JP3396740B2 - ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は試料中の炭酸ガス濃度を
測定するのに好適である、新規なホスホエノールピルビ
ン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子及びその用途
に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼは、ホスホエノールピルビン酸及び重炭酸イオンに
作用して、オキザロ酢酸とリン酸イオンを生成する反応
を触媒する酵素であり、臨床検査薬の分野では体液、特
に血清及び血漿中の重炭酸イオン測定用試薬に従来から
用いられてきた。このホスホエノールピルビン酸カルボ
キシラーゼの給源としては、多くの植物、原生動物、大
部分の細菌に存在することが報告されている（「蛋白
質、核酸、酵素」Vol.22, No.14(1977))。しかしこれら
のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの大部分
は活性発現のためのアクチベーターとして高価なアセチ
ルコエンザイムＡ、フルクトース−１，６−ジリン酸や
グルコース−６リン酸を必要としており、臨床検査薬用
酵素としては問題があった。またアクチベーターを必要
としないホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは
一部の細菌及びＣ４植物に見いだされているが、臨床検
査薬用酵素としては安定性に問題があった。

【０００３】上記の問題点を解決するため鋭意研究を重
ねた結果、酢酸菌の一種が高価なアクチベーターを必要
とせず、且つ安定なホスホエノールピルビン酸カルボキ
シラーゼを生産することが見い出された（特願平5-1132
48号) 。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上記酢酸菌よりホスホ
エノールピルビン酸カルボキシラーゼを製造する場合、
生産性が低い点、多くの精製工程を必要とする点などか
ら製造コストが高くなり臨床検査薬用酵素の給源として
は問題であった。本発明の目的は、上記の問題点を解決
するため遺伝子工学的手法によって新規ホスホエノール
ピルビン酸カルボキシラーゼを純粋な形で大量供給し得
る手段を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するため、ホスホエノールピルビン酸カルボキシ
ラーゼ生産菌としてアセトバクター・ハンゼニイ(cetab
acter hansenii) IFO14820 を選び、該菌体より抽出し
た染色体ＤＮＡよりホスホエノールピルビン酸カルボキ
シラーゼ遺伝子の単離に成功し、そのＤＮＡの全構造を
決定した。更に該ホスホエノールピルビン酸カルボキシ
ラーゼを遺伝子工学的手法によって形質転換体に高生産
させることに成功し、高純度なホスホエノールピルビン
酸カルボキシラーゼを安価に大量供給することを可能に
した。

【０００６】すなわち本発明は配列表・配列番号１に記
載されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含有するこ
とを特徴とするホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼをコードするＤＮＡ断片である。

【０００７】また本発明は上記ＤＮＡ断片を含有する組
換えベクターである。

【０００８】さらに本発明は上記組換えベクターにより
形質転換された形質転換体である。

【０００９】本発明は上記形質転換体を培地で培養し、
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを生成さ
せ、該ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを採
取することを特徴とするホスホエノールピルビン酸カル
ボキシラーゼの製造法である。

【００１０】本発明の遺伝子は、例えばアセトバクター
・ハンゼニイ(Acertobacter hansenii) IFO 14820 を起
源とする。この菌株を培養する培地としては、炭素源、
窒素源、無機イオン、更に必要に応じて硝酸塩、リン酸
塩などを含有する培地を使用する。炭素源としてはグル
コース、ラクトースのような糖類あるいはグリセロール
やソルビトールのような糖アルコールなどを用いること
が出来る。窒素源としてはポリペプトン、トリプトン、
肉エキス、酵母エキスなどが利用できる。該菌体を培養
するに当たり、特に誘導物質等は必要なく、好気条件に
て、該菌株の最も良好に生育する温度、ｐＨにて培養
し、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの生産
量が最大になる時点まで培養する。

【００１１】培養した菌体よりホスホエノールピルビン
酸カルボキシラーゼを精製するには、以下のような方法
が用いられる。培養液より遠心分離にて菌体を回収し、
次いで菌体を破砕することによりホスホエノールピルビ
ン酸カルボキシラーゼを抽出する。菌体破砕方法として
は、例えばリゾチームの様な細胞壁溶解酵素による処理
や、超音波破砕、ガラスビーズ破砕、フレンチプレス破
砕のような物理的処理を用いることが出来る。このよう
にして得られた粗酵素抽出液を例えばポリエチレンイミ
ン処理により除核酸処理を行った後、硫安沈澱によりホ
スホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ画分を回収す
る。このようにして得られたホスホエノールピルビン酸
カルボキシラーゼ画分は、例えばＧ−２５ゲル濾過など
により脱塩した後、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ
（ファルマシアＬＫＢ）→ハイドロキシルアパタイト
（生化学工業）→セファデックスＧ−２００ゲル濾過
（ファルマシアＬＫＢ）→ＭｏｎｏＰ ＨＲ５／５クロ
マトフォーカシング（ファルマシアＬＫＢ）などにより
高純度に精製される。

【００１２】本発明者らが精製したタンパク質は、ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動的に均一なバンド
を示した。この時のホスホエノールピルビン酸カルボキ
シラーゼの比活性は８４単位(U)/mg蛋白であった。尚、
カラムクロマトグラフィーの組み合わせは上記ステップ
に限定する必要はないものの、電気泳動的に均一なバン
ドにするには数段階のカラムクロマトグラフィー操作が
必要である。

【００１３】上記ホスホエノールピルビン酸カルボキシ
ラーゼの理化学的性質は以下の通りである。 （１）作用：以下の反応を触媒する。

【００１４】ホスホエノールピルビン酸 ＋ ＨＣＯ₃
^- → オキザロ酢酸 ＋ ＨＰＯ₄ ^2-

【００１５】（２）至適作用ｐＨ：７．５〜８．０ （３）ｐＨ安定性：ｐＨ５．０〜８．０（２５℃、２４
時間処理） ｐＨ７．５〜８．５（１０ｍＭ ＭｇＳＯ₄ を含むトリ
ス緩衝液中で２５℃、２４時間処理） （４）至適温度：６０℃ （５）熱安定性：４５℃以下（ｐＨ７．０，１５分処
理） （６）分子量：３９０，０００±１０，０００（ゲル濾
過法） １００，０００±５，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） （７）比活性：８４単位／ｍｇ蛋白 （８）アセチルＣｏＡで活性化されない。

【００１６】本発明の新規ホスホエノールピルビン酸カ
ルボキシラーゼをコードする遺伝子は、アセトバクター
・ハンゼニイIFO 14820 菌体から抽出しても良く、また
化学的に合成することもできる。上記遺伝子配列として
は、例えば配列表番号１に記載されたアミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡ配列または配列表番号２に記載された塩
基配列を有するＤＮＡまたは配列表番号２に記載された
配列に対し突然変異により変化させられたＤＮＡなどを
挙げることが出来る。

【００１７】本発明の遺伝子は、例えばアセトバクター
・ハンゼニイIFO 14820 の染色体ＤＮＡを分離・精製し
た後、超音波破砕、制限酵素などを用いてＤＮＡを切断
したものと、リニヤーな発現ベクターとを両ＤＮＡの平
滑末端または接着末端部においてＤＮＡリガーゼなどに
より結合閉環させて組換えベクターとする。こうして得
られた組換えベクターは複製可能な宿主微生物に移入し
た後、ベクターのマーカーとホスホエノールピルビン酸
カルボキシラーゼ蛋白の発現を指標としてスクリーニン
グして、組換えＤＮＡベクターを保持する微生物を得
る。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ蛋白質
発現のスクリーニング方法としては、該蛋白質の抗体を
用いた抗原抗体反応による方法、直接該蛋白質の活性を
測定する方法、該蛋白質の欠損変異株を用いた栄養要求
性の相補による方法などを用いることができる。該蛋白
質を発現した微生物を培養し、該培養菌体から該組換え
ベクターを分離・精製し、次いで該組換えベクターから
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を採
取すれば良い。

【００１８】遺伝子供与体であるアセトバクター・ハン
ゼニイIFO 14820 に由来するＤＮＡは具体的に以下のよ
うに採取される。すなわち供与微生物を例えば液体培地
で約１〜３日間撹拌培養して得られた培養物を遠心分離
にて集菌し、次いでこれを溶菌させることによりホスホ
エノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の含有溶菌
物を調製することが出来る。溶菌の方法としては、例え
ばリゾチームやβ−グルカナーゼなどの溶菌酵素により
処理が施され、必要に応じてプロテアーゼや他の酵素や
ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの界面活性剤が
併用され、更に凍結融解やフレンチプレス処理の様な物
理的破砕方法と組み合わせても良い。

【００１９】このようにして得られた溶菌物からＤＮＡ
を分離・精製するには常法に従って例えばフェノール処
理やプロテアーゼ処理による除蛋白処理や、リボヌクレ
アーゼ処理、アルコール沈澱処理などの方法を適宜組み
合わせることにより行うことが出来る。微生物から分離
・精製されたＤＮＡを切断する方法は、例えば超音波処
理、制限酵素処理などにより行うことが出来るが、好ま
しくは特定ヌクレオチド配列に作用するII型制限酵素が
適している。

【００２０】ベクターとしては、宿主微生物内で自立的
に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換
え用として構築された物が適している。ファージとして
は、例えばエシェリヒア・コリー(Escherichia coli)を
宿主微生物とする場合には、λｇｔ・１０，λｇｔ・１
１などが使用できる。またプラスミドとしては、例えば
エシェリヒア・コリーを宿主微生物とした場合、ｐＢＲ
３２２、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなどが使
用できる。このようなベクターを先に述べたホスホエノ
ールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子供与体である微
生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素で切断してベクタ
ー断片を得ることができるが、必ずしも該微生物ＤＮＡ
の切断に使用した制限酵素と同一の制限酵素を用いる必
要はない。微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片とを
結合させる方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法
で有れば良く、例えば微生物ＤＮＡ断片の接着末端とベ
クター断片の接着末端とのアニーリングの後、適当なＤ
ＮＡリガーゼの使用により微生物ＤＮＡ断片とベクター
断片との組換えベクターを作成する。必要ならば、アニ
ーリングの後、宿主微生物に移入して生体内のＤＮＡリ
ガーゼを利用し、組換えベクターを作成することもでき
る。

【００２１】宿主微生物としては、組換えベクターが安
定且つ自律的に増殖可能で、且つ外来性遺伝子の形質発
現できる物で有れば良く、一般的にはエシェリヒア・コ
リーＷ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００、エシ
ェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＨ
Ｂ１０１などを用いることができる。

【００２２】宿主微生物に組換えベクターを移入する方
法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリー
属に属する微生物の場合には、カルシウム処理によるコ
ンピテントセル法やエレクトロポレーション法などを用
いることができる。こうして得られた形質転換体である
微生物は栄養培地で培養されることにより、多量のホス
ホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを安定に生産し
得ることを見いだした。宿主微生物への目的組換えベク
ター移入の有無についての選択は、目的とするＤＮＡを
保持するベクターの薬剤耐性マーカーとアセチルＣｏＡ
などの活性化剤を必要としないホスホエノールピルビン
酸カルボキシラーゼ活性とを同時に発現する微生物を検
索すれば良く、例えば薬剤耐性マーカーに基づく選択培
地で生育し、且つ活性化剤を必要としないホスホエノー
ルピルビン酸カルボキシラーゼを生成する微生物を選択
すれば良い。

【００２３】上記の方法により得られたホスホエノール
ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の塩基配列はサイエ
ンス(Science), 214, 1205〜1210(1981)に記載されたジ
デオキシ法で解読し、またホスホエノールピルビン酸カ
ルボキシラーゼのアミノ酸配列は塩基配列より推定し
た。このようにして一度選択されたホスホエノールピル
ビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を保有する組換えベクタ
ーは、形質転換微生物から取り出され、他の微生物に移
入することも容易に実施できる。また、ホスホエノール
ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を保持する組換えベ
クターから制限酵素などによりホスホエノールピルビン
酸カルボキシラーゼ遺伝子であるＤＮＡを切り出し、こ
れを同様な方法により切断して得られるベクター断片と
結合させて、宿主微生物に移入することも容易に実施で
きる。

【００２４】形質転換体である宿主微生物の培養形態
は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択す
れば良く、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的
には通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の炭素源
としては、微生物の培養に通常用いられる物が広く使用
され得る。宿主微生物が資化可能で有れば良く、例えば
グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトー
ス、フラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用でき
る。窒素源としては、宿主微生物が利用可能な窒素化合
物で有れば良く、例えばペプトン、肉エキス、カゼイン
加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物のような有機窒素化
合物や、硫安、塩安のような無機窒素化合物が使用でき
る。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウ
ム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの
塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応
じて使用できる。

【００２５】培養温度は宿主微生物が発育し、ホスホエ
ノールピルビン酸カルボキシラーゼを生産する範囲で適
宜変更し得るが、エシェリヒア・コリーの場合、好まし
くは２０〜４２℃程度である。培養時間は、培養条件に
より多少変動するが、ホスホエノールピルビン酸カルボ
キシラーゼが最高収量に達する時期を見計らって適当時
期に培養を終了すれば良く、通常は２０〜４８時間程度
である。培地ｐＨは宿主微生物が発育し、ホスホエノー
ルピルビン酸カルボキシラーゼを生産する範囲内で適宜
変更し得るが、通常好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度
である。培養液より菌体を回収する方法は、通常用いら
れる方法により行えば良く、例えば遠心分離、濾過など
によって回収することができる。培養液中のホスホエノ
ールピルビン酸カルボキシラーゼが菌体外に分泌される
場合は、この菌体分離液を用いれば良く、以下の菌体破
砕後の方法に準じてホスホエノールピルビン酸カルボキ
シラーゼを分離精製できる。ホスホエノールピルビン酸
カルボキシラーゼが菌体内に存在する場合、前述したよ
うな酵素的または物理的な破砕方法によって破砕抽出す
ることができる。このようにして得られたホスホエノー
ルピルビン酸カルボキシラーゼ含有溶液は親水性ポリマ
ー、例えばポリエチレンイミン処理により除核酸を行
い、次いで硫安沈澱によりホスホエノールピルビン酸カ
ルボキシラーゼ画分を回収する。この粗酵素液を通常用
いる方法、例えば半透膜を用いた透析や Sephadex G-25
（ファルマシアLKB ）ゲル濾過などにより脱塩を行うこ
とができる。この操作の後、酵素溶液を各種のクロマト
グラフィーの組み合わせ、好ましくはＤＥＡＥセファロ
ースCL-6B （ファルマシアLKB ）、ブチル・トヨパール
650M（東洋曹達）カラムクロマトグラフィーにより分離
精製し、精製酵素標品を得ることができる。この精製酵
素標品は、SDS-PAGE電気泳動でほぼ単一バンドを示す程
度に純化されている。

【００２６】本発明のホスホエノールピルビン酸カルボ
キシラーゼ活性を有する蛋白質は、以下に示す性質を有
する。 （１）作用：以下の反応を触媒する。

【００２７】ホスホエノールピルビン酸 ＋ ＨＣＯ₃
^- → オキザロ酢酸 ＋ ＨＰＯ₄ ^2-

【００２８】（２）至適作用ｐＨ：７．５〜８．０ （３）ｐＨ安定性：ｐＨ５．０〜８．０（２５℃、２４
時間処理） ｐＨ７．５〜８．５（１０ｍＭ ＭｇＳＯ4 を含むトリ
ス緩衝液中で２５℃、２４時間処理） （４）至適温度：６０℃ （５）熱安定性：４５℃以下（ｐＨ７．０，１５分処
理） （６）分子量：３９０，０００±１０，０００（ゲル濾
過法） １００，０００±５，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） （７）比活性：１１０単位／ｍｇ蛋白 （８）アセチルＣｏＡで活性化されない。

【００２９】該酵素はアセトバクター・ハンゼニイIFO
14820 が生産する酵素と比べて、炭酸ガス測定用試薬中
の安定性及び比活性において異なっている。すなわち、
アセトバクター・ハンゼニイIFO 14820 の生産する酵素
は、比活性８４単位／ｍｇ蛋白、炭酸ガス測定用試薬中
の２５℃、７日保存後の活性残存率が約３０％であるの
に対し、本発明のホスホエノールピルビン酸カルボキシ
ラーゼ活性を有する蛋白質は、比活性が１１０単位／ｍ
ｇ蛋白、炭酸ガス測定用試薬中にて２５℃、７日保存後
の活性残存率は約９５％である。

【００３０】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
る。実施例中、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼの活性測定は以下のようにして行った。すなわち、
５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ
Ｎａ₂ ＣＯ₃ 、３．２ｍＭ ホスホエノールピルビン酸
カリウム塩、１０ｍＭ ＭｇＳＯ₄ 、０．１４ｍＭ Ｎ
ＡＤＨ、１０Ｕ／ｍｌ マレートデヒドロゲナーゼを含
む反応混液２．９ｍｌをキュベット（ｄ＝１ｃｍ）に調
製し、３０℃で約５分間予備加温する。次に酵素溶液
０．１ｍｌを添加し緩やかに混和後、水を対照に３０℃
に制御された分光光度計で３４０ｎｍの吸光度変化を２
〜３分間記録し、その初期直線部分から１分間当たりの
吸光度変化を求める（ΔＯＤｔｅｓｔ）。盲検は酵素溶
液の代わり５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０
を加え、同様に操作を行って、１分間当たりの吸光度変
化を求める（ΔＯＤｂｌａｎｋ）。ホスホエノールピル
ビン酸カルボキシラーゼの活性は、上記条件で１分間当
たり１マイクロモルのＮＡＤＨを消費する酵素量を１単
位（Ｕ）とする。

【００３１】参考例１アセトバクター・ハンゼニイＩＦＯ１４８２０株からの
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの精製 ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ生産菌アセ
トバクター・ハンゼニイIFO 14820 を１０Ｌジャーファ
ーメンターで培養した。培地組成はポリペプトン０．５
％、酵母エキス０．５％、グルコース０．５％、硫酸マ
グネシウム０．５％を含む培地（ｐＨ７．０）１００ｍ
ｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに移し、１２１℃、１５
分間オートクレーブを行った。種菌としてアセトバクタ
ー・ハンゼニイIFO 14820 を１白金耳植菌し、３０℃、
４８時間培養し、種培養液とした。次に培地６Ｌを１０
Ｌ容ジャーファーメンターに移し１２１℃、１５分間オ
ートクレーブを行い、放令後種培養液を１００ｍｌを移
し、３００ｒｐｍ、通気２Ｌ／分、３０℃で４８時間培
養した。この時の培養液中のホスホエノールピルビン酸
カルボキシラーゼ活性は０．２Ｕ／ｍｌであった。

【００３２】培養液を遠心分離にて集菌し、５０ｍＭリ
ン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０に懸濁した。本液をフ
レンチプレスで処理し、遠心分離を行い、ホスホエノー
ルピルビン酸カルボキシラーゼ粗酵素画分を得た。得ら
れた粗酵素画分は硫安分画後、セファデックス G-25
（ファルマシアLKB)ゲル濾過にて脱塩した後、ＤＥＡＥ
セファロースCL-6B （ファルマシアLKB ）、ハイドロキ
シルアパタイト（生化学工業株式会社）、セファデック
ス G-200ゲル濾過（ファルマシアLKB ）、MonoP HR5/5
クロマトフォーカシング（ファルマシアLKB ）の４種の
クロマトグラフィーを行った。このホスホエノールピル
ビン酸カルボキシラーゼ標品は、SDS-PAGE電気泳動で均
一なバンドを示すまで精製されていた。この時のホスホ
エノールピルビン酸カルボキシラーゼの比活性は８４Ｕ
／ｍｇ蛋白であった。下記表１にこれまでの精製のまと
めを示す。また表２に上記方法により得られたホスホエ
ノールピルビン酸カルボキシラーゼの理化学的性質を示
す。

【００３３】

【表１】

【００３４】

【表２】

【００３５】実施例１染色体ＤＮＡの分離 アセトバクター・ハンゼニイ IFO 14820の染色体ＤＮＡ
は、以下の方法で分離した。同菌株を１５０ｍｌの普通
ブイヨン培地、ｐＨ５．０で３０℃、４８時間振盪培養
後、遠心分離（８０００ｒｐｍ、１０分間）により集菌
した。１０％シュークロース、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ８．０、５０ｍＭ ＥＤＴＡを含んだ溶液５
ｍｌに懸濁し、１ｍｌのリゾチーム溶液（１０ｍｇ／ｍ
ｌ）を加えて３７℃、１５分間保温し、次いで１０％Ｓ
ＤＳ溶液を加えた。この溶液に等量のクロロホルム・フ
ェノール（１：１）を加え、撹拌混合し、１０，０００
ｒｐｍ、３分間の遠心分離で水層と溶媒層に分離し、水
層を分取した。この水層に２倍量のエタノールを静かに
重層し、ガラス棒でゆっくり撹拌しながらＤＮＡをガラ
ス棒に巻き付かせて分離した。これを１ｍＭ ＥＤＴＡ
を含んだ１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０（以
下ＴＥと略記）で溶解した。これを等量のクロロホルム
・フェノール溶液で処理後、遠心分離により水層を分取
し、２倍量のエタノールを加えて、上記の方法により再
度ＤＮＡを分離し、２ｍｌのＴＥで溶解した。エシェリ
ヒア・コリーＪＭ１０９のコンピテントセルは Hanahan
の方法により作成し、ライブラリー作成の宿主とした。

【００３６】ホスホエノールピルビン酸カルボキシラー
ゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片を有する組
換えベクターの調製 上記方法で得たＤＮＡ２０μｇを制限酵素Ｓａｕ３ＡII
I （東洋紡製）で部分分解した後、シュークロース密度
勾配遠心法にて３〜１０ｋｂｐの断片を分離回収し、エ
タノール沈澱にて濃縮後、ＴＥにて１μｇ／μｌになる
ように再溶解した。このＤＮＡ断片１μｇを、ＳａｌII
I （東洋紡製）で切断したｐＵＣ１９０．５μｇと M.
G.Loftusらの Backfilling法 (Biotechniques Vol. 12,
No.2(1992)に従い、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（東洋紡製）
１ユニットで１６℃、１２時間反応させＤＮＡを連結し
た。連結したＤＮＡはエシェリヒア・コリーＪＭ１０９
のコンピテントセルを用いて形質転換した。使用したＤ
ＮＡ１μｇ当たり約１×１０⁵個の形質転換体のコロニ
ーが得られた。

【００３７】ホスホエノールピルビン酸カルボキシラー
ゼ遺伝子をコードするＤＮＡ断片を含有する形質転換体
のスクリーニング 上記方法で得た形質転換体よりホスホエノールピルビン
酸カルボキシラーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を含む
形質転換体のスクリーニングは、アセトバクター・ハン
ゼニイIFO 14820 由来のホスホエノールピルビン酸カル
ボキシラーゼに特異的な抗体を用いた酵素免疫テストに
より行った。アセトバクター・ハンゼニイIFO 14820 由
来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ抗体及
び抗体への酵素標識の調製は常法に従い、以下のように
行った。アセトバクター・ハンゼニイIFO 14820 由来ホ
スホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを免疫した兎
の血清１０ｍｌをプロテインA-セファロース CL-6B（フ
ァルマシアLKB ）にて精製を行い、ＩｇＧ画分を回収し
た。次いでこのＩｇＧ８ｍｇとペルオキダーゼ（東洋紡
製）５ｍｇを新ナカネ法によりＩｇＧ−ペルオキシダー
ゼコンジュゲートを作成し、TSK G3000SW （東洋曹達）
ゲル濾過により精製を行った。上記方法により得られた
ＩｇＧ−ペルオキダーゼコンジュゲートは０．１ｎｇの
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ蛋白質を検
出できる感度を有しており、更にエシェリヒア・コリー
由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼには
反応しなかった。上記方法により得たホスホエノールピ
ルビン酸カルボキシラーゼ抗体−ペルオキダーゼコンジ
ュゲートを用いたホスホエノールピルビン酸カルボキシ
ラーゼ遺伝子のスクリーニングの方法は以下の通りに行
った。

【００３８】上記方法で得た形質転換体のコロニーは、
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ抗体で被覆
したビニールシートにレプリカした後、３７℃で終夜培
養し再度コロニーを形成した後マスタープレートとして
保存した。一方、レプリカしたビニールシート上の菌体
はクロロホルム蒸気に約２０分間さらして溶菌した。溶
菌操作の後、０．１％ＢＳＡを含んだ１０ｍＭ ＰＢＳ
（２．３ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄ ，７．７ｍＭ Ｎａ₂ ＨＰ
Ｏ₄ ・１２Ｈ₂ Ｏ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．
２）にて洗浄し菌体残渣を除去した。このビニールシー
トを０．１％のホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼ抗体−ペルオキダーゼコンジュゲートと０．１％の
ＢＳＡを含んだ１０ｍＭ ＰＢＳに室温で３時間浸漬し
た。次いで０．１％のＢＳＡと０．０５％のＴｗｅｅｎ
２０を含んだＰＢＳにて洗浄し、更に蒸留水にて洗浄を
行った後、風乾した。この風乾後のビニールシートをペ
ルオキシダーゼ用の発色基質を含んだゼラチンプレート
（３ｍｇ／ｍｌ 3,3'-5,5'- テトラメチルベンチジン、
１０ｍｇ／ｍｌジオクチル・ソジウム・サルフェート、
０．４ｇ／ｍｌゼラチン、５０％メタノール、５０ｍＭ
クエン酸緩衝液、ｐＨ５．０）上にのせ、緑色に発色
するスポットを検出した。この発色したスポットとマス
タープレート上のコロニーの位置とを照合し、一致する
コロニーをホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
遺伝子含んだ形質転換株として選択した。

【００３９】以上の方法により、形質転換株約２万株を
スクリーニングした結果、２個の抗体陽性株を取得し
た。この２株よりプラスミドを抽出し制限酵素地図を作
成した結果、共通した約２．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を確
認した。

【００４０】塩基配列の決定 上記方法で得られた組換えプラスミドの内、挿入ＤＮＡ
の小さかったプラスミドをｐＥＰＣ１１と命名し、その
挿入ＤＮＡ（約４．２ｋｂｐ）について塩基配列の決定
を行った。種々のサブクローン及びデリィーションミュ
ータントは常法に従い、Nonradioactive Sequencing ki
t （東洋紡製）を用いて決定した。決定した塩基配列及
びアミノ酸配列を配列表・配列番号１及び２に示した。
アミノ酸配列から求められる蛋白質の分子量は約１０
３，０００であり、アセトバクター・ハンゼニイ IFO 1
4820のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの分
子量（約１００，０００）と良く一致した。

【００４１】エシェリヒア・コリー形質転換体の作成 ｐＥＰＣ１１でエシェリヒア・コリーＪＭ１０９のコン
ピテントセルを形質転換後、形質転換体エシェリヒア・
コリーＪＭ１０９（ｐＥＰＣ１１）を得た。

【００４２】ホスホエノールピルビン酸カルボキシラー
ゼの製造 ＴＢ培地（１．２％バクトトリプトン、２．４％バクト
イーストエキストラクト、０．４％グリセロール、１７
ｍＭ ＫＨ₂ ＰＯ₄ 、７２ｍＭ Ｋ₂ ＨＰＯ₄）６Ｌを
１０Ｌ−ジャーファーメンターに分注し、１２１℃、１
５分間オートクレーブを行い放冷後、別途無菌濾過した
５０ｍｇ／ｍｌアンピシリン（ナカライテスク製）及び
１００ｍＭ イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラク
トシド（ＩＰＴＧ、日本精化製）をそれぞれ６ｍｌ添加
した。この培地にＬＢ培地（１％バクトトリプトン、
０．５％バクトイーストエキストラクト、１．０％Ｎａ
Ｃｌ，ｐＨ７．４）で予め３０℃、１６時間振盪培養し
たエシェリヒア・コリーＪＭ１０９（ｐＥＰＣ１１）の
培養液６０ｍｌを接種し、３０℃、２４時間通気撹拌培
養した。培養終了時の培養液のホスホエノールピルビン
酸カルボキシラーゼ活性は５．４Ｕ／ｍｌであった。培
養液６Ｌを遠心分離にて集菌し、３Ｌの２０ｍＭ リン
酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０に懸濁し、常法に従いフ
レンチプレスで破砕した後、８，０００ｒｐｍ２０分間
遠心分離してホスホエノールピルビン酸カルボキシラー
ゼ粗酵素液を得た。このようにして得た粗酵素液をポリ
エチレンイミンを用いて除核酸処理をした後、硫安沈澱
によりホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ画分
を回収した。次いでセファデックス G-25 （ファルマシ
アLKB ）ゲル濾過により脱塩を行った後、ＤＥＡＥセフ
ァロース CL-6B（ファルマシアLKB ）カラムクロマトグ
ラフィー、ブチル・トヨパール650Mカラムクロマトグラ
フィーを行い、硫安沈澱によって濃縮して精製ホスホエ
ノールピルビン酸カルボキシラーゼ標品を得た。このホ
スホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ精製標品は、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で単一のバンドを示し、活性
回収率は３３．２％であった。下記表３にこれまでの精
製のまとめを示す。また表４に上記方法により得られた
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの理化学的
性質を示す。

【００４３】

【表３】

【００４４】

【表４】

【００４５】上記表１と３を比較すれば、本発明のホス
ホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは野性株である
アセトバクター・ハンゼニイ IFO 14820の製造法に比べ
簡便な方法により高収率にホスホエノールピルビン酸カ
ルボキシラーゼを回収することができる。また上記表２
と表４を比較すれば、本発明のホスホエノールピルビン
酸カルボキシラーゼが野性株であるアセトバクター・ハ
ンゼニイIFO 14820 由来のホスホエノールピルビン酸カ
ルボキシラーゼより高純度であることが判る。

【００４６】参考例２エシェリヒア・コリーＪＭ１０９由来のホスホエノール
ピルビン酸カルボキシラーゼ標品を用いた炭酸ガス測定 実施例１で精製したエシェリヒア・コリーＪＭ１０９由
来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ標品を
用いて、下記炭酸ガス測定用試薬を作成した。 Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０ ５０ ｍＭ ＭｇＳＯ₄ １０ ｍＭ ホスホエノールピルビンカリウム塩 ３．２ ｍＭ ＮＡＤＨ ０．５ ｍＭ マレートデヒドロゲナーゼ ５０ Ｕ／ｍｌ ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ ３ Ｕ／ｍｌ 上記試薬３ｍｌと重炭酸イオン０〜２０ｍＭを含む試料
０．０５ｍｌを添加し、３７℃で５分間反応させ、３４
０ｎｍにおける５分間の吸光度の減少量を測定した（重
炭酸イオン濃度０ｍＭをブランクとして減じた）。試料
中の重炭酸濃度と５分間に吸光度減少量の関係を図１に
示した。重炭酸イオン濃度と吸光度変化の間には直線関
係が存在した。

【００４７】参考例３エシェリヒア・コリーＪＭ１０９由来のホスホエノール
ピルビン酸カルボキシラーゼ標品の炭酸ガス測定用試液
中の安定性 比較例１で精製したアセトバクター・ハンゼニイ IFO 1
4820由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
標品と実施例１で精製したエシェリヒア・コリーＪＭ１
０９由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
標品を用いて炭酸ガス測定用試液中の安定性を２５℃で
比較した。その結果を図２に示す。図２から明らかなよ
うに、本発明のホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼ標品は野性株であるアセトバクター・ハンゼニイ I
FO 14820由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼに比べ、２５℃での保存安定性が有意に向上してい
た。

【００４８】

【発明の効果】本発明により新規ホスホエノールピルビ
ン酸カルボキシラーゼ遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配
列が明かとなり、工業的に大量生産ができるようになっ
た。また、本発明の製法により、野性株により生産され
たホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼに比べ、
高純度のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを
高収率で取得することが可能になった。更に、本発明の
製法により取得したホスホエノールピルビン酸カルボキ
シラーゼを用いる事により、安定性にすぐれた炭酸ガス
測定用試薬を作成することが可能となった。

【００４９】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ： 933 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：アセトバクター・ハンゼニイ（Acetobacter ha
nsenii） 株名：ＩＦＯ１４８２０ 配列 Met Ser Gln Ala Ser Ala Pro His Ala Thr Asp Met Leu Gln Gln Gln 1 5 10 15 Ala Arg Glu Leu Val Ala Ile Pro Ala Leu Ser Asp Asn Pro Val Met 20 25 30 Thr Leu Ala Arg Ser Ile Gly Gln Gln Ile Asp Arg Gly Ser Leu Ser 35 40 45 Thr Asp Ala Leu Glu Ala Trp Val Arg Arg Leu Arg Asp Ala Ala Phe 50 55 60 Ala Arg Arg Ala Cys His Ile Ala Ala Tyr Val Gly Gly Val Asp Asp 65 70 75 80 Ala Val Ile Asp Gln Arg Met Arg Asp Val Ala Arg Arg Ile Met Gln 85 90 95 Pro Asp Pro Asn Asp Ser Pro Val Pro Ile Ala Arg Phe Arg Ala Ala 100 105 110 Thr Glu Arg Ser Arg Phe Ala Ala Val Phe Thr Ala His Pro Thr Phe 115 120 125 Ala Leu Ala Ser Pro Val Tyr Asp Cys Leu Ala Asp Met Ala Thr Gln 130 135 140 Asn Pro Gln Gln Pro Pro Thr Asp Val Pro Ala Phe Ile Thr His Arg 145 150 155 160 Arg Ala Ala Pro Pro Thr Leu Asp Glu Glu Phe Thr Leu Ala Thr Gln 165 170 175 Ala Ile Leu Arg Gly Arg Asn Ala Leu Asp Arg Leu Thr Arg Val Leu 180 185 190 Leu Thr Glu Ala Arg Ala His Trp Pro Gln Leu Trp Ala Thr Leu Ala 195 200 205 Pro Arg Pro Ile Ile Met Thr Ser Trp Val Gly Tyr Asp Thr Asp Gly 210 215 220 Arg Thr Asp Ile Gly Trp Trp Asp Thr Leu Arg Leu Arg Val Arg Met 225 230 235 240 Lys His Met Gln Leu Thr Arg Leu Asn Ala Gln Ile Gly Pro Val Ala 245 250 255 Ser Val Pro Asn Asp Leu His Glu Arg Val Asn Arg Ala Ile Gln Ala 260 265 270 Val Glu Ala Gln Ile Ala Ala Cys Pro Gly Ser Ala Asp Pro Gln Ala 275 280 285 Val Ala Asp Phe Ala Ala Val Leu Ile Gly Arg Arg Glu Glu Ala Met 290 295 300 Thr Ser Ser Asn Asp Leu Ala Pro Thr Phe Ala Glu Ala Ile Asp Ala 305 310 315 320 Ala Thr Leu Asp Asp Lys Met Thr Leu Ala Val Ala Arg Ala Gly Phe 325 330 335 Met Ala His Gly Leu Ser Ala Ala His Thr His Val Arg Leu Asn Ser 340 345 350 Thr Gln Leu His Asn Val Ala Arg Gln Arg Leu Gly Ile Thr Asp Asn 355 360 365 Pro Asp Ile His Ala Gln Arg Arg Ala Arg Ile Ala Arg Ile Asp Glu 370 375 380 Ala Leu Asp Thr Thr Gln Pro Ile Asp Ile Asp Phe Gly Ser Leu Leu 385 390 395 400 Val Glu Gln Ser Thr Ala Gly Arg Leu Met Met Thr Val Arg Gln Ile 405 410 415 Leu His His Ile Asp Arg Thr Thr Pro Ile Arg Phe Leu Ile Ala Glu 420 425 430 Thr Glu Thr Gly Tyr Thr Leu Leu Thr Ala Leu Trp Leu Ala Arg Leu 435 440 445 Leu Gly Val Glu Asp Met Ile Glu Ile Ser Pro Leu Phe Glu Thr Gln 450 455 460 Asp Ala Leu Glu Gln Gly Glu His Leu Ile Glu Glu Ala Leu His Ser 465 470 475 480 Pro His Trp Arg Ala Tyr Leu His Arg Thr Arg Lys Leu Ser Leu Gln 485 490 495 Phe Gly Phe Ser Asp Ser Gly Arg Tyr Val Gly Gln Leu Ala Ala Thr 500 505 510 Tyr Leu Ile Glu Arg Leu Arg Leu Lys Val Cys Asp Leu Leu Arg Gln 515 520 525 Trp Asp Leu Ala Phe Val Glu Val Ile Leu Phe Asp Thr His Gly Glu 530 535 540 Ser Ile Gly Arg Gly Ala His Pro Tyr Ser Leu Ala Glu Arg Phe Asp 545 550 555 560 Tyr Leu Ser Pro Pro His Ala Arg Met Arg Phe Leu Gln Ala Gly Ile 565 570 575 Arg Leu Arg Glu Glu Thr Ala Phe Gln Gly Gly Asp Gly Tyr Leu Leu 580 585 590 Phe Gly Thr Gln Pro Leu Ala Asp Ala Thr Val Ser Val Ile Ala Glu 595 600 605 His Ala Phe Ala Thr Thr Ser Ile Asp Glu Asp Pro Val Tyr Asp Glu 610 615 620 Pro Asp Phe Ser Ala Asp Phe Phe Ser Ala Ile Ala Arg Gly Met Thr 625 630 635 640 Gly Leu Val Glu Asp Pro Gly Tyr Ala Ala Leu Leu Gly Ala Phe Gly 645 650 655 Pro Ser Leu Ile Asp Lys Thr Gly Ser Arg Pro Ser Ala Arg Gln Ser 660 665 670 Asp Thr Ala Ala Ile Thr Thr Arg Ile Arg His Pro Ser Gln Leu Arg 675 680 685 Ala Ile Pro Asn Asn Ala Ile Leu Gln Gln Leu Gly Trp Cys Ala Asn 690 695 700 Thr Leu Gln Gly Leu Gly Thr Ala Ala Ala Arg His Pro Asp Thr Phe 705 710 715 720 Glu Arg Tyr Leu Asn Asp Ser Pro Arg Phe Arg Arg Ala Leu Asp Phe 725 730 735 Ala Ala His Gly Leu Ala His Ser Ser Asp Gly Val Leu Arg Gly Val 740 745 750 Ile Arg Leu Leu Asp Pro Asp Met Trp Leu Gln Arg Ala Thr Ala His 755 760 765 His Asp Pro Lys Arg Gln Asp Ala Cys Leu Thr Leu Met His Gly Leu 770 775 780 Glu Arg Leu Asp Phe Trp Ala Cys Thr Gln Ser Met Phe Arg Arg Leu 785 790 795 800 Gln Ser Asp His Leu Ala Leu Arg Asn Ala Trp Pro Ser Ala Pro Arg 805 810 815 Met Glu Ala Asp Glu Met Leu Leu His Ala Ile Arg Ile Ala Ile Ile 820 825 830 Glu Gln Ile Trp Met Leu Ser Thr Arg Ile Pro Tyr Phe Ala Pro Arg 835 840 845 Asn Ala Phe Thr Arg Asp Val Leu Thr Ala Lys Val Leu Cys Leu Glu 850 855 860 Ile Pro Asp Val Leu Lys Glu Leu Glu His Ile Phe Pro Tyr His Ala 865 870 875 880 Asp Arg Ser Phe Asp Leu Asp Phe His Glu Pro His Gly Pro Arg Asp 885 890 895 Glu Gly Thr Tyr Met Arg Glu Tyr Thr Glu Ile Phe Glu Pro Met Gln 900 905 910 Arg Leu Phe Thr Leu Val Arg Glu Ile Ser Thr Gly Val Met His His 915 920 925 Val Gly Ala Phe Gly 930 933

【００５０】配列番号：２ 配列の長さ：2802 配列の型：核酸（ＤＮＡ） 鎖の数：ニ本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ 起源 生物名：アセトバクター・ハンゼニイ（Acetobacter ha
nsenii） 株名：ＩＦＯ１４８２０ 配列 ATG TCC CAG GCC TCT GCC CCT CAT GCA ACA GAC ATG CTG CAG CAG CAG 48 Met Ser Gln Ala Ser Ala Pro His Ala Thr Asp Met Leu Gln Gln Gln 1 5 10 15 GCC CGC GAA CTT GTG GCG ATC CCT GCC CTT TCC GAC AAC CCG GTC ATG 96 Ala Arg Glu Leu Val Ala Ile Pro Ala Leu Ser Asp Asn Pro Val Met 20 25 30 ACG CTG GCA CGC AGC ATC GGA CAG CAG ATC GAC CGG GGC AGC CTG TCG 144 Thr Leu Ala Arg Ser Ile Gly Gln Gln Ile Asp Arg Gly Ser Leu Ser 35 40 45 ACC GAC GCG CTG GAG GCC TGG GTC CGC CGC CTG CGC GAC GCC GCG TTC 192 Thr Asp Ala Leu Glu Ala Trp Val Arg Arg Leu Arg Asp Ala Ala Phe 50 55 60 GCC CGC CGC GCC TGC CAT ATC GCC GCG TAT GTC GGG GGG GTG GAT GAT 240 Ala Arg Arg Ala Cys His Ile Ala Ala Tyr Val Gly Gly Val Asp Asp 65 70 75 80 GCC GTC ATC GAC CAG CGC ATG CGT GAC GTG GCG CGC CGC ATC ATG CAG 288 Ala Val Ile Asp Gln Arg Met Arg Asp Val Ala Arg Arg Ile Met Gln 85 90 95 CCC GAC CCA AAT GAC AGC CCG GTG CCC ATC GCC CGG TTC CGC GCC GCG 336 Pro Asp Pro Asn Asp Ser Pro Val Pro Ile Ala Arg Phe Arg Ala Ala 100 105 110 ACC GAA CGC AGC CGC TTT GCC GCC GTG TTC ACC GCG CAT CCC ACG TTT 384 Thr Glu Arg Ser Arg Phe Ala Ala Val Phe Thr Ala His Pro Thr Phe 115 120 125 GCG CTG GCC AGC CCC GTC TAT GAC TGC CTT GCC GAC ATG GCG ACG CAA 432 Ala Leu Ala Ser Pro Val Tyr Asp Cys Leu Ala Asp Met Ala Thr Gln 130 135 140 AAC CCG CAG CAG CCC CCG ACC GAT GTC CCG GCA TTC ATA ACG CAT CGC 480 Asn Pro Gln Gln Pro Pro Thr Asp Val Pro Ala Phe Ile Thr His Arg 145 150 155 160 CGC GCC GCG CCG CCG ACG CTG GAT GAG GAA TTC ACG CTG GCG ACG CAG 528 Arg Ala Ala Pro Pro Thr Leu Asp Glu Glu Phe Thr Leu Ala Thr Gln 165 170 175 GCG ATC CTG CGC GGG CGC AAT GCA CTC GAT CGC CTG ACG CGG GTT CTC 576 Ala Ile Leu Arg Gly Arg Asn Ala Leu Asp Arg Leu Thr Arg Val Leu 180 185 190 CTG ACC GAG GCA CGG GCA CAC TGG CCG CAA CTG TGG GCC ACG CTG GCG 624 Leu Thr Glu Ala Arg Ala His Trp Pro Gln Leu Trp Ala Thr Leu Ala 195 200 205 CCG CGT CCC ATT ATC ATG ACA AGC TGG GTC GGA TAC GAC ACG GAC GGA 672 Pro Arg Pro Ile Ile Met Thr Ser Trp Val Gly Tyr Asp Thr Asp Gly 210 215 220 CGC ACC GAT ATC GGG TGG TGG GAC ACG CTG CGG CTG CGC GTG CGC ATG 720 Arg Thr Asp Ile Gly Trp Trp Asp Thr Leu Arg Leu Arg Val Arg Met 225 230 235 240 AAG CAC ATG CAG TTA ACC CGC CTG AAT GCA CAG ATT GGC CCC GTC GCC 768 Lys His Met Gln Leu Thr Arg Leu Asn Ala Gln Ile Gly Pro Val Ala 245 250 255 TCC GTC CCC AAT GAC CTG CAC GAA CGC GTC AAT CGC GCC ATA CAG GCG 816 Ser Val Pro Asn Asp Leu His Glu Arg Val Asn Arg Ala Ile Gln Ala 260 265 270 GTG GAG GCA CAG ATC GCC GCA TGC CCC GGC AGT GCC GAC CCG CAG GCG 864 Val Glu Ala Gln Ile Ala Ala Cys Pro Gly Ser Ala Asp Pro Gln Ala 275 280 285 GTG GCC GAT TTT GCC GCG GTC CTG ATC GGT CGC CGC GAA GAG GCC ATG 912 Val Ala Asp Phe Ala Ala Val Leu Ile Gly Arg Arg Glu Glu Ala Met 290 295 300 ACC AGC AGC AAC GAC CTC GCC CCC ACT TTT GCC GAA GCC ATT GAT GCC 960 Thr Ser Ser Asn Asp Leu Ala Pro Thr Phe Ala Glu Ala Ile Asp Ala 305 310 315 320 GCG ACG CTG GAC GAC AAG ATG ACG CTG GCG GTC GCA CGC GCG GGT TTC 1008 Ala Thr Leu Asp Asp Lys Met Thr Leu Ala Val Ala Arg Ala Gly Phe 325 330 335 ATG GCC CAT GGC CTG TCG GCG GCG CAT ACG CAT GTA CGC CTC AAT TCC 1056 Met Ala His Gly Leu Ser Ala Ala His Thr His Val Arg Leu Asn Ser 340 345 350 ACG CAA TTA CAC AAT GTC GCC CGC CAG CGC CTG GGC ATT ACC GAC AAT 1104 Thr Gln Leu His Asn Val Ala Arg Gln Arg Leu Gly Ile Thr Asp Asn 355 360 365 CCC GAT ATC CAT GCC CAG CGT CGC GCC CGG ATC GCA CGC ATT GAC GAG 1152 Pro Asp Ile His Ala Gln Arg Arg Ala Arg Ile Ala Arg Ile Asp Glu 370 375 380 GCG CTG GAT ACA ACG CAG CCA ATC GAC ATT GAT TTC GGC TCC CTG CTG 1200 Ala Leu Asp Thr Thr Gln Pro Ile Asp Ile Asp Phe Gly Ser Leu Leu 385 390 395 400 GTG GAA CAG TCA ACG GCG GGG CGG CTG ATG ATG ACG GTG CGC CAG ATC 1248 Val Glu Gln Ser Thr Ala Gly Arg Leu Met Met Thr Val Arg Gln Ile 405 410 415 CTG CAC CAT ATC GAC CGC ACC ACG CCC ATC CGT TTC CTG ATC GCG GAA 1296 Leu His His Ile Asp Arg Thr Thr Pro Ile Arg Phe Leu Ile Ala Glu 420 425 430 ACG GAA ACC GGC TAT ACG CTG CTG ACG GCA CTG TGG CTT GCG CGC CTG 1344 Thr Glu Thr Gly Tyr Thr Leu Leu Thr Ala Leu Trp Leu Ala Arg Leu 435 440 445 CTG GGC GTG GAA GAC ATG ATC GAA ATC TCC CCC CTG TTT GAA ACG CAG 1392 Leu Gly Val Glu Asp Met Ile Glu Ile Ser Pro Leu Phe Glu Thr Gln 450 455 460 GAC GCG CTG GAA CAG GGG GAA CAC CTG ATC GAA GAA GCG CTG CAT TCA 1440 Asp Ala Leu Glu Gln Gly Glu His Leu Ile Glu Glu Ala Leu His Ser 465 470 475 480 CCG CAC TGG CGC GCC TAC CTG CAT CGT ACG CGC AAG CTG AGC CTG CAA 1488 Pro His Trp Arg Ala Tyr Leu His Arg Thr Arg Lys Leu Ser Leu Gln 485 490 495 TTC GGT TTT TCG GAT TCG GGA CGT TAT GTG GGA CAG CTT GCC GCG ACC 1536 Phe Gly Phe Ser Asp Ser Gly Arg Tyr Val Gly Gln Leu Ala Ala Thr 500 505 510 TAC CTG ATC GAA CGG CTG CGG CTG AAG GTC TGC GAC CTT CTG CGG CAA 1584 Tyr Leu Ile Glu Arg Leu Arg Leu Lys Val Cys Asp Leu Leu Arg Gln 515 520 525 TGG GAC CTC GCC TTC GTG GAA GTC ATC CTG TTC GAC ACC CAT GGG GAA 1632 Trp Asp Leu Ala Phe Val Glu Val Ile Leu Phe Asp Thr His Gly Glu 530 535 540 AGC ATC GGC CGC GGG GCA CAT CCC TAC AGC CTT GCC GAA CGT TTC GAC 1680 Ser Ile Gly Arg Gly Ala His Pro Tyr Ser Leu Ala Glu Arg Phe Asp 545 550 555 560 TAT CTC TCC CCC CCG CAT GCG CGC ATG CGT TTC CTG CAG GCA GGC ATT 1728 Tyr Leu Ser Pro Pro His Ala Arg Met Arg Phe Leu Gln Ala Gly Ile 565 570 575 CGC CTG CGC GAG GAA ACG GCC TTT CAG GGG GGG GAT GGC TAC CTC CTG 1776 Arg Leu Arg Glu Glu Thr Ala Phe Gln Gly Gly Asp Gly Tyr Leu Leu 580 585 590 TTC GGG ACG CAG CCC CTT GCG GAT GCA ACT GTC AGC GTG ATC GCG GAA 1824 Phe Gly Thr Gln Pro Leu Ala Asp Ala Thr Val Ser Val Ile Ala Glu 595 600 605 CAC GCC TTT GCC ACG ACC TCC ATC GAC GAA GAC CCG GTT TAC GAC GAA 1872 His Ala Phe Ala Thr Thr Ser Ile Asp Glu Asp Pro Val Tyr Asp Glu 610 615 620 CCC GAT TTC TCT GCC GAT TTC TTT TCC GCC ATC GCG CGC GGC ATG ACA 1920 Pro Asp Phe Ser Ala Asp Phe Phe Ser Ala Ile Ala Arg Gly Met Thr 625 630 635 640 GGA CTG GTG GAG GAT CCA GGC TAT GCC GCG CTG CTG GGT GCG TTC GGG 1968 Gly Leu Val Glu Asp Pro Gly Tyr Ala Ala Leu Leu Gly Ala Phe Gly 645 650 655 CCG TCA CTA ATC GAC AAG ACG GGT TCA CGC CCC TCC GCC CGG CAG AGC 2016 Pro Ser Leu Ile Asp Lys Thr Gly Ser Arg Pro Ser Ala Arg Gln Ser 660 665 670 GAT ACG GCC GCC ATC ACC ACG CGC ATC CGC CAT CCC AGC CAG TTG CGC 2064 Asp Thr Ala Ala Ile Thr Thr Arg Ile Arg His Pro Ser Gln Leu Arg 675 680 685 GCC ATC CCC AAC AAC GCC ATC CTC CAG CAG CTT GGC TGG TGC GCC AAT 2112 Ala Ile Pro Asn Asn Ala Ile Leu Gln Gln Leu Gly Trp Cys Ala Asn 690 695 700 ACG TTG CAG GGG CTG GGC ACG GCG GCC GCG CGT CAT CCC GAT ACG TTC 2160 Thr Leu Gln Gly Leu Gly Thr Ala Ala Ala Arg His Pro Asp Thr Phe 705 710 715 720 Glu Arg Tyr Leu Asn Asp Ser Pro Arg Phe Arg Arg Ala Leu Asp Phe 725 730 735 GCC GCC CAT GGC CTG GCC CAT TCC AGC GAC GGC GTC CTG CGT GGT GTG 2256 Ala Ala His Gly Leu Ala His Ser Ser Asp Gly Val Leu Arg Gly Val 740 745 750 ATC CGG CTG CTG GAC CCG GAC ATG TGG TTG CAA CGC GCA ACG GCG CAT 2304 Ile Arg Leu Leu Asp Pro Asp Met Trp Leu Gln Arg Ala Thr Ala His 755 760 765 CAC GAC CCG AAA CGG CAG GAT GCG TGC CTG ACG CTG ATG CAC GGG CTG 2352 His Asp Pro Lys Arg Gln Asp Ala Cys Leu Thr Leu Met His Gly Leu 770 775 780 GAA CGG CTG GAT TTC TGG GCC TGT ACG CAA TCC ATG TTC CGC CGC CTG 2400 Glu Arg Leu Asp Phe Trp Ala Cys Thr Gln Ser Met Phe Arg Arg Leu 785 790 795 800 CAA TCG GAC CAT CTG GCG TTA CGC AAC GCA TGG CCC AGC GCA CCA CGG 2448 Gln Ser Asp His Leu Ala Leu Arg Asn Ala Trp Pro Ser Ala Pro Arg 805 810 815 ATG GAG GCG GAT GAA ATG CTG CTG CAT GCC ATC CGC ATC GCC ATC ATT 2496 Met Glu Ala Asp Glu Met Leu Leu His Ala Ile Arg Ile Ala Ile Ile 820 825 830 GAA CAG ATA TGG ATG CTG TCC ACC CGG ATC CCG TAT TTT GCG CCG CGC 2544 Glu Gln Ile Trp Met Leu Ser Thr Arg Ile Pro Tyr Phe Ala Pro Arg 835 840 845 AAT GCG TTC ACC CGC GAC GTG CTG ACG GCG AAG GTC CTG TGC CTG GAA 2592 Asn Ala Phe Thr Arg Asp Val Leu Thr Ala Lys Val Leu Cys Leu Glu 850 855 860 ATC CCC GAT GTG CTG AAG GAG CTG GAG CAT ATC TTC CCC TAT CAC GCG 2640 Ile Pro Asp Val Leu Lys Glu Leu Glu His Ile Phe Pro Tyr His Ala 865 870 875 880 GAC CGC AGC TTC GAC CTG GAT TTC CAT GAA CCG CAC GGG CCC CGC GAT 2688 Asp Arg Ser Phe Asp Leu Asp Phe His Glu Pro His Gly Pro Arg Asp 885 890 895 GAA GGG ACG TAT ATG CGC GAA TAC ACG GAA ATT TTC GAA CCG ATG CAA 2736 Glu Gly Thr Tyr Met Arg Glu Tyr Thr Glu Ile Phe Glu Pro Met Gln 900 905 910 CGG CTG TTC ACA CTG GTG CGC GAA ATC AGC ACC GGC GTG ATG CAC CAT 2784 Arg Leu Phe Thr Leu Val Arg Glu Ile Ser Thr Gly Val Met His His 915 920 925 GTC GGG GCC TTT GGC TGA 2802 Val Gly Ala Phe Gly *** 930 933

【図面の簡単な説明】

【図１】重炭酸イオン濃度と吸光度変化の関係を示す。

【図２】炭酸ガス測定用試液中の安定性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 山本 和巳 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績 株式会社 敦賀バイオ研究所内 (72)発明者 川村 良久 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績 株式会社 敦賀バイオ研究所内 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 9/00 C12N 15/00

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表・配列番号１に記載されたアミノ
   酸配列をコードするＤＮＡを含有することを特徴とする
   ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードす
   るＤＮＡ断片。
2. 【請求項２】 配列表・配列番号２に記載された塩基配
   列を含有することを特徴とする請求項１記載のホスホエ
   ノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするＤＮＡ
   断片。
3. 【請求項３】 請求項２に記載のＤＮＡ配列に対し突然
   変異によって変化させられた、ホスホエノールピルビン
   酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコード
   することを特徴とするホスホエノールピルビン酸カルボ
   キシラーゼをコードするＤＮＡ断片。
4. 【請求項４】 請求項２または３に記載されたＤＮＡ断
   片を含有する組換えベクター。
5. 【請求項５】 請求項４に記載された組換えベクターに
   より形質転換された形質転換体。
6. 【請求項６】 請求項５に記載された形質転換体を培地
   で培養し、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
   を生成させ、該ホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
   ーゼを採取することを特徴とするホスホエノールピルビ
   ン酸カルボキシラーゼの製造法。