla de reducción de escilo-inososa y disolver el complejo, y luego liberar y desalinizar el escilo-inositol utilizando una resina de intercambio
10 g (56 mmol) del polvo de escilo-inososa se disuelve en 50 ml de agua caliente, y la solución se enfrió a temperatura ambiente. Posteriormente, se agrega agua con el fin de tener un volumen de 90 ml. La solución se ajustó a un pH de 7.5 con una solución acuosa de NaOH 5N, y se agrega adicionalmente agua con el fin de tener un volumen de 100 ml.
0.59 g de polvo de NaBH4 se agrega gradualmente a la solución durante 15 minutos con agitación para efectuar una reacción de reducción. La temperatura de la solución de reacción se incrementa hasta 36°C debido al calentamiento de la reacción. 30 minutos más tarde, se disolvieron 6.75 g de ácido bórico y 7.22 g de NaCl en la solución de reacción enfriada a 31°C, para preparar de esta manera una solución en la cual se forma el complejo. Luego, la solución en la cual se forma el complejo se ajustó a un pH de 9.5 con una solución acuosa de NaOH 5N, y la solución se mantuvo a un pH de 9.5 con una solución acuosa de NaOH 5N mediante un aparato “stat” de pH con agitación. 3 días más tarde, los precipitaos contenidos en la solución en la cual se forma el complejo se filtraron y se lavaron con una pequeña cantidad de agua, seguido por secado, para producir de esta manera 5.71 g (20.5 mmol) del complejo escilo-inositol/ácido bórico.
230 ml de solución de ácido clorhídrico 1.05N se agrega a 5.71 g del complejo resultante de escilo-inositol/ácido bórico, para disolver el complejo de escilo-inositol ácido bórico y de esta manera se obtuvo una solución disuelta. La solución disuelta fue una solución ácida 0.2N. Luego, la solución disuelta se paso a través de una columna llena con 200 ml de resina de intercambio de ión con ácido fuerte (Duolite C20, tipo H+, Sumitomo Chemical Co., Ltd.) a una tasa de flujo de 2 ml/min, y eluado resultante se paso a través de una columna llena con 400 ml de resina de intercambio de ión con base fuerte (Duolite A 116, tipo OH-, Sumitomo Chemical Co., Ltd.). El eluado resultante se concentra, para producir de esta manera 3.52 g (19.5 mmol) de un polvo blanco. El análisis RMN revela que el polvo blanco fue escilo-inositol. Mientras tanto, el rendimiento de escilo-inositol proveniente de la escilo-inososa fue del 35%.
Ejemplo 18
Método para formar complejo de escilo-inositol/ácido bórico de la mezcla de reducción de escilo-inososa y disolver el complejo y luego liberar y cristalizar el escilo-inositol mediante precipitación con disolvente orgánico
Como materia prima, 5.71 g (20.5 mmol) de un complejo de escilo-inositol/ácido bórico que se había preparado a partir de 10g (56 mmol) de polvo de escilo-inososa de la misma manera que se utiliza en el ejemplo 17.
Se agregaron 5.71 g de un complejo de escilo-inositol/ácido bórico y un recipiente cónico de 100 ml con una cubierta junto con un agitador, de 22.8 ml de una solución de ácido clorhídrico de 1.83N se agrega para preparar una suspensión. Después de completar la agitación durante 1 hora, se agregan 23 ml de metanol a este, y la mezcla se agita adicionalmente. 5 horas más tarde, la suspensión se filtró, y lo sólidos se lavaron con una cantidad pequeña de metanol y se secan, para darle un rendimiento de esta manera de 3.58 g (20.0 mmol) de escilo-inositol crudo.
Luego, 3.58 g de escilo-inositol crudo resultante se disolvieron en 230 ml de agua, y 20 ml de resina de intercambio de ión de ácido fuerte (Duolite C20/tipo H+) y 40 ml de una resina de intercambio de ión de base fuerte (Duolite A116/tipo OH+) se agregan a esta, seguidos por agitación. Después de completar la agitación durante 30 minutos, la resina de intercambio de ión se separaron mediante filtración, y el filtrado resultante se concentro, para rendirse de esta manera
3.41 g (18.9 mmol) del polvo blanco. El análisis RMN revela que el polvo blanco fue de escilo-inositol. Mientras tanto, el rendimiento de escilo-inositol proveniente de la escilo-inososa fue del 34%.
Ejemplo 19 (Comparativo)
Método para reducir escilo-inososa, y luego liberar directamente y cristalizar escilo-inositol
5 g (28 mmol) de polvo de escilo-inososa se disolvieron en 40 ml de agua caliente, y la solución se enfrió a temperatura ambiente. La solución se ajustó a un pH de 7.5 con una solución acuosa de NaOH 5N y el agua se agrega adicionalmente con el fin de tener un volumen de 45 ml.
0.29 g de polvo de NaBH4 se agrega gradualmente a la solución durante 15 minutos con agitación para efectuar una reacción de reducción. La temperatura de la solución de reacción se incrementa hasta 37°C debido al calentamiento de la reacción. 30 minutos más tarde, la solución de reacción que se había enfriado hasta 30°C se ajustó aun pH de 1.0 con ácido clorhídrico 5N. Posteriormente, se agrega agua con el fin de tener un volumen de 50 ml, para de esta manera preparar una solución ácida 0.1 N. luego, se agregan 25 ml de metanol a la solución con agitación. 10 minutos más
tarde, la solución comenzó gradualmente a volverse opaca, y la suspensión se agita adicionalmente durante 24 horas. 24 horas más tarde, la suspensión se filtró, y el lavado se efectuó con una cantidad pequeña de metanol, seguido por secado, para rendir de esta manera 1.55 g (8.6 mmol) de escilo-inositol crudo.
Luego, 1.55 g de escilo-inositol crudo resultante se disuelve en 120 ml de agua, y 10 ml de resina de intercambio de ión de ácido fuerte (Duolite C20/tipo H+) 20 ml de una resina de intercambio de ión de base fuerte (Duolite A116/tipo OH-) se agregaron, seguido por agitación. Después de completar la agitación durante 30 minutos, la resina de intercambio de ión se separaron mediante filtración, y el filtrado resultante se concentro, para rendir de esta manera 1.51 g (8.3 mmol) de polvo blanco. Los análisis RMN revelaron que el polvo blanco era escilo-inositol. Mientras tanto, el rendimiento del escilo-inositol proveniente de la escilo-inososa fue del 30%.
APLICACIÓN INDUSTRIAL
De acuerdo con la presente invención, el escilo-inositol que se está disponible como un fármaco se puede producir eficientemente. Mientras tanto, el método de producción de la presente invención tiene una ventaja de generar difícilmente isómeros.
De acuerdo con la presente invención, el complejo de escilo-inositol/ácido bórico se puede formar eficientemente de una mezcla que contiene escilo-inositol y azúcares neutros diferentes de escilo-inositol, y la alta pureza del escilo-inositol se puede obtener eficientemente del complejo resultante de escilo-inositol/ácido bórico mediante una operación fácil.
LISTA DE SECUENCIAS
<110> Hokko CHEMICAL INDUSTRY CO., LTD.
<120> MÉTODO PARA PRODUCIR ESCILO-INOSITOL
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<213> Artificial
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<223> cebador
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<213> Artificial
<220>
<223> cebador
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<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> cebador
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<213> Artificial
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<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> cebador
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<213> Artificial
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<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> cebador
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<220>
<223> cebador
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<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> cebador
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<220>
<223> cebador
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<220>
<223> cebador
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (18), (27)
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<220>
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<222> (15)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (18), (24)
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<210> 31
<211> 26
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> cebador
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<212> ADN
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (7), (17)
<223> n=inosina
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<213> Artificial
<220>
<223> cebador
<400> 33 gctcgtcaac gatcctgaaa ttgat 25
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<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> cebador
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<213> Artificial
<220>
<223> cebador
<400> 35 cccttcaatt tccgggcggg t 21
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<212> ADN
<213> Artificial
<220>
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<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> cebador
<400> 37 tatgaattcg ttatgccttc tcatgctgtc g 31
Claims (10)
- REIVINDICACIONES1. Un método para producir un escilo-inositol purificado que comprende:una primera etapa de precipitación de un complejo escilo-inositol/ácido bórico agregando ñacido bórico y un sal metálica a una mezcla líquida que contiene escilo-inositol y un azúcar neutro diferente a escilo-inositol en una cantidad dos veceso más veces el número de moles de escilo-inositol disuelto en la mezcla líquida, y ajustando el pH de la mezcla líquida a
- 8.0 hasta 11.0;una segunda etapa de separación del complejo a partir de la mezcla líquida;una tercera etapa de disolución del complejo separado en ácido para escindirlo en escilo-inositol y ácido bórico; yuna cuarta etapa para aislar y purificar el escilo-inositol a partir de la solución ácida o suspensión ácida obtenidad en la tercera etapa, en donde la sal metálica que se va a gregar es de una o más clases de sales metálicas selecciondas del grupo consistente de NaCl, NaHCO3, Na2CO3, Na2SO4, NaHSO4, NaH2PO4, Na2HPO4, Na3PO4, borax, KCl, KHCO3, K2CO3, K2SO4, KHSO4, KH2PO4, K2HPO4, K3PO4, MgCl2, MgCO3, y MgSO4.
-
- 2.
- El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde, en la primera etapa, las cantidades de ácido bórico y sal metálica que van a ser añadidas es no menor de dos veces, y no más de tres veces el número de moles del esciloinositol disuelto en la mezcla líquido.
-
- 3.
- El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde, en la primera etapa, el pH de la mecla líquida se ajusta de
- 9.0 a 10.0.
-
- 4.
- El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la mezcla líquida que contiene el escilo-inositol y el azúcar neutro deiferente al escilo-inositol es una mezcl líquida que contiene mio-inositol y escilo-inositol obtenido reduciendo la escilo-inososa en una solución que contiene escilo-inososa.
-
- 5.
- El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde, en la tercera etapa, la solución obtenida por disolución del complejo en ácido se ajusta a una solución ácida de 0.1 N o superior; y, en la cuarta etapa, la solución ácida se pone en contacto con una resina de intercambio iónico ácida fuerte, y con una resina de intercambio iónico básica fuerte, y con una resina de absorción selectiva de ácido bórico, y luego el escilo-inositol es precipitado desde la solución ácida.
-
- 6.
- El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde, en la cuarta etapa, el escilo-inositol es precipitado agregando un solvente orgánico acuoso a la solución ácida o a la suspensión ácida.
-
- 7.
- El método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el solvente orgánico acuoso es etanol o metanol; y el etanol se agrega en un volumen de 0.3 a 3 veces mayor, o el metanol se agrega en un volumen de 0.3 a 5 veces mayor, que el de la solución ácida o la suspensión ácida.
-
- 8.
- El método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el solvente orgánico acuoso es etanol o metanol, y el etanol se agrega en un volumen 0.6 a 1.5 veces mayor, o el metanol se agrega en un volumen 0.9 a 2 veces mayor, que el de la solución ácida o la suspensión ácida.
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