JP4526485B2 - シロ−イノシトールの製造方法 - Google Patents
シロ−イノシトールの製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4526485B2 JP4526485B2 JP2005514651A JP2005514651A JP4526485B2 JP 4526485 B2 JP4526485 B2 JP 4526485B2 JP 2005514651 A JP2005514651 A JP 2005514651A JP 2005514651 A JP2005514651 A JP 2005514651A JP 4526485 B2 JP4526485 B2 JP 4526485B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- inositol
- scyllo
- solution
- myo
- enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 793
- CDAISMWEOUEBRE-CDRYSYESSA-N scyllo-inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-CDRYSYESSA-N 0.000 title claims abstract description 467
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 96
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 claims abstract description 252
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 claims abstract description 226
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 94
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 58
- 241000589220 Acetobacter Species 0.000 claims abstract description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 129
- 241000589234 Acetobacter sp. Species 0.000 claims description 35
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 24
- 241000776564 Acetobacter cerevisiae Species 0.000 claims description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 277
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 277
- VYEGBDHSGHXOGT-HYFGLKJPSA-N 2,4,6/3,5-pentahydroxycyclohexanone Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)C(=O)[C@@H](O)[C@@H]1O VYEGBDHSGHXOGT-HYFGLKJPSA-N 0.000 abstract description 212
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 abstract description 87
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical class OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 86
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 abstract description 86
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 abstract description 82
- 108010050450 myo-inositol 2-dehydrogenase Proteins 0.000 abstract description 81
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 abstract description 75
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 59
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 abstract description 41
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 abstract description 36
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 abstract description 32
- 239000002253 acid Substances 0.000 abstract description 31
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 abstract description 27
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 abstract description 24
- 229910052751 metal Chemical class 0.000 abstract description 21
- 239000002184 metal Chemical class 0.000 abstract description 21
- 239000000725 suspension Substances 0.000 abstract description 17
- 241001453380 Burkholderia Species 0.000 abstract description 6
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 450
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 275
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 181
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 145
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 135
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 124
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 98
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical group [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 94
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 93
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 89
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 79
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 75
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 66
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical group CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 59
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 58
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 58
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 58
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 56
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 54
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 47
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 47
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 45
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 43
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 43
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 42
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 41
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 39
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 38
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 35
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 34
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 31
- 239000000047 product Substances 0.000 description 31
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 31
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 30
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 30
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 30
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 29
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 28
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 27
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 27
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 26
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 26
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 25
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 24
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 24
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 24
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 24
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 23
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 22
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 21
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 21
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 21
- CCBICDLNWJRFPO-UHFFFAOYSA-N 2,6-dichloroindophenol Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1N=C1C=C(Cl)C(=O)C(Cl)=C1 CCBICDLNWJRFPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 102100034289 Deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase SAMHD1 Human genes 0.000 description 20
- 101000641031 Homo sapiens Deoxynucleoside triphosphate triphosphohydrolase SAMHD1 Proteins 0.000 description 20
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 20
- 230000001603 reducing effect Effects 0.000 description 20
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 19
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 19
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 19
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 19
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 19
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 19
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 18
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 18
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 18
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 18
- 241000276408 Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 Species 0.000 description 17
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 17
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 17
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 17
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 17
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 241000589649 Xanthomonas campestris pv. campestris Species 0.000 description 16
- 239000002585 base Substances 0.000 description 16
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 16
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 16
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 16
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 15
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 15
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 15
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 15
- 101150085694 ydgJ gene Proteins 0.000 description 15
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 14
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 14
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 14
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 14
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 13
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 13
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 13
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 13
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 13
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 13
- CDAISMWEOUEBRE-GNIYUCBRSA-N muco-inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GNIYUCBRSA-N 0.000 description 13
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 13
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 13
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 12
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 12
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 12
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 12
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 12
- 241000589159 Agrobacterium sp. Species 0.000 description 11
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 11
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 11
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 11
- CDAISMWEOUEBRE-NIPYSYMMSA-N epi-inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O CDAISMWEOUEBRE-NIPYSYMMSA-N 0.000 description 11
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 11
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 11
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 11
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 11
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 11
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 11
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 11
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- -1 L-kilo-inositol Chemical compound 0.000 description 10
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 10
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 10
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 10
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 10
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 10
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 9
- 108020005199 Dehydrogenases Proteins 0.000 description 9
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 9
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 9
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 9
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 9
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 9
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 9
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 9
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 9
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 20-hydroxyecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)(O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 0.000 description 8
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 8
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 8
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 8
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 8
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 8
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 8
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 8
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 8
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 7
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 7
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 7
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 7
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 7
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 7
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 7
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 7
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 7
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 7
- 230000000707 stereoselective effect Effects 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- VYEGBDHSGHXOGT-ZLIBEWLCSA-N (2r,3s,5r,6s)-2,3,4,5,6-pentahydroxycyclohexan-1-one Chemical compound OC1[C@H](O)[C@@H](O)C(=O)[C@@H](O)[C@@H]1O VYEGBDHSGHXOGT-ZLIBEWLCSA-N 0.000 description 6
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 6
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 6
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 6
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 6
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 6
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 6
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 6
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 6
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 6
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 6
- 229960004592 isopropanol Drugs 0.000 description 6
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 6
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 6
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 6
- BPHPUYQFMNQIOC-MBOVONDJSA-N (2r,3r,4s,5r)-2-(hydroxymethyl)-6-propan-2-ylsulfanyloxane-3,4,5-triol Chemical compound CC(C)SC1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-MBOVONDJSA-N 0.000 description 5
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 5
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 5
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 5
- ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N Molybdenum Chemical compound [Mo] ZOKXTWBITQBERF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000010718 Oxidation Activity Effects 0.000 description 5
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 5
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 5
- 241001135520 Robbsia andropogonis Species 0.000 description 5
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 5
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 5
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 5
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 5
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 5
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 5
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 5
- 229910001882 dioxygen Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 5
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 5
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 5
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 5
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 5
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 229910052750 molybdenum Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000011733 molybdenum Substances 0.000 description 5
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 5
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 5
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 5
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 5
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 5
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 4
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 4
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 4
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000010757 Reduction Activity Effects 0.000 description 4
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 4
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 4
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 4
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N hydron Chemical compound [H+] GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000004001 inositols Chemical class 0.000 description 4
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- RPACBEVZENYWOL-XFULWGLBSA-M sodium;(2r)-2-[6-(4-chlorophenoxy)hexyl]oxirane-2-carboxylate Chemical compound [Na+].C=1C=C(Cl)C=CC=1OCCCCCC[C@]1(C(=O)[O-])CO1 RPACBEVZENYWOL-XFULWGLBSA-M 0.000 description 4
- 241000776559 Acetobacter malorum Species 0.000 description 3
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 3
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 3
- PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N Ethyl methanesulfonate Chemical compound CCOS(C)(=O)=O PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012448 Lithium borohydride Substances 0.000 description 3
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- 238000003028 enzyme activity measurement method Methods 0.000 description 3
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 239000012456 homogeneous solution Substances 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- 238000007852 inverse PCR Methods 0.000 description 3
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 3
- FSVCQIDHPKZJSO-UHFFFAOYSA-L nitro blue tetrazolium dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 FSVCQIDHPKZJSO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 3
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 3
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 3
- 235000012773 waffles Nutrition 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- VEPOHXYIFQMVHW-XOZOLZJESA-N 2,3-dihydroxybutanedioic acid (2S,3S)-3,4-dimethyl-2-phenylmorpholine Chemical compound OC(C(O)C(O)=O)C(O)=O.C[C@H]1[C@@H](OCCN1C)c1ccccc1 VEPOHXYIFQMVHW-XOZOLZJESA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WTLKTXIHIHFSGU-UHFFFAOYSA-N 2-nitrosoguanidine Chemical compound NC(N)=NN=O WTLKTXIHIHFSGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000589212 Acetobacter pasteurianus Species 0.000 description 2
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FMMWHPNWAFZXNH-UHFFFAOYSA-N Benz[a]pyrene Chemical compound C1=C2C3=CC=CC=C3C=C(C=C3)C2=C2C3=CC=CC2=C1 FMMWHPNWAFZXNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L Brilliant Blue Chemical compound [Na+].[Na+].C=1C=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C(=CC=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=CC=1N(CC)CC1=CC=CC(S([O-])(=O)=O)=C1 SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Natural products CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010009512 Glucose-fructose oxidoreductase Proteins 0.000 description 2
- LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N L-(-)-Sorbose Chemical compound OCC1(O)OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N Nitrous acid Chemical compound ON=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PCNDJXKNXGMECE-UHFFFAOYSA-N Phenazine Natural products C1=CC=CC2=NC3=CC=CC=C3N=C21 PCNDJXKNXGMECE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589634 Xanthomonas Species 0.000 description 2
- QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N ac1mix0p Chemical compound C1=CC=C2N(C[C@H](C)CN(C)C)C3=CC(OC)=CC=C3SC2=C1.O([C@H]1[C@]2(OC)C=CC34C[C@@H]2[C@](C)(O)CCC)C2=C5[C@]41CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C2O QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000999 acridine dye Substances 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 239000003570 air Substances 0.000 description 2
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 2
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- VAYGXNSJCAHWJZ-UHFFFAOYSA-N dimethyl sulfate Chemical compound COS(=O)(=O)OC VAYGXNSJCAHWJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- LELOWRISYMNNSU-UHFFFAOYSA-N hydrogen cyanide Chemical compound N#C LELOWRISYMNNSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 239000004973 liquid crystal related substance Substances 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- MBABOKRGFJTBAE-UHFFFAOYSA-N methyl methanesulfonate Chemical compound COS(C)(=O)=O MBABOKRGFJTBAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CXKWCBBOMKCUKX-UHFFFAOYSA-M methylene blue Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 CXKWCBBOMKCUKX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229960000907 methylthioninium chloride Drugs 0.000 description 2
- 239000013081 microcrystal Substances 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 239000004328 sodium tetraborate Substances 0.000 description 2
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000283763 Acetobacter aceti Species 0.000 description 1
- 235000007847 Acetobacter aceti Nutrition 0.000 description 1
- 241001497543 Acetobacter indonesiensis Species 0.000 description 1
- 241001310537 Acetobacter orientalis Species 0.000 description 1
- 241001497697 Acetobacter orleanensis Species 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241001674044 Blattodea Species 0.000 description 1
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical compound [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241001583810 Colibri Species 0.000 description 1
- 206010010071 Coma Diseases 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- AVVWPBAENSWJCB-IVMDWMLBSA-N D-glucofuranose Chemical class OC[C@@H](O)[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H]1O AVVWPBAENSWJCB-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 241000032686 Gluconacetobacter liquefaciens Species 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 208000007976 Ketosis Diseases 0.000 description 1
- 241000588915 Klebsiella aerogenes Species 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- MBBZMMPHUWSWHV-BDVNFPICSA-N N-methylglucamine Chemical compound CNC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBBZMMPHUWSWHV-BDVNFPICSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 241001135514 Paraburkholderia caryophylli Species 0.000 description 1
- 241000866630 Paraburkholderia graminis Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 239000007868 Raney catalyst Substances 0.000 description 1
- NPXOKRUENSOPAO-UHFFFAOYSA-N Raney nickel Chemical compound [Al].[Ni] NPXOKRUENSOPAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000564 Raney nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 1
- PPWHTZKZQNXVAE-UHFFFAOYSA-N Tetracaine hydrochloride Chemical compound Cl.CCCCNC1=CC=C(C(=O)OCCN(C)C)C=C1 PPWHTZKZQNXVAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N [14c]-nicotinamide Chemical compound N[14C](=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;hydrate Chemical compound O.CC#N PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 150000001323 aldoses Chemical class 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- VWPUAXALDFFXJW-UHFFFAOYSA-N benzenehexol Chemical compound OC1=C(O)C(O)=C(O)C(O)=C1O VWPUAXALDFFXJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-JMVOWJSSSA-N cis-inositol Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-JMVOWJSSSA-N 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000012084 conversion product Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 1
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012458 free base Substances 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 150000003840 hydrochlorides Chemical class 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000002584 ketoses Chemical class 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- SYSQUGFVNFXIIT-UHFFFAOYSA-N n-[4-(1,3-benzoxazol-2-yl)phenyl]-4-nitrobenzenesulfonamide Chemical class C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1S(=O)(=O)NC1=CC=C(C=2OC3=CC=CC=C3N=2)C=C1 SYSQUGFVNFXIIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N nickel Substances [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M potassium hydroxide Substances [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000011403 purification operation Methods 0.000 description 1
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011946 reduction process Methods 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000002195 soluble material Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate group Chemical group S(=O)(=O)([O-])[O-] QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C29/00—Preparation of compounds having hydroxy or O-metal groups bound to a carbon atom not belonging to a six-membered aromatic ring
- C07C29/132—Preparation of compounds having hydroxy or O-metal groups bound to a carbon atom not belonging to a six-membered aromatic ring by reduction of an oxygen containing functional group
- C07C29/136—Preparation of compounds having hydroxy or O-metal groups bound to a carbon atom not belonging to a six-membered aromatic ring by reduction of an oxygen containing functional group of >C=O containing groups, e.g. —COOH
- C07C29/143—Preparation of compounds having hydroxy or O-metal groups bound to a carbon atom not belonging to a six-membered aromatic ring by reduction of an oxygen containing functional group of >C=O containing groups, e.g. —COOH of ketones
- C07C29/145—Preparation of compounds having hydroxy or O-metal groups bound to a carbon atom not belonging to a six-membered aromatic ring by reduction of an oxygen containing functional group of >C=O containing groups, e.g. —COOH of ketones with hydrogen or hydrogen-containing gases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
- C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
- C12P7/26—Ketones
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明はまた、新規なNAD+非依存型ミオ−イノシトール2−デヒドロゲナーゼ及びその製造方法に関する。本発明はまた、NAD+非依存型ミオ−イノシトール2−デヒドロゲナーゼ活性を指標としたシロ−イノソース製造用微生物のスクリーニング方法に関する。本発明はさらに、NAD+非依存型ミオ−イノシトール2−デヒドロゲナーゼ又は該酵素の高活性株を用いたシロ−イノソース及びシロ−イノシトールの製造方法に関する。
本発明はまた、新規酵素シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼ及び、当該酵素を利用したシロ−イノシトールの製造方法に関する。更に詳しくは、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する新規酵素シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼ及び、当該酵素を利用したシロ−イノシトールの製造方法に関する。
本発明はさらに、シロ−イノシトール及びシロ−イノシトール以外の中性糖を含有する混合液から、シロ−イノシトールを効率良く製造する方法に関する。
シロ−イノシトールはアルツハイマー病の治療薬や、生理活性物質の合成原料、液晶化合物の合成原料として利用することができる。
一方、アセトバクター属細菌(非特許文献5参照)は、ミオ−イノシトールに作用して、酸素を吸収し、シロ−イノソースへ酸化することが知られているが、詳細なメカニズムは検討されていない。
本発明はまた、ミオ−イノシトールをシロ−イノソースに変換する反応を触媒する新規な酵素、及びそれを用いたシロ−イノソース及びシロ−イノシトールの新規な製造方法を提供することを課題とする。
本発明はまた、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する新規酵素シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼ、及び、当該酵素を利用したシロ−イノシトールの新規な製造方法を提供することを課題とする。
本発明はさらに、シロ−イノシトール及びシロ−イノシトール以外の中性糖を含有する混合液から、高純度のシロ−イノシトールを効率よく製造する新しい方法を提供することを課題とする。
さらに、AB10253株よりも低い変換能力であるが、ミオ−イノシトールからシロ−イノシトールを生成する能力を有する菌株を自然界から見出し、16SrRNAの塩基配列による同定を試みたところ、アセトバクター・セルビシエ、アセトバクター・マローラム、または、バークホルデリア・アンドロポゴニスに属する微生物が見出された。
これらの微生物を用いることにより、シロ−イノシトールを効率よく製造できることを見出した。
そこで、本発明者らは、ミオ−イノシトールからシロ−イノソースへ変換する反応を触媒することのできる、従来知られていない新しいタイプのNAD+非依存型のミオ−イノシトール2−デヒドロゲナーゼがあるという仮説のもと、該酵素を単離すべく、鋭意研究した。その結果、アセトバクター属に属するアセトバクター・エスピーAB10253株においてNAD+非依存型のミオ−イノシトール2−デヒドロゲナーゼが存在することを見出した。さらに、本発明者らは、この酵素、又はこの酵素の活性の高い微生物を使用することにより、シロ−イノソースを効率よく製造することができること、及び得られたシロ−イノソースを還元することによって高純度のシロ−イノシトールを効率よく製造することに成功した。
以上によって、本発明を完成させるに至った。
(1) アセトバクター属またはバークホルデリア属に属する微生物であって、ミオ−イノシトールをシロ−イノシトールに変換する能力を有する微生物を、ミオ−イノシトールを含む溶液中でミオ−イノシトールに作用させることにより、シロ−イノシトールを前記溶液中に生成蓄積させ、該溶液中からシロ−イノシトールを採取することを特徴とする、シロ−イノシトールの製造方法。
(2) 前記ミオ−イノシトールを含む溶液がミオ−イノシトールを含有する液体培地であり、前記微生物を、該液体培地中で培養することによりミオ−イノシトールに作用させることを特徴とする、(1)の製造方法。
(3) 培養により得られた前記微生物の菌体を、前記溶液中でミオ−イノシトールに作用させることを特徴とする、(1)の製造方法。
(4) 前記微生物が、アセトバクター・セルビシエ、アセトバクター・マローラム、または、バークホルデリア・アンドロポゴニスに属する微生物である(1)〜(3)のいずれかの製造方法。
(5) 前記微生物が、アセトバクター・エスピーAB10281株(FERM BP-10119)またはその変異株である、(1)〜(3)のいずれかの製造方法。
(6) ミオ−イノシトールをシロ−イノシトールに変換する能力を有する、アセトバクター・エスピーAB10281株(FERM BP-10119)またはその変異株。
(a)作用:電子受容物質の存在下で、ミオ−イノシトールから電子を奪いシロ−イノソースを生成する反応を触媒する、
(b)至適pH:pH4.5〜5.5において活性が極大値を示す、
(c)補因子:1モルの酵素に1モルのヘム鉄を含有する、
(d)阻害剤:1mMのSn2+イオンにより酵素活性が1%以下に阻害される、
(e)サブユニット構造:少なくとも分子量76kダルトンと46kダルトンのタンパク質を含有するヘテロマーである、
(f)基質特異性:D−キロ−イノシトール、ムコ−イノシトール、ミオ−イノシトールに反応し、D−キロ−1−イノソース、L−キロ−2−イノソース、シロ−イノソースへ、それぞれ、変換する。アロ−イノシトール、シロ−イノシトール、L−キロ−イノシトール、グルコースには反応しない。
(8) NAD+非依存型ミオ−イノシトール2−デヒドロゲナーゼ生産能を有するアセトバクター属に属する微生物を培養し、培養された微生物の菌体から、ミオ−イノシトール2−デヒドロゲナーゼを分離精製することを特徴とする、ミオ−イノシトール2−デヒドロゲナーゼの製造方法。
(9) 前記微生物がアセトバクター・エスピーAB10253株 (FERM BP-10136)である、(8)の製造方法。
(10) ミオ−イノシトール及び電子受容体を含有する溶液中で、NAD+非依存型ミオ−イノシトール2−デヒドロゲナーゼをミオ−イノシトールに作用させてシロ−イノソースを生成せしめ、生成したシロ−イノソースを溶液中から分離精製することを特徴とする、シロ−イノソースの製造方法。
(11) ミオ−イノシトール及び電子受容体を含有する溶液中で、NAD+非依存型ミオ−イノシトール2−デヒドロゲナーゼをミオ−イノシトールに作用させてシロ−イノソースを生成させる工程、前記シロ−イノソースに還元剤を作用させてシロ−イノシトールを生成させる工程、及び前記シロ−イノシトールを分離精製する工程を含む、シロ−イノシトールの製造方法。
(12) アセトバクター・エスピーのAB10253株を変異処理し、得られた変異株から、NAD+非依存型ミオ−イノシトール2−デヒドロゲナーゼ活性を指標にして選別することを特徴とする、シロ−イノソース製造用微生物のスクリーニング方法。
(13) 微生物を含む天然試料の中から微生物を単離し、単離された微生物から、NAD+非依存型ミオ−イノシトール2−デヒドロゲナーゼ活性を指標にして選別することを特徴とする、シロ−イノソース製造用微生物のスクリーニング方法。
(14) (12)又は(13)のスクリーニング方法によって得られたシロ−イノソース製造用微生物を、ミオ−イノシトールを含有する培地で培養することにより、ミオ−イノシトールからシロ−イノソースを生成せしめ、生成したシロ−イノソースを培地から分離精製することを特徴とする、シロ−イノソースの製造方法。
(15) (12)又は(13)のスクリーニング方法によって得られたシロ−イノソース製造用微生物を、ミオ−イノシトールを含有する培地で培養することにより、ミオ−イノシトールからシロ−イノソースを生成させる工程、前記シロ−イノソースに還元剤を作用させてシロ−イノシトールを生成させる工程、及び前記シロ−イノシトールを分離精製する工程を含む、シロ−イノシトールの製造方法。
反応:下記反応式に示すように、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する。
(a)分子量および会合特性 : 38〜46kダルトン、2または3量体を形成する。
(b)補酵素 : NAD+若しくはNADP+又はNADH若しくはNADPHを補酵素とする。
(c)活性化重金属 : Co2+イオンの存在下で活性化される。
(d)阻害重金属 : Sn2+イオンの存在下で阻害される。
(e)至適pH : pH5〜9で活性を有する。
(18) 以下の(A)または(B)のタンパク質。
(A)配列番号28に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(B)配列番号28に記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を有し、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質。
(19) 以下の(A)または(B)のタンパク質をコードするDNA。
(A)配列番号28に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(B)配列番号28に記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を有し、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質。
(20) 以下の(a)または(b)のDNA。
(a)配列番号27に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
(b)配列番号27に記載の塩基配列もしくは同塩基配列に相補的な塩基配列を有するDNAとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(21) (19)または(20)のDNAを含むベクター。
(22) (19)もしくは(20)のDNA、または(21)のベクターを保持する形質転換微生物。
(23) 形質転換する宿主が大腸菌である(22)の形質転換微生物。
(24) (22)または(23)の形質転換微生物を培養し、培養物からシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼを採取することを特徴とする、シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼの製造方法。
(25) (16)のシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼと、NAD+またはNADP+存在下でミオ−イノシトールを酸化しシロ−イノソースを生成する反応を触媒するミオ−イノシトール2−デヒドロゲナーゼ(EC1.1.1.18)とを共存させた溶液中、pH6.0〜8.5で、かつNAD+ またはNADP+存在下で、ミオーイノシトールを基質として、シロ−イノシトールへ酵素変換反応させることを特徴とする、シローイノシトールの製造方法。
(26) 溶液中に、シロ−イノソースを0.01〜3%になるように添加することを特徴とする、(25)のシローイノシトールの製造方法。
(27) 溶液中に、シロ−イノソースを0.2〜0.5%になるように添加することを特徴とする、(25)のシローイノシトールの製造方法。
(28) 溶液中に、Co塩および/または、Mg塩を0.01〜5.0mMになるように添加することを特徴とする、(25)のシローイノシトールの製造方法。
(29) 溶液中に、Co塩および/または、Mg塩を0.2〜2.0mMになるように添加することを特徴とする、(25)のシローイノシトールの製造方法。
(30) 溶液中のミオ−イノシトール濃度が5〜22%になるように調製し、酵素反応で生成したシロ−イノシトールを反応溶液中で結晶化させ、シロ−イノシトールを系外に結晶として、ろ別することを特徴とする、(25)のシローイノシトールの製造方法。
(31) シロイノシトールデヒドロゲナーゼが以下の(A)または(B)のタンパク質である(25)の製造方法。
(A)配列番号28に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(B)配列番号28に記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を有し、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH依存下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質。
(32) シロイノシトールデヒドロゲナーゼが以下の(a)または(b)のDNAによってコードされるタンパク質である(25)の製造方法。
(a)配列番号27に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
(b)配列番号27に記載の塩基配列もしくは同塩基配列に相補的な塩基配列を有するDNAとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH依存下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(33) シロイノシトールデヒドロゲナーゼが以下の(C)または(D)のタンパク質である(25)の製造方法。
(C)配列番号2、4、6、8、10、12または14に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(D)配列番号2、4、6、8、10、12または14に記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を有し、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質。
(34) シロイノシトールデヒドロゲナーゼが以下の(c)または(d)のDNAによってコードされるタンパク質である(25)の製造方法。
(c)配列番号1、3、5、7、9、11または13に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
(d)配列番号1、3、5、7、9、11または13に記載の塩基配列もしくは同塩基配列に相補的な塩基配列を有するDNAとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(36) 前記第1の工程において、加えるホウ酸及び金属塩の量が、前記混合液中に溶解したシロ−イノシトールの2倍モル以上、かつ3倍モル以下であることを特徴とする、(35)の製造方法。
(37) 前記第1の工程において、前記混合液のpHを9.0〜10.0に調整することを特徴とする、(35)の製造方法。
(38) 前記金属塩が、NaCl、NaHCO3、Na2CO3、Na2SO4、NaHSO4、NaH2PO4、Na2HPO4、Na3PO4、硼砂、KCl、KHCO3、K2CO3、K2SO4、KHSO4、KH2PO4、K2HPO4、K3PO4、MgCl2、MgCO3、およびMgSO4からなる群より選ばれる1種または2種類以上の金属塩である、(35)の製造方法。
(39) 前記シロ−イノシトール及びシロ−イノシトール以外の中性糖を含有する混合液が、シロ−イノソースを含有する溶液中でシロ−イノソースを還元することにより得られるミオ−イノシトール及びシロ−イノシトールを含有する混合液である、(35)の製造方法。
(40) 前記第3の工程において、前記複合体を酸に溶解させて得られた溶液を0.1規定以上の酸性に調整し、かつ、前記第4の工程において、前記酸性溶液を強酸性イオン交換樹脂、及び強塩基性イオン交換樹脂又はホウ酸選択的吸着樹脂に接触させた後、該酸性溶液からシロ−イノシトールを析出させることを特徴とする、(35)の製造方法。
(41) 前記第4の工程において、前記酸性溶液又は酸性懸濁液に水溶性有機溶媒を加えてシロ−イノシトールを析出させることを特徴とする、(35)の製造方法。
(42) 前記水溶性有機溶媒がエタノール又はメタノールであり、前記酸性溶液又は酸性懸濁液に対して、エタノールを0.3〜3倍容、又はメタノールを0.3〜5倍容加えることを特徴とする、(41)の製造方法。
(43) 前記水溶性有機溶媒がエタノール又はメタノールであり、前記酸性溶液又は酸性懸濁液に対して、エタノールを0.6〜1.5倍容、またはメタノールを0.9容〜2倍容加えることを特徴とする、(41)の製造方法。
(44) シロ−イノソースを含有する溶液中において、シロ−イノソースを水素化ホウ素金属塩を用いて還元し、ミオ−イノシトール及びシロ−イノシトールを含有する混合液を得る第1の工程、前記混合液に酸を加えて混合液中のシロ−イノシトール・ホウ酸複合体を溶解させ、かつ溶液を0.01規定以上の酸性溶液に調整する第2の工程、及び前記酸性溶液に、水溶性有機溶媒をミオ−イノシトールが析出しない量で加えて、シロ−イノシトールのみを析出させる第3の工程を含む、シロ−イノシトールの製造方法。
(45) 前記第3の工程において、加える水溶性有機溶媒がエタノール、メタノール又は1−プロパノールであり、前記酸性溶液に対して、エタノールを0.2〜0.4倍容、メタノールを0.2〜0.8倍容、又は1−プロパノールを0.2〜0.4倍容加えることを特徴とする、(44)の製造方法。
(46) 前記第3の工程において、加える水溶性有機溶媒がエタノール、メタノール又は1−プロパノールであり、前記酸性溶液に対して、エタノールを0.35〜0.45倍容、メタノールを0.45〜0.55倍容、又は1−プロパノールを0.35〜0.45倍容加えることを特徴とする、(44)の製造方法。
本発明の一形態は、アセトバクター属またはバークホルデリア属に属する微生物であって、ミオ−イノシトールをシロ−イノシトールに変換する能力を有する微生物を、ミオ−イノシトールを含む溶液中でミオ−イノシトールに作用させることにより、シロ−イノシトールを前記溶液中に生成蓄積させ、該溶液中からシロ−イノシトールを採取することを特徴とする、シロ−イノシトールの製造方法に関する。
なお、アセトバクター・エスピーAB10253株は、2002年5月24日に独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(〒305-8566 日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6)に受託番号FERM P-18868として寄託され、さらに、ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-10136の受託番号で寄託されている。
本発明の他の形態は、新規なNAD+非依存型ミオ−イノシトール2−デヒドロゲナーゼ、ならびに該酵素を用いたシロ−イノソースおよびシロ−イノシトールの製法に関する。
本発明のNAD+非依存型ミオ−イノシトール2−デヒドロゲナーゼは、少なくとも以下の理化学的性質を有する。
(a)作用:電子受容物質の存在下で、ミオ−イノシトールから電子を奪いシロ−イノソースを生成する反応を触媒する、
(b)至適pH:pH4.5〜5.5において活性が極大値を示す、
(c)補因子:1モルの酵素に1モルのヘム鉄を含有する、
(d)阻害剤:1mMのSn2+イオンにより酵素活性が1%以下に阻害される、
(e)サブユニット構造:少なくとも分子量76kダルトンと46kダルトンのタンパク質を含有するヘテロマーである、
(f)基質特異性:D−キロ−イノシトール、ムコ−イノシトール、ミオ−イノシトールに反応し、D−キロ−1−イノソース、L−キロ−2−イノソース、シロ−イノソースへ、それぞれ、変換する。アロ−イノシトール、シロ−イノシトール、L−キロ−イノシトール、グルコースには反応しない。
本発明のNAD+非依存型ミオ−イノシトール2−デヒドロゲナーゼの製造法は、NAD+非依存型ミオ−イノシトール2−デヒドロゲナーゼ生産能を有するアセトバクター属に属する微生物を培養し、培養された微生物の菌体から、ミオ−イノシトール2−デヒドロゲナーゼを分離精製することを特徴とする製造方法である。
本発明はまた、アセトバクター・エスピーのAB10253株を変異処理し、得られた変異株から、NAD+非依存型ミオ−イノシトール2−デヒドロゲナーゼ活性を指標にして選別することを特徴とする、シロ−イノソース製造用微生物のスクリーニング方法に関する。
本発明はまた、ミオ−イノシトールに、NAD+非依存ミオ−イノシトール2−デヒドロゲナーゼ又は同酵素の高活性株(シロ−イノソース製造用微生物)を作用させることを特徴とする、シロ−イノソースの製造方法に関する。
本発明の「NAD+非依存型ミオ−イノシトール2−デヒドロゲナーゼを用いたシロ−イノソースの製造方法」は、NAD+非依存型ミオ−イノシトール2−デヒドロゲナーゼをミオ−イノシトール及び電子受容体を含有する溶液中でミオ−イノシトールに作用させてシロ−イノソースを生成せしめ、生成したシロ−イノソースを溶液中から分離精製することを特徴とする製造方法である。ここでNAD+非依存型ミオ−イノシトール2−デヒドロゲナーゼは、既述した方法によって得られるものを使用することができる。なお、本酵素はミオ−イノシトールからシロ−イノソースを生成する活性を有する限り、その精製の程度は問わない。
本発明はまた、上記スクリーニング方法によって得られるシロ−イノソース製造用微生物を、ミオ−イノシトールを含有する培地で培養することにより、ミオ−イノシトールからシロ−イノソースを生成せしめ、生成したシロ−イノソースを培地から分離精製することを特徴とする、微生物を用いたシロ−イノソースの製造方法に関する。
本発明はまた、NAD+非依存型ミオ−イノシトール2−デヒドロゲナーゼ又は該酵素の高活性株を用いてミオ−イノシトールからシロ−イノソースを生成させ、得られたシロ−イノソースを還元してシロ−イノシトールを得る事を特徴とする、シロ−イノシトールの製造方法に関する。
また、後述するように、得られたシロ−イノシトールを含む溶液に、ホウ酸と、NaClを加えて、シロ−イノシトールホウ酸複合体を作り、これをろ別後に、酸によりホウ酸を遊離させ、メタノールのような有機溶媒を加えることで結晶化させる方法によって、シロ−イノシトールを分離精製してもよい。
本発明の他の形態は、新規酵素シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼ、ならびに該酵素を用いたシロ−イノシトールの製法に関する。
本発明のシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼは、以下の反応式に示すように、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する。
反応:以下の反応式に示すように、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する。
還元活性の測定は、シローイノソースを基質にして、NADHまたは、NADPHを共存させ、NADHまたはNADPHの340nmの吸収の減少を測定することで成される。また、反応後の溶液を、HPLC、GLCなどの分析装置で、生産物(シロ−イノシトールか、ミオ−イノシトール)の判断でも可能である。
分子量および会合特性: 38〜46kダルトン、2または3量体を形成する。
分子量は、SDS−PAGE(ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動)などの結果から、またはDNAの全長から酵素の推定分子量を算出することができる。また、会合特性は、ゲルろ過カラム(東ソー社:2000SWXL)で分画した画分の活性を測定し、相当する分子量画分から、分子量を計算し、これを、酵素の分子量で割った値を整数化することにより求めることが可能である。
補酵素: NAD+若しくはNADP+又はNADH若しくはNADPHを補酵素とする。
補酵素の選択性は、反応液(200mMトリス緩衝液pH8.0、2% NADPHまたはNADH、1%シロ−イノソース)5μlと、酵素液5μlを混合し、36℃、30min反応後、ただちに、500μlの水を加えて、340nmの吸光度を測定し、酵素液の代わりに水を用いた試験液のブランク値から、340nmの吸光度の減少量を測定することで確認することができる。なお、%で示した値は質量/体積(W/V)の百分率を示すものであり、濃度を%で表示する場合は、以下においても同様とする。
活性化重金属 : Co2+イオンの存在下で活性化される。または、Mn2+、Zn2+、Ca2+イオンの存在下で活性化される場合もあり得る。
阻害重金属 : Sn2+イオンの存在下で阻害される。または、Zn2+イオンの存在下で阻害される場合もあり得る。
当該重金属による効果は、反応液(200mMトリス緩衝液pH8.0、2% NADPH、1%シロ−イノソース、2mM金属塩)5μlと、酵素液5μlを混合し、36℃、30min反応後、ただちに、500μlの水を加えて、340nmの吸光度を測定し、酵素液の代わりに水を用いた試験液のブランク値から、340nmの吸光度の減少量を測定することで確認できる。「活性化されるとは」重金属無添加区の酵素活性を100%としたときに重金属1mM添加区の酵素活性が105%以上を、好ましくは120%以上を示すことを意味する。一方、「阻害されるとは」重金属無添加区の酵素活性を100%としたときに重金属1mM添加区の酵素活性が95%以下に、好ましくは70%以下になることを意味する。
至適pH : 本発明酵素は、pH5〜9で活性を有する。
至適pHは、反応液(200mMリン酸緩衝液pH5.0〜9.0、2% NADPH、1%シロ−イノソース)5μlと、酵素液5μlを混合し、36℃、30min反応後、ただちに、500μlの水を加えて、340nmの吸光度を測定し、酵素液の代わりに水を用いた試験液のブランク値から、340nmの吸光度の減少量を測定することで確認できる。至適pHとは、最大活性の90%以上の活性を有することを意味する。本発明酵素は、例えば、至適pHの範囲により酸性側に至適pHがあるグループ(至適pHがpH5.5〜6.5)、中性域に至適pHがあるグループ(至適pHがpH6.5〜7.5またはpH6.5〜8.5)、アルカリ性側に至適pHがあるグループ(至適pHがpH7.0〜8.5またはpH7.5〜9.0)に分けることも可能である。
熱安定性:本発明のシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼは、60℃まで安定である。
熱安定性は、酵素液を所定の温度で10min間処理した後、冷却し、この酵素液と反応液(200mMリン酸緩衝液pH5.0〜9.0、2% NADPH、1%シロ−イノソース)5μlを混合し、36℃、30min反応後、ただちに、500μlの水を加えて、340nmの吸光度を測定し、酵素液の代わりに水を用いた試験液のブランク値から、340nmの吸光度の減少量を測定することで確認できる。「熱安定であるとは」20℃10min処理区の活性を100%として、上記熱処理した酵素の活性が90%以上残存していることを意味する。
シロ−イノソースに対するKm値: シロ−イノソースに対するKm値は、2〜13mMを示す。
シロ−イノソースに対するKm値は、反応液(200mMトリス緩衝液pH8.0、2% NADPH、0.001〜2.5%シロ−イノソース)5μlと、酵素液5μlを混合し、36℃、30min反応後、ただちに、500μlの水を加えて、340nmの吸光度を測定し、酵素液の代わりに水を用いた試験液のブランク値から、340nmの吸光度の減少量を測定することで確認できる。測定値は定法に従い、逆数プロットし、Km値を算出する。本発明酵素は、例えば、シロ−イノソースに対するKm値が4mM未満のグループ、4mM以上10mM未満のグループ、10mM以上13mM未満のグループに分けることも可能である。
基質特異性:相対活性が70%以上の基質は、シロ−イノシトール(SI)、ミオ−イノシトール(MI)、D−キロ−イノシトール(DCI)、エピ−イノシトール(EI)、L−キロ−イノシトール(LCI)が挙げられる。相対活性が20%以上70%未満の基質は、L−キロ−イノシトール(LCI)、エピ−イノシトール(EI)、ムコ−イノシトール(MuI)、ミオ−イノシトール(MI)、D−キロ−イノシトール(DCI)、アロ−イノシトール(AI)、ネオ−イノシトール(NI)が挙げられる。相対活性が20%未満の基質は、アロ−イノシトール(AI)、ネオ−イノシトール(NI)、D−キロ−イノシトール(DCI)、L−キロ−イノシトール(LCI)、エピ−イノシトール(EI)、ムコ−イノシトール(MuI)が挙げられる。
基質特異性は、酸化活性を指標にシロ−イノシトールに対する反応性に対する相対活性を測定することで確認できる。イノシトール異性体としては、シロ−イノシトール(SI)、ミオ−イノシトール(MI)、D−キロ−イノシトール(DCI)、L−キロ−イノシトール(LCI)、エピ−イノシトール(EI)、ムコ−イノシトール(MuI)、アロ−イノシトール(AI)、ネオ−イノシトール(NI)等が挙げられる。本発明のシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼの基質特異性は、相対活性が70%以上の区、70%未満20%以上の区、20%未満の区に分けて示すことが可能である。
測定方法として、反応液(各種イノシトール異性体1%(ネオ−イノシトールのみ0.4%))、200mMトリス緩衝液pH8.0、0.002%NADP+、0.002%ジアホラーゼ、0.01%ニトロテトラゾリウムブルー)50μlと、酵素液50μlを混合し、25℃、3min毎に、545nmの吸光度の増加をマイクロプレートリーダーで測定することが可能である。
シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼの製造に使用することのできる微生物としては、該酵素の生産能を有する限り特に限定されないが、例えば、大腸菌K−12株 ATCC10798(Escherichia coli K-12 ATCC10798)(以下、大腸菌K−12株ともいう)、アセトバクター・エスピー AB10281株 FERM BP-10119(Acetobacter sp.AB10281 FERM BP-10119)(以下、AB10281株ともいう)、バチルス ズブチリス 168株 ATCC23857(Bacillus subtilis 168 ATCC23857)(以下、Bucillus sub.168株、B.sub.168株ともいう)、アグロバクテリウム チュメファシエンス C58株 ATCC33970(Agrobacterium tumefacience C58 ATCC33970)(以下、A.tume.C58株ともいう)、アグロバクテリウム・エスピー AB10121株 FERM P-17383(Agrobacterium sp.AB10121 FERM P-17383)(以下、AB10121株ともいう)、キサントモナス キャンペストリス pv. キャンペストリス ATCC33913(Xanthomonas campestris pv. campestris ATCC33913)(以下、X.camp.ともいう)が挙げられる。
シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼを製造する目的で、これら微生物を培養するために用いる培地は、従来知られる一般的な微生物用培地を使用することが可能である。例えば、アセトバクター・エスピー AB10281株 FERM BP-10119、バチルス ズブチリス 168株 ATCC23857、アグロバクテリウム チュメファシエンス C58株 ATCC33970、アグロバクテリウム・エスピー AB10121株 FERM P-17383、キサントモナス キャンペストリス pv. キャンペストリス ATCC33913を培養するときの培地組成は、目的に達する限り何ら特別の制限はなく、シロ−イノシトールへの変換原料であるミオ−イノシトールに加えて、炭素源、窒素源、有機栄養源、無機塩類等を含有する培地であればよく、合成培地・天然培地のいずれも使用できる。ミオ−イノシトールを0.1〜40%、より好ましくは10〜30%添加し、炭素源としては、グリセロール、シュークロース、マルトースあるいは澱粉を0.1〜20%、より好ましくは0.3〜5%、窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、カザミノ酸、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムあるいは尿素等を0.01〜5.0%、好ましくは0.5〜2.0%添加するのが望ましい。その他、必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、マンガン、亜鉛、鉄、銅、モリブデン、リン酸、硫酸などのイオンを生成することができる無機塩類を培地中に添加することができる。培養液中の水素イオン濃度は特に調製する必要は無いが、好ましくはpH4〜10、より好ましくはpH5〜9に調整し培養すると、効率よくシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼ含有する菌体を得ることができる。
(a)配列番号2、4、6、8、10、12、14または28に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(b)配列番号2、4、6、8、10、12、14または28に記載のアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を有し、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質。
この中で配列番号28のアミノ酸配列を有するシロ−イノシトールデヒドロゲナーゼは、本発明によって提供される新規なタンパク質である。
(a)配列番号1、3、5、7、9、11、13または27に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA。
(b)配列番号1、3、5、7、9、11、13または27に記載の塩基配列もしくは同塩基配列に相補的な塩基配列を有するDNAとストリジェントな条件下でハイブリダイズし、シロ−イノシトールとシロ−イノソース間の酸化還元反応を触媒し、NADHまたはNADPH存在下で、シロ−イノソースを立体特異的にシロ−イノシトールへ還元する酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA。
この中で配列番号27の塩基配列を有するDNAは、本発明によって提供される新規な、シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼをコードするDNAである。
本発明はさらに、シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼと、ミオ−イノシトール2−デヒドロゲナーゼとを共存させた溶液中で、NADHまたはNADPH存在下で、(図1を参照)、安価なミオ−イノシトールを基質として、シロ−イノソースを経由して、シロ−イノシトールへ酵素変換反応させることを特徴とする、シロ−イノシトールの製造方法に関する。
また、シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼをコードするDNAは、その相同性から検索されるホモログDNAを単離することによっても得ることが可能である。ここで、ydgJ遺伝子と称される一連の相同性の高い遺伝子は、シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼをコードするDNAである可能性が高い。
また、プラスミドに組み込まれたDNAを発現させるために使用されるプロモーターは、宿主微生物中で、DNAが発現すれば、特に限定されない。例えばlacプロモーター、tacプロモーターなどが使用できる。
この製造方法では既知のNAD+またはNADP+依存型ミオ−イノシトール2−デヒドロゲナーゼを使用することができる。例えば、市販の酵素、バチルス ズブチリス、バチルス ハロヂュランスなどの培養菌体から精製することによって製造した酵素、または、遺伝子配列が既知であることから、遺伝子操作によって発現させたリコンビナント酵素を使用してもよい。
既知のミオ−イノシトール2−デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列としては、例えば、NCBI(National Center for Biotechnology Information)のプロテインデータベースにアクセション番号2636516、17982589、23464076、10174936、17742455、50120397、28853468、または13422633で登録されており、これらのアミノ酸配列をコードする塩基配列情報も上記アクセション番号のCDSを参照することにより得ることができる。
リコンビナント酵素を発現した菌体は、洗浄後に、そのまま反応溶液に加えて、菌体懸濁液として反応させることもできるが、好ましくは、菌体を破砕し、菌体内に存在する酵素を抽出した溶液を用いることが好ましい。また、本抽出液を精製して使用することもできる。精製としては硫安分画処理、または、イオン交換樹脂に吸着後、塩濃度による直線濃度勾配を利用したカラムクロマトグラフィー、温度処理などによって、精製することができる。さらに、本酵素は固定化酵素もしくは固定化菌体としても使用可能である。固定化法としては、ゲル抱埋法、イオン交換樹脂吸着法など、一般の固定化方法が適用できる。
本発明はさらに、シロ−イノシトール及びシロ−イノシトール以外の中性糖を含有する混合液からシロ−イノシトールを製造する方法に関する。
<4−1>
当該方法の一形態は、シロ−イノシトール及びシロ−イノシトール以外の中性糖を含有する混合液に、該混合液中に溶解したシロ−イノシトールの2倍モル以上の量のホウ酸及び金属塩を加え、かつ該混合液のpHを8.0〜11.0に調整してシロ−イノシトール・ホウ酸複合体を形成させる第1の工程、前記複合体を混合液から分離する第2の工程、分離した複合体を酸に溶解させてシロ−イノシトールとホウ酸に開裂させる第3の工程、第3の工程で得られた酸性溶液又は酸性懸濁液からシロ−イノシトールを単離精製する第4の工程を含む、精製されたシロ−イノシトールの製造方法である。
次に、シロ−イノシトール及びシロ−イノシトール以外の中性糖を含有する混合液からシロ−イノシトールを製造する方法のもう一つの形態について説明する。
この方法は、シロ−イノソースを含有する溶液中において、シロ−イノソースを水素化ホウ素金属塩を用いて還元し、ミオ−イノシトール及びシロ−イノシトールを含有する混合液を得る第1の工程、前記混合液に酸を加えて混合液中のシロ−イノシトール・ホウ酸複合体を溶解させ、かつ溶液を0.01規定以上の酸性溶液に調整する第2の工程、及び前記酸性溶液に、水溶性有機溶媒をミオ−イノシトールが析出しない量で加えて、シロ−イノシトールのみを析出させる第3の工程を含む、シロ−イノシトールの製造方法である。
以下、実施例を示して本発明を具体的に説明する。
ミオ−イノシトール 10.0%、酵母エキス 1.0%、シュークロース1.0%を含む液体培地3リットルを、1N NaOHを用いてpH7.0に調製し、100mlずつ500ml容のバッフル付き三角フラスコ30本に分注し、オートクレーブ滅菌した。各々の三角フラスコにアセトバクター・エスピーAB10281株(FERM BP-10119)のスラント培養物を1白金耳接種し、27℃で5日間ロータリーシェーカーで培養した。培養後、各々の三角フラスコに、水を250mlづつ加え、1時間ロータリーシェーカーで攪拌し、培養液に存在する結晶性のシロ−イノシトールを溶解した。この培養液を集めて、遠心分離(8,000 rpm 20分間)し、上清を培養上清液(10.2L)とした。
カラム:Wakosil 5NH2 (4.6 × 250 mm)
カラム温度 : 40℃
検出器 : RI DETECTER ERC-7515A (ERMA CR.INC.)
注入量 : 5μl
溶媒 : アセトニトリル−水= 4 : 1
流量 : 2 ml/min
溶出時間 : シロ−イノソース ; 11.6分
ミオ−イノシトール; 17.8分
シロ−イノシトール; 18.2分
なお、上記のシロ−イノシトールの変換率は、次式により求めた。
ミオ−イノシトール 10.0%、酵母エキス 1.0%、シュークロース1.0%を含む液体培地40リットルを50L容ジャーファメンターに導入し、1N NaOHを用いてpH7.0に調製し、オートクレーブ滅菌した。同一組成の培地(三角フラスコ)で培養したアセトバクター・エスピーAB10281株(FERM BP-10119)を400ml接種し、27℃で5日間、通気量1vvm、回転数200rpmで培養した。培養後、取り出された培養液約40Lに、約50℃の温水を60L加え、1時間攪拌し、培養液に存在する結晶性のシロ−イノシトールを溶解した。この培養液を連続遠心分離(8,000 rpm)し、菌体を除去した液を培養除菌液(約100L)とした。
ミオ−イノシトールをシロ−イノシトールに変換する能力を有する3つの自然分離菌株、AB10285株、AB10286株、AB10287株、および、AB10253株より育種されたAB10281株の計4菌株の16SrRNA塩基配列解析は、常法に従って行なった。すなわち、培養後の菌体からゲノムDNAを抽出後、16SrRNAの約1.6kbpが増幅できる様に設計されたプライマーを用いてPCR法により、相当するDNA断片を調製し、約1.3kbp相当のシークエンスを解析(北海道システムサイエンス社)した。その配列結果を元にデータベースと照合し、近縁種を同定した。
500ml容ワッフル付き三角フラスコに、ミオ−イノシトール3g、酵母エキス(FNI205:Lallemand BI社製)1g、グルコース0.5gを加え、100mlになる様に水に溶解し、pH5.0に調整し、オートクレーブにより滅菌した培地を4本作製し、これに、アセトバクター・エスピーAB10253株をスラントから、それぞれ1白金耳加えて、2日間、27℃、ロータリーシェーカーでプレ培養した。
実施例4と同様にして、40Lジャーファメンターから精製を行ない、途中のヒドロキシアパタイトカラム100mlにより精製、脱塩を行なった5mlの酵素溶液を、酵素液として、以下の変換反応を行なった。
試験管に入れた酵母エキス(Difco社製)1%、グルコース0.5%を含むpH5.0の液体培地5mlを滅菌し、これに、スラントからアセトバクター・エスピーAB10253株を1白金耳加えて、27℃、16時間、振騰培養を行なった。培養液2.5mlを滅菌チューブにとり出し、3000×gの遠心分離を行ない、菌体を集菌した。上清を捨て、200mMリン酸緩衝液(pH8.0)2.5mlに再度懸濁し、3000×gの遠心分離を行ない、菌体を集菌した。上清を捨て、200mMリン酸緩衝液(pH8.0)2.5mlに再度懸濁し、この内、2.0mlを、滅菌した100ml容の三角フラスコに入れ、0.5mlの40%グルコース溶液と、7.5mlの200mMリン酸緩衝液(pH8.0)を加え混ぜ合わせ、これに、20μlのメタンスルホン酸エチルを加えて、30℃、45分間、振とう培養を行なった。処理後、1mlを滅菌チューブにとり出し、3000×gの遠心分離を行ない、菌体を集菌した。上清を捨て、200mMリン酸緩衝液(pH7.0)2.5mlに懸濁し、3000×gの遠心分離を行ない、菌体を集菌する。上清を捨て、200mMリン酸緩衝液(pH7.0)2.5mlに再度懸濁し、変異処理菌液を得た。
500ml容ワッフル付き三角フラスコに、ミオ−イノシトール10g、酵母エキス(FNI205:Lallemand BI社製)1g、グルコース0.5gを加え、100mlになる様に水に溶解し、pH5.0に調整し、オートクレーブにより滅菌した培地を20本(2リットル相当:ミオ−イノシトール200g(1.11mol))作製し、これに、変異菌株(B7-14)をスラントから、それぞれ1白金耳加えて、3日間、27℃、ロータリーシェーカーで培養した。
500ml容ワッフル付き三角フラスコに、ミオ−イノシトール10g、酵母エキス(FNI205:Lallemand BI社製)1g、グルコース0.5gを加え、100mlになる様に水に溶解し、pH5.0に調整し、オートクレーブにより滅菌した培地を20本(2リットル相当:ミオ−イノシトール200g(1.11mol))作製し、これに、変異菌株(B7-14)をスラントから、それぞれ1白金耳加えて、3日間、27℃、ロータリーシェーカーで培養した。
ミオ−イノシトール 10.0%、酵母エキス 1.0%、シュークロース1.0%を含む液体培地3リットルを、1N NaOHを用いてpH7.0に調製し、100mlずつ500ml容のバッフル付き三角フラスコ30本に分注し、オートクレーブ滅菌した。各々の三角フラスコにアセトバクター・エスピー AB10281株 FERM BP-10119のスラント培養物を1白金耳接種し、27℃で5日間ロータリーシェーカー(180rpm)を用いて培養した。培養後、各々の三角フラスコに、水を250mlずつ加え、1時間ロータリーシェーカーで攪拌し、培養液に存在する結晶性のシロ−イノシトールを溶解した。この培養液を集めて、遠心分離(8,000 rpm 20分間)し、菌体(湿重量75g)を得た。
L−ソルボース 0.5%を含む、LBブロス培地(1%バクトトリプトン、0.5%酵母エキス、1%NaCl、pH7.0)3リットルを、100mlずつ500ml容の坂口フラスコ30本に分注し、オートクレーブ滅菌した。各々の三角フラスコに大腸菌K12株のスラント培養物を1白金耳接種し、36℃で1日間レシプロシェーカー(135rpm)で培養した。培養後、培養液を集めて、遠心分離(8,000 rpm 20分間)し、菌体(湿重量32g)を得た。この菌体を100mlの水に懸濁し、10℃以下で超音波で破砕した。破砕溶液は、pH6.8を示し、この溶液を1NのNaOH溶液で、pH7.0に調製した後に、遠心分離(16,000 rpm 20分間)により、上清液を単離した。次に、上清液が2mM Mg2+になるようにMgSO4を加えて、ブルートヨパールカラム(東ソー社:20ml)にチャージし、2mM Mg2+になるように添加した20mMトリス緩衝液pH7.0 50mlを通過させ、カラムを洗浄した。その後、1M KClになるように添加した20mMトリス緩衝液pH7.0 50mlを通過させ、吸着タンパクを溶出させた。次に、溶出液をMW30000cut offの限外ろ過装置で、濃縮を行ない、濃縮液に、20mMトリス緩衝液pH7.0 50mlを加えて、再度濃縮し、脱塩濃縮液を得た。次に、この脱塩濃縮液を、DEAEトヨパールカラム(東ソー社:20ml)にチャージし、20mMトリス緩衝液pH7.0 から、500mM NaClになるように添加した20mMトリス緩衝液pH7.0 の直線濃度勾配をかけた溶液で溶出し、溶出液をフラクション別に分画した。分画した溶液別に、シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼ活性を測定したところ、300mMで溶出した画分に活性があった。
本発明酵素をコードしていると思われるydgJ遺伝子を取得するために、まず、鋳型とする大腸菌K12株の全ゲノムを以下の様に抽出した。LBフラスコ培地100ml(1%バクト-トリプトン、0.5%酵母エキス、1%NaCl、pH7.0)にLBスラント培地(1%バクト-トリプトン、0.5%酵母エキス、1%NaCl、pH7.0、1.5%寒天)で培養した大腸菌K12株を一白金耳接種し、8時間、36℃で好気的に培養し、これを集菌した。この菌体ペレットに、15mlのSaline−EDTA溶液(0.15M NaCl、0.1M EDTA、pH8.0)とリゾチーム50mgを加えて懸濁し、37℃、2時間作用させた。処理後、この溶液に25%SDS溶液を0.5ml加えて完全に溶菌させ、フェノールを3ml加えて、タンパク質を変成させた後に、遠心分離し、上清を取り出し、この溶液に20mlの2−プロパノールを加えて、粗ゲノムDNAを析出させた。析出した粗ゲノムDNAを遠心分離し、沈殿させ、上清を取り除いた後、減圧下で乾燥させた。乾燥した粗ゲノムDNAは、さらに3mlTE液(10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH8.0)に溶解後、0.01mgのRNAaseを加え、36℃、2時間反応させ、RNAを分解させた。さらに、0.01mgのプロテイナーゼKを加えて、36℃、2時間反応させ、タンパク質を分解させた。次に、1mlのフェノール−クロロホルム(1:1)混液を加えて、ゆっくりと攪拌し、RNAaseと、プロテイナーゼKを変成させ、遠心分離し、2相に分離した内の水相である上層を取り出し、これに3M酢酸Na溶液を0.3ml加えて、pH5.2に調製した。これに3mlの2−プロパノールを加えて、ゲノムDNAを析出させた。析出したゲノムDNAを遠心分離し、沈殿させ、上清を取り除いた後、減圧下で乾燥させた。乾燥したゲノムDNAは、3mlTE液に溶解させ、これに1mlのフェノール−クロロホルム(1:1)混液を加える操作から、3mlTE液に溶解させる過程までを、再度繰り返して、遠心分離を行い、同様にpH5.2にて、上清に等量の2−プロパノールを加えて、大腸菌K12株のゲノムDNA溶液を調製した。このようにして得られたゲノムDNAをPCR反応のための鋳型DNA溶液とした。
配列番号15:ydgj-F 5'- cattcaagcttaatgagaggcaatgacatgagcg-3'
配列番号16:ydgj-R 5'- tcggaattcttcatgcaaggcacaaagtcgc-3'
大腸菌ydgJ遺伝子産物のアミノ酸配列から三次元構造を推定すると、グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼのファミリーに属することが推定された。このファミリーにはミオ−イノシトール2−デヒドロゲナーゼ(EC1.1.1.18)も含まれ、アミノ酸配列の内、NAD結合に関与する配列は、相同性が高いことが判った。さらに、グルコース−フルクトースオキシドレダクターゼのX線構造解析から、基質結合に関与する個所のアミノ酸配列を特定し、部分的に同じアミノ酸配列を有し、ydgJ遺伝子産物に相同なタンパク質を検索したところ、グラム陰性菌、陽性菌を問わず、多くの細菌に相同なタンパク質があることが判明した。
これらの細菌の中から、大腸菌ydgJ遺伝子の相同性から推定されるホモログDNAを検索した結果、アグロバクテリウム チュメファシエンスC58株 ATCC33970(Agrobacterium tumefacience C58 ATCC33970)ゲノム中のAtu4375遺伝子と、Atu3234遺伝子、バチルス ズブチリス168株 ATCC23857(Bacillus subtilis 168 ATCC23857)ゲノム中のBG14057遺伝子、キサントモナス キャンペストリス pv. キャンペストリス株 ATCC33913(Xanthomonas campestris pv. campestris ATCC33913)ゲノム中のXcc3438遺伝子ならびに、ミオ−イノシトールから直接にシロ−イノシトールへ変換する能力のある微生物も知られているアグロバクテリウム・エスピーAB10121株 FERM P-17383(Agrobacterium sp.AB10121 FERM P-17383)ゲノム中のAtu4375遺伝子と、Atu3234遺伝子について大腸菌ydgJ遺伝子との相同性が認められた。従って、それぞれのDNAの単離と発現を行なった。
配列番号17:Atu4375-F 5'- ggcggatcctttgaaagggatagtcatgtcct -3'
配列番号18:Atu4375-R 5'- attggaagcttcgattggctgcgacctag -3'
配列番号19:Atu3234-F 5'- ttgggatcctttcaggggaaatattatggc -3'
配列番号20:Atu3234-R 5'- gccgcaagcttgttttacagcttcac -3'
配列番号23:Xcc3438-F 5'- tcggaattcgcgttgcggtgaatcgttttcaatg -3'
配列番号24:Xcc3438-R 5'- ataagaagcttgctcagtcgctgctgttgccttc -3'
配列番号21:BG14057-F 5'- aggaattcgatgataacgcttttaaaggggagaa -3'
配列番号22:BG14057-R 5'- tttctgcagtttagtgctccagcataatggttcg -3'
精製された酵素の内、SIDH1を含む酵素液をPVDF膜(イモビロンPSQ:ミリポア社製)を通過させ、PVDF膜に吸着させた。このPVDF膜を取りだし、コマシブリリアントブルー染色液(ラピッドCBB KANTO:関東化学社製)で染色後脱色し、乾燥後、N末端アミノ酸分析装置(Hewlett Packard社)により分析を行なった。その結果、N末端から、メチオニン−リシ゛ン−アルキ゛ニン−リシ゛ン−ロイシン−アルキ゛ニン−イソロイシン−ク゛リシン−ロイシン−イソロイシン−ク゛リシン−セリン−ク゛リシン−フェニルアラニン−メチオニン−ク゛リシン−アルキ゛ニン−スレオニン−ヒスチシ゛ン−アラニン−フェニルアラニン−ク゛リシン−チロシン−セリンの配列が検出され、このアミノ酸配列をコードするDNA配列を想定し、以下の2種類のプライマーを作製した。
配列番号29:SIDH1-F1 atgaarcgnaarytncgiatyggyytiatygg
配列番号30:SIDH1-F2 ggyttyatgggycgnacicaygcittyggyta
配列番号31:SIDH1-B1 ggyttrtcrmmgayracrtgrstrcc
配列番号32: SIDH1-B2 artgwrirtgrttgggigt
また、鋳型となるAB10281株のゲノムDNAは、実施例9で調製した菌体ヘ゜レット(湿重量約400mg)を対象に、実施例12に記載したDNA調製方法と同様の方法で、AB10281株のゲノムDNA溶液を調製した。
PCR反応は宝酒造社のEx taq反応用液を使用し、組成はTakara ExTaq Buffer×10倍液 5μl、dNTP mixture 4μl、鋳型DNA 30ng、10μM プライマー溶液 各1μl(SIDH1-F1と、SIDH1-B1)、Takara ExTaq 0.5μlを50μlになるように水を加え、30μlのミネラルオイルを重層し、調製した。反応条件は、PCR増幅装置(ASTEC社 PC-700)を用い、変成を94℃30秒、ア二―リングを50℃30秒、伸長を72℃1分、の3段階の反応を35回繰返し行った。上記のPCR反応によって、電気泳動後、約0.3kbpの大きさのDNA断片が増幅したことを確認した。さらに、この0.3kbpのバンドをゲルから切りだし、ゲル破砕溶液の一部を鋳型(2μl)として、プライマーの組合せをSIDH1-F2と、SIDH1-B2にした以外は、同様のPCR反応液組成で反応液を調製し、反応条件は、PCR増幅装置(ASTEC社 PC-700)を用い、変成を94℃30秒、ア二―リングを46℃30秒、伸長を72℃1分、の3段階の反応を35回繰返し行った。このPCR反応によって、電気泳動後、約0.25kbpの大きさのDNA断片が増幅したことを確認した。
約0.25kbpの大きさのDNA断片は、この部分をゲルから切り出し、ジーンクリーン(Bio101社製)を用いてPCR断片を精製した。すなわち、ゲルをNaI溶液に溶解させる以外は、実施例12に記載の精製方法と同様の方法で、DNA断片溶液12μlを得た。
得られたプラスミドを、ユニバーサルプライマー(R-20merと、U-19mer)を用いて、塩基配列解析(北海道システムサイエンス社)したところ、この酵素をコードする遺伝子の塩基配列の前半約1/3が明らかになった。
さらに、完全長の塩基配列を決定するため、AB10281株のゲノムDNAを制限酵素BamHIで完全に消化させ、得られたDNA断片溶液を、ジーンクリーン(Bio101社製)を用いて精製し、この断片をセルフライゲートさせた。すなわち、DNA断片溶液10μlに、Takara Ligation kit−I溶液(宝酒造社)を10μl加え、16℃、1時間反応させた。反応後、ジーンクリーン(Bio101社製)を用いて、このDNAを精製し、インバースPCR用の鋳型DNA溶液とした。
配列番号33:SIDH1-INV-F gctcgtcaacgatcctgaaattgat
配列番号34:SIDH1-INV-B ttcgctgcagcttcatcggaaatat
配列番号35:SIDH1-INVF3 cccttcaatttccgggcgggt
インバースPCR反応は宝酒造社のEx taq反応用液を使用し、組成はTakara ExTaq Buffer×10倍液 5μl、dNTP mixture 4μl、鋳型DNA 30ng、10μM プライマー溶液 各1μl(SIDH1-INV-FとSIDH1-INV-Bの組合せ、SIDH1-INV-FとSIDH1-INV3の組合せ)、Takara ExTaq 0.5μlを50μlになるように水を加え、30μlのミネラルオイルを重層し、調製した。反応条件は、PCR増幅装置(ASTEC社 PC-700)を用い、変成を94℃30秒、アニーリングを50℃1分、伸長を72℃2分、の3段階の反応を35回繰返し行った。上記のPCR反応によって、電気泳動後、約2.7kbpと、約1.8kbpの大きさのDNA断片が増幅した。この約2.7kbpと、約1.8kbpのバンドをゲルから切りだし、ジーンクリーン(Bio101社製)を用いてPCR断片を精製し、DNA断片溶液10μlを得た。得られたDNA断片2種類を、PCRで使用したプライマーを用いて、塩基配列解析(北海道システムサイエンス社)を行ない、この酵素をコードする遺伝子の全塩基配列を決定した。
配列番号36:281SIDH1-F gctggatcccgcccttattgtgaata
配列番号37:281SIDH1-R tatgaattcgttatgccttctcatgctgtcg
PCR反応は宝酒造社のEx taq反応用液を使用し、組成はTakara ExTaq Buffer×10倍液 5μl、dNTP mixture 4μl、鋳型DNA 30ng、10μM プライマー溶液 各1μl、Takara ExTaq 0.5μlを50μlになるように水を加え、30μlのミネラルオイルを重層し、調製した。反応条件は、PCR増幅装置(ASTEC社 PC-700)を用い、変成を94℃30秒、ア二―リングを55℃1分、伸長を72℃1分、の3段階の反応を35回繰返し行った。上記のPCR反応によって、約1.2 kbpの大きさのDNA断片が増幅した。
約1.2kbpの大きさのDNA断片は、ジーンクリーン(Bio101社製)を用いて精製され、DNA断片溶液12μlを得た。このDNA断片を発現ベクターに組み込む操作は、DNA断片溶液10μlに、発現用プラスミドを0.5μg(pUC119)、宝酒造社の制限酵素(BamH1、EcoRI)を各1μl、宝酒造社の制限酵素用緩衝液K buffer×10倍液 2μlを加え、20μlになるように滅菌水を加え、混合した。この反応液を36℃、2時間反応した。
反応溶液からのDNA断片の回収、精製、ライゲーション反応、および、コンピテントセル(宝酒造社DH5α)への形質転換は実施例12と同様の方法で行った。さらに、シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼ活性を確認するための、酵素の発現と、活性測定方法も実施例12と同様の方法で行い、本遺伝子産物が、シロ−イノシトールデヒドロゲナーゼであることを確認した。
結果として、AB10281株の産出するSIDH1をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号27に、また、アミノ酸配列を配列番号28に記載した。
実施例9の酵素精製により得られたAB10281株由来のSIDH1、SIDH2、SIDH3と、実施例11のリコンビナント酵素として得られた大腸菌由来のydgJ遺伝子産物と、実施例12のリコンビナント酵素として得られたアグロバクテリウム チュメファシエンスC58株のAtu4375遺伝子産物と、Atu3234遺伝子産物、バチルス ズブチリス168株のBG14057遺伝子産物、キサントモナス キャンペストリス pv. キャンペストリス株のXcc3438遺伝子産物、ならびに、AB10121株のAtu4375遺伝子産物と、Atu3234遺伝子産物の酵素としての諸性質を以下に示す方法で検討し、その結果を表5に記載した。
本製造法で使用する酵素は、ミオ−イノシトール2−デヒドロゲナーゼと、本発明酵素の2種類が必要である。ここでは、バチルス ズブチリス168株 ATCC23857由来のBG10669遺伝子産物であるミオ−イノシトール2−デヒドロゲナーゼのリコンビナント酵素と、本発明DNAによりコードされる(大腸菌K12株由来ydgJ遺伝子:配列番号1)本発明酵素のリコンビナント酵素を用いた実施例を示す。
配列番号25:BG10669-F 5'- ttgggatccgatgagtttacgtattggcgtaattg -3'
配列番号26:BG10669-R 5'- aaactgcagttagttttgaactgttgtaaaagattgata -3'
粉末のシロ−イノソース100gを500mlの熱水に溶解し、室温まで冷却後、水を加えて900mlになるようにした。この溶液を5規定NaOH水溶液を用いて、pH7.5に合わせ、さらに水を加えて、1リットルになるようにした。
表中の灰色部分は、回収率が90%を超えた試験区を示す。
粉末のシロ−イノソース10g(56mmol)を50mlの熱水に溶解し、室温まで冷却後、水を加えて90mlになるようにした。この溶液を5規定NaOH水溶液を用いて、pH7.5に合わせ、さらに水を加えて、100mlになるようにした。
粉末のシロ−イノソース10g(56mmol)から、実施例17に示す方法と同様の方法で調製した5.71g(20.5mmol)のシロ−イノシトール・ホウ酸複合体を原料とした。
粉末のシロ−イノソース5g(28mmol)を40mlの熱水に溶解し、室温まで冷却後、この溶液を5規定NaOH水溶液を用いて、pH7.5に合わせ、水を加えて45mlになるようにした。
本発明のNAD+非依存型ミオ−イノシトール2−デヒドロゲナーゼを用いることにより、NAD+を反応液中に添加することなく、シロ−イノソースを製造することができる。さらに得られたシロ−イノソースを還元することにより、簡便かつ高効率で高純度のシロ−イノシトールを得ることができる。
本発明によれば、シロ−イノシトール及びシロ−イノシトール以外の中性糖を含有する混合液から、効率良くシロ−イノシトール・ホウ酸複合体を形成せることができ、得られたシロ−イノシトール・ホウ酸複合体から高純度のシロ−イノシトールを効率よく簡便な操作で得ることができる。
Claims (6)
- アセトバクター属に属する微生物であって、ミオ−イノシトールをシロ−イノシトールに変換する能力を有する微生物を、ミオ−イノシトールを含む溶液中でミオ−イノシトールに作用させることにより、シロ−イノシトールを前記溶液中に生成蓄積させ、該溶液中からシロ−イノシトールを採取することを特徴とする、シロ−イノシトールの製造方法。
- 前記ミオ−イノシトールを含む溶液がミオ−イノシトールを含有する液体培地であり、前記微生物を、該液体培地中で培養することによりミオ−イノシトールに作用させることを特徴とする、請求項1に記載の製造方法。
- 培養により得られた前記微生物の菌体を、前記溶液中でミオ−イノシトールに作用させることを特徴とする、請求項1に記載の製造方法。
- 前記微生物が、アセトバクター・セルビシエ、またはアセトバクター・マローラムに属する微生物である請求項1〜3のいずれかの項に記載の製造方法。
- 前記微生物が、アセトバクター・エスピーAB10281株(FERM BP-10119)またはその変異株である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の製造方法。
- ミオ−イノシトールをシロ−イノシトールに変換する能力を有する、アセトバクター・エスピーAB10281株(FERM BP-10119)またはその変異株。
Applications Claiming Priority (9)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2003353490 | 2003-10-14 | ||
JP2003353491 | 2003-10-14 | ||
JP2003353490 | 2003-10-14 | ||
JP2003353491 | 2003-10-14 | ||
JP2004018128 | 2004-01-27 | ||
JP2004018128 | 2004-01-27 | ||
JP2004194088 | 2004-06-30 | ||
JP2004194088 | 2004-06-30 | ||
PCT/JP2004/015174 WO2005035774A1 (ja) | 2003-10-14 | 2004-10-14 | シロ−イノシトールの製造方法 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010086459A Division JP5122599B2 (ja) | 2003-10-14 | 2010-04-02 | シロ−イノシトールの製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2005035774A1 JPWO2005035774A1 (ja) | 2006-12-21 |
JP4526485B2 true JP4526485B2 (ja) | 2010-08-18 |
Family
ID=34437726
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2005514651A Expired - Lifetime JP4526485B2 (ja) | 2003-10-14 | 2004-10-14 | シロ−イノシトールの製造方法 |
JP2010086459A Expired - Lifetime JP5122599B2 (ja) | 2003-10-14 | 2010-04-02 | シロ−イノシトールの製造方法 |
JP2012160384A Expired - Fee Related JP5674724B2 (ja) | 2003-10-14 | 2012-07-19 | シロ−イノシトールの製造方法 |
Family Applications After (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010086459A Expired - Lifetime JP5122599B2 (ja) | 2003-10-14 | 2010-04-02 | シロ−イノシトールの製造方法 |
JP2012160384A Expired - Fee Related JP5674724B2 (ja) | 2003-10-14 | 2012-07-19 | シロ−イノシトールの製造方法 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US7745671B2 (ja) |
EP (3) | EP2058390B1 (ja) |
JP (3) | JP4526485B2 (ja) |
KR (3) | KR101314079B1 (ja) |
AT (1) | ATE458042T1 (ja) |
CA (3) | CA2774930C (ja) |
DE (1) | DE602004025596D1 (ja) |
DK (2) | DK2058390T3 (ja) |
ES (2) | ES2404554T3 (ja) |
PT (2) | PT2058390E (ja) |
WO (1) | WO2005035774A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2014098453A1 (ko) * | 2012-12-17 | 2014-06-26 | 솔젠트(주) | 휴면 세포 전환법을 이용한 d-카이로 이노시톨의 생산 방법 |
Families Citing this family (28)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7521481B2 (en) | 2003-02-27 | 2009-04-21 | Mclaurin Joanne | Methods of preventing, treating and diagnosing disorders of protein aggregation |
CN101102779A (zh) * | 2004-11-17 | 2008-01-09 | 乔安妮·麦克劳林 | 用于治疗蛋白聚集疾病的含鲨肌醇衍生物的组合物和方法 |
JP4761763B2 (ja) * | 2004-12-16 | 2011-08-31 | 北興化学工業株式会社 | ホウ酸選択的結合物質およびホウ酸の除去又は回収方法 |
JP4659545B2 (ja) * | 2005-07-20 | 2011-03-30 | 北興化学工業株式会社 | シロ−イノソースの製造方法 |
JP2009511568A (ja) * | 2005-10-13 | 2009-03-19 | ワラタ ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド | イノシトール誘導体、ならびに異常なタンパク質の折りたたみまたは凝集、あるいはアミロイドの形成、沈着、蓄積または残存を特徴とする疾患の処置におけるその使用 |
WO2007129221A2 (en) * | 2006-02-17 | 2007-11-15 | Waratah Parmaceuticals Inc | Compositions comprising an epi-inositol compounds and methods for treatment of disorders of protein aggregation |
US20070197452A1 (en) * | 2006-02-17 | 2007-08-23 | Mclaurin Joanne | Treatment of amyloid-related diseases |
NZ571181A (en) * | 2006-03-09 | 2011-12-22 | Waratah Pharmaceuticals Inc | A cyclohexane polyalcohol formulation for treatment of disorders of protein aggregation |
WO2007134449A1 (en) * | 2006-05-19 | 2007-11-29 | Waratah Pharmaceuticals Inc. | Screening methods for amyloid beta modulators |
JP5101841B2 (ja) * | 2006-06-15 | 2012-12-19 | オルガノ株式会社 | 高分子多孔質体の製造方法 |
US20100173960A1 (en) * | 2006-09-21 | 2010-07-08 | Antonio Cruz | The Combination of a Cyclohexanehexol and a NSAID for the Treatment of Neurodegenerative Diseases |
WO2008061373A1 (en) * | 2006-11-24 | 2008-05-29 | Waratah Pharmaceuticals Inc. | Combination treatments for alzheimer's disease and similar diseases |
CA2679403A1 (en) * | 2007-03-01 | 2008-09-04 | Concourse Health Sciences Llc | Isomers of inositol niacinate and uses thereof |
CA2683548A1 (en) * | 2007-04-12 | 2008-10-23 | Joanne Mclaurin | Use of cyclohexanehexol derivatives for the treatment of polyglutamine diseases |
US20100144891A1 (en) * | 2007-04-12 | 2010-06-10 | Mclaurin Joanne | Use of cyclohexanehexol derivatives in the treatment of amyotrophic lateral sclerosis |
DK2148667T3 (da) | 2007-04-12 | 2013-08-26 | Waratah Pharmaceuticals Inc | Anvendelse af cyclohexanhexolderivater til behandling af øjensygdomme |
WO2008124929A1 (en) * | 2007-04-12 | 2008-10-23 | Joanne Mclaurin | USE OF CYCLOHEXANEHEXOL DERIVATIVES IN THE TREATMENT OF α-SYNUCLEINOPATHIES |
AU2009301603A1 (en) * | 2008-10-09 | 2010-04-15 | Waratah Pharmaceuticals Inc. | Use of scyllo-inositols for the treatment of macular degeneration-related disorders |
JP5649119B2 (ja) * | 2008-10-31 | 2015-01-07 | 国立大学法人神戸大学 | シロ−イノシトール産生細胞および当該細胞を用いたシロ−イノシトール製造方法 |
US8372367B2 (en) * | 2009-10-26 | 2013-02-12 | Emc Metals Corporation | System and method for recovering boron values from plant tailings |
WO2011100670A1 (en) * | 2010-02-15 | 2011-08-18 | Abbott Laboratories | Process for the preparation of scyllo-inositol |
BR112013009072A2 (pt) | 2010-10-13 | 2016-07-19 | Elan Pharm Inc | processo de síntese de scyllitol e compostos relacionados |
CA2837926A1 (en) | 2011-06-03 | 2012-12-20 | Susan ABUSHAKRA | Scyllo - inositol for the treatment of behavioral and psychiatric disorders |
US9505795B2 (en) * | 2012-02-02 | 2016-11-29 | Asahi Kasei Chemicals Corporation | Method for producing scyllo-inositol |
US10017537B2 (en) * | 2013-04-15 | 2018-07-10 | Korea Institute Of Science And Technology | Peptide selectively binding to graphitic materials and volatile organic compounds |
CN105492606B (zh) * | 2013-12-16 | 2018-11-27 | 旭化成株式会社 | 2-脱氧青蟹肌糖还原酶 |
WO2017029353A1 (en) | 2015-08-20 | 2017-02-23 | Transition Therapeutics Ireland Limited | Treatment of behaviors in dementia patients |
CN114181045B (zh) * | 2021-12-02 | 2024-04-26 | 吉林海资生物工程技术有限公司 | 一种球形无水肌醇的制备方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH09140388A (ja) * | 1995-11-17 | 1997-06-03 | Hokko Chem Ind Co Ltd | イノシトール立体異性体の製造方法 |
JP2001008694A (ja) * | 1999-06-25 | 2001-01-16 | Hokko Chem Ind Co Ltd | D−キロ−イノシトールの新規製造方法 |
JP2003102492A (ja) * | 2001-06-25 | 2003-04-08 | Hokko Chem Ind Co Ltd | シロ−イノソースの製造法及びシロ−イノシトールの製造法 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3405663A1 (de) | 1984-02-17 | 1985-08-22 | Merck Patent Gmbh, 6100 Darmstadt | Verfahren zur herstellung von scyllo-inosit |
DE3642999A1 (de) | 1986-12-17 | 1988-06-30 | Merck Patent Gmbh | Scyllo-inositverbindungen |
JP2984043B2 (ja) | 1990-09-18 | 1999-11-29 | 旭化成工業株式会社 | ミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼおよびその製造法 |
JPH05192163A (ja) * | 1991-09-30 | 1993-08-03 | Suntory Ltd | イノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子 |
JP3251976B2 (ja) | 1992-06-23 | 2002-01-28 | 旭化成株式会社 | ミオ・イノシトールデヒドロゲナーゼを生産する実質上純粋な微生物 |
US5412080A (en) | 1993-08-25 | 1995-05-02 | President And Fellow Of Harvard College | Enterobactin compounds |
-
2004
- 2004-10-14 EP EP08019987A patent/EP2058390B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-10-14 US US10/576,030 patent/US7745671B2/en active Active
- 2004-10-14 DK DK08019987.0T patent/DK2058390T3/da active
- 2004-10-14 DE DE602004025596T patent/DE602004025596D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2004-10-14 DK DK04817164.9T patent/DK1674578T3/da active
- 2004-10-14 AT AT04817164T patent/ATE458042T1/de not_active IP Right Cessation
- 2004-10-14 ES ES08019987T patent/ES2404554T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-10-14 CA CA2774930A patent/CA2774930C/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-10-14 PT PT80199870T patent/PT2058390E/pt unknown
- 2004-10-14 KR KR1020127019981A patent/KR101314079B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2004-10-14 PT PT04817164T patent/PT1674578E/pt unknown
- 2004-10-14 JP JP2005514651A patent/JP4526485B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2004-10-14 ES ES04817164T patent/ES2341964T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2004-10-14 CA CA2542560A patent/CA2542560C/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-10-14 KR KR1020107026017A patent/KR101173148B1/ko active IP Right Grant
- 2004-10-14 EP EP10182641A patent/EP2298870A1/en not_active Withdrawn
- 2004-10-14 KR KR1020067009224A patent/KR101191675B1/ko active IP Right Grant
- 2004-10-14 WO PCT/JP2004/015174 patent/WO2005035774A1/ja active Application Filing
- 2004-10-14 EP EP04817164A patent/EP1674578B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2004-10-14 CA CA2852842A patent/CA2852842A1/en not_active Abandoned
-
2010
- 2010-02-25 US US12/712,635 patent/US8409833B2/en active Active
- 2010-04-02 JP JP2010086459A patent/JP5122599B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2012
- 2012-07-19 JP JP2012160384A patent/JP5674724B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2013
- 2013-03-08 US US13/791,172 patent/US8715974B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2014
- 2014-03-25 US US14/224,645 patent/US20140322775A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH09140388A (ja) * | 1995-11-17 | 1997-06-03 | Hokko Chem Ind Co Ltd | イノシトール立体異性体の製造方法 |
JP2001008694A (ja) * | 1999-06-25 | 2001-01-16 | Hokko Chem Ind Co Ltd | D−キロ−イノシトールの新規製造方法 |
JP2003102492A (ja) * | 2001-06-25 | 2003-04-08 | Hokko Chem Ind Co Ltd | シロ−イノソースの製造法及びシロ−イノシトールの製造法 |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2014098453A1 (ko) * | 2012-12-17 | 2014-06-26 | 솔젠트(주) | 휴면 세포 전환법을 이용한 d-카이로 이노시톨의 생산 방법 |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5674724B2 (ja) | シロ−イノシトールの製造方法 | |
CN115896199A (zh) | 一种双酶偶联合成高浓度(s)-构型玻色因的方法 | |
JP5344466B2 (ja) | デオキシポリオール脱水素酵素産生能を有する微生物およびその利用 | |
JPWO2005098012A1 (ja) | キラルなヒドロキシアルデヒド化合物の製造方法 | |
EP2357222B1 (en) | Scyllo-inositol-producing cell and scyllo-inositol production method using said cells | |
EP1788089B1 (en) | Sequence of thermotolerant l-rhamnose isomerase gene and use of the same | |
JP3981597B2 (ja) | シロ−イノソースの製造法及びシロ−イノシトールの製造法 | |
EP1323827A2 (en) | Method for producing optically active 2-hydroxycycloalkanecarboxylic acid ester | |
JP4276886B2 (ja) | シロ−イノソースとd−キロ−1−イノソースとの相互変換作用を有する酵素とその製造および応用 | |
JP2004350625A (ja) | 光学活性n−ベンジル−3−ピロリジノールの製造方法 | |
JP2004057192A (ja) | 4−アセトキシ−3−ヒドロキシブタン酸エステルの製造方法 | |
JP2004057193A (ja) | 4−アセトキシ−3−ヒドロキシブタン酸エステルの製造方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070413 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100202 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100402 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100511 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100601 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130611 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Ref document number: 4526485 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |