JP3358686B2 - 新規なグルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子及び該遺伝子を用いたグルタミン酸デヒドロゲナーゼの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規なグルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼをコードする遺伝子及び該遺伝子を用いた
グルタミン酸デヒドロゲナーゼの製造法に関するもので
ある。

【０００２】

【従来の技術】グルタミン酸デヒドロゲナーゼは、動
物、植物、微生物等に広く存在するが、補酵素特異性に
より３種類に分類されている。補酵素としてＮＡＤ⁺ を
要求する酵素(EC1.4.1.2) は、高等植物、細菌、カビ、
酵母等に存在し、グルタミン酸の分解に関与している。
補酵素としてＮＡＤ⁺ とＮＡＤＰ⁺ を要求する酵素(EC
1.4.1.3) は、動物、細菌、カビ等に存在するが、ウシ
肝由来のものが最も有名である。また、補酵素としてＮ
ＡＤＰ⁺ を要求する酵素(EC1.4.1.4) は、細菌、酵母、
カビ等に存在し、グルタミン酸の生合成に関与してい
る。

【０００３】グルタミン酸デヒドロゲナーゼは、酸化的
脱アミノ反応および還元的アミノ化反応を利用して、グ
ルタミン酸、アンモニアの測定に利用できる。また、各
種の酵素と共役して、尿素態窒素、クレアチニン、ロイ
シンアミノペプチダーゼ、グルタミン酸オキサロ酢酸ト
ランスアミナーゼの測定に使用することができる。

【０００４】汎用されているグルタミン酸デヒドロゲナ
ーゼは、ウシ肝由来のものが挙げられる。該酵素はＮＡ
Ｄ⁺ とＮＡＤＰ⁺ を利用できる酵素(EC.1.4.1.3)である
が、活性化剤としてＡＤＰを必要とし、ＡＤＰ非存在下
では安定性に乏しいことも知られている。また、プロテ
ウス(Proteus) 属の酵素、酵母由来の酵素も市販されて
いる。これらはＮＡＤＰ⁺ 依存性のグルタミン酸デヒド
ロゲナーゼ(EC1.4.1.4) であり、ＮＡＤＰ⁺ を利用する
ため、生体試料中のアンモニア等を測定する際、夾雑反
応が少ない利点がある。しかし、その一方、ＮＡＤＰＨ
（ＮＡＤＰ⁺ ）はＮＡＤＨ（ＮＡＤ⁺ ）に比して、高価
であるという欠点を持つ。また、近年、調製の手間が不
必要な液状試薬が流通しつつあるが、ＮＡＤＰＨはＮＡ
ＤＨに比べ、液状での安定性が著しく劣ることが知られ
ている。

【０００５】上記の問題点を解決するため、鋭意研究を
重ねた結果、シュードモナス(Pseudomonas) 属の１種
（シュードモナス・エスピー 433-3(FERMP-14092))がＮ
ＡＤ⁺（ＮＡＤＨ）を補酵素として使用でき、熱安定で
あり、また試薬溶液中で安定性が高く、かつ活性化にＡ
ＤＰを必要としない新規なグルタミン酸デヒドロゲナー
ゼを生産することが見い出された（特願平6-19448 号、
特願平7-28242 号）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】上記シュードモナス・
エスピー 433-3(FERMP-14092) からグルタミン酸デヒド
ロゲナーゼを製造する場合、生産性が低い点などから製
造コストが高くなり、臨床検査薬用酵素の給源としては
問題であった。本発明の目的は、上記の問題点を解決す
るため、遺伝子工学的手法によって、新規グルタミン酸
デヒドロゲナーゼを高純度な形で大量供給し得る手段を
提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するため、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ生産菌
として、シュードモナス・エスピー 433-3(FERMP-1409
2) を選び、該菌体より抽出した染色体ＤＮＡよりグル
タミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の単離に成功し、その
ＤＮＡの全構造を決定した。さらに該グルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼを遺伝子工学的手法によって高生産させる
ことに成功し、高純度なグルタミン酸デヒドロゲナーゼ
を安価に大量供給することを可能にした。

【０００８】すなわち本発明は、グルタミン酸デヒドロ
ゲナーゼをもたらす配列表・配列番号１に記載されたア
ミノ酸配列、または該アミノ酸配列において、１もしく
は複数のアミノ酸が付加、欠失、もしくは置換されてお
り、且つグルタミン酸デヒドロゲナーゼの酵素活性をも
たらすアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含有すること
を特徴とするグルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードす
るＤＮＡ断片である。

【０００９】また本発明は、配列表・配列番号１に記載
されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡとハイブリダイ
ズするＤＮＡを含有することを特徴とするグルタミン酸
デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ断片である。

【００１０】本発明の一実施態様は、配列表・配列番号
１に記載されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含有
するグルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ
断片である。

【００１１】さらに本発明の別な実施態様は、配列表・
配列番号１に記載されたアミノ酸配列において、１もし
くは複数のアミノ酸が付加、欠失、もしくは置換されて
おり、且つグルタミン酸デヒドロゲナーゼの酵素活性を
もたらすアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含有するグ
ルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ断片で
ある。

【００１２】本発明のＤＮＡ断片は、配列表・配列番号
２に記載された塩基配列を含有するグルタミン酸デヒド
ロゲナーゼをコードするＤＮＡ断片であってもよい。

【００１３】また本発明のＤＮＡ断片は、配列表２に記
載のＤＮＡ配列に対し、突然変異によって変化させられ
た、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペ
プチドをコードすることを特徴とするグルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼをコードするＤＮＡ断片であってもよい。

【００１４】また本発明は上記ＤＮＡ断片を含有する組
換えベクターである。

【００１５】さらに本発明は上記組換えベクターによ
り、微生物またはセル・カルチャーを形質転換したこと
を特徴とする形質転換体である。

【００１６】本発明は上記形質転換体を栄養培地で培養
し、グルタミン酸デヒドロゲナーゼを生成させ、該グル
タミン酸デヒドロゲナーゼを採取することを特徴とする
グルタミン酸デヒドロゲナーゼの製造法である。

【００１７】本発明の遺伝子は、例えばシュードモナス
・エスピー 433-3(FERMP-14092) を起源とする。この菌
株を培養する培地としては、使用菌株が資化しうる炭素
源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を適量含有す
るものであれば、合成培地、天然培地いずれも使用でき
る。炭素源としては例えばグルコース、グリセロール等
が使用できる。窒素源としては例えばペプトン類、肉エ
キス、酵母エキス等の窒素含有天然物や塩化アンモニウ
ム、クエン酸アンモニウム等の無機窒素含有化合物が使
用される。無機物としてはリン酸カリウム、リン酸ナト
リウム、硫酸マグネシウム等が使用される。

【００１８】また、グルタミン酸デヒドロゲナーゼの生
産誘導物質としてグルタミン酸ナトリウムを培地に添加
しておくことが望ましい。培養は通常、振盪培養あるい
は、通気撹拌培養で行う。培養温度は20〜30℃、好まし
くは25〜30℃、培養ｐＨは６〜９の範囲で、好ましくは
ｐＨ７〜８に制御するのがよい。培養期間は通常１〜３
日で菌体内にグルタミン酸デヒドロゲナーゼが生産蓄積
される。

【００１９】培養した菌体からのグルタミン酸デヒドロ
ゲナーゼの精製法は、一般に用いられる精製法を用いれ
ば良い。例えば、抽出法には超音波破砕、ガラスビーズ
やフレンチプレスなどを用いた物理的物理的破砕方法が
用いられる。さらに抽出液については硫安などの塩析法
による粗精製を行った後、ＤＥＡＥセファロース、ＣＭ
ーセファロースなどのイオン交換クロマトグラフィーや
フェニルセファロース、ブチルセファロースなどの疎水
クロマトグラフィー、あるいはゲルろ過等により高純度
に精製することができる。またこれらの方法で得られた
粗酵素液や精製酵素液は、例えばスプレードライや凍結
乾燥により粉末化できる。

【００２０】本発明者らが精製したタンパク質は、ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動的に均一なバンド
を示した。

【００２１】次に本発明のグルタミン酸デヒドロゲナー
ゼの活性測定法（還元的アミノ化反応）を示す。下記の
反応混液を調製する。 ０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３） ２５ｍｌ ３．３Ｍ ＮＨ₄ Ｃｌ溶液 ２ｍｌ ０．２２５Ｍ α−ケトグルタル酸溶液 １ｍｌ ７．５ｍＭ ＮＡＤＨ溶液 １ｍｌ 上記反応液2.9ml をキュベットにとり、37℃で約５分予
備加温する。次いで酵素溶液0.1ml を加えて反応を開始
し、37℃に制御された分光光度計で340nm の吸光光度変
化を３〜４分間記録し、その初期直線部分から１分間当
たりの吸光度変化を求める。盲検は酵素液の代わりに0.
1M Tris-HCl 緩衝液(pH8.3) を加え、上記同様に操作を
行う。グルタミン酸デヒドロゲナーゼの活性の表示は、
上記条件下で１分間に１μモルのＮＡＤＨが酸化される
酵素量を１単位（Ｕ）とする。

【００２２】上記グルタミン酸デヒドロゲナーゼの理化
学的性質は以下の通りである。 （１）作用：以下の反応を触媒する。

【００２３】

【化１】

【００２４】（２）基質特異性：Ｌ−グルタミン酸に対
し特異的である。補酵素としてＮＡＤ⁺ およびＮＡＤＨ
を要求し、ＮＡＤＰ⁺およびＮＡＤＰＨには作用しな
い。 （３）至適作用ｐＨ：１０．５〜１１．５（酸化的脱ア
ミノ反応） （４）ｐＨ安定性：ｐＨ５〜１０（２５℃、２０時間） （５）至適作用温度：約６０℃（酸化的脱アミノ反応） （６）熱安定性：約６０℃まで安定（ｐＨ８．３，１０
分処理） （７）分子量：約２８０，０００（ゲルろ過法） （８）ＡＤＰを活性化剤として要求しない。

【００２５】本発明の新規グルタミン酸デヒドロゲナー
ゼをコードする遺伝子は、シュードモナス・エスピー 4
33-3(FERMP-14092) 菌体から抽出しても良く、また化学
的に合成することもできる。上記遺伝子配列としては、
例えば配列番号１に記載されたアミノ酸配列、または該
アミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が付
加、欠失もしくは置換されており、且つグルタミン酸デ
ヒドロゲナーゼの酵素活性をもたらすアミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡ、または該アミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡにハイブリダイズするＤＮＡ、または配列番号２に
記載された塩基配列を有するＤＮＡ、または配列表番号
２に記載された配列に対し、突然変異により変化させら
れたＤＮＡを挙げることができる。

【００２６】本発明の遺伝子は、例えばシュードモナス
・エスピー 433-3(FERMP-14092) の染色体ＤＮＡを分離
・精製した後、超音波破砕、制限酵素などを用いてＤＮ
Ａを切断したものと、リニヤーな発現ベクターとを両Ｄ
ＮＡの平滑末端または接着末端部においてＤＮＡリガー
ゼなどにより結合閉環させて組換えベクターとする。得
られた組換えベクターは複製可能な宿主微生物に移入し
た後、ベクターのマーカーとグルタミン酸デヒドロゲナ
ーゼ蛋白質の発現を指標として、スクリーニングして、
該組換えＤＮＡベクターを保持する微生物を得る。グル
タミン酸デヒドロゲナーゼ蛋白質発現のスクリーニング
方法としては、該蛋白質の抗体を用いた抗原抗体反応に
よる方法、直接、該蛋白質の活性を測定する方法、該蛋
白質の欠損変異株を用いた栄養要求性の相補による方法
等を用いることができる。該蛋白質を発現した微生物を
培養し、該培養菌体から該組換えベクターを分離・精製
し、次いで該組換えベクターからグルタミン酸デヒドロ
ゲナーゼ遺伝子を採取すれば良い。

【００２７】遺伝子供与体であるシュードモナス・エス
ピー 433-3(FERMP-14092) に由来するＤＮＡは、具体的
に以下のように採取される。すなわち供与微生物を例え
ば液体培地で約１〜３日間撹拌培養して得られた培養物
を遠心分離にて集菌し、次いでこれを溶菌させる事によ
りグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の含有溶菌物を
調製する事が出来る。溶菌の方法としては、例えばリゾ
チームやβ−グルカナーゼなどの溶菌酵素により処理が
施され、必要に応じてプロテアーゼや他の酵素やラウリ
ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの界面活性剤が併用さ
れ、更に凍結融解やフレンチプレス処理の様な物理的破
砕方法と組み合わせても良い。

【００２８】このようにして得られた溶菌物からＤＮＡ
を分離・精製するには、常法に従って、例えばフェノー
ル処理やプロテアーゼ処理による除蛋白処理や、リボヌ
クレアーゼ処理、アルコール沈澱処理などの方法を適宜
組み合わせることにより行う。微生物から分離・精製さ
れたＤＮＡを切断する方法は、例えば超音波処理、制限
酵素処理などにより行うことできるが、好ましくは特定
ヌクレオチド配列に作用するII型制限酵素が適してい
る。

【００２９】ベクターとしては、宿主微生物内で自律的
に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換
え用として構築されたものが適している。ファージとし
ては、例えばエシェリヒア・コリー(Escherichia coli)
を宿主微生物とする場合には、λgt・10 ，λgt・11 など
が使用できる。またプラスミドとしては、例えばエシェ
リヒア・コリーを宿主微生物とした場合、pBR322，pUC1
9 ，pBluescript などが使用できる。このようなベクタ
ーを先に述べたグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子供
与体である微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素で切
断してベクター断片を得る事ができるが、必ずしも該微
生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素と同一の制限酵素
を用いる必要はない。微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮ
Ａ断片とを結合させる方法は、公知のＤＮＡリガーゼを
用いる方法で有れば良く、例えば微生物ＤＮＡ断片の接
着末端とベクター断片の接着末端とのアニーリングの
後、適当なＤＮＡリガーゼの使用により微生物ＤＮＡ断
片とベクター断片との組換えベクターを作成する。必要
ならば、アニーリングの後、宿主微生物に移入して生体
内のＤＮＡリガーゼを利用し、組換えベクターを作成す
ることもできる。

【００３０】宿主微生物としては、組換えベクターが安
定且つ自立的に増殖可能で、且つ外来性遺伝子の形質発
現できる物で有れば良く、一般的にはエシェリヒア・コ
リーW3110 、エシェリヒア・コリーC600、エシェリヒア
・コリーJM109 、エシェリヒア・コリーHB101 などを用
いることができる。

【００３１】宿主微生物に組換えベクターを移入する方
法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリー
属に属する微生物の場合には、カルシウム処理によるコ
ンピテントセル法やエレクトロポレーション法などを用
いることができる。こうして得られた形質転換体である
微生物は栄養培地で培養されることにより、多量のグル
タミン酸デヒドロゲナーゼを安定に生産し得ることを見
いだした。宿主微生物への目的組換えベクター移入の有
無についての選択は、目的とするＤＮＡを保持するベク
ターの薬剤耐性マーカーとグルタミン酸デヒドロゲナー
ゼとを同時に発現する微生物を検索すれば良く、例えば
薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、グルタミ
ン酸デヒドロゲナーゼを生成する微生物を選択すれば良
い。

【００３２】上記方法により得られたグルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼ遺伝子の塩基配列は、サイエンス(Scienc
e),214,1205〜1210(1981)に記載されたジデオキシ法で
解読し、またグルタミン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸
配列は塩基配列より推定した。このようにして一度選択
されたグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を保有する
組換えベクターは、形質転換微生物から取り出され、他
の微生物に移入することも容易に実施できる。また、グ
ルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を保持する組換えベ
クターから制限酵素などによりグルタミン酸デヒドロゲ
ナーゼ遺伝子であるＤＮＡを切り出し、これを同様な方
法により切断して得られるベクター断片と結合させて、
宿主微生物に移入する事も容易に実施できる。

【００３３】形質転換体である宿主微生物の培養形態
は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択す
れば良く、通常、多くの場合は液体培養で行うが、工業
的には通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の炭素
源としては、微生物の培養に通常用いられる物が広く使
用され得る。宿主微生物が資化可能で有れば良く、例え
ばグルコース、シュークロース、ラクトース、マルトー
ス、フラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用でき
る。窒素源としては、宿主微生物が利用可能な窒素化合
物で有れば良く、例えばペプトン、肉エキス、カゼイン
加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物のような有機窒素化
合物や、硫安、塩安の様な無機窒素化合物が使用でき
る。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウ
ム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの
塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応
じて使用できる。

【００３４】培養温度は宿主微生物が発育し、グルタミ
ン酸デヒドロゲナーゼを生産する範囲で適宜変更し得る
が、エシェリヒア・コリーの場合、好ましくは２０〜４
２℃程度である。培養時間は、培養条件により多少変動
するが、グルタミン酸デヒドロゲナーゼが最高収量に達
する時期を見計らって適当時期に培養を終了すれば良
い。培地ｐＨは宿主微生物が発育し、グルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼを生産する範囲内で適宜変更し得る。培養
液より菌体を回収する方法は、通常、用いられる方法に
より行えば良く、例えば遠心分離、濾過などによって回
収することができる。培養液中のグルタミン酸デヒドロ
ゲナーゼが菌体外に分泌される場合は、この菌体分離液
を用いれば良く、菌体内に存在する場合は、前述したよ
うな破砕方法によって破砕抽出することができる。この
ようにして得られた抽出液を用いて硫安などの塩析法に
よる粗精製を行った後、ＤＥＡＥセファロース、ＣＭ−
セファロースなどのイオン交換クロマトグラフィーやフ
ェニルセファロース、ブチルセファロースなどの疎水ク
ロマトグラフィー、あるいはゲルろ過等により高純度に
精製することができる。

【００３５】本発明のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活
性を有する蛋白質は、以下に示す性質を有する。 （１）作用：以下の反応を触媒する。

【００３６】

【化２】

【００３７】（２）基質特異性：Ｌ−グルタミン酸に対
し特異的である。補酵素としてＮＡＤ⁺ およびＮＡＤＨ
を要求し、ＮＡＤＰ⁺およびＮＡＤＰＨには作用しな
い。 （３）至適作用ｐＨ：１０．５〜１１．５（酸化的脱ア
ミノ反応） （４）ｐＨ安定性：ｐＨ５〜１０（２５℃、２０時間） （５）至適作用温度：約６０℃（酸化的脱アミノ反応） （６）熱安定性：約６０℃まで安定（ｐＨ８．３，１０
分処理） （７）分子量：約２８０，０００（ゲルろ過法） （８）ＡＤＰを活性化剤として要求しない。

【００３８】以下、実施例により本発明を詳細に説明す
る。参考例１ シュードモナス・エスピー 433-3(FERMP-14092) からの
グルタミン酸デヒドロゲナーゼの製造 グルタミン酸ナトリウム0.6%、ポリペプトン1.0%、酵母
エキス1.O%、グリセロール1.0%を含む培地(pH7.0) 60ml
を 500ml容坂口フラスコに分注し、殺菌(121℃、15分）
した。シュードモナス・エスピー 433-3(FERPM-14092)
をこれに接種し、30℃で 1日培養したものを種培養液と
した。次に、同培地 6リットルを10リットル容ジャーフ
ァーメンターに移し、121 ℃で15分間オートクレーブを
行い、放冷後、種培養液60mlを移し、300rpm、通気量 2
リットル／分、30℃で24時間培養した。この時の培養力
価は8.9U/ml だった。培養終了後、培養液より集菌し、
50mM Tris-HCl 緩衝液(pH7.5) に懸濁した。

【００３９】懸濁液をダイノミルで処理し、遠心分離を
行い、上清液を得た。得られた粗酵素液を硫安分画、Ｄ
ＥＡＥ−セファロース CL6B クロマトグラフィー（ファ
ルマシアバイオテク製）、フェニルセファロース CL6B
クロマトグラフィー（ファルマシアバイオテク製）、セ
ファデックスG-200 （ファルマシアバイオテク製）によ
るゲル濾過により比活性300U/mg にまで精製した。活性
収率は33.5% であった。表１に、これまでの精製のまと
めを示す。また表２に上記方法により得られたグルタミ
ン酸デヒドロゲナーゼの理化学的性質を示す。

【００４０】

【表１】

【００４１】下記表２に上記方法により得られたグルタ
ミン酸デヒドロゲナーゼの理化学的性質を示す。

【００４２】

【表２】

【００４３】実施例１ 染色体ＤＮＡの分離 シュードモナス・エスピー 433-3株(FERMP-14092) の染
色体ＤＮＡは、以下の方法で分離した。同菌株を200ml
のＬＢ培地（1.0%バクトトリプトン、0.5%バクトイース
トエキストラクト、1.0%NaCl），pH7.0で30℃，24時間
振盪培養後、遠心分離（8000rpm,10分間）により集菌し
た。 20%シュークロース、50mM Tris-HCl, pH7.6、50mM
ＥＤＴＡを含んだ溶液 5mlに懸濁し、 0.2mlのリゾチー
ム溶液(5mg/ml)、 0.1mlのＲＮａｓｅ溶液(10mg/ml) を
加えて、37℃、15分間保温し、次いで25% ＳＤＳ溶液0.
1ml 加えた。この溶液に等量のクロロホルム・フェノー
ル (1:1)を加え、撹拌混合し、10,000rpm,３分間の遠心
分離で水層と溶媒層に分離し、水層を分取した。この水
層に２倍量のエタノールを静かに重層し、ガラス棒でゆ
っくり撹拌しながらＤＮＡをガラス棒に巻き付かせて分
離した。これを1mM ＥＤＴＡを含んだ10mM Tris-ＨＣ
ｌ， pH8.0（以下ＴＥと略記）で溶解した。これを等量
のクロロホルム・フェノール溶液で処理後、遠心分離に
より水層を分取し、２倍量のエタノールを加えて、上記
の方法により再度ＤＮＡを分離し、２mlのＴＥで溶解し
た。

【００４４】実施例２ グルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を含
有するＤＮＡ断片を有する組換えベクターの調製 実施例１で得たＤＮＡ20μg を制限酵素Tsp509I （New
England Biolabs,Inc製）で部分分解した後、アガロー
スゲルにて電気泳動後、２〜10kbp の断片を分離回収
し、エタノール沈澱にて濃縮後、ＴＥにて１μg/μl に
なるように再溶解した。このＤＮＡ断片 0.4μg と、La
mbda Zap／EcoRI （STRATAGENE製） 1μgとをＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ（東洋紡製）１ユニットで16℃、12時間反応
させＤＮＡを連結した。GIGAPACK GOLD （STRATAGENE
製）でパッケージングした後、エシェリヒア・コリーXL
I-Blueを形質導入した。

【００４５】実施例３ グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をコードするＤＮ
Ａ断片を含有する形質転換体のスクリーニング 実施例２により生じたファージプラークよりグルタミン
酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を含む
ファージのスクリーニングは、シュードモナス・エスピ
ー 433-3(FERMP-14092) 由来のグルタミン酸デヒドロゲ
ナーゼに特異的な抗体を用いた酵素免疫テストにより行
った。シュードモナス・エスピー 433-3(FERMP-14092)
由来ＧＴＤ抗体及び抗体への酵素標識の調製は常法に従
い、以下のように行った。シュードモナス・エスピー 4
33-3(FERMP-14092) 由来グルタミン酸デヒドロゲナーゼ
を免疫した兎の血清10mlをプロテインＡ−セファロース
CL-6B （ファルマシアバイオテク製）にて精製を行い、
ＩｇＧ画分を回収した。次いで、このＩｇＧ 5.5mgとペ
ルオキダーゼ（東洋紡製）2mg を新ナカネ法によりＩｇ
Ｇ−ペルオキシダーゼコンジュゲートを作成した。上記
方法により得られたＩｇＧ−ペルオキダーゼコンジュゲ
ートは、0.1ng のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ蛋白質
を検出できる感度を有しており、更にエシェリヒア・コ
リー由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼには反応しな
かった。

【００４６】上記方法により得たグルタミン酸デヒドロ
ゲナーゼ抗体−ペルオキダーゼコンジュゲートを用いた
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のスクリーニング
の方法は以下の通りに行った。実施例２で得たファージ
プラークを形成させたプレートは、グルタミン酸デヒド
ロゲナーゼ抗体で被覆したビニールシートにレプリカし
た後、マスタープレートとして保存した。一方、レプリ
カしたビニールシート上のファージに対して、0.1%BSA
を含んだ10mMＰＢＳ(2.3mM KH₂PO₄,7.7mM Na₂HPO₄ 12H₂
O,150mM NaCl,pH7.2) にて洗浄し、菌体残渣を除去し
た。このビニールシートを終濃度 1.5μg/mlグルタミン
酸デヒドロゲナーゼ抗体−ペルオキダーゼコンジュゲー
トを含む0.1%ＢＳＡ、10mMＰＢＳに室温で３時間浸漬し
た。次いで0.1%ＢＳＡ、 0.05%Ｔｗｅｅｎ20、10mMＰＢ
Ｓにて洗浄し、更に蒸留水にて洗浄を行った後、風乾し
た。この風乾後のビニールシートをペルオキシダーゼ用
の発色基質を含んだゼラチンプレート（3mg/ml 3,3'-5,
5'- テトラメチルベンチジン，10mg/ml ジオクチル・ソ
ジウム・サルフェート，0.4g/ml ゼラチン，50% メタノ
ール，50mMクエン酸緩衝液，pH5.0)上にのせ、緑色に発
色するスポットを検出した。この発色したスポットとマ
スタープレート上のファージプラークの位置とを照合
し、一致するファージプラークーをグルタミン酸デヒド
ロゲナーゼ遺伝子含んだ形質転換株として選択した。

【００４７】以上の方法により、ファージプラークを約
4000個スクリーニングした結果、１個の抗体陽性株を取
得した。この組換えファージを用いてエシェリヒア・コ
リーXLI-Blueを形質導入し、さらにヘルパーファージを
感染させ、組換えファージ中の挿入ＤＮＡをプラスミド
状態にし、このプラスミドを抽出した。挿入ＤＮＡ断片
の大きさは約2.4kbpであった。

【００４８】実施例４ 塩基配列の決定 実施例３で得られた組換えプラスミドをｐＧＴＤ１と命
名し、その挿入ＤＮＡ（約2.4kbp）について塩基配列の
決定を行った。ｐＧＴＤ１の制限酵素地図を図１に示
す。種々のサブクローン及びデレーションミュータント
は常法により取得し、ダイデオキシ法により塩基配列を
決定した。決定した塩基配列及びアミノ酸配列を配列表
・配列番号１、２に示した。アミノ酸配列から推定され
る蛋白質の分子量は約49,000であった。

【００４９】実施例５ エシェリヒア・コリー形質転換体の作成 ｐＧＴＤ１でエシェリヒア・コリーJM109 のコンピテン
トセルを形質転換後、形質転換体エシェリヒア・コリー
JM109 （ｐＧＴＤ１）を得た。

【００５０】実施例６ エシェリヒア・コリーJM109 （ｐＧＴＤ１）からのグル
タミン酸デヒドロゲナーゼの製造 ＧＴＤ生産培地（2.5%ポリペプトン、2.6%イーストエキ
ストラクト、1.5%ラクトース、0.23% リン酸一カリウ
ム、0.75% リン酸二カリウム）6Lを10L-ジャーファーメ
ンターに分注し、 121℃、20分間オートクレーブを行い
放冷後、別途無菌濾過したアンピシリン（ナカライテス
ク製）及びIPTG（日本精化製）をそれぞれ終濃度0・2mM
，100 μg/mlとなるように加えた。この培地に２×Ｙ
Ｔ培地で予め37℃、16時間振盪培養したエシェリヒア・
コリーJM109 （ｐＧＴＤ１）の培養液100ml を接種し、
37℃、24時間通気撹拌培養した。この時の培養力価は50
U/mlだった。培養液6Lを遠心分離にて集菌し、3Lの50mM
リン酸カリウム緩衝液（pH8.0)，5mM ＥＤＴＡ・３Ｎ
ａに懸濁し、ダイノミル破砕後、8,000rpm, 20分間遠心
分離してグルタミン酸デヒドロゲナーゼ粗酵素液を得
た。得られた粗酵素液を硫安分画、 Sephadex G-25によ
る脱塩、ＤＥＡＥ−セファロース CLB6Bクロマトグラフ
ィーにより精製して、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ精
製標品を得た。このグルタミン酸デヒドロゲナーゼ精製
標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一のバンドを示し、活性
回収率は56.3% であった。表３にこれまでの精製のまと
めを示す。また表３に上記方法により得られたグルタミ
ン酸デヒドロゲナーゼの理化学的性質を示す。

【００５１】

【表３】

【００５２】

【表４】

【００５３】また表１と表３を比較すれば、本発明のグ
ルタミン酸デヒドロゲナーゼは野性株であるシュードモ
ナス・エスピー 433-3株(FERMP-14092) 由来のグルタミ
ン酸デヒドロゲナーゼの製造法に比べ、簡便な方法によ
り高収率にグルタミン酸デヒドロゲナーゼを回収するこ
とができる。また表２と表４を比較すれば、本発明のグ
ルタミン酸デヒドロゲナーゼは野性株であるシュードモ
ナス・エスピー 433-3(FERMP-14092) 由来のグルタミン
酸デヒドロゲナーゼより高純度であることが判る。酵素
純度が高ければ夾雑酵素の混入が少ない、臨床検査薬へ
の添加量が減少し、溶状が良くなる等のメリットが大き
い。

【００５４】

【発明の効果】本発明により新規グルタミン酸デヒドロ
ゲナーゼ遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列が明かとな
り、工業的に大量生産ができるようになった。また、本
発明の製法により、野性株により生産されたグルタミン
酸デヒドロゲナーゼに比べ、高純度のグルタミン酸デヒ
ドロゲナーゼを高純度かつ大量に取得することが可能に
なった。

【００５５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：４４７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.) 株名：433-3 （FERMP-14092) 配列 Met Glu Gln Lys Ile Asn Glu Phe Met Ala Leu Val Glu Ser Lys Asn 1 5 10 15 Pro Asn Glu Pro Glu Phe Leu Gln Ala Val Arg Glu Phe Ala Glu Thr 20 25 30 Val Ile Pro Phe Ile Ser Glu Arg Lys Lys Tyr Asp Gly Lys Asn Ile 35 40 45 Leu Leu Arg Ile Ala Glu Pro Glu Arg Ser Ile Ile Phe Arg Val Pro 50 55 60 Trp Val Asp Asp Lys Gly Glu Ile Ile Val Asn Arg Gly Phe Arg Ile 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Ala Ile Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Ile Arg Phe His 85 90 95 His Ser Val Asn Leu Ser Val Leu Lys Phe Leu Ala Phe Glu Gln Val 100 105 110 Phe Lys Asn Ser Leu Thr Thr Leu Pro Met Gly Gly Gly Lys Gly Gly 115 120 125 Ser Asp Phe Asp Pro Glu Gly Lys Ser Asp Ala Glu Ile Met Arg Phe 130 135 140 Cys Gln Ser Phe Met Thr Glu Leu Cys Arg His Ile Gly Pro Asp Leu 145 150 155 160 Asp Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly Val Gly Ala Arg Glu Ile Gly Tyr 165 170 175 Leu Phe Gly Gln Tyr Lys Arg Ile Arg Asn Glu Phe Thr Gly Val Leu 180 185 190 Thr Gly Lys Gly Leu Ala Tyr Gly Gly Ser Leu Ile Arg Pro Glu Ala 195 200 205 Thr Gly Tyr Gly Val Val Tyr Phe Thr Asp Gln Met Leu Arg Thr Ile 210 215 220 Gly His Glu Ile Lys Gly Lys Arg Val Ala Ile Ser Gly Phe Gly Asn 225 230 235 240 Val Ala Trp Gly Val Ala Leu Lys Val Asn Glu Leu Gly Gly Lys Val 245 250 255 Val Thr Ile Ser Gly Pro Asp Gly Tyr Ile Tyr Asp Glu Glu Gly Ile 260 265 270 Ser Gly Glu Lys Ile Glu His Met Val Glu Met Arg Ala Thr Gly Asp 275 280 285 Asn Arg Ala Glu Arg Tyr Leu Glu Lys Tyr Pro Asn Ala Ile Phe His 290 295 300 Lys Gly Lys Ser Pro Trp Glu Val Lys Val Asp Ile Ala Ile Pro Cys 305 310 315 320 Ala Thr Gln Asn Glu Leu Asn Gly Asp Asp Ala Lys Lys Leu Ile Asp 325 330 335 Asn Gly Val Leu Cys Val Thr Glu Ala Ala Asn Met Pro Ser Thr Leu 340 345 350 Asp Ala Ile Lys Leu Phe Leu Asp Ser Lys Val Leu Phe Ala Pro Gly 355 360 365 Lys Ala Ala Asn Ala Gly Gly Val Ala Ala Ser Gly Leu Glu Met Thr 370 375 380 Gln Asn Ser Ile Arg Leu Asn Trp Thr Ser Glu Glu Val Asp Leu Arg 385 390 395 400 Leu Lys Glu Ile Met Ile Gly Ile His Asn Gln Cys Lys Lys Tyr Gly 405 410 415 Ala Glu Glu Asp Gly Tyr Val Asn Tyr Val Lys Gly Ala Asn Ile Ala 420 425 430 Gly Phe Val Lys Val Ala Asp Ala Met Leu Ala Gln Gly Val Val 435 440 445

【００５６】配列番号：２ 配列の長さ：１３４４ 配列の型：核酸（ＤＮＡ） 鎖の数：ニ本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ 起源 生物名：シュードモナス・エスピー（Pseudomonas sp.) 株名：433-3(FERMP-14092) 配列 ATG GAA CAA AAA ATA AAT GAA TTT ATG GCT CTT GTT GAG TCA AAA AAT 48 Met Glu Gln Lys Ile Asn Glu Phe Met Ala Leu Val Glu Ser Lys Asn 1 5 10 15 CCA AAC GAG CCA GAA TTT CTT CAA GCA GTT AGA GAA TTC GCA GAA ACT 96 Pro Asn Glu Pro Glu Phe Leu Gln Ala Val Arg Glu Phe Ala Glu Thr 20 25 30 GTA ATT CCG TTT ATA TCT GAG CGT AAA AAA TAT GAC GGA AAG AAT ATC 144 Val Ile Pro Phe Ile Ser Glu Arg Lys Lys Tyr Asp Gly Lys Asn Ile 35 40 45 CTT TTA AGA ATC GCT GAA CCA GAA AGA TCA ATA ATA TTC AGA GTT CCG 192 Leu Leu Arg Ile Ala Glu Pro Glu Arg Ser Ile Ile Phe Arg Val Pro 50 55 60 TGG GTA GAC GAT AAA GGG GAA ATT ATT GTA AAT AGA GGT TTC AGA ATT 240 Trp Val Asp Asp Lys Gly Glu Ile Ile Val Asn Arg Gly Phe Arg Ile 65 70 75 80 CAA ATG AAC TCT GCA ATT GGA CCT TAC AAA GGA GGA ATT AGA TTT CAT 288 Gln Met Asn Ser Ala Ile Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Ile Arg Phe His 85 90 95 CAT TCG GTA AAC TTA TCA GTT TTA AAA TTC TTG GCA TTT GAA CAA GTG 336 His Ser Val Asn Leu Ser Val Leu Lys Phe Leu Ala Phe Glu Gln Val 100 105 110 TTT AAA AAC AGT TTG ACA ACA CTT CCG ATG GGA GGT GGA AAA GGA GGT 384 Phe Lys Asn Ser Leu Thr Thr Leu Pro Met Gly Gly Gly Lys Gly Gly 115 120 125 TCT GAT TTT GAT CCA GAA GGA AAA TCT GAT GCT GAA ATT ATG CGT TTC 432 Ser Asp Phe Asp Pro Glu Gly Lys Ser Asp Ala Glu Ile Met Arg Phe 130 135 140 TGC CAG TCA TTC ATG ACA GAA TTA TGC CGT CAT ATT GGT CCA GAT CTT 480 Cys Gln Ser Phe Met Thr Glu Leu Cys Arg His Ile Gly Pro Asp Leu 145 150 155 160 GAC GTT CCA GCT GGA GAT ATT GGT GTT GGC GCA CGT GAA ATC GGT TAC 528 Asp Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly Val Gly Ala Arg Glu Ile Gly Tyr 165 170 175 TTA TTT GGT CAA TAT AAA AGA ATT AGA AAT GAA TTT ACA GGA GTT TTA 576 Leu Phe Gly Gln Tyr Lys Arg Ile Arg Asn Glu Phe Thr Gly Val Leu 180 185 190 ACT GGA AAA GGT TTG GCT TAC GGA GGT TCG TTA ATC AGA CCA GAA GCT 624 Thr Gly Lys Gly Leu Ala Tyr Gly Gly Ser Leu Ile Arg Pro Glu Ala 195 200 205 ACA GGA TAT GGA GTA GTT TAT TTT ACA GAT CAA ATG CTT CGT ACA ATT 672 Thr Gly Tyr Gly Val Val Tyr Phe Thr Asp Gln Met Leu Arg Thr Ile 210 215 220 GGT CAC GAA ATT AAA GGA AAA AGA GTT GCT ATT TCT GGA TTC GGA AAT 720 Gly His Glu Ile Lys Gly Lys Arg Val Ala Ile Ser Gly Phe Gly Asn 225 230 235 240 GTG GCT TGG GGT GTT GCT TTA AAA GTA AAT GAA CTA GGA GGT AAA GTA 768 Val Ala Trp Gly Val Ala Leu Lys Val Asn Glu Leu Gly Gly Lys Val 245 250 255 GTT ACT ATT TCT GGA CCT GAT GGT TAT ATT TAT GAT GAA GAA GGT ATC 816 Val Thr Ile Ser Gly Pro Asp Gly Tyr Ile Tyr Asp Glu Glu Gly Ile 260 265 270 TCT GGA GAA AAA ATC GAG CAT ATG GTT GAG ATG AGA GCT ACT GGA GAT 864 Ser Gly Glu Lys Ile Glu His Met Val Glu Met Arg Ala Thr Gly Asp 275 280 285 AAT AGA GCA GAA AGA TAT TTA GAG AAA TAT CCA AAT GCT ATT TTC CAT 912 Asn Arg Ala Glu Arg Tyr Leu Glu Lys Tyr Pro Asn Ala Ile Phe His 290 295 300 AAA GGA AAG AGC CCT TGG GAA GTA AAA GTA GAT ATT GCT ATT CCA TGT 960 Lys Gly Lys Ser Pro Trp Glu Val Lys Val Asp Ile Ala Ile Pro Cys 305 310 315 320 GCT ACT CAA AAT GAA TTG AAT GGT GAC GAT GCT AAG AAA TTA ATA GAT 1008 Ala Thr Gln Asn Glu Leu Asn Gly Asp Asp Ala Lys Lys Leu Ile Asp 325 330 335 AAT GGC GTT TTA TGT GTT ACG GAA GCT GCC AAT ATG CCT TCT ACT TTA 1056 Asn Gly Val Leu Cys Val Thr Glu Ala Ala Asn Met Pro Ser Thr Leu 340 345 350 GAT GCT ATT AAA CTT TTC TTA GAT AGT AAA GTG TTA TTC GCG CCA GGA 2004 Asp Ala Ile Lys Leu Phe Leu Asp Ser Lys Val Leu Phe Ala Pro Gly 355 360 365 AAA GCT GCA AAT GCT GGT GGA GTT GCT GCT TCA GGA TTA GAA ATG ACT 1152 Lys Ala Ala Asn Ala Gly Gly Val Ala Ala Ser Gly Leu Glu Met Thr 370 375 380 CAG AAC TCA ATT CGT TTA AAC TGG ACT AGT GAA GAG GTA GAC TTG AGA 1200 Gln Asn Ser Ile Arg Leu Asn Trp Thr Ser Glu Glu Val Asp Leu Arg 385 390 395 400 TTG AAA GAA ATC ATG ATC GGA ATT CAT AAC CAA TGT AAA AAA TAC GGT 1268 Leu Lys Glu Ile Met Ile Gly Ile His Asn Gln Cys Lys Lys Tyr Gly 405 410 415 GCA GAA GAA GAC GGA TAT GTT AAC TAC GTA AAA GGA GCT AAT ATT GCC 1296 Ala Glu Glu Asp Gly Tyr Val Asn Tyr Val Lys Gly Ala Asn Ile Ala 420 425 430 GGA TTT GTA AAA GTT GCC GAC GCT ATG CTT GCA CAA GGT GTA GTT TAA 1344 Gly Phe Val Lys Val Ala Asp Ala Met Leu Ala Gln Gly Val Val *** 435 440 445

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例４で得られた組換えプラスミドｐＧＴＤ
１の制限酵素地図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平７−203980（ＪＰ，Ａ) Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ, Ｖｏｌ．20，ｐ．219−224（1991) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 グルタミン酸デヒドロゲナーゼをもたら
   す配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列、また
   は該アミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸
   が付加、欠失、もしくは置換されており、且つグルタミ
   ン酸デヒドロゲナーゼの酵素活性をもたらすアミノ酸配
   列をコードするＤＮＡを含有することを特徴とするグル
   タミン酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ断片。
2. 【請求項２】 配列表・配列番号２に記載された塩基配
   列を含有することを特徴とするグルタミン酸デヒドロゲ
   ナーゼをコードするＤＮＡ断片。
3. 【請求項３】 請求項２に記載のＤＮＡ断片中のＤＮＡ
   配列に対し、突然変異によって変化させられた、グルタ
   ミン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコ
   ードすることを特徴とするグルタミン酸デヒドロゲナー
   ゼをコードするＤＮＡ断片。
4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか１項に記載され
   たＤＮＡ断片およびベクターを含有することを特徴とす
   る組換えベクター。
5. 【請求項５】 ベクターがファージまたはプラスミドで
   ある請求項４に記載の組換えベクター。
6. 【請求項６】 請求項４に記載された組換えベクターに
   より、微生物を形質転換したことを特徴とする形質転換
   体。
7. 【請求項７】 微生物が大腸菌または酵母である請求項
   ６記載の形質転換体。
8. 【請求項８】 請求項７に記載された形質転換体を栄養
   培地で培養し、グルタミン酸デヒドロゲナーゼを生成さ
   せ、該グルタミン酸デヒドロゲナーゼを採取することを
   特徴とするグルタミン酸デヒドロゲナーゼの製造法。