JPH08131194A - 炭酸ガス測定方法およびその試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】高価なアクチベーターを必要としない新規なホ
スホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを使用する炭
酸ガス測定方法およびその試薬を提供する。 【構成】試料中の重炭酸イオンにホスホピルビン酸塩の
存在下、アセトバクター・ハンゼニーIFO14820由来の遺
伝子を使用して製造した組換えホスホエノールピルビン
酸カルボキシラーゼを反応させ、生成したオキザロ酢酸
にＮＡＤＨの存在下にマレートデヒドロゲナーゼを作用
させ、減少するＮＡＤＨを測定することにより、試料中
の炭酸ガスを測定する方法およびその試薬。 【効果】従来の酢酸菌由来のホスホエノールピルビン酸
カルボキシラーゼに比べて、安定性に優れた炭酸ガス測
定用試薬を得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は体液、特に血清または血
漿中に存在する炭酸ガスを測定する方法およびそのため
の試薬に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】血清または血漿中の炭酸ガスは、重炭酸
イオン（ＨＣＯ₃ ^- ）と平衡状態にあり、これら血清ま
たは血漿の中で第２に大きなフラクションである。故に
血液中で最も重要な生理学的緩衝作用系を形成してい
る。このため血清または血漿の炭酸ガス含量の測定値は
電解質分散、アニオン不足の有意な標識であり、これは
呼吸、代謝系の酸−塩基不均衡の医学的診断の助けにな
っている。例えば血清および血漿中の正常炭酸イオン濃
度は２２〜３２ｍｍｏｌ／ｌであるが、異常時には１５
ｍｍｏｌ／ｌの低値または４０ｍｍｏｌ／ｌの高値へと
変動する。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
は、ホスホエノールピルビン酸及び重炭酸イオンに作用
して、オキザロ酢酸とリン酸イオンを生成する反応を触
媒する酵素であり、臨床検査薬の分野では体液、特に血
清及び血漿中の重炭酸イオン測定用試薬に従来から用い
られてきた。

【０００３】体液中の炭酸ガスの測定は様々な方法で実
施可能であるが、通常以下に述べる酵素反応によって生
じる変化を追跡することにより行われている。重炭酸イ
オンとホスホエノールピルビン酸にホスホエノールピル
ビン酸カルボキシラーゼを作用させるとオキザロ酢酸と
リン酸が生成する。生成したオキザロ酢酸をＮＡＤＨ存
在下、マレートデヒドロゲナーゼと反応させ、その際の
ＮＡＤＨの減少量を公知方法によりエンド法もしくはレ
ート法で測定している。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】炭酸ガスはアリカリ性
ｐＨでは重炭酸イオン形成側に平衡が偏り、重炭酸イオ
ンとして存在しては炭酸イオンとなる。従って上記炭酸
ガス測定試薬はｐＨ８．０以上の緩衝液が汎用されてい
る。これに関する基本的な問題点はホスホエノールピル
ビン酸カルボキシラーゼがアルカリ側のｐＨで不安定で
あり、該酵素を含む炭酸ガス測定試薬が液状で長時間保
存できないことである。ホスホエノールピルビン酸カル
ボキシラーゼとして市販されているものは、大部分がト
ウモロコシの葉や小麦の胚等の植物由来の酵素であり、
ｐＨ８．０での安定性は極めて低い。

【０００５】ハイフォミクロビウム由来のホスホエノー
ルピルビン酸カルボキシラーゼを使用する重炭酸イオン
の測定法は公知である（特開平4-228074号公報) 。該酵
素は微生物起源によるものであり、植物起源のホスホエ
ノールピルビン酸カルボキシラーゼに関する上記欠点を
有していない。また比較的高い安定性を有している。し
かしながら、炭酸ガス測定試薬で用いられる酵素濃度
（通常０．０５〜５Ｕ／ｍｌ）では安定性が不充分であ
ることが判明した。米国特許第３，９７４，０３７号明
細書に記載の炭酸ガス測定法では、Escherichia coli由
来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼが使用
されている。しかしながら、該酵素も弱アルカリ性であ
る炭酸ガス測定試薬中では安定性が低く、さらにホスホ
エノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性化のために
高価なアセチルＣｏＡが必要である。

【０００６】つまり炭酸ガス測定に用いるホスホエノー
ルピルビン酸カルボキシラーゼとして、また測定試薬の
緩衝液（約ｐＨ８．０〜８．５）中で安定な酵素が求め
られていた。

【０００７】本発明者らは上記問題点を解決するため鋭
意研究を重ねた結果、酢酸菌の生産するホスホエーノル
ピルビン酸カルボキシラーゼが弱アルカリ性である炭酸
ガス測定試薬中で安定であること見出し、既に提案した
（特願平5-61987 号) 。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、酢酸菌
よりホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを製造
する場合、生産性が低い点、多くの精製工程を必要とす
る点などから製造コストが高くなり臨床検査薬用酵素の
給源としては問題であった。本発明の目的は、上記の問
題点を解決するため遺伝子工学的手法によって新規ホス
ホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを純粋な形で大
量供給し、得られた酵素を炭酸ガス測定に使用する方法
ならびにそのための試薬を提供することにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するため、ホスホエノールピルビン酸カルボキシ
ラーゼ生産菌としてアセトバクター・ハンゼニイ(cetab
acter hansenii) IFO14820 を選び、該菌体より抽出し
た染色体ＤＮＡよりホスホエノールピルビン酸カルボキ
シラーゼ遺伝子の単離に成功し、そのＤＮＡの全構造を
決定した。更に該ホスホエノールピルビン酸カルボキシ
ラーゼを遺伝子工学的手法によって形質転換体に高生産
させることに成功し、高純度なホスホエノールピルビン
酸カルボキシラーゼを安価に大量供給することを可能に
した。

【００１０】すなわち本発明は試料中の重炭酸イオンに
ホスホエノールピルビン酸塩の存在下、組換えホスホエ
ノールピルビン酸カルボキシラーゼを反応させ、生成し
たオキザロ酢酸にＮＡＤＨの存在下にマレートデヒドロ
ゲナーゼを作用させ、減少するＮＡＤＨを測定すること
により試料中の炭酸ガスを測定することを特徴とする炭
酸ガス測定方法である。

【００１１】また本発明はホスホエノールピルビン酸
塩、組換えホスホエノールピルビン酸カルボキシラー
ゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＨおよび緩衝液
を含有することを特徴とする炭酸ガス測定試薬である。

【００１２】本発明に使用する組換えホスホエノールピ
ルビン酸カルボキシラーゼは、アセトバクター属に属す
る細菌由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラー
ゼをコードする遺伝子を有する組換えべクターにより形
質転換された形質転換体を培養し、培養物から採取され
た酵素である。アセトバクター属に属する細菌として
は、アセトバクター・ハンゼニイ、例えばアセトバクタ
ー・ハンゼニイIFO 14820 が例示される。

【００１３】また本発明の組換えホスホエノールピルビ
ン酸カルボキシラーゼは配列表・配列番号１に記載する
アミノ酸配列を有する酵素である。

【００１４】さらに本発明の組換えホスホエノールピル
ビン酸カルボキシラーゼは好ましくは下記理化学的性質
を有する酵素である。 （１） 次の反応を触媒する。 ホスホエノールピルビン酸 ＋ ＨＣＯ₃ ^- → オキザ
ロ酢酸 ＋ ＨＰＯ₄ ^2- （２） 至適ｐＨ：７．５〜８．０ （３） ｐＨ安定性：ｐＨ５．０〜８．０（２５℃、２
４時間） ｐＨ７．５〜８．５（１０ｍＭ ＭｇＳＯ₄ を含むトリ
ス緩衝液中で２５℃、２４時間処理） （４） 至適作用温度：６０℃ （５） 熱安定性：４５℃まで安定（ｐＨ７．０、１５
分間処理） （６） 分子量：３９０，０００±１０，０００（ゲル
濾過法） １００，０００±５，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） （７） アセチルＣｏＡで活性化されない。 （８） 比活性：少なくとも１１０Ｕ／ｍｇ蛋白

【００１５】本発明の組換えホスホエノールピルビン酸
カルボキシラーゼを製造する遺伝子は、例えばアセトバ
クター・ハンゼニイ(Acertobacter hansenii) IFO 1482
0 を起源とする。この菌株を培養する培地としては、炭
素源、窒素源、無機イオン、更に必要に応じて硝酸塩、
リン酸塩などを含有する培地を使用する。炭素源として
はグルコース、ラクトースのような糖類あるいはグリセ
ロールやソルビトールのような糖アルコールなどを用い
ることが出来る。窒素源としてはポリペプトン、トリプ
トン、肉エキス、酵母エキスなどが利用できる。該菌体
を培養するに当たり、特に誘導物質等は必要なく、好気
条件にて、該菌株の最も良好に生育する温度、ｐＨにて
培養し、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの
生産量が最大になる時点まで培養する。

【００１６】培養した菌体よりホスホエノールピルビン
酸カルボキシラーゼを精製するには、以下のような方法
が用いられる。培養液より遠心分離にて菌体を回収し、
次いで菌体を破砕することによりホスホエノールピルビ
ン酸カルボキシラーゼを抽出する。菌体破砕方法として
は、例えばリゾチームの様な細胞壁溶解酵素による処理
や、超音波破砕、ガラスビーズ破砕、フレンチプレス破
砕のような物理的処理を用いることが出来る。このよう
にして得られた粗酵素抽出液を例えばポリエチレンイミ
ン処理により除核酸処理を行った後、硫安沈澱によりホ
スホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ画分を回収す
る。このようにして得られたホスホエノールピルビン酸
カルボキシラーゼ画分は、例えばＧ−２５ゲル濾過など
により脱塩した後、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ
（ファルマシアＬＫＢ）→ハイドロキシルアパタイト
（生化学工業）→セファデックスＧ−２００ゲル濾過
（ファルマシアＬＫＢ）→ＭｏｎｏＰ ＨＲ５／５クロ
マトフォーカシング（ファルマシアＬＫＢ）などにより
高純度に精製される。

【００１７】本発明者らが精製したタンパク質は、ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動的に均一なバンド
を示した。この時のホスホエノールピルビン酸カルボキ
シラーゼの比活性は８４単位(U)/mg蛋白であった。尚、
カラムクロマトグラフィーの組み合わせは上記ステップ
に限定する必要はないものの、電気泳動的に均一なバン
ドにするには数段階のカラムクロマトグラフィー操作が
必要である。

【００１８】上記ホスホエノールピルビン酸カルボキシ
ラーゼの理化学的性質は以下の通りである。 （１）作用：以下の反応を触媒する。 ホスホエノールピルビン酸 ＋ ＨＣＯ₃ ^- → オキザ
ロ酢酸 ＋ ＨＰＯ₄ ^2- （２）至適作用ｐＨ：７．５〜８．０ （３）ｐＨ安定性：ｐＨ５．０〜８．０（２５℃、２４
時間処理） ｐＨ７．５〜８．５（１０ｍＭ ＭｇＳＯ₄ を含むトリ
ス緩衝液中で２５℃、２４時間処理） （４）至適温度：６０℃ （５）熱安定性：４５℃以下（ｐＨ７．０，１５分処
理） （６）分子量：３９０，０００±１０，０００（ゲル濾
過法） １００，０００±５，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） （７）比活性：８４単位／ｍｇ蛋白 （８）アセチルＣｏＡで活性化されない。

【００１９】本発明の新規ホスホエノールピルビン酸カ
ルボキシラーゼをコードする遺伝子は、アセトバクター
・ハンゼニイIFO 14820 菌体から抽出しても良く、また
化学的に合成することもできる。上記遺伝子配列として
は、例えば配列表番号１に記載されたアミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡ配列または配列表番号２に記載された塩
基配列を有するＤＮＡまたは配列表番号２に記載された
配列に対し突然変異により変化させられたＤＮＡを挙げ
ることが出来る。

【００２０】本発明のＤＮＡは、例えばアセトバクター
・ハンゼニイIFO 14820 のＤＮＡを分離・精製した後、
超音波破砕、制限酵素などを用いてＤＮＡを切断したも
のと、リニヤーな発現ベクターとを両ＤＮＡの平滑末端
または接着末端部においてＤＮＡリガーゼなどにより結
合閉環させて組換えベクターとする。こうして得られた
組換えベクターは複製可能な宿主微生物に移入した後、
ベクターのマーカーとホスホエノールピルビン酸カルボ
キシラーゼ蛋白の発現を指標としてスクリーニングして
該組換えＤＮＡベクターを保持する微生物を得る。ホス
ホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ蛋白質発現のス
クリーニング方法としては、該蛋白質の抗体を用いた抗
原抗体反応による方法、直接該蛋白質の活性を測定する
方法、該蛋白質の欠損変異株を用いた栄養要求性の相補
による方法などを用いることができる。該蛋白質を発現
した微生物を培養し、該培養菌体から該組換えベクター
を分離・精製し、次いで該組換えベクターからホスホエ
ノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を採取すれば
良い。

【００２１】遺伝子供与体であるアセトバクター・ハン
ゼニイIFO 14820 に由来するＤＮＡは具体的に以下のよ
うに採取される。すなわち供与微生物を例えば液体培地
で約１〜３日間撹拌培養して得られた培養物を遠心分離
にて集菌し、次いでこれを溶菌させることによりホスホ
エノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の含有溶菌
物を調製することが出来る。溶菌の方法としては、例え
ばリゾチームやβ−グルカナーゼなどの溶菌酵素により
処理が施され、必要に応じてプロテアーゼや他の酵素や
ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの界面活性剤が
併用され、更に凍結融解やフレンチプレス処理の様な物
理的破砕方法と組み合わせても良い。

【００２２】このようにして得られた溶菌物からＤＮＡ
を分離・精製するには常法に従って例えばフェノール処
理やプロテアーゼ処理による除蛋白処理や、リボヌクレ
アーゼ処理、アルコール沈澱処理などの方法を適宜組み
合わせることにより行うことが出来る。微生物から分離
・精製されたＤＮＡを切断する方法は、例えば超音波処
理、制限酵素処理などにより行うことが出来るが、好ま
しくは特定ヌクレオチド配列に作用するII型制限酵素が
適している。

【００２３】ベクターとしては、宿主微生物内で自立的
に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換
え用として構築された物が適している。ファージとして
は、例えばエシェリヒア・コリー(Escherichia coli)を
宿主微生物とする場合には、λｇｔ・１０，λｇｔ・１
１などが使用できる。またプラスミドとしては、例えば
エシェリヒア・コリーを宿主微生物とした場合、ｐＢＲ
３２２、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなどが使
用できる。このようなベクターを先に述べたホスホエノ
ールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子供与体である微
生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素で切断してベクタ
ー断片を得ることができるが、必ずしも該微生物ＤＮＡ
の切断に使用した制限酵素と同一の制限酵素を用いる必
要はない。微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片とを
結合させる方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法
で有れば良く、例えば微生物ＤＮＡ断片の接着末端とベ
クター断片の接着末端とのアニーリングの後、適当なＤ
ＮＡリガーゼの使用により微生物ＤＮＡ断片とベクター
断片との組換えベクターを作成する。必要ならば、アニ
ーリングの後、宿主微生物に移入して生体内のＤＮＡリ
ガーゼを利用し、組換えベクターを作成することもでき
る。

【００２４】宿主微生物としては、組換えベクターが安
定且つ自律的に増殖可能で、且つ外来性遺伝子の形質発
現できる物で有れば良く、一般的にはエシェリヒア・コ
リーＷ３１１０、エシェリヒア・コリーＣ６００、エシ
ェリヒア・コリーＪＭ１０９、エシェリヒア・コリーＨ
Ｂ１０１などを用いることができる。

【００２５】宿主微生物に組換えベクターを移入する方
法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリー
属に属する微生物の場合には、カルシウム処理によるコ
ンピテントセル法やエレクトロポレーション法などを用
いることができる。こうして得られた形質転換体である
微生物は栄養培地で培養されることにより、多量のホス
ホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを安定に生産し
得ることを見いだした。宿主微生物への目的組換えベク
ター移入の有無についての選択は、目的とするＤＮＡを
保持するベクターの薬剤耐性マーカーとアセチルＣｏＡ
などの活性化剤を必要としないホスホエノールピルビン
酸カルボキシラーゼ活性とを同時に発現する微生物を検
索すれば良く、例えば薬剤耐性マーカーに基づく選択培
地で生育し、且つ活性化剤を必要としないホスホエノー
ルピルビン酸カルボキシラーゼを生成する微生物を選択
すれば良い。

【００２６】上記の方法により得られたホスホエノール
ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の塩基配列はサイエ
ンス(Science), 214, 1205〜1210(1981)に記載されたジ
デオキシ法で解読し、またホスホエノールピルビン酸カ
ルボキシラーゼのアミノ酸配列は塩基配列より推定し
た。このようにして一度選択されたホスホエノールピル
ビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を保有する組換えベクタ
ーは、形質転換微生物から取り出され、他の微生物に移
入することも容易に実施できる。また、ホスホエノール
ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を保持する組換えベ
クターから制限酵素などによりホスホエノールピルビン
酸カルボキシラーゼ遺伝子であるＤＮＡを切り出し、こ
れを同様な方法により切断して得られるベクター断片と
結合させて、宿主微生物に移入することも容易に実施で
きる。

【００２７】形質転換体である宿主微生物の培養形態
は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択す
れば良く、通常多くの場合は液体培養で行うが、工業的
には通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の炭素源
としては、微生物の培養に通常用いられる物が広く使用
され得る。宿主微生物が資化可能で有れば良く、例えば
グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトー
ス、フラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用でき
る。窒素源としては、宿主微生物が利用可能な窒素化合
物で有れば良く、例えばペプトン、肉エキス、カゼイン
加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物のような有機窒素化
合物や、硫安、塩安のような無機窒素化合物が使用でき
る。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウ
ム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの
塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応
じて使用できる。

【００２８】培養温度は宿主微生物が発育し、ホスホエ
ノールピルビン酸カルボキシラーゼを生産する範囲で適
宜変更し得るが、エシェリヒア・コリーの場合、好まし
くは２０〜４２℃程度である。培養時間は、培養条件に
より多少変動するが、ホスホエノールピルビン酸カルボ
キシラーゼが最高収量に達する時期を見計らって適当時
期に培養を終了すれば良く、通常は２０〜４８時間程度
である。培地ｐＨは宿主微生物が発育し、ホスホエノー
ルピルビン酸カルボキシラーゼを生産する範囲内で適宜
変更し得るが、通常好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度
である。培養液より菌体を回収する方法は、通常用いら
れる方法により行えば良く、例えば遠心分離、濾過など
によって回収することができる。培養液中のホスホエノ
ールピルビン酸カルボキシラーゼが菌体外に分泌される
場合は、この菌体分離液を用いれば良く、以下の菌体破
砕後の方法に準じてホスホエノールピルビン酸カルボキ
シラーゼを分離精製できる。ホスホエノールピルビン酸
カルボキシラーゼが菌体内に存在する場合、前述したよ
うな酵素的または物理的な破砕方法によって破砕抽出す
ることができる。このようにして得られたホスホエノー
ルピルビン酸カルボキシラーゼ含有溶液は親水性ポリマ
ー、例えばポリエチレンイミン処理により除核酸を行
い、次いで硫安沈澱によりホスホエノールピルビン酸カ
ルボキシラーゼ画分を回収する。この粗酵素液を通常用
いる方法、例えば半透膜を用いた透析や Sephadex G-25
（ファルマシアLKB ）ゲル濾過などにより脱塩を行うこ
とができる。この操作の後、酵素溶液を各種のクロマト
グラフィーの組み合わせ、好ましくはＤＥＡＥセファロ
ースCL-6B （ファルマシアLKB ）、ブチル・トヨパール
650M（東洋曹達）カラムクロマトグラフィーにより分離
精製し、精製酵素標品を得ることができる。この精製酵
素標品は、SDS-PAGE電気泳動でほぼ単一バンドを示す程
度に純化されている。

【００２９】本発明の組換えホスホエノールピルビン酸
カルボキシラーゼ活性を有する蛋白質は、以下に示す性
質を有する。 （１）作用：以下の反応を触媒する。 ホスホエノールピルビン酸 ＋ ＨＣＯ₃ ^- → オキザ
ロ酢酸 ＋ ＨＰＯ₄ ^2- （２）至適作用ｐＨ：７．５〜８．０ （３）ｐＨ安定性：ｐＨ５．０〜８．０（２５℃、２４
時間処理） ｐＨ７．５〜８．５（１０ｍＭ ＭｇＳＯ4 を含むトリ
ス緩衝液中で２５℃、２４時間処理） （４）至適温度：６０℃ （５）熱安定性：４５℃以下（ｐＨ７．０，１５分処
理） （６）分子量：３９０，０００±１０，０００（ゲル濾
過法） １００，０００±５，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） （７）比活性：少なくとも１１０単位／ｍｇ蛋白 （８）アセチルＣｏＡで活性化されない。

【００３０】該酵素はアセトバクター・ハンゼニイIFO
14820 が生産する酵素と比べて、炭酸ガス測定用試薬中
の安定性及び比活性において異なっている。すなわち、
アセトバクター・ハンゼニイIFO 14820 の生産する酵素
は、比活性８４単位／ｍｇ蛋白、炭酸ガス測定用試薬中
の２５℃、７日保存後の活性残存率が約３０％であるの
に対し、本発明のホスホエノールピルビン酸カルボキシ
ラーゼ活性を有する蛋白質は、比活性が少なくとも１１
０単位／ｍｇ蛋白、炭酸ガス測定用試薬中にて２５℃、
７日保存後の活性残存率は約９５％である。

【００３１】なおホスホエノールピルビン酸カルボキシ
ラーゼの活性測定は以下の方法によって算出できる。す
なわち、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１
０ｍＭ Ｎａ₂ ＣＯ ₃ 、３．２ｍＭ ホスホエノールピ
ルビン酸カリウム塩、１０ｍＭ ＭｇＳＯ₄、０．１４
ｍＭ ＮＡＤＨ、１０Ｕ／ｍｌ マレートデヒドロゲナ
ーゼを含む反応混液２．９ｍｌをキュベット（ｄ＝１ｃ
ｍ）に調製し、３０℃で約５分間予備加温する。次に酵
素溶液０．１ｍｌを添加し緩やかに混和後、水を対照に
３０℃に制御された分光光度計で３４０ｎｍの吸光度変
化を２〜３分間記録し、その初期直線部分から１分間当
たりの吸光度変化を求める（ΔＯＤｔｅｓｔ）。盲検は
酵素溶液の代わり５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ
７．０を加え、同様に操作を行って、１分間当たりの吸
光度変化を求める（ΔＯＤｂｌａｎｋ）。ホスホエノー
ルピルビン酸カルボキシラーゼの活性は、上記条件で１
分間当たり１マイクロモルのＮＡＤＨを消費する酵素量
を１単位（Ｕ）とする。

【００３２】本発明に使用するホスホエノールピルビン
酸塩としては、カリウム塩、ナトリウム塩、トリシクロ
ヘキシルアンモニウム塩、モノシクロヘキシルアンモニ
ウム塩等が挙げられる。本発明に使用するマレートデヒ
ドロゲナーゼは、豚心臓由来、サーマス属由来、バチル
ス属由来のもの等が挙げられる。

【００３３】本発明に使用する緩衝液は、弱アルカリ性
（ｐＨ８．０〜８．５）ものであれば、いかなるもので
もよい。例えばトリス緩衝液、トリシン緩衝液、グッド
緩衝液等が挙げられる。

【００３４】本発明の炭酸ガスを測定する方法は、下記
反応式に従う。 （式中、ＰＥＰＣはホスホエノールピルビン酸カルボキ
シラーゼ、ＭＤＨはマレートデヒドロゲナーゼであ
る。）

【００３５】本発明の炭酸ガス測定試薬は組換えホスホ
エノールピルビン酸カルボキシラーゼの他に、試薬とし
てホスホエノールピルビン酸塩が必要である。試料中の
重炭酸イオンは一般的には弱アルカリ性条件下、上記ホ
スホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの作用により
ホスホエノールピルビン酸よりオキザロ酢酸を生成す
る。オキザロ酢酸の定量法としては、ＮＡＤＨ存在下、
マレートデヒドロゲナーゼを利用し、オキザロ酢酸から
リンゴ酸の生成を伴うＮＡＤＨの減少量によって求める
ことができる。これはエンド法およびレート法で実施可
能である。

【００３６】炭酸ガス測定は、弱アルカリ性条件下、通
常ｐＨ７．５〜９．０、好ましくはｐＨ８．０〜８．５
で行う。本発明の試薬には、さらに補因子としてマグネ
シウムイオン（Ｍｇ²⁺）、マンガンイオン（Ｍｎ²⁺）に
ような２価イオンを３〜１００ｍＭ含有させることが望
ましい。特にマグネシウムイオンを添加することが好ま
しい。これらの２価イオンを供給する物質としては、硫
酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸マンガン、塩
化マンガン等の塩が挙げられる。

【００３７】本発明試薬は一般的には下記組成を有す
る。 弱アルカリ性緩衝液 １０〜５０ｍＭ ホスホエノールピルビン酸塩 ２〜５ｍＭ マグネシウムイオン ３〜１００ｍＭ ＮＡＤＨ ０．３〜１．５ｍＭ マレートデヒドロゲナーゼ ５〜５０Ｕ／ｍｌ 組換えホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ ０．５〜１０Ｕ／ｍｌ さらに具体的な一例としては、下記組成を有する。 トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０） １０〜５０ｍＭ ホスホエノールピルビン酸カリウム塩 ２〜５ｍＭ 硫酸マグネシウム ３〜１００ｍＭ ＮＡＤＨ ０．３〜１．５ｍＭ マレートデヒドロゲナーゼ ５〜５０Ｕ／ｍｌ 組換えホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ ０．５〜１０Ｕ／ｍｌ

【００３８】また試料中のラクテートデヒドロゲナーゼ
とピルビン酸による妨害反応を抑えるために、ソジウム
オキザメートのようなラクテートデヒドロゲナーゼイン
ヒビターを約１〜２０ｍＭ程度添加することが望まし
い。

【００３９】上記試薬１．５〜３．０ｍｌと重炭酸イオ
ンを含む試料０．０１ｍｌを混合し、３７℃で５〜１０
分間反応させ、ＮＡＤＨ濃度に応じて、例えば３４０ｎ
ｍ、３６５ｎｍ、３８０ｎｍ等における吸光度の減少を
測定する。

【００４０】上記はエンド法の組成でるが、レート法で
は一般的に下記組成が好適である。 弱アルカリ性緩衝液 １０〜５０ｍＭ ホスホエノールピルビン酸塩 ２〜５ｍＭ マグネシウムイオン ３〜１００ｍＭ ＮＡＤＨ ０．１〜０．２ｍＭ マレートデヒドロゲナーゼ ５〜５０Ｕ／ｍｌ 組換えホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ ０．０５〜１Ｕ／ｍｌ さらに具体的な一例としては、下記組成を有する。 トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０） １０〜５０ｍＭ ホスホエノールピルビン酸カリウム塩 ２〜５ｍＭ 硫酸マグネシウム ３〜１００ｍＭ ＮＡＤＨ ０．１〜０．２ｍＭ マレートデヒドロゲナーゼ ５〜５０Ｕ／ｍｌ 組換えホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ ０．０５〜０．５Ｕ／ｍｌ またエンド法と同じ理由からソジウムオキザメートのよ
うなラクテートデヒドロゲナーゼインヒビターを約１〜
２０ｍＭ程度添加することが望ましい。

【００４１】

【発明の効果】本発明で使用する組換えホスホエノール
ピルビン酸カルボキシラーゼは、従来法で使用する酢酸
菌由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼに
比べて、比活性が高く、さらに弱アルカリ性における安
定性に優れる。したがって本発明では組換えホスホエノ
ールピルビン酸カルボキシラーゼを用いることにより、
液状で長期保存に耐える安定性のよい炭酸ガス測定試薬
が提供できる。従来の酢酸菌由来の酵素を使用すると、
後記比較例に見られるように炭酸ガス測定試薬で用いら
れる酵素濃度（約２．５Ｕ／ｍｌ）では、２５℃では７
０％以上の活性低下が見られる。一方、本発明の酵素を
用いると、２５℃で保存しても、ほぼ１００％に近い活
性を保っており、液状安定性の向上した測定試薬を提供
できる。

【００４２】以下、本発明を実施例により具体的に説明
する。 参考例１アセトバクター・ハンゼニイＩＦＯ１４８２０株からの
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの精製 ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ生産菌アセ
トバクター・ハンゼニイIFO 14820 を１０Ｌジャーファ
ーメンターで培養した。培地組成はポリペプトン０．５
％、酵母エキス０．５％、グルコース０．５％、硫酸マ
グネシウム０．５％を含む培地（ｐＨ７．０）１００ｍ
ｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに移し、１２１℃、１５
分間オートクレーブを行った。種菌としてアセトバクタ
ー・ハンゼニイIFO 14820 を１白金耳植菌し、３０℃、
４８時間培養し、種培養液とした。次に培地６Ｌを１０
Ｌ容ジャーファーメンターに移し１２１℃、１５分間オ
ートクレーブを行い、放令後種培養液を１００ｍｌを移
し、３００ｒｐｍ、通気２Ｌ／分、３０℃で４８時間培
養した。この時の培養液中のホスホエノールピルビン酸
カルボキシラーゼ活性は０．２Ｕ／ｍｌであった。

【００４３】培養液を遠心分離にて集菌し、５０ｍＭリ
ン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０に懸濁した。本液をフ
レンチプレスで処理し、遠心分離を行い、ホスホエノー
ルピルビン酸カルボキシラーゼ粗酵素画分を得た。得ら
れた粗酵素画分は硫安分画後、セファデックス G-25
（ファルマシアLKB)ゲル濾過にて脱塩した後、ＤＥＡＥ
セファロースCL-6B （ファルマシアLKB ）、ハイドロキ
シルアパタイト（生化学工業株式会社）、セファデック
ス G-200ゲル濾過（ファルマシアLKB ）、MonoP HR5/5
クロマトフォーカシング（ファルマシアLKB ）の４種の
クロマトグラフィーを行った。このホスホエノールピル
ビン酸カルボキシラーゼ標品は、SDS-PAGE電気泳動で均
一なバンドを示すまで精製されていた。この時のホスホ
エノールピルビン酸カルボキシラーゼの比活性は８４Ｕ
／ｍｇ蛋白であった。下記表１にこれまでの精製のまと
めを示す。また表２に上記方法により得られたホスホエ
ノールピルビン酸カルボキシラーゼの理化学的性質を示
す。

【００４４】

【表１】

【００４５】

【表２】

【００４６】参考例２染色体ＤＮＡの分離 アセトバクター・ハンゼニイ IFO 14820の染色体ＤＮＡ
は、以下の方法で分離した。同菌株を１５０ｍｌの普通
ブイヨン培地、ｐＨ５．０で３０℃、４８時間振盪培養
後、遠心分離（８０００ｒｐｍ、１０分間）により集菌
した。１０％シュークロース、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ８．０、５０ｍＭ ＥＤＴＡを含んだ溶液５
ｍｌに懸濁し、１ｍｌのリゾチーム溶液（１０ｍｇ／ｍ
ｌ）を加えて３７℃、１５分間保温し、次いで１０％Ｓ
ＤＳ溶液を加えた。この溶液に等量のクロロホルム・フ
ェノール（１：１）を加え、撹拌混合し、１０，０００
ｒｐｍ、３分間の遠心分離で水層と溶媒層に分離し、水
層を分取した。この水層に２倍量のエタノールを静かに
重層し、ガラス棒でゆっくり撹拌しながらＤＮＡをガラ
ス棒に巻き付かせて分離した。これを１ｍＭ ＥＤＴＡ
を含んだ１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０（以
下ＴＥと略記）で溶解した。これを等量のクロロホルム
・フェノール溶液で処理後、遠心分離により水層を分取
し、２倍量のエタノールを加えて、上記の方法により再
度ＤＮＡを分離し、２ｍｌのＴＥで溶解した。エシェリ
ヒア・コリーＪＭ１０９のコンピテントセルは Hanahan
の方法により作成し、ライブラリー作成の宿主とした。

【００４７】ホスホエノールピルビン酸カルボキシラー
ゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片を有する組
換えベクターの調製 上記方法で得たＤＮＡ２０μｇを制限酵素Ｓａｕ３ＡII
I （東洋紡製）で部分分解した後、シュークロース密度
勾配遠心法にて３〜１０ｋｂｐの断片を分離回収し、エ
タノール沈澱にて濃縮後、ＴＥにて１μｇ／μｌになる
ように再溶解した。このＤＮＡ断片１μｇを、ＳａｌII
I （東洋紡製）で切断したｐＵＣ１９０．５μｇと M.
G.Loftusらの Backfilling法 (Biotechniques Vol. 12,
No.2(1992)に従い、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（東洋紡製）
１ユニットで１６℃、１２時間反応させＤＮＡを連結し
た。連結したＤＮＡはエシェリヒア・コリーＪＭ１０９
のコンピテントセルを用いて形質転換した。使用したＤ
ＮＡ１μｇ当たり約１×１０⁵個の形質転換体のコロニ
ーが得られた。

【００４８】ホスホエノールピルビン酸カルボキシラー
ゼ遺伝子をコードするＤＮＡ断片を含有する形質転換体
のスクリーニング 上記方法で得た形質転換体よりホスホエノールピルビン
酸カルボキシラーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を含む
形質転換体のスクリーニングは、アセトバクター・ハン
ゼニイIFO 14820 由来のホスホエノールピルビン酸カル
ボキシラーゼに特異的な抗体を用いた酵素免疫テストに
より行った。アセトバクター・ハンゼニイIFO 14820 由
来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ抗体及
び抗体への酵素標識の調製は常法に従い、以下のように
行った。アセトバクター・ハンゼニイIFO 14820 由来ホ
スホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを免疫した兎
の血清１０ｍｌをプロテインA-セファロース CL-6B（フ
ァルマシアLKB ）にて精製を行い、ＩｇＧ画分を回収し
た。次いでこのＩｇＧ８ｍｇとペルオキダーゼ（東洋紡
製）５ｍｇを新ナカネ法によりＩｇＧ−ペルオキシダー
ゼコンジュゲートを作成し、TSK G3000SW （東洋曹達）
ゲル濾過により精製を行った。上記方法により得られた
ＩｇＧ−ペルオキダーゼコンジュゲートは０．１ｎｇの
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ蛋白質を検
出できる感度を有しており、更にエシェリヒア・コリー
由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼには
反応しなかった。上記方法により得たホスホエノールピ
ルビン酸カルボキシラーゼ抗体−ペルオキダーゼコンジ
ュゲートを用いたホスホエノールピルビン酸カルボキシ
ラーゼ遺伝子のスクリーニングの方法は以下の通りに行
った。

【００４９】上記方法で得た形質転換体のコロニーは、
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ抗体で被覆
したビニールシートにレプリカした後、３７℃で終夜培
養し再度コロニーを形成した後マスタープレートとして
保存した。一方、レプリカしたビニールシート上の菌体
はクロロホルム蒸気に約２０分間さらして溶菌した。溶
菌操作の後、０．１％ＢＳＡを含んだ１０ｍＭ ＰＢＳ
（２．３ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄, ７．７ｍＭ Ｎａ₂ ＨＰ
Ｏ₄ ・１２Ｈ₂ Ｏ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．
２）にて洗浄し菌体残渣を除去した。このビニールシー
トを０．１％のホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼ抗体−ペルオキダーゼコンジュゲートと０．１％の
ＢＳＡを含んだ１０ｍＭ ＰＢＳに室温で３時間浸漬し
た。次いで０．１％のＢＳＡと０．０５％のＴｗｅｅｎ
２０を含んだＰＢＳにて洗浄し、更に蒸留水にて洗浄を
行った後、風乾した。この風乾後のビニールシートをペ
ルオキシダーゼ用の発色基質を含んだゼラチンプレート
（３ｍｇ／ｍｌ 3,3'-5,5'- テトラメチルベンチジン、
１０ｍｇ／ｍｌジオクチル・ソジウム・サルフェート、
０．４ｇ／ｍｌゼラチン、５０％メタノール、５０ｍＭ
クエン酸緩衝液、ｐＨ５．０）上にのせ、緑色に発色
するスポットを検出した。この発色したスポットとマス
タープレート上のコロニーの位置とを照合し、一致する
コロニーをホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
遺伝子含んだ形質転換株として選択した。

【００５０】以上の方法により、形質転換株約２万株を
スクリーニングした結果、２個の抗体陽性株を取得し
た。この２株よりプラスミドを抽出し制限酵素地図を作
成した結果、共通した約２．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を確
認した。

【００５１】塩基配列の決定 上記方法で得られた組換えプラスミドの内、挿入ＤＮＡ
の小さかったプラスミドをｐＥＰＣ１１と命名し、その
挿入ＤＮＡ（約４．２ｋｂｐ）について塩基配列の決定
を行った。種々のサブクローン及びデリィーションミュ
ータントは常法に従い、Nonradioactive Sequencing ki
t （東洋紡製）を用いて決定した。決定した塩基配列及
びアミノ酸配列を配列表に示した。アミノ酸配列から求
められる蛋白質の分子量は約１０３，０００であり、ア
セトバクター・ハンゼニイ IFO 14820のホスホエノール
ピルビン酸カルボキシラーゼの分子量（約１００，００
０）と良く一致した。

【００５２】エシェリヒア・コリー形質転換体の作成 ｐＥＰＣ１１でエシェリヒア・コリーＪＭ１０９のコン
ピテントセルを形質転換後、形質転換体エシェリヒア・
コリーＪＭ１０９（ｐＥＰＣ１１）を得た。

【００５３】ホスホエノールピルビン酸カルボキシラー
ゼの製造 ＴＢ培地（１．２％バクトトリプトン、２．４％バクト
イーストエキストラクト、０．４％グリセロール、１７
ｍＭ ＫＨ₂ ＰＯ₄ 、７２ｍＭ Ｋ₂ ＨＰＯ₄）６Ｌを
１０Ｌ−ジャーファーメンターに分注し、１２１℃、１
５分間オートクレーブを行い放冷後、別途無菌濾過した
５０ｍｇ／ｍｌアンピシリン（ナカライテスク製）及び
１００ｍＭ イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラク
トシド（ＩＰＴＧ、日本精化製）をそれぞれ６ｍｌ添加
した。この培地にＬＢ培地（１％バクトトリプトン、
０．５％バクトイーストエキストラクト、１．０％Ｎａ
Ｃｌ，ｐＨ７．４）で予め３０℃、１６時間振盪培養し
たエシェリヒア・コリーＪＭ１０９（ｐＥＰＣ１１）の
培養液６０ｍｌを接種し、３０℃、２４時間通気撹拌培
養した。培養終了時の培養液のホスホエノールピルビン
酸カルボキシラーゼ活性は５．４Ｕ／ｍｌであった。培
養液６Ｌを遠心分離にて集菌し、３Ｌの２０ｍＭ リン
酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０に懸濁し、常法に従いフ
レンチプレスで破砕した後、８，０００ｒｐｍ２０分間
遠心分離してホスホエノールピルビン酸カルボキシラー
ゼ粗酵素液を得た。このようにして得た粗酵素液をポリ
エチレンイミンを用いて除核酸処理をした後、硫安沈澱
によりホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ画分
を回収した。次いでセファデックス G-25 （ファルマシ
アLKB ）ゲル濾過により脱塩を行った後、ＤＥＡＥセフ
ァロース CL-6B（ファルマシアLKB ）カラムクロマトグ
ラフィー、ブチル・トヨパール650Mカラムクロマトグラ
フィーを行い、硫安沈澱によって濃縮して精製ホスホエ
ノールピルビン酸カルボキシラーゼ標品を得た。このホ
スホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ精製標品は、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で単一のバンドを示し、活性
回収率は３３．２％であった。下記表３にこれまでの精
製のまとめを示す。また表４に上記方法により得られた
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの理化学的
性質を示す。

【００５４】

【表３】

【００５５】

【表４】

【００５６】上記表１と３を比較すれば、本発明のホス
ホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは野性株である
アセトバクター・ハンゼニイ IFO 14820の製造法に比べ
簡便な方法により高収率にホスホエノールピルビン酸カ
ルボキシラーゼを回収することができる。また上記表２
と表４を比較すれば、本発明のホスホエノールピルビン
酸カルボキシラーゼが野性株であるアセトバクター・ハ
ンゼニイIFO 14820 由来のホスホエノールピルビン酸カ
ルボキシラーゼより高純度であることが判る。

【００５７】実施例１エシェリヒア・コリーＪＭ１０９由来のホスホエノール
ピルビン酸カルボキシラーゼ標品を用いた炭酸ガス測定 参考例２で精製したエシェリヒア・コリーＪＭ１０９由
来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ標品を
用いて、下記炭酸ガス測定用試薬を作成した。 Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０ ５０ ｍＭ ＭｇＳＯ₄ １０ ｍＭ ホスホエノールピルビンカリウム塩 ３．２ ｍＭ ＮＡＤＨ ０．５ ｍＭ マレートデヒドロゲナーゼ ５０ Ｕ／ｍｌ ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ ３ Ｕ／ｍｌ 上記試薬３ｍｌと重炭酸イオン０〜２０ｍＭを含む試料
０．０５ｍｌを添加し、３７℃で５分間反応させ、３４
０ｎｍにおける５分間の吸光度の減少量を測定した（重
炭酸イオン濃度０ｍＭをブランクとして減じた）。試料
中の重炭酸濃度と５分間に吸光度減少量の関係を図１に
示した。重炭酸イオン濃度と吸光度変化の間には直線関
係が存在した。

【００５８】実施例２エシェリヒア・コリーＪＭ１０９由来のホスホエノール
ピルビン酸カルボキシラーゼ標品の炭酸ガス測定用試液
中の安定性 参考例１で精製したアセトバクター・ハンゼニイ IFO 1
4820由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
標品と参考例２で精製したエシェリヒア・コリーＪＭ１
０９由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
標品を用いて炭酸ガス測定用試液中の安定性を２５℃で
比較した。その結果を図２に示す。図２から明らかなよ
うに、本発明のホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼ標品は野性株であるアセトバクター・ハンゼニイ I
FO 14820由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼに比べ、２５℃での保存安定性が有意に向上してい
た。

【００５９】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ： 933 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：アセトバクター・ハンゼニイ（Acetobacter ha
nsenii） 株名：ＩＦＯ１４８２０ 配列 Met Ser Gln Ala Ser Ala Pro His Ala Thr Asp Met Leu Gln Gln Gln 1 5 10 15 Ala Arg Glu Leu Val Ala Ile Pro Ala Leu Ser Asp Asn Pro Val Met 20 25 30 Thr Leu Ala Arg Ser Ile Gly Gln Gln Ile Asp Arg Gly Ser Leu Ser 35 40 45 Thr Asp Ala Leu Glu Ala Trp Val Arg Arg Leu Arg Asp Ala Ala Phe 50 55 60 Ala Arg Arg Ala Cys His Ile Ala Ala Tyr Val Gly Gly Val Asp Asp 65 70 75 80 Ala Val Ile Asp Gln Arg Met Arg Asp Val Ala Arg Arg Ile Met Gln 85 90 95 Pro Asp Pro Asn Asp Ser Pro Val Pro Ile Ala Arg Phe Arg Ala Ala 100 105 110 Thr Glu Arg Ser Arg Phe Ala Ala Val Phe Thr Ala His Pro Thr Phe 115 120 125 Ala Leu Ala Ser Pro Val Tyr Asp Cys Leu Ala Asp Met Ala Thr Gln 130 135 140 Asn Pro Gln Gln Pro Pro Thr Asp Val Pro Ala Phe Ile Thr His Arg 145 150 155 160 Arg Ala Ala Pro Pro Thr Leu Asp Glu Glu Phe Thr Leu Ala Thr Gln 165 170 175 Ala Ile Leu Arg Gly Arg Asn Ala Leu Asp Arg Leu Thr Arg Val Leu 180 185 190 Leu Thr Glu Ala Arg Ala His Trp Pro Gln Leu Trp Ala Thr Leu Ala 195 200 205 Pro Arg Pro Ile Ile Met Thr Ser Trp Val Gly Tyr Asp Thr Asp Gly 210 215 220 Arg Thr Asp Ile Gly Trp Trp Asp Thr Leu Arg Leu Arg Val Arg Met 225 230 235 240 Lys His Met Gln Leu Thr Arg Leu Asn Ala Gln Ile Gly Pro Val Ala 245 250 255 Ser Val Pro Asn Asp Leu His Glu Arg Val Asn Arg Ala Ile Gln Ala 260 265 270 Val Glu Ala Gln Ile Ala Ala Cys Pro Gly Ser Ala Asp Pro Gln Ala 275 280 285 Val Ala Asp Phe Ala Ala Val Leu Ile Gly Arg Arg Glu Glu Ala Met 290 295 300 Thr Ser Ser Asn Asp Leu Ala Pro Thr Phe Ala Glu Ala Ile Asp Ala 305 310 315 320 Ala Thr Leu Asp Asp Lys Met Thr Leu Ala Val Ala Arg Ala Gly Phe 325 330 335 Met Ala His Gly Leu Ser Ala Ala His Thr His Val Arg Leu Asn Ser 340 345 350 Thr Gln Leu His Asn Val Ala Arg Gln Arg Leu Gly Ile Thr Asp Asn 355 360 365 Pro Asp Ile His Ala Gln Arg Arg Ala Arg Ile Ala Arg Ile Asp Glu 370 375 380 Ala Leu Asp Thr Thr Gln Pro Ile Asp Ile Asp Phe Gly Ser Leu Leu 385 390 395 400 Val Glu Gln Ser Thr Ala Gly Arg Leu Met Met Thr Val Arg Gln Ile 405 410 415 Leu His His Ile Asp Arg Thr Thr Pro Ile Arg Phe Leu Ile Ala Glu 420 425 430 Thr Glu Thr Gly Tyr Thr Leu Leu Thr Ala Leu Trp Leu Ala Arg Leu 435 440 445 Leu Gly Val Glu Asp Met Ile Glu Ile Ser Pro Leu Phe Glu Thr Gln 450 455 460 Asp Ala Leu Glu Gln Gly Glu His Leu Ile Glu Glu Ala Leu His Ser 465 470 475 480 Pro His Trp Arg Ala Tyr Leu His Arg Thr Arg Lys Leu Ser Leu Gln 485 490 495 Phe Gly Phe Ser Asp Ser Gly Arg Tyr Val Gly Gln Leu Ala Ala Thr 500 505 510 Tyr Leu Ile Glu Arg Leu Arg Leu Lys Val Cys Asp Leu Leu Arg Gln 515 520 525 Trp Asp Leu Ala Phe Val Glu Val Ile Leu Phe Asp Thr His Gly Glu 530 535 540 Ser Ile Gly Arg Gly Ala His Pro Tyr Ser Leu Ala Glu Arg Phe Asp 545 550 555 560 Tyr Leu Ser Pro Pro His Ala Arg Met Arg Phe Leu Gln Ala Gly Ile 565 570 575 Arg Leu Arg Glu Glu Thr Ala Phe Gln Gly Gly Asp Gly Tyr Leu Leu 580 585 590 Phe Gly Thr Gln Pro Leu Ala Asp Ala Thr Val Ser Val Ile Ala Glu 595 600 605 His Ala Phe Ala Thr Thr Ser Ile Asp Glu Asp Pro Val Tyr Asp Glu 610 615 620 Pro Asp Phe Ser Ala Asp Phe Phe Ser Ala Ile Ala Arg Gly Met Thr 625 630 635 640 Gly Leu Val Glu Asp Pro Gly Tyr Ala Ala Leu Leu Gly Ala Phe Gly 645 650 655 Pro Ser Leu Ile Asp Lys Thr Gly Ser Arg Pro Ser Ala Arg Gln Ser 660 665 670 Asp Thr Ala Ala Ile Thr Thr Arg Ile Arg His Pro Ser Gln Leu Arg 675 680 685 Ala Ile Pro Asn Asn Ala Ile Leu Gln Gln Leu Gly Trp Cys Ala Asn 690 695 700 Thr Leu Gln Gly Leu Gly Thr Ala Ala Ala Arg His Pro Asp Thr Phe 705 710 715 720 Glu Arg Tyr Leu Asn Asp Ser Pro Arg Phe Arg Arg Ala Leu Asp Phe 725 730 735 Ala Ala His Gly Leu Ala His Ser Ser Asp Gly Val Leu Arg Gly Val 740 745 750 Ile Arg Leu Leu Asp Pro Asp Met Trp Leu Gln Arg Ala Thr Ala His 755 760 765 His Asp Pro Lys Arg Gln Asp Ala Cys Leu Thr Leu Met His Gly Leu 770 775 780 Glu Arg Leu Asp Phe Trp Ala Cys Thr Gln Ser Met Phe Arg Arg Leu 785 790 795 800 805 810 815 Met Glu Ala Asp Glu Met Leu Leu His Ala Ile Arg Ile Ala Ile Ile 820 825 830 Glu Gln Ile Trp Met Leu Ser Thr Arg Ile Pro Tyr Phe Ala Pro Arg 835 840 845 Asn Ala Phe Thr Arg Asp Val Leu Thr Ala Lys Val Leu Cys Leu Glu 850 855 860 Ile Pro Asp Val Leu Lys Glu Leu Glu His Ile Phe Pro Tyr His Ala 865 870 875 880 Asp Arg Ser Phe Asp Leu Asp Phe His Glu Pro His Gly Pro Arg Asp 885 890 895 Glu Gly Thr Tyr Met Arg Glu Tyr Thr Glu Ile Phe Glu Pro Met Gln 900 905 910 Arg Leu Phe Thr Leu Val Arg Glu Ile Ser Thr Gly Val Met His His 915 920 925 Val Gly Ala Phe Gly 930 933

【００６０】配列番号：２ 配列の長さ：2802 配列の型：核酸（ＤＮＡ） 鎖の数：ニ本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ 起源 生物名：アセトバクター・ハンゼニイ（Acetobacter ha
nsenii） 株名：ＩＦＯ１４８２０ 配列 ATG TCC CAG GCC TCT GCC CCT CAT GCA ACA GAC ATG CTG CAG CAG CAG 48 Met Ser Gln Ala Ser Ala Pro His Ala Thr Asp Met Leu Gln Gln Gln 1 5 10 15 GCC CGC GAA CTT GTG GCG ATC CCT GCC CTT TCC GAC AAC CCG GTC ATG 96 Ala Arg Glu Leu Val Ala Ile Pro Ala Leu Ser Asp Asn Pro Val Met 20 25 30 ACG CTG GCA CGC AGC ATC GGA CAG CAG ATC GAC CGG GGC AGC CTG TCG 144 Thr Leu Ala Arg Ser Ile Gly Gln Gln Ile Asp Arg Gly Ser Leu Ser 35 40 45 ACC GAC GCG CTG GAG GCC TGG GTC CGC CGC CTG CGC GAC GCC GCG TTC 192 Thr Asp Ala Leu Glu Ala Trp Val Arg Arg Leu Arg Asp Ala Ala Phe 50 55 60 GCC CGC CGC GCC TGC CAT ATC GCC GCG TAT GTC GGG GGG GTG GAT GAT 240 Ala Arg Arg Ala Cys His Ile Ala Ala Tyr Val Gly Gly Val Asp Asp 65 70 75 80 GCC GTC ATC GAC CAG CGC ATG CGT GAC GTG GCG CGC CGC ATC ATG CAG 288 Ala Val Ile Asp Gln Arg Met Arg Asp Val Ala Arg Arg Ile Met Gln 85 90 95 CCC GAC CCA AAT GAC AGC CCG GTG CCC ATC GCC CGG TTC CGC GCC GCG 336 Pro Asp Pro Asn Asp Ser Pro Val Pro Ile Ala Arg Phe Arg Ala Ala 100 105 110 ACC GAA CGC AGC CGC TTT GCC GCC GTG TTC ACC GCG CAT CCC ACG TTT 384 Thr Glu Arg Ser Arg Phe Ala Ala Val Phe Thr Ala His Pro Thr Phe 115 120 125 GCG CTG GCC AGC CCC GTC TAT GAC TGC CTT GCC GAC ATG GCG ACG CAA 432 Ala Leu Ala Ser Pro Val Tyr Asp Cys Leu Ala Asp Met Ala Thr Gln 130 135 140 AAC CCG CAG CAG CCC CCG ACC GAT GTC CCG GCA TTC ATA ACG CAT CGC 480 Asn Pro Gln Gln Pro Pro Thr Asp Val Pro Ala Phe Ile Thr His Arg 145 150 155 160 CGC GCC GCG CCG CCG ACG CTG GAT GAG GAA TTC ACG CTG GCG ACG CAG 528 Arg Ala Ala Pro Pro Thr Leu Asp Glu Glu Phe Thr Leu Ala Thr Gln 165 170 175 GCG ATC CTG CGC GGG CGC AAT GCA CTC GAT CGC CTG ACG CGG GTT CTC 576 Ala Ile Leu Arg Gly Arg Asn Ala Leu Asp Arg Leu Thr Arg Val Leu 180 185 190 CTG ACC GAG GCA CGG GCA CAC TGG CCG CAA CTG TGG GCC ACG CTG GCG 624 Leu Thr Glu Ala Arg Ala His Trp Pro Gln Leu Trp Ala Thr Leu Ala 195 200 205 CCG CGT CCC ATT ATC ATG ACA AGC TGG GTC GGA TAC GAC ACG GAC GGA 672 Pro Arg Pro Ile Ile Met Thr Ser Trp Val Gly Tyr Asp Thr Asp Gly 210 215 220 CGC ACC GAT ATC GGG TGG TGG GAC ACG CTG CGG CTG CGC GTG CGC ATG 720 Arg Thr Asp Ile Gly Trp Trp Asp Thr Leu Arg Leu Arg Val Arg Met 225 230 235 240 AAG CAC ATG CAG TTA ACC CGC CTG AAT GCA CAG ATT GGC CCC GTC GCC 768 Lys His Met Gln Leu Thr Arg Leu Asn Ala Gln Ile Gly Pro Val Ala 245 250 255 TCC GTC CCC AAT GAC CTG CAC GAA CGC GTC AAT CGC GCC ATA CAG GCG 816 Ser Val Pro Asn Asp Leu His Glu Arg Val Asn Arg Ala Ile Gln Ala 260 265 270 GTG GAG GCA CAG ATC GCC GCA TGC CCC GGC AGT GCC GAC CCG CAG GCG 864 Val Glu Ala Gln Ile Ala Ala Cys Pro Gly Ser Ala Asp Pro Gln Ala 275 280 285 GTG GCC GAT TTT GCC GCG GTC CTG ATC GGT CGC CGC GAA GAG GCC ATG 912 Val Ala Asp Phe Ala Ala Val Leu Ile Gly Arg Arg Glu Glu Ala Met 290 295 300 ACC AGC AGC AAC GAC CTC GCC CCC ACT TTT GCC GAA GCC ATT GAT GCC 960 Thr Ser Ser Asn Asp Leu Ala Pro Thr Phe Ala Glu Ala Ile Asp Ala 305 310 315 320 GCG ACG CTG GAC GAC AAG ATG ACG CTG GCG GTC GCA CGC GCG GGT TTC 1008 Ala Thr Leu Asp Asp Lys Met Thr Leu Ala Val Ala Arg Ala Gly Phe 325 330 335 ATG GCC CAT GGC CTG TCG GCG GCG CAT ACG CAT GTA CGC CTC AAT TCC 1056 Met Ala His Gly Leu Ser Ala Ala His Thr His Val Arg Leu Asn Ser 340 345 350 ACG CAA TTA CAC AAT GTC GCC CGC CAG CGC CTG GGC ATT ACC GAC AAT 1104 Thr Gln Leu His Asn Val Ala Arg Gln Arg Leu Gly Ile Thr Asp Asn 355 360 365 CCC GAT ATC CAT GCC CAG CGT CGC GCC CGG ATC GCA CGC ATT GAC GAG 1152 Pro Asp Ile His Ala Gln Arg Arg Ala Arg Ile Ala Arg Ile Asp Glu 370 375 380 GCG CTG GAT ACA ACG CAG CCA ATC GAC ATT GAT TTC GGC TCC CTG CTG 1200 Ala Leu Asp Thr Thr Gln Pro Ile Asp Ile Asp Phe Gly Ser Leu Leu 385 390 395 400 GTG GAA CAG TCA ACG GCG GGG CGG CTG ATG ATG ACG GTG CGC CAG ATC 1248 Val Glu Gln Ser Thr Ala Gly Arg Leu Met Met Thr Val Arg Gln Ile 405 410 415 CTG CAC CAT ATC GAC CGC ACC ACG CCC ATC CGT TTC CTG ATC GCG GAA 1296 Leu His His Ile Asp Arg Thr Thr Pro Ile Arg Phe Leu Ile Ala Glu 420 425 430 ACG GAA ACC GGC TAT ACG CTG CTG ACG GCA CTG TGG CTT GCG CGC CTG 1344 Thr Glu Thr Gly Tyr Thr Leu Leu Thr Ala Leu Trp Leu Ala Arg Leu 435 440 445 CTG GGC GTG GAA GAC ATG ATC GAA ATC TCC CCC CTG TTT GAA ACG CAG 1392 Leu Gly Val Glu Asp Met Ile Glu Ile Ser Pro Leu Phe Glu Thr Gln 450 455 460 GAC GCG CTG GAA CAG GGG GAA CAC CTG ATC GAA GAA GCG CTG CAT TCA 1440 Asp Ala Leu Glu Gln Gly Glu His Leu Ile Glu Glu Ala Leu His Ser 465 470 475 480 CCG CAC TGG CGC GCC TAC CTG CAT CGT ACG CGC AAG CTG AGC CTG CAA 1488 Pro His Trp Arg Ala Tyr Leu His Arg Thr Arg Lys Leu Ser Leu Gln 485 490 495 TTC GGT TTT TCG GAT TCG GGA CGT TAT GTG GGA CAG CTT GCC GCG ACC 1536 Phe Gly Phe Ser Asp Ser Gly Arg Tyr Val Gly Gln Leu Ala Ala Thr 500 505 510 TAC CTG ATC GAA CGG CTG CGG CTG AAG GTC TGC GAC CTT CTG CGG CAA 1584 Tyr Leu Ile Glu Arg Leu Arg Leu Lys Val Cys Asp Leu Leu Arg Gln 515 520 525 TGG GAC CTC GCC TTC GTG GAA GTC ATC CTG TTC GAC ACC CAT GGG GAA 1632 Trp Asp Leu Ala Phe Val Glu Val Ile Leu Phe Asp Thr His Gly Glu 530 535 540 AGC ATC GGC CGC GGG GCA CAT CCC TAC AGC CTT GCC GAA CGT TTC GAC 1680 Ser Ile Gly Arg Gly Ala His Pro Tyr Ser Leu Ala Glu Arg Phe Asp 545 550 555 560 TAT CTC TCC CCC CCG CAT GCG CGC ATG CGT TTC CTG CAG GCA GGC ATT 1728 Tyr Leu Ser Pro Pro His Ala Arg Met Arg Phe Leu Gln Ala Gly Ile 565 570 575 CGC CTG CGC GAG GAA ACG GCC TTT CAG GGG GGG GAT GGC TAC CTC CTG 1776 Arg Leu Arg Glu Glu Thr Ala Phe Gln Gly Gly Asp Gly Tyr Leu Leu 580 585 590 TTC GGG ACG CAG CCC CTT GCG GAT GCA ACT GTC AGC GTG ATC GCG GAA 1824 Phe Gly Thr Gln Pro Leu Ala Asp Ala Thr Val Ser Val Ile Ala Glu 595 600 605 CAC GCC TTT GCC ACG ACC TCC ATC GAC GAA GAC CCG GTT TAC GAC GAA 1872 His Ala Phe Ala Thr Thr Ser Ile Asp Glu Asp Pro Val Tyr Asp Glu 610 615 620 CCC GAT TTC TCT GCC GAT TTC TTT TCC GCC ATC GCG CGC GGC ATG ACA 1920 Pro Asp Phe Ser Ala Asp Phe Phe Ser Ala Ile Ala Arg Gly Met Thr 625 630 635 640 GGA CTG GTG GAG GAT CCA GGC TAT GCC GCG CTG CTG GGT GCG TTC GGG 1968 Gly Leu Val Glu Asp Pro Gly Tyr Ala Ala Leu Leu Gly Ala Phe Gly 645 650 655 CCG TCA CTA ATC GAC AAG ACG GGT TCA CGC CCC TCC GCC CGG CAG AGC 2016 Pro Ser Leu Ile Asp Lys Thr Gly Ser Arg Pro Ser Ala Arg Gln Ser 660 665 670 GAT ACG GCC GCC ATC ACC ACG CGC ATC CGC CAT CCC AGC CAG TTG CGC 2064 Asp Thr Ala Ala Ile Thr Thr Arg Ile Arg His Pro Ser Gln Leu Arg 675 680 685 GCC ATC CCC AAC AAC GCC ATC CTC CAG CAG CTT GGC TGG TGC GCC AAT 2112 Ala Ile Pro Asn Asn Ala Ile Leu Gln Gln Leu Gly Trp Cys Ala Asn 690 695 700 ACG TTG CAG GGG CTG GGC ACG GCG GCC GCG CGT CAT CCC GAT ACG TTC 2160 Thr Leu Gln Gly Leu Gly Thr Ala Ala Ala Arg His Pro Asp Thr Phe 705 710 715 720 GAG CGT TAC CTG AAC GAC AGC CCG CGT TTT CGC CGT GCG CTG GAT TTC 2208 Glu Arg Tyr Leu Asn Asp Ser Pro Arg Phe Arg Arg Ala Leu Asp Phe 725 730 735 GCC GCC CAT GGC CTG GCC CAT TCC AGC GAC GGC GTC CTG CGT GGT GTG 2256 Ala Ala His Gly Leu Ala His Ser Ser Asp Gly Val Leu Arg Gly Val 740 745 750 ATC CGG CTG CTG GAC CCG GAC ATG TGG TTG CAA CGC GCA ACG GCG CAT 2304 Ile Arg Leu Leu Asp Pro Asp Met Trp Leu Gln Arg Ala Thr Ala His 755 760 765 CAC GAC CCG AAA CGG CAG GAT GCG TGC CTG ACG CTG ATG CAC GGG CTG 2352 His Asp Pro Lys Arg Gln Asp Ala Cys Leu Thr Leu Met His Gly Leu 770 775 780 GAA CGG CTG GAT TTC TGG GCC TGT ACG CAA TCC ATG TTC CGC CGC CTG 2400 Glu Arg Leu Asp Phe Trp Ala Cys Thr Gln Ser Met Phe Arg Arg Leu 785 790 795 800 CAA TCG GAC CAT CTG GCG TTA CGC AAC GCA TGG CCC AGC GCA CCA CGG 2448 Gln Ser Asp His Leu Ala Leu Arg Asn Ala Trp Pro Ser Ala Pro Arg 805 810 815 ATG GAG GCG GAT GAA ATG CTG CTG CAT GCC ATC CGC ATC GCC ATC ATT 2496 Met Glu Ala Asp Glu Met Leu Leu His Ala Ile Arg Ile Ala Ile Ile 820 825 830 GAA CAG ATA TGG ATG CTG TCC ACC CGG ATC CCG TAT TTT GCG CCG CGC 2544 Glu Gln Ile Trp Met Leu Ser Thr Arg Ile Pro Tyr Phe Ala Pro Arg 835 840 845 AAT GCG TTC ACC CGC GAC GTG CTG ACG GCG AAG GTC CTG TGC CTG GAA 2592 Asn Ala Phe Thr Arg Asp Val Leu Thr Ala Lys Val Leu Cys Leu Glu 850 855 860 ATC CCC GAT GTG CTG AAG GAG CTG GAG CAT ATC TTC CCC TAT CAC GCG 2640 Ile Pro Asp Val Leu Lys Glu Leu Glu His Ile Phe Pro Tyr His Ala 865 870 875 880 GAC CGC AGC TTC GAC CTG GAT TTC CAT GAA CCG CAC GGG CCC CGC GAT 2688 Asp Arg Ser Phe Asp Leu Asp Phe His Glu Pro His Gly Pro Arg Asp 885 890 895 GAA GGG ACG TAT ATG CGC GAA TAC ACG GAA ATT TTC GAA CCG ATG CAA 2736 Glu Gly Thr Tyr Met Arg Glu Tyr Thr Glu Ile Phe Glu Pro Met Gln 900 905 910 CGG CTG TTC ACA CTG GTG CGC GAA ATC AGC ACC GGC GTG ATG CAC CAT 2784 Arg Leu Phe Thr Leu Val Arg Glu Ile Ser Thr Gly Val Met His His 915 920 925 GTC GGG GCC TTT GGC TGA 2802 Val Gly Ala Phe Gly *** 930 933

【図面の簡単な説明】

【図１】重炭酸イオン濃度と吸光度変化の関係を示す。

【図２】炭酸ガス測定用試液中の安定性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/527 6807−4Ｂ // Ｇ０１Ｎ 33/49 Ｗ (Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:02） Ｃ１２Ｒ 1:02） (72)発明者 山本 和巳 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績株 式会社敦賀バイオ研究所内 (72)発明者 川村 良久 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績株 式会社敦賀バイオ研究所内

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 試料中の重炭酸イオンにホスホエノール
   ピルビン酸塩の存在下、組換えホスホエノールピルビン
   酸カルボキシラーゼを反応させ、生成したオキザロ酢酸
   にＮＡＤＨの存在下にマレートデヒドロゲナーゼを作用
   させ、減少するＮＡＤＨを測定することにより試料中の
   炭酸ガスを測定することを特徴とする炭酸ガス測定方
   法。
2. 【請求項２】 組換えホスホエノールピルビン酸カルボ
   キシラーゼがアセトバクター属に属する細菌由来のホス
   ホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺
   伝子を有する組換えべクターにより形質転換された形質
   転換体を培養し、培養物から採取された酵素である請求
   項１記載の炭酸ガス測定方法。
3. 【請求項３】 アセトバクター属に属する細菌が、アセ
   トバクター・ハンゼニイである請求項２記載の炭酸ガス
   測定方法。
4. 【請求項４】 アセトバクター属に属する細菌が、アセ
   トバクター・ハンゼニイIFO 14820 である請求項２記載
   の炭酸ガス測定方法。
5. 【請求項５】 組換えホスホエノールピルビン酸カルボ
   キシラーゼが配列表・配列番号１に記載するアミノ酸配
   列を有する酵素である請求項１記載の炭酸ガス測定方
   法。
6. 【請求項６】 組換えホスホエノールピルビン酸カルボ
   キシラーゼが下記理化学的性質を有する酵素である請求
   項１記載の炭酸ガス測定方法。 （１） 次の反応を触媒する。 ホスホエノールピルビン酸 ＋ ＨＣＯ₃ ^- → オキザ
   ロ酢酸 ＋ ＨＰＯ₄ ^2- （２） 至適ｐＨ：７．５〜８．０ （３） ｐＨ安定性：ｐＨ５．０〜８．０（２５℃、２
   ４時間） ｐＨ７．５〜８．５（１０ｍＭ ＭｇＳＯ₄ を含むトリ
   ス緩衝液中で２５℃、２４時間処理） （４） 至適作用温度：６０℃ （５） 熱安定性：４５℃まで安定（ｐＨ７．０、１５
   分間処理） （６） 分子量：３９０，０００±１０，０００（ゲル
   濾過法） １００，０００±５，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） （７） アセチルＣｏＡで活性化されない。 （８） 比活性：少なくとも１１０Ｕ／ｍｇ蛋白
7. 【請求項７】 ｐＨ８．０〜８．５の緩衝液中で反応を
   行う請求項１記載の炭酸ガス測定方法。
8. 【請求項８】 反応系中にさらにマグネシウムが存在す
   る請求項１記載の炭酸ガス測定方法。
9. 【請求項９】 反応液の吸光度変化によりＮＡＤＨの減
   少量を測定する請求項１記載の炭酸ガス測定方法。
10. 【請求項１０】 ホスホエノールピルビン酸塩、組換え
    ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、マレート
    デヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＨおよび緩衝液を含有するこ
    とを特徴とする炭酸ガス測定試薬。
11. 【請求項１１】 組換えホスホエノールピルビン酸カル
    ボキシラーゼがアセトバクター属に属する細菌由来のホ
    スホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする
    遺伝子を有する組換えべクターにより形質転換された形
    質転換体を培養し、培養物から採取された酵素である請
    求項１２記載の炭酸ガス測定方法。
12. 【請求項１２】 アセトバクター属に属する細菌が、ア
    セトバクター・ハンゼニイである請求項１３記載の炭酸
    ガス測定方法。
13. 【請求項１３】 アセトバクター属に属する細菌が、ア
    セトバクター・ハンゼニイIFO 14820 である請求項１３
    記載の炭酸ガス測定方法。
14. 【請求項１４】 組換えホスホエノールピルビン酸カル
    ボキシラーゼが配列表・配列番号１に記載するアミノ酸
    配列を有する酵素である請求項１２記載の炭酸ガス測定
    方法。
15. 【請求項１５】 組換えホスホエノールピルビン酸カル
    ボキシラーゼが下記理化学的性質を有する酵素である請
    求項１２記載の炭酸ガス測定試薬。 （１） 次の反応を触媒する。 ホスホエノールピルビン酸 ＋ ＨＣＯ₃ ^- → オキザ
    ロ酢酸 ＋ ＨＰＯ₄ ^2- （２） 至適ｐＨ：７．５〜８．０ （３） ｐＨ安定性：ｐＨ５．０〜８．０（２５℃、２
    ４時間） ｐＨ７．５〜８．５（１０ｍＭ ＭｇＳＯ₄ を含むトリ
    ス緩衝液中で２５℃、２４時間処理） （４） 至適作用温度：６０℃ （５） 熱安定性：４５℃まで安定（ｐＨ７．０、１５
    分間処理） （６） 分子量：３９０，０００±１０，０００（ゲル
    濾過法） １００，０００±５，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） （７） アセチルＣｏＡで活性化されない。 （８） 比活性：少なくとも１１０Ｕ／ｍｇ蛋白
16. 【請求項１６】 緩衝液がｐＨ８．０〜８．５である請
    求項１２記載の炭酸ガス測定試薬。
17. 【請求項１７】 さらにマグネシウムを含有する請求項
    １２記載の炭酸ガス測定試薬。
18. 【請求項１８】 弱アルカリ性緩衝液１０〜５０ｍＭ、
    ホスホエノールピルビン酸塩２〜５ｍＭ、マグネシウム
    イオン３〜１００ｍＭ、ＮＡＤＨ０．３〜１．５ｍＭ、
    マレートデヒドロゲナーゼ５〜５０Ｕ／ｍｌおよび組換
    えホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ０．５〜
    １０Ｕ／ｍｌを含有する請求項１２記載の炭酸ガス測定
    試薬。
19. 【請求項１９】 弱アルカリ性緩衝液１０〜５０ｍＭ、
    ホスホエノールピルビン酸塩２〜５ｍＭ、マグネシウム
    イオン３〜１００ｍＭ、ＮＡＤＨ０．１〜０．２ｍＭ、
    マレートデヒドロゲナーゼ５〜５０Ｕ／ｍｌおよび組換
    えホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ０．５〜
    １０Ｕ／ｍｌを含有する請求項１２記載の炭酸ガス測定
    試薬。