JPH05192163A - イノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 微生物由来のイノシトールデヒドロゲナーゼ
遺伝子の構造を明らかにし、当該酵素を安価かつ大量に
生産する手段を提供する。 【構成】 下記式： ATGAGTTTACGTATTGGCGTAATTGGAACTGGAGCAATCGGAAAAGAACATATTAACCGTATCACGAACAAG CTGTCAGGCGCGGAAATTGTAGCTGTAACGGATGTTAATCAAGAAGCTGCACAAAAGGTCGTTGAGCAATAC CAATTAAACGCGACGGTTTATCCGAATGATGACAGCTTGCTTGCAGACGAAAATGTAGACGCTGTTTTAGTG ACAAGCTGGGGGCCTGCGCATGAGTCAAGCGTGCTGAAAGCGATTAAAGCCCAGAAATATGTGTTCTGTGAA AAACCGCTCGCGACAACGGCTGAAGGATGCATGCGCATTGTCGAAGAAGAAATCAAAGTGGGCAAACGCCTT GTTCAAGTCGGCTTCATGCGCCGTTATGACAGCGGTTACGTACAGCTGAAAGAAGCGCTCGATAATCATGTC AACGGCGAGCCTCTTATGATTCACTGCGCGCACCGCAACCCGACTGTAGGAGATAACTATACAACGGATATG GCTGTAGTCGACACGCTTGTTCATGAAATTGACGTGCTCCACTGGCTCGTCAATGATGACTACGAGTCCGTT CAAGTCATCTATCCGAAAAAATCAAAAAACGCGCTTCCACATTTAAAAGATCCGCAAATCGTCGTGATTGAA ACAAAAGGCGGTATCGTCATCAATGCTGAAATCTATGTGAACTGTAAATACGGCTATGACATTCAATGTGAA ATCGTCGGAGAAGACGGCATCATCAAGCTTCCCGAGCCATCAAGCATCAGCTTGAGAAAAGAAGGCAGATTC AGCACTGATATTTTGATGGATTGGCAGAGACGCTTTGTCGCTGCGTATGATGTGGAAATCCAAGACTTTATT GATTCGATTCAAAAGAAAGGCGAGGTCAGCGGACCGACGGCATGGGACGGCTATATTGCTGCTGTCACGACT GACGCGTGTGTAAAAGCCCAGGAATCTGGACAAAAAGAAAAGGTTGAATTGAAGGAAAAACCGGAATTCTAT CAATCTTTTACAACAGTTCAAAACTAA で表されるイノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子または
これと実質的に生物学的に同等な遺伝子。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、バシラス・サチルス
（Bacillus subtilis ）由来のイノシトールデヒドロゲ
ナーゼ遺伝子およびその遺伝子が組み込まれた組換えベ
クターならびにその利用に関する。

【０００２】

【従来の技術】ミオ−イノシトールはビタミンＢ群の一
種として成長促進、脂肪肝、および肝硬変の予防、動脈
硬化の予防作用があり、総合ビタミン剤、肝臓強化剤、
老化防止剤などの医薬に広く用いられている。また、そ
の誘導体であるイノシトールヘキサニコチネートが末梢
血管拡張剤として使用されるなど有用な物質である。こ
のように広く用いられているイノシトールの定量には、
イノシトールデヒドロゲナーゼが用いられ、即ち、イノ
シトールデヒドロゲナーゼによる脱水素反応に際して還
元されるＮＡＤ⁺ を測定することによりイノシトールが
定量される。イノシトールデヒドロゲナーゼはまた、イ
ノシトールを結合したマルトオリゴ糖を基質としたα−
アミラーゼの活性測定法にも利用されている（特開昭６
３−１９６３００）。

【０００３】このイノシトールデヒドロゲナーゼはミオ
−イノシトール資化能を有する微生物（例えばエンテロ
バクター・アエロゲネス［バーマン・ティー，マガサニ
ック・ビー，ジェイ・ビー・シー（Barman, T. and Mag
asanik, B., Journal of Biological Chemistry ）２４
１，８００−８０６（１９６６）］、バシラス・サチル
ス［ラマレイ・アール，フジタ・ワイおよびフリーズ・
イー，ジェイ・ビー・シー（Ramaley, R., Fujita, Y.
and Freese, E.,The Journal of Biological Chemistr
y）, ２５４（１６），７６８４−７６９０（１９７
９）］）、酵母（例えばクリプトコッカス・メリビオサ
ム［ビダル−レイリア・エム，バン ユーデン・エヌ，
バイオケム・バイオフィズ・アクタ（Vidal-Leiria,
M., Van Uden,N., Biochemica et Biophysica Acta）２
９３，２９５−３０３（１９７３）］，クレブジラ・ニ
ュモニエ，セラチア・マセッセンス）、動物の器官（例
えば脳［ヒップス・ピー・ピー，イブランド・エム・ア
ール，バイオケム・バイオフィズ・リス・コミュン（Bi
ochemical and Biophysical Research Communicatio
n），６８，１１３３−１１３８，（１９７６）］、精
子）に存在しており、現在、エンテロバクター・アエロ
ゲネスから精製された酵素が市販されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、イノシ
トールデヒドロゲナーゼは細胞内酵素であり、かつ細胞
中での存在量が極めて微量であるため、その精製に複雑
な工程を必要とするうえ、大量生産が困難であるという
問題がある。また、いずれの由来のイノシトールデヒド
ロゲナーゼにおいてもその遺伝子の構造が明らかにされ
ておらず、そのため、当該酵素を安価かつ大量に生産さ
せるべき遺伝子工学的手段を講じることができない状況
にあった。

【０００５】なお、イノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝
子のクローニングが困難であった一因は、通常の微生物
はイノシトールデヒドロゲナーゼ活性を有するため、活
性を指標として遺伝子をクローニングすることが困難で
あったためである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、これらの
問題を解決すべく鋭意研究を重ねた。その結果、バシラ
ス・サチルス由来のイノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝
子を含む２．４KbのＤＮＡ断片の全塩基配列を決定し、
当該イノシトールデヒドロゲナーゼタンパク質の構造
（アミノ酸配列）を明らかにし、本発明を完成するに至
った。ハジラス・サチルス由来のイノシトールデヒドロ
ゲナーゼは、前記ラマレイ・アール等により分子量約３
９００のサブユニットからなることが示唆されていた
が、そのアミノ酸配列あるいは遺伝子配列は知られてい
なかった。

【０００７】すなわち、本発明は、 （１）下記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列、または式
（Ｉ）と実質的に生物学的に同等なアミノ酸配列を有す
るバシラス・サチルス（Bacillus subtilis）由来のイ
ノシトールデヒドロゲナーゼ： 式（Ｉ）： MSLRIGVIGTGAIGKEHINRITNKLSGAEIVAVTDVNQEAAQKVVEQYQLNATVYPNDDSLLADENVDAVLV TSWGPAHESSVLKAIKAQKYVFCEKPLATTAEGCMRIVEEEIKVGKRLVQVGFMRRYDSGYVQLKEALDNHV NGEPLMIHCAHRNPTVGDNYTTDMAVVDTLVHEIDVLHWLVNDDYESVQVIYPKKSKNALPHLKDPQIVVIE TKGGIVINAEIYVNCKYGYDIQCEIVGEDGIIKLPEPSSISLRKEGRFSTDILMDWQRRFVAAYDVEIQDFI DSIQKKGEVSGPTAWDGYIAAVTTDACVKAQESGQKEKVELKEKPEFYQSFTTVQN （Ｉ） （式中のアルファベットは、以下のアミノ酸を示す： Ａ；アラニン、Ｃ；システイン、Ｄ；アスパラギン酸、
Ｅ；グルタミン酸、Ｆ；フェニルアラニン、Ｇ；グリシ
ン、Ｈ；ヒスチジン、Ｉ；イソロイシン、Ｋ；リシン、
Ｌ；ロイシン、Ｍ；メチオニン、Ｎ；アスパラギン、
Ｐ；プロリン、Ｑ；グルタミン、Ｒ；アルギニン、Ｓ；
セリン、Ｔ；スレオニン、Ｖ；バリン、Ｗ；トリプトフ
ァン、Ｙ；チロシン）； （２）式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列、またはそれと
実質的に生物学的に同等なアミノ酸配列を有するイノシ
トールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列をコードする遺
伝子； （３）上記式（Ｉ）のアミノ酸配列をコードし、さらに
その末端に終止コドンＴＡＡを含む下記式（II）で表さ
れる塩基配列、またはそれと実質的に生物学的に同等な
塩基配列を有する生物学的に純化されたイノシトールデ
ヒドロゲナーゼ遺伝子； 式（II）： ATGAGTTTACGTATTGGCGTAATTGGAACTGGAGCAATCGGAAAAGAACATATTAACCGTATCACGAACAAG CTGTCAGGCGCGGAAATTGTAGCTGTAACGGATGTTAATCAAGAAGCTGCACAAAAGGTCGTTGAGCAATAC CAATTAAACGCGACGGTTTATCCGAATGATGACAGCTTGCTTGCAGACGAAAATGTAGACGCTGTTTTAGTG ACAAGCTGGGGGCCTGCGCATGAGTCAAGCGTGCTGAAAGCGATTAAAGCCCAGAAATATGTGTTCTGTGAA AAACCGCTCGCGACAACGGCTGAAGGATGCATGCGCATTGTCGAAGAAGAAATCAAAGTGGGCAAACGCCTT GTTCAAGTCGGCTTCATGCGCCGTTATGACAGCGGTTACGTACAGCTGAAAGAAGCGCTCGATAATCATGTC AACGGCGAGCCTCTTATGATTCACTGCGCGCACCGCAACCCGACTGTAGGAGATAACTATACAACGGATATG GCTGTAGTCGACACGCTTGTTCATGAAATTGACGTGCTCCACTGGCTCGTCAATGATGACTACGAGTCCGTT CAAGTCATCTATCCGAAAAAATCAAAAAACGCGCTTCCACATTTAAAAGATCCGCAAATCGTCGTGATTGAA ACAAAAGGCGGTATCGTCATCAATGCTGAAATCTATGTGAACTGTAAATACGGCTATGACATTCAATGTGAA ATCGTCGGAGAAGACGGCATCATCAAGCTTCCCGAGCCATCAAGCATCAGCTTGAGAAAAGAAGGCAGATTC AGCACTGATATTTTGATGGATTGGCAGAGACGCTTTGTCGCTGCGTATGATGTGGAAATCCAAGACTTTATT GATTCGATTCAAAAGAAAGGCGAGGTCAGCGGACCGACGGCATGGGACGGCTATATTGCTGCTGTCACGACT GACGCGTGTGTAAAAGCCCAGGAATCTGGACAAAAAGAAAAGGTTGAATTGAAGGAAAAACCGGAATTCTAT CAATCTTTTACAACAGTTCAAAACTAA （II）； （４）前記（２）の遺伝子を含有する組換えベクター； （５）前記（５）の宿主細胞を培養し、その菌体ないし
は培養液から酵素を回収することよりなる、バシラス・
サチルス由来のイノシトールデヒドロゲナーゼの製造方
法を提供するものである。

【０００８】式（II）で表されるイノシトールデヒドロ
ゲナーゼ遺伝子は、バシラス ジェネティック ストッ
ク センターより入手できるバシラス・サチルス１Ａ１
株から、後記実施例に記載の方法にしたがって単離され
た。この遺伝子を含むプラスミドｐＩＯＬ０５ｄ１５に
より形質転換された大腸菌ＭＶ１１８４株は、Escheric
ia coli ＳＡＭ１８５８と命名され、平成３年９月２５
日付で工業技術院微生物工業技術研究所に、受託番号微
工研菌寄第１２５３１号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２５３１）
として寄託されている。

【０００９】本発明のイノシトールデヒドロゲナーゼ遺
伝子は、上記１Ａ１株以外のイノシトール資化能を持つ
バシラス・サチルスにも存在すると思われる。そのよう
な微生物に由来する遺伝子も後記の実施例と同様の操作
を、場合により当業者に明らかな修飾を加えて実施すれ
ば単離することができ、本発明の範囲に含まれる。さら
に、式（II）の配列と実質的に生物学的に同等な塩基配
列を有する遺伝子も本発明の範囲内である。例えば、一
つのアミノ酸に対応するコドンおよび終止コドンは複数
存在することが知られており、したがって、式（II）の
配列に対応する上記式（I）のアミノ酸配列をコードし
うる遺伝子は本発明の範囲内である。さらに、蛋白質の
性質は、その一部のアミノ酸を性質の類似する他のアミ
ノ酸に置換し、あるいは活性に影響の少ない部分に１つ
もしくはそれ以上のアミノ酸の削除、挿入または置換を
行っても、実質的に生物学的に同等の性質を示すことが
知られている。したがって、そのような修飾アミノ酸配
列をコードする塩基配列も本発明の遺伝子に含まれる。

【００１０】後述の実施例に示すイノシトールデヒドロ
ゲナーゼ遺伝子の塩基配列およびアミノ酸配列は、公知
の方法にしたがって細菌ＤＮＡの単離、遺伝子ライブラ
リーの作成、スクリーニング、クローニング、ハイブリ
ダイゼーション、サブクローニング、ＤＮＡ塩基配列の
決定等を行うことにより決定した。

【００１１】そのようなクローニング等のため、あるい
は本発明の遺伝子を用いてイノシトールデヒドロゲナー
ゼを生産するための宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌
等の細菌類、望ましくは大腸菌ＨＢ１０１、ＪＭ１０
９、ＭＶ１１８４株等を用いることができ、ベクターと
してはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１８、ｐＵ
Ｂ１１０などが使用できる。プロモーターとしては、宿
主細胞で機能するプロモーターであればいずれも使用可
能であり、例えば宿主として大腸菌を用いる場合は、下
記実施例に示すｌａｃプロモーターが望ましい。ｌａｃ
プロモーターを用いた場合は、大腸菌の対数増殖期にＩ
ＰＴＧを０．１〜１mMになるように添加することによ
り、イノシトールデヒドロゲナーゼの発現を効果的に誘
導することができる。

【００１２】本発明の遺伝子を含有するプラスミドで形
質転換された宿主細胞を用いてイノシトールデヒドロゲ
ナーゼを製造するには、公知の方法にしたがって、適当
な炭素源、窒素源および微量の金属元素等を含む培地中
で、該細胞を通気培養することによりイノシトールデヒ
ドロゲナーゼを含有する菌体を得ることができる。その
ような培地として例えば実施例に示すＬブロスが知られ
ている。イノシトールデヒドロゲナーゼは菌体内に生産
されるので、菌体から回収できる。例えば、当該イノシ
トールデヒドロゲナーゼを含む菌体溶解液からウルトロ
ゲルＡｃＡ−３４、ＤＥＡＥ−セルロース、ヒドロキシ
アパタイト、オメガ−アミノヘキシルセファロース等に
よるクロマトグラフィーを行うことにより、所望のイノ
シトールデヒドロゲナーゼの精製品が得られる。精製に
関しては、ラマレイ・アール，フジタ・ワイおよびフリ
ーズ・イー，ジェイ・ビー・シー（Ramaley, R., Fujit
a,Y. and Freese, E.,The Journal of Biological Chem
istry），２５４（１６），７６８４（１９７９）に記
載されている方法も利用可能である。

【００１３】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく
説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。

【００１４】実施例１ 遺伝子のスクリーニング 枯草菌、バシラス・サチルス（Bacillus subtilis ）６
００１５株から常法により全ＤＮＡを単離した。細菌Ｄ
ＮＡの単離法としては、例えばサイトウ・ミウラ法［サ
イトウ・エイチおよびミウラ・ケイ，バイオケミカ・バ
イオフィジカ・アクタ（Saito, H. and Miura, K., Bio
chem. Biophys. Acta ），７２，６１９（１９６３）］
が挙げられる。このＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部
分分解した。このＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩで切
断したファージρ１１とＴ４リガーゼで結合し、イノシ
トールオペロンを含む大きな部分が欠損した変異株であ
るバシラス・サチルス６１６５６（Δｉｇｆ）［フジタ
・ワイおよびフリース・イー，ジャーナル・オブ・バク
テリオロジー（Fujita, Y. and Freese, E., Journal o
f Bacteriology, １４５，７６０（１９８１）］［フジ
タ・ワイおよびフジタ・ティー，ジャーナル・オブ・バ
クテリオロジー（Fujita, Y. and Fujita,T., Journal
of Bacteriology, １５４，８６４（１９８３）］（バ
シラス ジェネティック ストック センター，オハイ
オ州立大学より１Ａ４６５株として入手可能）のρ１１
溶原菌を形質転換してイノシトール資化性の復帰したク
ローンを選択することにより、イノシトールオペロンが
クローン化されたファージρ１１iol⁺ を得た。このフ
ァージρ１１iol⁺ を制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、制
限酵素ＢａｍＨＩで切断したプラスミドｐＢＲ３２２と
Ｔ４リガーゼで結合し、大腸菌ＨＢ１０１を形質転換し
てテトラサイクリン感受性、アンピシリン耐性形質転換
体としてρ１１由来のＤＮＡ断片およびイノシトールオ
ペロンを含むバシラス・サチルス由来のＤＮＡ断片計１
３Ｋｂを含むプラスミドｐＩＯＬ０１を選択した。

【００１５】なお上記において、バシラス・サチルス６
１６５６（Δｉｇｆ）株のρ１１溶原菌の形質転換は常
法、例えば河村らの方法［カワムラ・エフ，サイトウ・
エイチおよびイケダ・ワイ，ジーン（Kawamura, F. Sai
to, H. and Ikeda, Y., Gene）５，８７（１９７９）］
を用いた。また、大腸菌の形質転換は常法、例えば、マ
ンデル・ヒガの方法［マンデル・エムおよびヒガ・エ
イ，ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
（Mandel, M. and Higa,A., J. Mol. Biol.），５３，
１５４（１９７０）］を用いた。

【００１６】第１表に示すようにバシラス・サチルス６
１６５６（Δｉｇｆ）株および大腸菌ＨＢ１０１株はイ
ノシトールデヒドロゲナーゼ活性を有さないが、ファー
ジρ１１iol⁺ で溶原化したバシラス・サチルス６１６
５６（Δｉｇｆ）株およびｐＩＯＬ０１を持つ大腸菌Ｈ
Ｂ１０１株はイノシトールデヒドロゲナーゼ活性を有す
ることから、この１３Ｋｂ断片内にイノシトールデヒド
ロゲナーゼの遺伝子が含まれることが示された。

【００１７】 第１表 バシラス・サチルスにおけるイノシトールデハイドロゲナーゼ遺伝子の発現 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 菌株 イノシトールデヒドロゲナーゼ活性 (nmol/min 蛋白質mg当たり) 培地へのイノシトールの添加 − ＋ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− B. Subtilis 60015(iol+) 10 363 61656( Δigf) <5 <5 61656( Δigf)［ρ11iol+］ 474 232 E. coli HB101 <5 <5 HB101［pIOL01］ 177 226 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−実施例２ 遺伝子のサブクローニング ｐＩＯＬ０１を制限酵素ＢａｍＨＩにて切断し、アガロ
ースゲル電気泳動により１３Ｋｂの挿入断片を回収し、
制限酵素ＢａｍＨＩで切断したプラスミドｐＵＣ１１８
とＴ４リガーゼで結合し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換
して、アンピシリン耐性、５−ブロモ−４−クロロ−３
−インドリル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−
ｇａｌ）およびイソプロピル−ベータ−Ｄ−チオ−ガラ
クトピラノシド（ＩＰＴＧ）共存下での白色コロニー形
成を指標として図１に示すプラスミドｐＩＯＬ０５を得
た。さらに、回収した１３Ｋｂ断片を制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉにて切断し、６．５ＫｂのＥｃｏＲＩ−Ａ断片（図１
中の左方に示されている）を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断
したプラスミドｐＵＣ１１８と結合し、大腸菌ＪＭ１０
９を形質転換して、アンピシリン耐性、Ｘ−ｇａｌおよ
びＩＰＴＧ共存下での白色コロニー形成を指標としてプ
ラスミドｐＩＯＬ０２を得た。

【００１８】これらのプラスミドｐＩＯＬ０５およびｐ
ＩＯＬ０２における挿入断片を大腸菌エキソヌクレアー
ゼIIIを用いてさらに欠失させた。すなわち、ｐＩＯＬ
０５を制限酵素ＢｇｌIIおよびＫｐｎＩにて、ｐＩＯＬ
０２を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩにてそれぞれ
分解し、大腸菌エキソヌクレアーゼIIIを用いてｐＩＯ
Ｌ０５はＢｇｌII認識部位から、ｐＩＯＬ０２はＢａｍ
ＨＩ認識部位から単一方向に欠失させてｐＩＯＬ０５か
らはｐＩＯＬ０５ｄ４４、ｐＩＯＬ０５ｄ１５、ｐＩＯ
Ｌ０５ｄ２６、ｐＩＯＬ０５ｄ３８の各欠失プラスミド
を（図１）、そしてｐＩＯＬ０２からはｐＩＯＬ０２ｄ
００２の欠失プラスミドを（図２）得た。

【００１９】実施例３ 形質転換体のイノシトールデヒドロゲナーゼ活性 実施例２で得た各欠失プラスミドのどれが目的のイノシ
トールデヒドロゲナーゼ遺伝子を有するか調べるため、
これらのプラスミドを含む大腸菌組換え体のイノシトー
ルデヒドロゲナーゼ活性を測定した。イノシトールデヒ
ドロゲナーゼの活性はラマレイ・アールらの方法［ラマ
レイ・アール，フジタ・ワイおよびフリーズ・イー，ジ
ェイ・ビー・シー（Ramaley, R.,Fujita, Y. and Frees
e, E.,The Journal of Biological Chemistry），２５
４（１６），７６８４（１９７９）］を用いた。

【００２０】（詳細な活性測定方法）プラスミドを含む
大腸菌ＨＢ１０１、ＪＭ１０９、ＭＶ１１８４およびプ
ラスミドをもたない大腸菌ＨＢ１０１、ＪＭ１０９、Ｍ
Ｖ１１８４をＬＢ培地（必要に応じてアンピシリンを添
加）にて波長６００ｎｍの吸光度が０．８となるまで３
７℃で培養した（対数増殖中期）。培養液６ｍｌから４
℃，１万回転，１０分の遠心により菌体を集めた。この
菌体を５ｍｌのＰＭ溶液（１００ｍＭリン酸カリウム緩
衝液ｐＨ６．５，１ｍＭ ＭｇＳＯ₄ ）に懸濁、再度の
遠心で菌体を洗浄した。この洗浄済み菌体に０．５ｍｌ
の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えて懸
濁し、６０μｌのリゾチーム溶液（リゾチーム１ｍｇを
０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍｌに溶か
したもの）を添加して３７℃にて２０分処理した後、超
音波式の菌体破砕機で数秒間菌体を破砕し４℃，１万２
千回転，２０分の遠心により上清を回収、酵素粗抽出液
とした。

【００２１】蒸留水６００μｌ、１Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ９．０）１００μｌ、５ｍＭ ＮＡＤ １００μ
ｌからなる反応溶液に１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）で必要に応じて希釈した１００μｌの酵素粗抽出液
を添加し、３４０ｎｍの吸光度に変化の無いことを確認
した上で０．５Ｍのイノシトールを１００μｌ基質とし
て添加し、３４０ｎｍの吸光度の増加速度を測定した。

【００２２】（活性の定義）第２表に示すように、イノ
シトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＩ
ＯＬ０２、ｐＩＯＬ０５、ｐＩＯＬ０５ｄ４４、ｐＩＯ
Ｌ０５ｄ１５を含有する大腸菌の粗抽出液中に高いイノ
シトールデヒドロゲナーゼ活性が認められた。このこと
からイノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子はＥｃｏＲＩ
認識部位からＳｔｕＩ認識部位の間の１．４Ｋｂの間に
存在することが示された。また、これらの活性は、ＩＰ
ＴＧの不存在下でも見られたがＩＰＴＧで誘導された場
合にさらに高い値を示したことから、ｌａｃプロモータ
ーおよびそれ以外の構成的なプロモーターで転写されて
いることが明らかになった。また、対照とした大腸菌中
にはイノシトールデヒドロゲナーゼ活性は認められなか
った。以上の結果から、プラスミドｐＩＯＬ０２、ｐＩ
ＯＬ０５、ｐＩＯＬ０５ｄ４４、ｐＩＯＬ０５ｄ１５は
イノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含有すること、
および当該遺伝子産物であるイノシトールデヒドロゲナ
ーゼは、大腸菌中では、ｌａｃプロモーターおよびそれ
以外の構成的なプロモーターで転写されていることが明
らかになった。

【００２３】 第２表 大腸菌におけるイノシトールデハイドロゲナーゼ遺伝子の発現 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− E. coli 菌株 イノシトールデヒドロゲナーゼ活性 (nmol/min 蛋白質mg当たり) 培地中へのIPTGの添加 − ＋ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− JM109 <5 <5 MV1184 <5 <5 JM109 ［pIOL02］ 353 630 JM109 ［pIOL05］ 250 516 MV1184［pIOL02d002］ <5 <5 MV1184［pIOL05d44 ］ 51 6040 MV1184［pIOL05d15 ］ 108 12000 MV1184［pIOL05d26 ］ 20 226 MV1184［pIOL05d38 ］ <5 <5 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−実施例４ 遺伝子産物の解析 組換え体大腸菌内での枯草菌イノシトールデヒドロゲナ
ーゼ遺伝子産物を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳
動法およびウエスターンブロット法によって解析した。
ウエスターンブロット法はバーネットの方法［バーネッ
ト，ダブリュウ・エヌ，アナリティカル・バイオケミス
トリー（Burnette, W. N., Anal. Biochem.), １１２，
６８０（１９８１）］により行った。

【００２４】実施例３で得た大腸菌粗抽出液、対照のバ
シラス・サチルス６００１５株（イノシトールデヒドロ
ゲナーゼ生産菌）の粗抽出液をＳＤＳ−ポリアクリルア
ミド電気泳動法により分画した。

【００２５】ウエスターンブロット法により、分画され
たタンパク質をニトロセルロース膜に移した後、ウサギ
より調製した抗イノシトールデヒドロゲナーゼ抗体と反
応させた。このように、イノシトールデヒドロゲナーゼ
タンパク質と反応した抗体だけを、パーオキシダーゼ標
識した抗ウサギＩｇＧ抗体と反応させ、イノシトールデ
ヒドロゲナーゼのバンドだけを発色させた。図３に示す
ようにイノシトールで誘導されたバシラス・サチルスの
粗抽出液およびＩＰＴＧで誘導されたイノシトールデヒ
ドロゲナーゼ遺伝子を含む大腸菌の粗抽出液では約４キ
ロダルトン（Kd）に相当するバンドが認められたが、ｐ
ＩＯＬ０５ｄ３８を含む大腸菌の粗抽出液では抗イノシ
トールデヒドロゲナーゼ抗体と反応するタンパク質は認
められなかった。以上の結果は、イノシトールデヒドロ
ゲナーゼ遺伝子を含む大腸菌中では、免疫学的にも同等
のタンパク質が生産されていることを示している。

【００２６】実施例５ ＤＮＡ塩基配列の決定 前記プラスミドｐＩＯＬ０２の約５．６Kbの挿入断片の
うち、実施例３で明かとなったイノシトールデヒドロゲ
ナーゼ遺伝子を含むＥｃｏＲＩ−ＳｔｕＩ断片を含む約
２．４KbのＤＮＡ断片について、サンガーらの方法［サ
ンガー・エフら，プロシーディングス・オブ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー・エス・エイ
（Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad.Sci. US
A）, ７４，５４６３（１９７７）］によってその全塩
基配列を決定した（配列表および図４−図１０参照）。

【００２７】決定した塩基配列は２４０１塩基対からな
り、イノシトールデヒドロゲナーゼの全領域を含んでい
る。塩基配列（図４−図１０）中には、１３２９番目の
ＡＴＧから始まり、２３６０番目のＴＡＡで終わる１０
３２塩基対のイノシトールデヒドロゲナーゼに対応する
オープンリーディングフレームが存在する。ＡＴＧ開始
コドンの９塩基対前にはＧＡＡＧＧＡＧＴのリボソーム
バインディングサイトが存在する。

【００２８】実施例６ アミノ酸配列 決定されたイノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子の塩基
配列から推定されるアミノ酸配列（図４−図１０）か
ら、イノシトールデヒドロゲナーゼは３４４アミノ酸残
基からなる分子量３８３３２ダルトンの酵素であると考
えられた。この値はラマレイ・アールら［ラマレイ・ア
ール，フジタ・ワイおよびフリーズ・イー，ジェイ・ビ
ー・シー（Ramaley, R., Fujita, Y. and Freese, E.,T
he Journalof Biological Chemistry），２５４（１
６），７６８４（１９７９）］によるサブユニットの分
子量３９００ダルトンと良く一致する。

【００２９】

【発明の効果】本発明によれば、バシラス・サチルス由
来のイノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む２．４
KbのＤＮＡ断片の全塩基配列を決定し、当該イノシトー
ルデヒドロゲナーゼの遺伝子構造、さらにはタンパク質
構造（アミノ酸配列）が明らかになり、イノシトールデ
ヒドロゲナーゼを、例えば、遺伝子工学的手法により改
良することや、適当な宿主で大量に生産することができ
るようになる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、イノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子
を含む組換えプラスミド（ｐＩＯＬ０５）および当該組
換えプラスミドより作成した、各種欠失プラスミドの制
限酵素地図であり、図中、下部の太線矢印は、イノシト
ールデヒドロゲナーゼ遺伝子をコードする領域およびそ
の転写の方向を示す。

【図２】図２は、図１と同様、イノシトールデヒドロゲ
ナーゼ遺伝子を含む組換えプラスミド（ｐＩＯＬ０２）
およびその欠失プラスミドの制限酵素地図である。

【図３】図３は、ウェスターンブロット法による組換え
体大腸菌内でのイノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子産
物の解析の結果を示す図面であり、図中、Ｍのレーンは
同時に泳動を行った分子量マーカーであり、その分子量
は、上から９３kd、６６kd、４５kd、３１kdおよび２２
kdである。

【図４】図４は、イノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子
を含むＤＮＡ断片の全塩基配列および上記塩基配列より
推定されるイノシトールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配
列のうち、１−４５５番迄の塩基に相当する部分を示す
図である。

【図５】図５は、イノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子
を含むＤＮＡ断片の全塩基配列および上記塩基配列より
推定されるイノシトールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配
列のうち、４５６−８５４番迄の塩基に相当する部分を
示す図である。

【図６】図６は、イノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子
を含むＤＮＡ断片の全塩基配列および上記塩基配列より
推定されるイノシトールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配
列のうち、８５７−１３１０番迄の塩基に相当する部分
を示す図である。

【図７】図７は、イノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子
を含むＤＮＡ断片の全塩基配列および上記塩基配列より
推定されるイノシトールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配
列のうち、１３１１−１５９５番迄の塩基に相当する部
分を示す図である。

【図８】図８は、イノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子
を含むＤＮＡ断片の全塩基配列および上記塩基配列より
推定されるイノシトールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配
列のうち、１５９６−１９３７番迄の塩基に相当する部
分を示す図である。

【図９】図９は、イノシトールデヒドロゲナーゼ遺伝子
を含むＤＮＡ断片の全塩基配列および上記塩基配列より
推定されるイノシトールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配
列のうち、１９３８−２２７９番迄の塩基に相当する部
分を示す図である。

【図１０】図１０は、イノシトールデヒドロゲナーゼ遺
伝子を含むＤＮＡ断片の全塩基配列および上記塩基配列
より推定されるイノシトールデヒドロゲナーゼのアミノ
酸配列のうち、２２８０−２４０１番迄の塩基に相当す
る部分を示す図である。 〔配列表〕 配列−１ １． 配列の種類 ｃＤＮＡ ２． 配列の名称 イノシトールデヒドロゲナーゼ遺
伝子 ３． 配列の長さ ２４０１ ５． 配列 ATGCAATACC ATGAATCAGC CTCAATAAAC GACAATCTAC AACATTGCCA ACTATATTGA 60 TGCCGGTTCA ATTGTGCAGC TCCGCCGGTT TATCATTATG GGTCAGTTAC CTTAAGCTAT 120 CCGATACGCA AATCGGGCTG CTCCGCGCGT TGAGGCCAAA TGCGATTTCT GCCGCTGTCG 180 CGCGCTGCTT GGCGGGTTTC TGGCTGATAA AGTCGGACGG AAGGCTGTTT ATACCAATAG 240 TATGCTGGTT TATGCACTAG GGATTTGTTT GGTTTTGTTC GGGGTTAATT TCCCCATGTT 300 GTTAAGCGGT TACATCATTA TCGGTTTATC AGTAGGGGCT GACATAACCG CGTCATGGAC 360 CATTATTGCG GAAAATGCGC CAAAGAAGAA TCGGGCCAGG CATTGCGCGT AGCACAAGTC 420 GCTTGGGCCG CGGGCGCTGT CGTTGTACTG CTCCTCTCCG TACTGGCCGG TGACTTGGGA 480 CTCTTGGGGA ATAAAATCGT ATTTGCCCAT CTGCTTGTGA TTGCGCTGAT TACGTACATC 540 CTGAGAATCA GGCTTCCGGA ATCAGACGCC TGGCAGACAA AAAATCAGCC GGAGGAAGCT 600 CAGGCAGAGA AGCCGGCTGT ATTGAATAAG ACATCGTATT TTGATTTGCT CAAGCCTATG 660 TATCTAAAAA GCATCCTGTT TTTGATGGGT GTGTACTTGG TTTGGAACCT AGCCGCCGGG 720 GTCATGGGCT TCTTTATGCC ATACATTTAT CAGCAGGTCC GGCGGTGTAT CTGCCAACAT 780 GGCCAACCTT TTGCAAATGG GGCTGTTTAT CTTCACAGGA TTGGGGGTCG CCTTGATCTT 840 CATGCCCTTT GCCGACAAAT ATAGAAAAAC CGTATTTGGA ATCGCCGCTT TCATGGCGGT 900 GATCGGGTGG ACACTGTTTC TGCTGCCAGT TGAAGGCCTG CCGATTCTGC TCCTGTTTAT 960 TGTCGTGATC GGCATCAATA ACGGAGCCGG GCAGCAAGCG AACTATCAGT TATGGGCCAG 1020 CGAAATCTTT CCTACGCAAT TAATTCGTTG CTTCCGCACA AGGACTGATG TTTTTCCTGT 1080 CCGTATTTCA ATAGGGATTT GGAGTCTGTT TGTCCCAATG ATTATCACCA ATTTCGGCAT 1140 TGGAACGATG GCTGCAATTC TTCTCGGATG TGTGACGGCC AGTATGATCA TCGGGCTGCT 1200 CTTTGCGCCG AATACGTCTG GCAAGTCGCT TGAACAAATT CAAGAGGAAC TCTACGGGTC 1260 TCCTCAGAGC CAAGTAAAGA AAGGAACAGA AAGCAAAATC ATGTAACCAA CAGAAGGAGT 1320 GGCTGTCA ATG AGT TTA CGT ATT GGC GTA ATT GGA ACT GGA GCA ATC GGA 1370 Met Ser Leu Arg Ile Gly Val Ile Gly Thr Gly Ala Ile Gly 1 5 10 AAA GAA CAT ATT AAC CGT ATC ACG AAC AAG CTG TCA GGC GCG GAA ATT 1418 Lys Glu His Ile Asn Arg Ile Thr Asn Lys Leu Ser Gly Ala Glu Ile 15 20 25 30 GTA GCT GTA ACG GAT GTT AAT CAA GAA GCT GCA CAA AAG GTC GTT GAG 1466 Val Ala Val Thr Asp Val Asn Gln Glu Ala Ala Gln Lys Val Val Glu 35 40 45 CAA TAC CAA TTA AAC GCG ACG GTT TAT CCG AAT GAT GAC AGC TTG CTT 1514 Gln Tyr Gln Leu Asn Ala Thr Val Tyr Pro Asn Asp Asp Ser Leu Leu 50 55 60 GCA GAC GAA AAT GTA GAC GCT GTT TTA GTG ACA AGC TGG GGG CCT GCG 1562 Ala Asp Glu Asn Val Asp Ala Val Leu Val Thr Ser Trp Gly Pro Ala 65 70 75 CAT GAG TCA AGC GTG CTG AAA GCG ATT AAA GCC CAG AAA TAT GTG TTC 1610 His Glu Ser Ser Val Leu Lys Ala Ile Lys Ala Gln Lys Tyr Val Phe 80 85 90 TGT GAA AAA CCG CTC GCG ACA ACG GCT GAA GGA TGC ATG CGC ATT GTC 1658 Cys Glu Lys Pro Leu Ala Thr Thr Ala Glu Gly Cys Met Arg Ile Val 95 100 105 110 GAA GAA GAA ATC AAA GTG GGC AAA CGC CTT GTT CAA GTC GGC TTC ATG 1706 Glu Glu Glu Ile Lys Val Gly Lys Arg Leu Val Gln Val Gly Phe Met 115 120 125 CGC CGT TAT GAC AGC GGT TAC GTA CAG CTG AAA GAA GCG CTC GAT AAT 1754 Arg Arg Tyr Asp Ser Gly Tyr Val Gln Leu Lys Glu Ala Leu Asp Asn 130 135 140 CAT GTC AAC GGC GAG CCT CTT ATG ATT CAC TGC GCG CAC CGC AAC CCG 1802 His Val Asn Gly Glu Pro Leu Met Ile His Cys Ala His Arg Asn Pro 145 150 155 ACT GTA GGA GAT AAC TAT ACA ACG GAT ATG GCT GTA GTC GAC ACG CTT 1850 Thr Val Gly Asp Asn Tyr Thr Thr Asp Met Ala Val Val Asp Thr Leu 160 165 170 GTT CAT GAA ATT GAC GTG CTC CAC TGG CTC GTC AAT GAT GAC TAC GAG 1898 Val His Glu Ile Asp Val Leu His Trp Leu Val Asn Asp Asp Tyr Glu 175 180 185 190 TCC GTT CAA GTC ATC TAT CCG AAA AAA TCA AAA AAC GCG CTT CCA CAT 1946 Ser Val Gln Val Ile Tyr Pro Lys Lys Ser Lys Asn Ala Leu Pro His 195 200 205 TTA AAA GAT CCG CAA ATC GTC GTG ATT GAA ACA AAA GGC GGT ATC GTC 1994 Leu Lys Asp Pro Gln Ile Val Val Ile Glu Thr Lys Gly Gly Ile Val 210 215 220 ATC AAT GCT GAA ATC TAT GTG AAC TGT AAA TAC GGC TAT GAC ATT CAA 2042 Ile Asn Ala Glu Ile Tyr Val Asn Cys Lys Tyr Gly Tyr Asp Ile Gln 225 230 235 TGT GAA ATC GTC GGA GAA GAC GGC ATC ATC AAG CTT CCC GAG CCA TCA 2090 Cys Glu Ile Val Gly Glu Asp Gly Ile Ile Lys Leu Pro Glu Pro Ser 240 245 250 AGC ATC AGC TTG AGA AAA GAA GGC AGA TTC AGC ACT GAT ATT TTG ATG 2138 Ser Ile Ser Leu Arg Lys Glu Gly Arg Phe Ser Thr Asp Ile Leu Met 255 260 265 270 GAT TGG CAG AGA CGC TTT GTC GCT GCG TAT GAT GTG GAA ATC CAA GAC 2186 Asp Trp Gln Arg Arg Phe Val Ala Ala Tyr Asp Val Glu Ile Gln Asp 275 280 285 TTT ATT GAT TCG ATT CAA AAG AAA GGC GAG GTC AGC GGA CCG ACG GCA 2234 Phe Ile Asp Ser Ile Gln Lys Lys Gly Glu Val Ser Gly Pro Thr Ala 290 295 300 TGG GAC GGC TAT ATT GCT GCT GTC ACG ACT GAC GCG TGT GTA AAA GCC 2282 Trp Asp Gly Tyr Ile Ala Ala Val Thr Thr Asp Ala Cys Val Lys Ala 305 310 315 CAG GAA TCT GGA CAA AAA GAA AAG GTT GAA TTG AAG GAA AAA CCG GAA 2330 Gln Glu Ser Gly Gln Lys Glu Lys Val Glu Leu Lys Glu Lys Pro Glu 320 325 330 TTC TAT CAA TCT TTT ACA ACA GTT CAA AAC TAA AAAACAGAGG AGTGAAAATA 2383 Phe Tyr Gln Ser Phe Thr Thr Val Gln Asn STP 335 340 TGAAGTTAGC ATTGGATC 2401

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 バシラス・サチルス（Bacillus subtili
   s）に属する微生物由来のイノシトールデヒドロゲナー
   ゼ遺伝子またはそれと実質的に生物学的に同等なイノシ
   トールデヒドロゲナーゼ活性をコードする遺伝子。
2. 【請求項２】 下記式（Ｉ）： MSLRIGVIGTGAIGKEHINRITNKLSGAEIVAVTDVNQEAAQKVVEQYQLNATVYPNDDSLLADENVDAVLV TSWGPAHESSVLKAIKAQKYVFCEKPLATTAEGCMRIVEEEIKVGKRLVQVGFMRRYDSGYVQLKEALDNHV NGEPLMIHCAHRNPTVGDNYTTDMAVVDTLVHEIDVLHWLVNDDYESVQVIYPKKSKNALPHLKDPQIVVIE TKGGIVINAEIYVNCKYGYDIQCEIVGEDGIIKLPEPSSISLRKEGRFSTDILMDWQRRFVAAYDVEIQDFI DSIQKKGEVSGPTAWDGYIAAVTTDACVKAQESGQKEKVELKEKPEFYQSFTTVQN （Ｉ） （式中のアルファベットは、以下のアミノ酸を示す：
   Ａ；アラニン、Ｃ；システイン、Ｄ；アスパラギン酸、
   Ｅ；グルタミン酸、Ｆ；フェニルアラニン、Ｇ；グリシ
   ン、Ｈ；ヒスチジン、Ｉ；イソロイシン、Ｋ；リシン、
   Ｌ；ロイシン、Ｍ；メチオニン、Ｎ；アスパラギン、
   Ｐ；プロリン、Ｑ；グルタミン、Ｒ；アルギニン、Ｓ；
   セリン、Ｔ；スレオニン、Ｖ；バリン、Ｗ；トリプトフ
   ァン、Ｙ；チロシン）で表されるアミノ酸配列、または
   それと実質的に生物学的に同等なアミノ酸配列を有す
   る、イノシトールデヒドロゲナーゼ。
3. 【請求項３】 請求項２記載の式（Ｉ）で表されるアミ
   ノ酸配列、またはそれと実質的に生物学的に同等なアミ
   ノ酸配列を有するイノシトールデヒドロゲナーゼのアミ
   ノ酸配列をコードする遺伝子。
4. 【請求項４】 下記式（II）： ATGAGTTTACGTATTGGCGTAATTGGAACTGGAGCAATCGGAAAAGAACATATTAACCGTATCACGAACAAG CTGTCAGGCGCGGAAATTGTAGCTGTAACGGATGTTAATCAAGAAGCTGCACAAAAGGTCGTTGAGCAATAC CAATTAAACGCGACGGTTTATCCGAATGATGACAGCTTGCTTGCAGACGAAAATGTAGACGCTGTTTTAGTG ACAAGCTGGGGGCCTGCGCATGAGTCAAGCGTGCTGAAAGCGATTAAAGCCCAGAAATATGTGTTCTGTGAA AAACCGCTCGCGACAACGGCTGAAGGATGCATGCGCATTGTCGAAGAAGAAATCAAAGTGGGCAAACGCCTT GTTCAAGTCGGCTTCATGCGCCGTTATGACAGCGGTTACGTACAGCTGAAAGAAGCGCTCGATAATCATGTC AACGGCGAGCCTCTTATGATTCACTGCGCGCACCGCAACCCGACTGTAGGAGATAACTATACAACGGATATG GCTGTAGTCGACACGCTTGTTCATGAAATTGACGTGCTCCACTGGCTCGTCAATGATGACTACGAGTCCGTT CAAGTCATCTATCCGAAAAAATCAAAAAACGCGCTTCCACATTTAAAAGATCCGCAAATCGTCGTGATTGAA ACAAAAGGCGGTATCGTCATCAATGCTGAAATCTATGTGAACTGTAAATACGGCTATGACATTCAATGTGAA ATCGTCGGAGAAGACGGCATCATCAAGCTTCCCGAGCCATCAAGCATCAGCTTGAGAAAAGAAGGCAGATTC AGCACTGATATTTTGATGGATTGGCAGAGACGCTTTGTCGCTGCGTATGATGTGGAAATCCAAGACTTTATT GATTCGATTCAAAAGAAAGGCGAGGTCAGCGGACCGACGGCATGGGACGGCTATATTGCTGCTGTCACGACT GACGCGTGTGTAAAAGCCCAGGAATCTGGACAAAAAGAAAAGGTTGAATTGAAGGAAAAACCGGAATTCTAT CAATCTTTTACAACAGTTCAAAACTAA （II） で表される塩基配列、またはそれと実質的に生物学的に
   同等な塩基配列を有するイノシトールデヒドロゲナーゼ
   遺伝子。
5. 【請求項５】 請求項３または４に記載のイノシトール
   デヒドロゲナーゼ遺伝子、または該遺伝子と実質的に生
   物学的に同等な遺伝子を有する組換えベクター。
6. 【請求項６】 請求項５記載の組換えベクターにより形
   質転換された宿主細胞。
7. 【請求項７】 請求項６記載の宿主細胞を培養し、その
   細胞体内または培養液からイノシトールデヒドロゲナー
   ゼ活性物質を回収することを特徴とするイノシトールデ
   ヒドロゲナーゼの製造方法。