JP3510284B2

JP3510284B2 - オキシダーゼの製造法

Info

Publication number: JP3510284B2
Application number: JP03642493A
Authority: JP
Inventors: 智中川; 修一石野; 貞夫手柴
Original assignee: 協和醗酵工業株式会社
Priority date: 1993-02-25
Filing date: 1993-02-25
Publication date: 2004-03-22
Anticipated expiration: 2019-03-22
Also published as: JPH06245762A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はオキシダーゼ、特にカタ
ラーゼ活性を有しないオキシダーゼを製造する方法に関
する。オキシダーゼは基質を酸化して、過酸化水素を生
成させる酵素であり、この生成させた過酸化水素を測定
することによる該基質の測定や染毛用キット等に使用さ
れる。

【０００２】

【従来の技術】オキシダーゼを遺伝子組換えにより得る
方法としては、オキシダーゼを生産する微生物から該酵
素をコードするＤＮＡを単離し、そのＤＮＡを含む組換
えＤＮＡを該微生物あるいは他の微生物に導入し（形質
転換という）、その形質転換微生物を増殖、培養し、大
量に目的のオキシダーゼを生産する方法が知られてお
り、このようなオキシダーゼとして、例えば、コレステ
ロールオキシダーゼ（特開平４−218367号公報）、尿酸
オキシダーゼ（特表平４−501807号公報）などがあげら
れる。

【０００３】従来得られているオキシダーゼはカタラー
ゼ活性を除去するために、通常、物理化学的にカタラー
ゼを失活させるか、硫安分画、イオン交換、ゲル濾過、
ヒドロキシアパタイトなどのカラムクロマトグラフィー
法など通常蛋白質、酵素の精製に使用される方法が用い
られている。また、カタラーゼ遺伝子の発現が欠損して
いる微生物は知られているが〔Environmental and Mole
cular Mutagenesis, 15 , p.184(1990)〕、該微生物を
用いてオキシダーゼを製造することは知られていない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】オキシダーゼはその反
応において酸素を受容体として過酸化水素を生成する。
しかし、該オキシダーゼ中にカタラーゼ活性が夾雑する
と、生成した過酸化水素を分解してしまうため、過酸化
水素を指標とした活性測定法ではオキシダーゼ活性は実
際より低い値となる。また、生成する過酸化水素を利用
して他の反応を行わせる目的で、オキシダーゼを利用す
る場合も、利用するオキシダーゼ中に過酸化水素を分解
するカタラーゼ活性が存在しないことが望ましい。

【０００５】本発明の目的は、カタラーゼ活性を失活ま
たは除去する煩雑な操作を必要とせず、カタラーゼ活性
の存在しないオキシダーゼを収率よく製造することであ
る。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、オキシ
ダーゼをコードするＤＮＡ配列を含む組換え体ＤＮＡに
よって形質転換され、カタラーゼ遺伝子の発現が欠損し
ている微生物を培地に培養することによりオキシダーゼ
を収率よく製造することができる。より具体的には、本
発明は、染色体上のＫａｔＧ遺伝子およびＫａｔＥ遺伝
子がＫａｔＧ：：ＧＡＴ遺伝子およびＫａｔＥ：：ＫＡ
Ｍ遺伝子で置換されることによりカタラーゼ遺伝子の発
現が欠損したエッシェリヒア属に属する微生物をオキシ
ダーゼをコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡによっ
て形質転換し、得られる形質転換体を培地に培養し、培
養物中にオキシダーゼを生成蓄積させ、該培養物からオ
キシダーゼを採取することを特徴とするオキシダーゼの
製造法に関する。

【０００７】オキシダーゼとしては、ウリカーゼ、乳酸
オキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、キサンチンオ
キシダーゼ、コレステロールオキシダーゼなどがあげら
れる。形質転換に用いられる微生物としては、従来知ら
れている宿主ベクター系の宿主であれば、いずれの微生
物でもよい。

【０００８】以下、本菌株の取得方法を説明する。カタ
ラーゼは、大腸菌においては２種類存在することが報告
されており、それぞれＨＰＩとＨＰIIと称され、ＨＰＩ
はＫａｔＧ遺伝子に、ＨＰIIはＫａｔＥ遺伝子にそれぞ
れコードされていることが明らかとなっている〔J. of
Bacteriology, 170 p.4415(1988), ibid, 173 p.514(19
91)〕。

【０００９】大腸菌のカタラーゼ活性を欠損させるため
に以下の方法により両者の活性を除去する。

【００１０】（1) ＫａｔＧ遺伝子の取得大腸菌Ｗ３１１０株から染色体ＤＮＡをザ・イーエムビ
ーオー・ジャーナル〔The EMBO Journal, 4 , 1875(198
5)〕記載の方法により取得する。このＤＮＡを鋳型とし
てサイキ（Saiki)らが開発したポリメラーゼチェインリ
アクション法〔以下ＰＣＲ法，Science, 230, 1350(198
5)〕に基づいて、カタラーゼＨＰＩをコードするカタラ
ーゼ遺伝子ＫａｔＧを重複する領域を含むように上流領
域と下流領域との２つのＤＮＡ断片を増幅する。これら
のＤＮＡ断片をベクターＤＮＡに挿入して、２種類の組
換え体ＤＮＡを取得し、それぞれｐＫＧ１２とｐＫＧ３
４と命名する。

【００１１】ＰＣＲ法で増幅したＤＮＡ断片のベクター
ＤＮＡへの組込みは、マルチュク〔D. Marchukuら、Nuc
leic Acid Res., 19 , 1154(1991)〕の方法に従って、
ベクターＤＮＡを適当な制限酵素で切断した後、ＴＴＰ
存在下でタックＤＮＡポリメラーゼで処理し、このもの
と先にＰＣＲで得られたＤＮＡ断片との混合物をＤＮＡ
リガーゼで処理することによって行うことができる。こ
こで用いるベクターＤＮＡとしては、大腸菌を宿主とす
ることが可能なプラスミドであればすべて可能であり、
pBluescriptII （ストラタジーン）が好適に用いられ
る。制限酵素としては、平滑末端を生じる酵素が用いら
れ、ＥｃｏＲＶが好適である。ＤＮＡリガーゼとして
は、Ｔ４ファージ感染大腸菌由来のＴ４ＤＮＡリガーゼ
が好適に用いられる。

【００１２】上記方法で得られる組換え体ＤＮＡは、常
法に従って、例えば、モレキュラー・クローニング
（Ｔ．マニアチス，Ｅ．Ｆ．フリッチ，Ｊ．サムブルッ
ク著，コールドスプリングハーバー出版社，1982年) に
記載の方法によって大腸菌に導入することができる。 (2) ＫａｔＧ遺伝子の不活性化上記で得られる組換え体ＤＮＡｐＫＧ３４中に存在する
制限酵素ＥｃｏＲＶ部位にプラスミドｐＨＳＧ３９７
（宝酒造）由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子部分
を含むＤＮＡ断片を挿入する。この組換え体ＤＮＡをｐ
ＫＧ３４：：ＣＡＴと命名する。

【００１３】２つの領域に分けて取得したＤＮＡ断片を
相同領域中に存在する制限酵素ＢｓｔＰＩ部位で連結す
る。すなわち、ｐＫＧ１２を制限酵素ＢｓｔＰＩとＰｓ
ｔＩで切断したものと、ｐＫＧ３４：：ＣＡＴを制限酵
素ＢｓｔＰＩ、ＰｓｔＩ、ＸｈｏＩで切断したものとを
混合し、両者の混合物をＤＮＡリガーゼで処理すること
により組換え体ＤＮＡｐＫＧ：：ＣＡＴを得る。このも
のは、ベクター側にアンピシリン耐性遺伝子を有し、Ｋ
ａｔＧ遺伝子の内部にクロラムフェニコール耐性遺伝子
が挿入されてＫａｔＧ遺伝子が不活性化されたものであ
る。得られる組換え体ＤＮＡを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ
（ストラタジーン）に導入する。

【００１４】（3) ＫａｔＧ：：ＣＡＴ遺伝子の導入プラスミドｐＫＧ：：ＣＡＴ中に存在する不活性化され
たＫａｔＧ遺伝子を含む領域を制限酵素ＸｈｏＩとＰｓ
ｔＩにより切断し、得られるＤＮＡ断片を大腸菌ＪＣ76
23株に形質転換する。目的とする形質転換体は、クロラ
ムフェニコールを含有するＬＢ培地〔バクトトリプトン
10g/l (Difco) 、バクトイーストエキストラクト 5g/l
(Difco)、NaCl5g/l 〕上で選択することが可能である。
大腸菌ＪＣ7623株は、直鎖状ＤＮＡの分解能が欠損して
おり、形質転換により薬剤耐性になった菌株からは染色
体ＤＮＡ上のＫａｔＧ遺伝子が、クロラムフェニコール
耐性遺伝子の挿入により不活性化されたＫａｔＧ遺伝子
（以下、変異ＫａｔＧ遺伝子という）とその相同する領
域でおきかわった変異株が取得される。この株をＳＮ０
００７株と命名する。

【００１５】（4) ＫａｔＥ遺伝子の取得上記の方法に従い、大腸菌Ｗ３１１０株の染色体ＤＮＡ
からＰＣＲ法によりカタラーゼＨＰIIをコードするカタ
ラーゼ遺伝子ＫａｔＥを重複する領域を含むように上流
領域と下流領域の２つのＤＮＡ断片を増幅する。これら
のＤＮＡ断片をベクタープラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔIIに挿入して、２種類の組換えプラスミドを取得
し、それぞれｐＫＥ１２とｐＫＥ３４と命名し、大腸菌
ＸＬ１−Ｂｌｕｅに導入する。

【００１６】（5) ＫａｔＥ遺伝子の不活性化上記で得られる組換えプラスミドｐＫＥ３４中に存在す
る制限酵素ＮｒｕＩ部位にプラスミドｐＵＣ４Ｋ（ファ
ルマシア）由来のカナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ
断片を挿入する。得られる組換え体ＤＮＡをｐＫＥ３
４：：ＫＡＭと命名する。

【００１７】２つの領域に分けて取得したＤＮＡ断片を
相同領域中に存在する制限酵素ＮｃｏＩ部位で連結す
る。すなわち、ｐＫＥ１２を制限酵素ＳａｃＩとＮｃｏ
Ｉで切断したものと、ｐＫＥ３４：：ＫＡＭを制限酵素
ＳａｃＩ、ＮｃｏＩ、ＫｐｎＩで切断したものとを混合
し、両者の混合物をＤＮＡリガーゼで処理することによ
り組換え体ＤＮＡｐＫＥ：：ＫＡＭを得る。このもの
は、ベクター側にアンピシリン耐性遺伝子を有し、Ｋａ
ｔＥ遺伝子の内部にカナマイシン耐性遺伝子が挿入され
てＫａｔＥ遺伝子が不活性化されたものである。得られ
る組換え体ＤＮＡを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅに導入す
る。

【００１８】（6) ＫａｔＥ：：ＫＡＭ遺伝子の導入ｐＫＥ：：ＫＡＭ中に存在する不活性化されたカタラー
ゼ遺伝子断片を含む領域を制限酵素ＫｐｎＩとＳａｃＩ
により切断し、得られるＤＮＡ断片を、大腸菌ＪＣ7623
株に形質転換する。目的とする形質転換体は、カナマイ
シンを含有するＬＢ培地上で選択することが可能であ
る。得られる形質転換体は、染色体上のＫａｔＥ遺伝子
が、カナマイシン耐性遺伝子の挿入により不活性化され
たＫａｔＥ遺伝子（以下変異ＫａｔＥ遺伝子という）と
その相同する領域で置きかわつた変異株である。この株
をＳＮ０００９株と命名する。

【００１９】（7) Ｐ１ファージによる形質導入分子遺伝学実験法（J.H.Millerら、コールド・スプリン
グ・ハーバー、1972年) に記載のＰ１ファージ形質導入
法により、変異ＫａｔＧ遺伝子と変異ＫａｔＥ遺伝子の
両者を含む変異株を作成する。まず、ＳＮ０００７株の
有する変異ＫａｔＧ遺伝子を大腸菌ＭＣ１０００株に導
入し、ＳＮ００１３株を取得する。引続き、ＳＮ０００
９株の有する変異ＫａｔＥ遺伝子を、上記のＳＮ００１
３株に導入し、ＳＮ００２９株を取得する。

【００２０】ＳＮ００２９株はＫａｔＧ遺伝子とＫａｔ
Ｅの両遺伝子が不活性化されているもので、カタラーゼ
活性を有しない大腸菌変異株である。Ｐ１形質導入法に
より外来ＤＮＡを染色体上の目的の部位に組込んだ変異
株の選抜及び同定は、種々の方法により行える。例え
ば、サザン・ハイブリダイゼーション法、カタラーゼ活
性の測定、薬剤耐性に関するスクリーニングがあるが、
これらに限定されるわけではない。

【００２１】（8) 遺伝子の導入ついで、ＳＮ００２９株にオキシダーゼ発現用の組換え
ＤＮＡを導入する。例えば、ウリカーゼの場合はＳＮ０
０２９株にウリカーゼ発現用の後記参考例で得られるプ
ラスミドｐＵＴ１１８を導入する。得られる組換え体大
腸菌をＳＮ００３７株と命名する。

【００２２】本菌株は平成４年12月17日付で工業技術院
微生物工業技術研究所（微工研）にブダペスト条約の条
件でFERM BP-4125として寄託されている。

【００２３】（9) オキシダーゼ製造および精製オキシダーゼ生産菌の培養は、該微生物を炭素源、窒素
源、無機物などを含有する培地において、好気的条件下
にて温度、ｐＨなどを調節しつつ行えばよい。培地に用
いる炭素源としては、例えば、グルコース、フラクトー
ス、シュークロース、糖蜜、廃糖蜜、澱粉加水分解物な
どの炭水化物、エタノール、グリセリン、ソルビトール
などのアルコール類、ピルビン酸、乳酸、酢酸などの有
機酸、グリシン、アラニン、グルタミン酸、アスパラギ
ン酸などのアミノ酸など該微生物が資化可能なものであ
ればいずれでも使用できる。

【００２４】窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、炭酸ア
ンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウムな
どの無機および有機アンモニウム塩、尿素、ペプトン、
ＮＺアミン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープ
リカー、カゼイン加水分解物、フィッシュミールまたは
その消化物などの窒素含有有機物、グリシン、グルタミ
ン酸などのアミノ酸などが使用できる。

【００２５】無機物としては、リン酸１カリウム、リン
酸２カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸マグネシウ
ム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸
亜鉛、炭酸カルシウムなどが使用できる。用いる微生物
が、アミノ酸、核酸、ビタミンなどの特定の栄養物質を
生育に要求する場合には、培地にこれらの物質を適量添
加する。

【００２６】培養は振盪培養、通気攪拌培養などの好気
的条件下、２５〜３７℃で１〜２４時間行う。培地のｐ
Ｈはアンモニア、尿素、水酸化ナトリウム溶液などで中
性付近に保つことが望ましい。培養終了後、培養物より
オキシダーゼを精製するには、遠心分離などの方法で菌
体を集め、一般の酵素精製法、例えば、次のようにして
単離することができる。まず、得られる菌体を充分洗浄
した後、超音波処理、ガラスビーズを用いる磨砕処理、
フレンチプレス処理などによって破砕し、酵素を抽出す
る。抽出液を硫安塩析法、イオン交換樹脂を用いるクロ
マトグラフィー、ゲル濾過法、ヒドロキシアパタイド吸
着樹脂を用いるクロマトグラフィーなどの常法により処
理して、精製オキシダーゼを得ることができる。

【００２７】（10) オキシダーゼ（ウリカーゼ）活性測定法オキシダーゼの活性は、そのオキシダーゼに特有の活性
測定法に従って測定できる。たとえば、ウリカーゼの活
性は次の方法で測定する。ウリカーゼの活性測定は、基
質となる尿酸の紫外部吸収（２９３nm) の吸光度の減少
を測定することにより行う。

【００２８】６０mlのＬＢ培地を含む３００ml容三角フ
ラスコに組換え体大腸菌を植菌し、３０℃で１６時間培
養した菌体を遠心分離により回収し、１００mMのリン酸
カリウムバッファー（ｐＨ7.０）で洗浄後、同バッファ
ーの４mlに懸濁した。この細胞懸濁液を等量のガラスビ
ーズと混合し、炭酸ガスで冷却しながらセルホモゲナイ
ザー（ブラウン）を用いて１分間破砕した後、１分間冷
却し、またさらに１分間破砕する。破砕液を15,000rpm
で１５分間遠心分離することにより得た上清を無細胞抽
出液とする。

【００２９】５０mM ほう酸緩衝液（ｐＨ8.５）、１２
５μM 尿酸の組成からなる反応液（以下反応液ａとい
う）３ml中に上記無細胞抽出液を１５０ng蛋白／ml程度
の濃度で接触させ、２５℃で３分間反応させる。本反応
中の２９３nmの吸光度の変化（ΔＯＤ）を測定し、次式
によりウリカーゼの単位（Ｕ）を算出する。上記条件下
で、１分間に１μmoleの尿酸を分解する酵素量を１Ｕと
する。

【００３０】

【数１】

【００３１】（11) カタラーゼの活性測定法カタラーゼ活性は次の方法で測定する。カタラーゼの活
性測定は、1.９５mlの１００mM リン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ7.０）に５３mM 過酸化水素溶液の1.０mlを添加
し、３７℃で保温した後、前記（10) 項と同様の方法で
取得した無細胞抽出液を５０μl 添加する。その後、３
分間後の２４０nmの吸光度の減少（ΔＥ）でカタラーゼ
活性を測定する。

【００３２】比活性は、以下の式で計算する。なお、１
Ｕは１分間に１mmole の過酸化水素を分解する量とす
る。

【００３３】

【数２】

【００３４】

【実施例】以下に実施例および参考例を示す。実施例１（1) カタラーゼ遺伝子を含む染色体ＤＮＡの調整大腸菌Ｗ３１１０株をＬＢ培地〔バクトトリプトン１
０g ／l(Difco)、バクトイーストエキストラクト５g ／
l(Difco)、NaCl ５g ／l 〕６０mlを含む３０ml三角フ
ラスコに植菌し、３０℃で１日間振盪培養した。得られ
た培養物を冷却遠心機ＲＤ−２０ IV （ローター No.4
；トミー製) を用いて４℃で10,000rpm、10分間遠心分
離して菌体を回収した。

【００３５】得られた菌体を３０mlのＭ９溶液（Na₂HPO
₄・12H₂O 15.14 g／l 、 KH₂PO₄ ３ｇ／ｌ、NaCl 5 ｇ
／ｌ、NH₄Cl １ｇ／ｌ）に懸濁した後、遠心分離するこ
とにより集菌した。菌体を１５mlの0.１M NaCl、0.１M
ＥＤＴＡ（ｐＨ8.５）を含む溶液に懸濁した後、これに
５mgのプロテイナーゼＫ（proteinase K；生化学工業)
と1.６５mlのに１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ9.
０）、１０％ラウリル硫酸ナトリウム溶液を添加し、
４２℃で１時間処理した。引続き１mM ＥＤＴＡを含む
１０mM トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ8.０）で飽和したフ
ェノール溶液を１８ml添加し、充分に攪拌することによ
りフェノール抽出を行った。その後、20℃で15,000rpm
、３０分間の遠心分離することにより上清を回収し
た。上清に対して等量のクロロホルムを添加して緩やか
に懸濁した後、遠心分離することにより上清を回収し
た。上清に1.５mlの３M 酢酸ナトリウム溶液と−２０℃
のエタノール３7.５mlとを加え緩やかに懸濁した。析出
した染色体ＤＮＡを、ガラス棒に巻きつけるようにして
回収し、乾燥させた後、１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０mM
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ8.０）に懸濁し、染色体Ｄ
ＮＡとして得た。

【００３６】（2) カタラーゼＨＰＩをコードする遺伝
子ＫａｔＧのクローニングＰＣＲ法によるＫａｔＧ遺伝子クローニング用の合成Ｄ
ＮＡプライマーとして、配列番号１〜４に示す４種類を
合成した。合成は、リン酸アミダイド法による固相合成
法〔S.L.Beaucageら、テトラヘドロンレター(Tetrahedr
on Lett.), 22,1859 (1981)〕に従い、ＤＮＡ自動合成
機３８０Ａ（アプライドバイオシステム社製）を用いて
行った。

【００３７】前項（１）で得られた染色体ＤＮＡ１００
ngを0.５ml用チューブにとり、これにジーンアンプキッ
ト^TM（宝酒造）中の１０μl の１０倍濃縮増幅用緩衝液
〔１００mM トリス−塩酸緩衝液 (ｐＨ8.３）、５００
mM ＫＣｌ、１５mM MgCl₂,0.０１％(W/V) ゼラチ
ン〕、８μl の1.２５mM ｄＮＴＰ混合液〔ｄＡＴＰ，
ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ＴＴＰ〕、配列番号１と配列番号
２で示すオリゴヌクレオチドＤＮＡを１００pmolずつ、
５μl のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）0.５μｌの
５ユニット／μｌアンプリタック^rM（宝酒造）を加え、
滅菌水を加えて全量を１００μｌにした。ついで、５０
μｌのミネラルオイル（シグマ）を重層した後、自動遺
伝子増幅装置サーマルサイクラー（宝酒造）により増幅
を行った。反応条件は、９４℃で１分間（熱変性）→５
５℃で２分間（アニーリング）→７２℃で３分間（合成
反応）のサイクルを３０サイクル行った。反応後、反応
液の１０μｌを取り、モレキュラークローニングに記載
されている方法に従い、0.７％アガロース（ナカライテ
スク）ゲル電気泳動を行い、1,320bp のＤＮＡ断片が増
幅されていることを確認した。このＤＮＡ断片をＫＧ１
２と命名した。

【００３８】同様に、配列番号３と配列番号４で示すオ
リゴヌクレオチドＤＮＡを用いて、前記と同条件下でＰ
ＣＲを行い、1,514bp のＤＮＡ断片を増幅し、このＤＮ
Ａ断片をＫＧ３４と命名した。ＰＣＲにより増幅された
遺伝子ＫＧ１２と遺伝子ＫＧ３４のベクターＤＮＡへの
組込は、D.Marchuk らのＴ−ベクター法〔Nucleic Acid
s Research, 19, 1154(1991)〕に従い行った。

【００３９】すなわち、２０μｇのプラスミドベクター
pBluescript IIをＨ緩衝液〔５０mMトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ7.５）、１０mM MgCl₂，１mM ジチオスレイトー
ル、100mM NaCl〕１００μl に溶解して、制限酵素Ｅｃ
ｏＲＶ（宝酒造）を２０単位添加し、３７℃で２時間保
温して切断した。ついで、フェノール処理、エタノール
沈澱により、１０μｇのＤＮＡを回収した。制限酵素Ｅ
ｃｏＲＶで切断したベクターの１０μｇを１mlのチュー
ブに入れ、２mMのＴＴＰを含む２００μl の緩衝液〔１
０mM トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ8.３）、５０mM KCl
1.５mM MgCl_2,0.001%(W/V) ゼラチン〕中に懸濁し、２
μl の５ユニット／μl のアンプリタック^rMを加えて、
７０℃で２時間反応した。その後、反応液から、フェノ
ール処理、エタノール沈澱により、ＤＮＡを回収した。

【００４０】ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片ＫＧ１２また
はＫＧ３４とＴベクター化したＤＮＡとを混合し、ライ
ゲーション緩衝液〔６６mM トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
7.6)、6.６mM MgCl₂、１０mM ジチオスレイトール、
１mM ＡＴＰ〕に懸濁した。この懸濁液にＴ４リガーゼ
（ベーリンガー・マンハイム）を１０単位添加し、16℃
で１６時間反応させることにより、両方のＤＮＡを連結
させ、組換え体ＤＮＡ混成物を得た。

【００４１】得られた組換え体ＤＮＡ混成物を含む溶液
を大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株の形質転換に供した。大腸
菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株のコンピテントセルは、ジャーナ
ルオブモレキュラーバイオロジー（J. of Molecu
lar Biology) 166 , 557(1983)に記載の方法にしたがっ
て調製した。

【００４２】前記で得られた組換え体ＤＮＡ混成物を含
む溶液１０μｌと２１０μｌの大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ
株コンピテントセルを混合し、氷上に３０分間静置後、
４２℃で９０秒間熱処理をし、その後、氷中に２分間保
った。これに８００μｌのＳＯＣ培地（２％バクトト
リプトン、0.５％バクトイーストエキストラクト、１
０mM NaCl 、2.5mM KCl 、１０mM MgCl₂、１０mM MgS
O₄、20mM グルコース)を加えて、３７℃で１時間振盪
培養した。ついで、これを５０μｇ／mlのアンピシリ
ン、４０μｇ／mlのＸ−Ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロ
ロ−３−インドリル−β−ガラクトシド）、0.１mM IP
TG（イソプロピル−β−チオ−ガラクトピラノシド）を
含むＬＢプレートに１００μｌずつ塗布した。これを３
７℃で１６時間培養することにより生じた白色を呈する
コロニーを形質転換体として取得した。

【００４３】得られたアンピシリン耐性を示す形質転換
株よりプラスミドを調製し、挿入ＤＮＡ断片のサイズを
常法により調べたところ、それぞれ約1.３２Kbと1.５２
Kbの供与ＤＮＡ断片が挿入されたものであることが判明
し、それぞれのプラスミドをｐＫＧ１２とｐＫＧ３４と
命名した。

【００４４】（3) クロラムフェニコール耐性遺伝子の取得ｐＨＧ３９７中に存在するクロラムフェニコール耐性遺
伝子をＰＣＲ法により取得した。ｐＨＧ３９７の１ngを
0.５ml用チューブにとり、これにジーンアンプキット^TM
（宝酒造）中の１０μｌの１０倍濃縮増幅用緩衝液、８
μｌの1.２５mM ｄＮＴＰ混合液、配列番号５と配列番
号６で示すオリゴヌクレオチドＤＮＡを１００pmolず
つ、５μｌのＤＭＳＯ、0.５μｌの５ユニット／μｌア
ンプリタック^rMを加え、滅菌水を加えて全量を１００μ
ｌにした。ついで、５０μｌのミネラルオイルを重層し
た後、自動遺伝子増幅装置サーマルサイクラーにより増
幅を行った。反応条件は、９４℃で１分間→５５℃で２
分間→７２℃で３分間のサイクルを３０サイクル行っ
た。

【００４５】反応後、反応液の１０μｌを取り、モレキ
ュラークローニングに記載されている方法にしたがっ
て、0.７％アガロースゲル電気泳動を行い、９３９ｂｐ
のＤＮＡ断片が増幅されていることを確認した。このＤ
ＮＡ断片をＣＡＴと命名した。

【００４６】（4) ＫａｔＧ遺伝子のクロラムフェニコ
ール耐性遺伝子挿入による不活性化ｐＫＧ３４中の制限酵素ＥｃｏＲＶ断片部位へのＰＣＲ
法で得られたクロラムフェニコール耐性遺伝子の挿入を
以下の方法で行った。ｐＫＧ３４の５μｇを制限酵素Ｅ
ｃｏＲＶで切断したものをＴベクター化処理した後、フ
ェノール処理、エタノール沈澱操作により精製した。

【００４７】このＤＮＡとＰＣＲで増幅した遺伝子断片
ＣＡＴとを混合し、ライゲーション緩衝液に懸濁し、Ｔ
４リガーゼを１０単位添加し、１６℃で１６時間反応さ
せ、両方のＤＮＡを連結させ、組換え体ＤＮＡ混成物を
得た。得られた組換えＤＮＡ混生物を含む溶液を用いＸ
Ｌ１−Ｂｌｕｅのコンピテントセルを形質転換し、４０
μｇ／ml Ｘ−Ｇａｌ、0.１mM ＩＰＴＧ、５０μｇ／
ml アンピシリンと１５μｇ／ml クロラムフェニコー
ルを含有するＬＢ寒天培地に１００μｌ塗布した。これ
を３７℃で１６時間培養することにより生じた白色を呈
するコロニーを形質転換体として取得した。得られたア
ンピシリンとクロラムフェニコール耐性を示した形質転
換株よりプラスミドを調製し、挿入ＤＮＡ断片のサイズ
を調べたところ、約0.９４Kbの供与ＤＮＡ断片が挿入さ
れたものであることが判明し、得られた組換え体プラス
ミドをｐＫＧ３４：：ＧＡＴと命名した。

【００４８】（5) 完全長の破壊済みＫａｔＧ遺伝子の
取得（ＫａｔＧ：：ＣＡＴ）ｐＫＧ１２とｐＫＧ３４：：ＣＡＴは、１３９bpの相同
領域を持つことから、この領域にある制限酵素サイトＢ
ｓｔＰＩを利用して組換えを行った。すなわち、組換え
プラスミドｐＫＧ３４：：ＣＡＴをＨ緩衝液中で制限酵
素ＰｓｔＩ（宝酒造）、ＢｓｔＰＩ（宝酒造）、Ｘｈｏ
Ｉ（宝酒造）により切断し、ＢｓｔＰＩ−ＰｓｔＩ断片
（約2,５４０bp) を含むＤＮＡ溶液を、組換えプラスミ
ドｐＫＧ１２のＢｓｔＰＩ、ＰｓｔＩ切断物とライゲー
ションし、反応後の試料を用いＸＬ１−Ｂｌｕｅのコン
ピテントセルを形質転換し、１５μg ／mlクロラムフェ
ニコールと５０μｇ／mlアンピシリン含有ＬＢ寒天培地
で生育した菌を選抜した。得られた組換え体大腸菌より
プラスミドを調製し、常法により解析を行ったところ、
目的の構造を有したプラスミドであることを確認し、こ
のＫａｔＧ遺伝子がＣＡＴ遺伝子を挿入することにより
不活性化された断片を有する組換えプラスミドをｐＫ
Ｇ：：ＣＡＴと命名した。

【００４９】（6) カタラーゼＨＰII遺伝子のクローニングカタラーゼＨＰIIクローニング用の合成ＤＮＡプライマ
ーとして、配列番号７〜１０に示す４種類を合成した。
前項（1)で得られた染色体ＤＮＡ１００ngを0.５ml用チ
ューブにとり、これにジーンアンプキット^TM中の１０μ
ｌの１０倍濃縮増幅用緩衝液、８μｌの1.２５mM ｄＮ
ＴＰ混合後、配列番号７と配列番号８で示すオリゴヌク
レオチドＤＮＡを１００pmolずつ、５μｌのＤＭＳＯ、
0.５μｌの５ユニット／μｌアンプリタック^rMを加え、
滅菌水を加えて全量を１００μｌにした。ついで、５０
μｌのミネラルオイルを重層した後、自動遺伝子増幅装
置サーマルサイクラーにより増幅を行った。反応条件
は、９４℃で１分間→５５℃で２分間→７２℃で３分間
のサイクルを３０サイクル行い、ＫａｔＥ遺伝子の上流
部分1,６６７bp断片を増幅した。反応後、反応液を１０
μｌ取り、0.７％アガロースゲル電気泳動を行い、約1.
６７KbのＤＮＡ断片が増幅されていることが確認でき
た。このＤＮＡ断片をＫＥ１２と命名した。

【００５０】同様に、配列番号９と配列番号１０で示す
オリゴヌクレオチドＤＮＡを用いて、前記と同条件下で
ＰＣＲを行い、ＫａｔＥ遺伝子の下流部分1,９００bpの
ＤＮＡ切断を増幅し、このＤＮＡ断片をＫＥ３４と命名
した。ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片ＫＥ１２またはＫＥ
３４とＴベクター化したベクターＤＮＡとを混合し、ラ
イゲーション緩衝液に懸濁し、Ｔ４リガーゼを１０単位
添加し、１６℃で１６時間反応させ、両方のＤＮＡを連
結させ、組換え体ＤＮＡ混成物を得た。

【００５１】得られた組換え体ＤＮＡ混合成物を含む溶
液を大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株の形質転換に供し、５０
μｇ／mlのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地１００μｌ
に塗布した。これを３７℃で１６時間培養することによ
り生じたコロニーを形質転換体として取得した。得られ
たアンピシリン耐性を示す形質転換株よりプラスミドを
調製し、挿入ＤＮＡ断片のサイズを常法により調べたと
ころ、それぞれ約1.６７Kbと1.９０Kbの供与体ＤＮＡ断
片が挿入されたものであることが判明し、それぞれのプ
ラスミドをｐＫＥ１２とｐＫＥ３４と命名した。

【００５２】（7) カナマイシン耐性遺伝子の取得カナマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドｐＵＣ４Ｋ
（ファルマシア）の１０μｇをＭ緩衝液〔１０mM トリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.５）、１０mM MgCl₂、１mM
ジチオスレイトール、５０mM NaCl 〕に懸濁し、制限酵
素ＨｉｎｃII（宝酒造）で切断することにより、カナマ
イシン耐性遺伝子を含む部分を切り出し、0.７％アガロ
ース電気泳動を行い、1.３kbのＤＮＡ断片を含む部分を
剃刀を用いて切出し、プレップ・エー・ジーン（Prep−
A−Gene、バイオラッド) を用いてＤＮＡ断片３μｇを
回収した。このＤＮＡ断片とｐＫＥ３４のＫａｔＥの下
流領域を含む断片中に存在する制限酵素ＮｒｕＩ部位で
切断したものとを混合し、ライゲーション緩衝液に懸濁
し、Ｔ４リガーゼで両方のＤＮＡを連結させ、組換え体
ＤＮＡ混成物を得た。

【００５３】得られた組換え体ＤＮＡ混成物を含む溶液
を用いＸＬ１−Ｂｌｕｅのコンピテントセルを形質転換
し、５０μｇ／mlアンピシリンと３５μg ／mlカナマイ
シンを含むＬＢ寒天培地上に生育してきたコロニーを選
抜した。得られたアンピシリンとカナマイシン耐性を示
した形質転換株よりプラスミドを調製し、挿入ＤＮＡ断
片のサイズを常法により調べたところ、約1.３Kbの供与
ＤＮＡ断片が挿入されたものであることが判明し、得ら
れた組換え体プラスミドをｐＫＥ34：：ＫＡＭと命名し
た。

【００５４】（8) 完全長の破壊済みＫａｔＥ遺伝子の
取得前項（2)の場合と同様に１０１bpの相同領域中に存在す
る制限酵素ＮｃｏＩ部位を用いて組換えを行った。すな
わち、ｐＫＥ３４：：ＫＡＭをＬ緩衝液〔１０mM トリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.５）、１０mM ＭｇＣl₂ 、１
mM ジチオスレイトール〕中で制限酵素ＳａｃＩ（宝酒
造）とＫｐｎＩ（宝酒造）で切断した後に、フェノール
処理、エタノール沈澱後、Ｈ緩衝液中で制限酵素Ｎｃｏ
Ｉ（宝酒造）で切断し、ＳａｃＩ−ＮｃｏＩ断片（約3,
140bp)を含むＤＮＡ溶液を得た。一方、ｐＫＥ１２もＳ
ａｃＩ、ＮｃｏＩで切断し、両者を混合しライゲーショ
ン反応を行った。この試料を用い、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌ
ｕｅのコンピテントセルを形質転換し、３５μｇ／mlの
カナマイシンと５０μｇ／mlのアンピシリンを含有する
ＬＢ寒天培地で生育した形質転換体を選抜した。得られ
た形質転換体よりプラスミドを調整し、常法により解析
を行った結果、ＫａｔＥ遺伝子がカナマイシン耐性遺伝
子を挿入することにより破壊された断片をもつプラスミ
ドであることを確認し、ｐＫＥ：：ＫＡＭと命名した。

【００５５】（9) 大腸菌ＪＣ７６２３株の染色体上の
カタラーゼ遺伝子の不活性化１０μｇのｐＫＧ：：ＣＡＴをＨ緩衝液中で制限酵素Ｘ
ｈｏＩとＰｓｔＩにより切断した後、0.７％アガロース
ゲル電気泳動で分離し、プレップ・エー・ジーンを用い
てクロラムフェニコール耐性遺伝子により不活性化され
た約3.７５KbのＫａｔＧ遺伝子断片２μｇを取得した。
この0.２μｇを用い大腸菌ＪＣ７６２３株のコンピテン
トセルを形質転換し、１５μｇ／mlのクロラムフェニコ
ールを含むＬＢ寒天培地で２日後に生じたコロニーを取
得した。これを１５μｇ／mlクロラムフェニコールを含
んだＬＢ培地で培養した。得られた菌体中にプラスミド
の存在は認められず、染色体上のＫａｔＧ遺伝子が、導
入したＫａｔＧ：：ＣＡＴ遺伝子とその相同領域を利用
して相同組換えにより入れ替わった株であることを確認
し、この株をＳＮ０００７株とした。

【００５６】同様に１０μｇのｐＫＥ：：ＫＡＭをＬ緩
衝液中で制限酵素ＫｐｎＩとＳａｃＩにより切断した
後、0.７％アガロースゲル電気泳動で分離し、プレップ
・エー・ジーンを用いてカナマイシン耐性遺伝子により
不活性化された約4.７５KbのＫａｔＥ遺伝子断片２μｇ
を取得した。この0.２μｇを用い大腸菌ＪＣ７６２３株
のコンピテントセルを形質転換し、３５μｇ／mlカナマ
イシンを含むＬＢ寒天培地で現れたコロニーを選抜し
た。これを３５μｇ／mlカナマイシンを含んだＬＢ培地
で培養した。得られた菌体中にプラスミドの存在は認め
られず、染色体上のＫａｔＥ遺伝子が、導入したＫａｔ
Ｅ：：ＫＡＭ遺伝子とその相同領域を利用して相同組換
えにより入れ替わった株であることを確認し、この株を
ＳＮ０００９株と命名した。

【００５７】（10) ＫａｔＧ：：ＣＡＴ由来Ｐ１ライセートの取得１０mM ＣａＣｌ₂を含むＬＢ培地で３７℃、１６時間
培養した大腸菌ＳＮ０００７株の培養液0.１mlとＰ1 フ
ァージ液１００μｌとを混合して室温で５分間放置した
後、３mlの１０mM ＣａＣｌ₂と0.５％寒天を含むＬＢ
寒天培地を添加し、１０mM ＣａＣｌ₂を含むＬＢ寒天
培地上に重層した。３７℃で７時間培養後、寒天培地表
面のライセートをガラス棒でかきとるように集め、１０
mM ＣａＣｌ₂含有ＬＢ培地を加え懸濁して遠心分離管
に回収した。0.５mlのクロロホルムを添加して攪拌した
後、卓上遠心分離機（日立製０５Ｐ−２１）を用い3,00
0rpmで１５分間遠心分離することにより回収した上清を
以下のＰ１ファージ形質導入の実験に用いた。

【００５８】（11) Ｐ１形質導入大腸菌ＭＣ１０００株を１０mM ＣａＣｌ₂を含むＬＢ
培地に３７℃で１６時間培養した培養液0.１mlと前記(1
0)項で取得したＰ１ファージ液の５０μｌとを混合し
た。これを３７℃で２０分間静置した後、３mlのＦ−ト
ップークエン酸溶液（0.８５％食塩、0.１Ｍクエン
酸ナトリウム、0.７％寒天）と混合した。この溶液を
１５μｇ／mlのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培
地上に重層し、３７℃で２日間培養した。

【００５９】生じたコロニーをＭＣ１０００株の染色体
上のＫａｔＧ遺伝子が不活性化された株として選抜し、
ＳＮ００１３株とした。

【００６０】（12) ＫａｔＥ：：ＫＡＭ由来Ｐ１ライセートの取得同様に、大腸菌ＳＮ０００９株を１０mM ＣａＣｌ₂を
含むＬＢ培地に３７℃で１６時間培養した培養液0.１ml
とＰ１ファージ液１００μｌとを混合して室温で５分間
放置した後、３mlの１０mM ＣａＣｌ₂と0.５％寒天を
含むＬＢ寒天培地を添加し、１０mM ＣａＣｌ₂を含む
ＬＢ寒天培地上に重層した。３７℃で７時間培養後、寒
天培地表面のライセートをガラス棒でかきとるように集
め、１０mM ＣａＣｌ₂含有ＬＢ培地を加え懸濁して遠
心分離管に回収した。0.５mlのクロロホルムを添加して
攪拌した後、卓上遠心分離機により3,000rpmで１５分間
の遠心分離をすることにより回収したものを以下のＰ１
ファージ形質導入の実験に用いた。

【００６１】（13) Ｐ１形質導入大腸菌ＳＮ００１３株を１０mM ＣａＣｌ₂を含むＬＢ
培地に３７℃で１６時間培養した培養液0.１mlと前記
（12) 項で取得したＰ１ファージ液の５０μｌとを混合
し、３７℃で２０分間静置した後、３mlのＦ−トップ−
クエン酸溶液と混合した。この溶液を３５μｇ／mlのカ
ナマイシンを含むＬＢ寒天培地上に重層し、３７℃で１
日間培養した。

【００６２】生じたコロニーをＭＣ１０００株の染色体
上のＫａｔＧ遺伝子とＫａｔＥ遺伝子の両カタラーゼ遺
伝子が破壊された株として選抜し、ＳＮ００２９株とし
た。

【００６３】（14) カタラーゼ活性測定親株のＭＣ１０００株と上記で得られた大腸菌変異株Ｓ
Ｎ００１３株、ＳＮ００２９株のカタラーゼの活性測定
を行った結果、第１表に示すように、ＳＮ００２９株で
は、カタラーゼ活性は検出されなかった。

【００６４】

【表１】

【００６５】 (15) カタラーゼ欠損株を利用したウリカーゼ生産ＳＮ００２９株をウリカーゼ高発現プラスミドｐＵＴ１
１８（参考例参照）で形質転換し、ＳＮ００３７株を取
得した。得られた大腸菌ＳＮ００３７株を培養する場合
には、高密度培養法〔バイオテクノロジー・アンド・バ
イオエンジニアリング（Biotechnol. Bioeng.) 17 , 22
7-239(1975) 〕が好適であり、以下の様に行った。な
お、下記のいずれの培地においても、プラスミドを安定
に形質転換体中に保持させるために、アンピシリンを５
０μｇ／mlの濃度で添加した。大腸菌ＳＮ００３７株を
0.５％のグルコースを含むＬＢ培地１００mlに植菌し、
３０℃で１６時間培養した。

【００６６】次に、５リットル容量の発酵槽に、1.８リ
ットルの下記組成からなる発酵培地を封入し、１２０℃
で２０分間蒸煮滅菌した。その後、滅菌した１０％グ
ルコース、2.４％ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、0.４％チ
アミンを含む溶液１００mlを発酵槽に添加した後、ＳＮ
００３７株を培養した前記培養物を植菌した。発酵培地：：1.５１４％Ｎａ₂ＨＰＯ₄・１２Ｈ
₂Ｏ、0.３％ＫＨ₂ＰＯ₄、0.５％ＮａＣｌ、0.１
％ＮＨ₄Ｃｌ、0.５％ペプトン（極東）、微量元素
溶液１ml／l 。微量元素溶液：：９９０mg／l ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、
８８０mg／l ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、３９３mg／l Ｃｕ
ＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ、７２mg／l ＭｎＣｌ₂・４Ｈ ₂Ｏ、
８８mg／l Ｎａ₂Ｂ₄Ｏ₇・１０Ｈ₂Ｏ、３７mg／l
（ＮＨ₄)₆Ｍｏ₇Ｏ ₂₄・４Ｈ₂Ｏ１４％アンモニア水を用いてｐＨ6.８に調整しつつ、攪
拌（５００rpm)、通気（２ l／min)し、３３℃で３０時
間培養を行った。培養液中の溶存酸素濃度を溶存酸素電
極にて測定し、グルコース濃度がゼロになり、培養液の
溶存酸素値が上昇を始めた時点で、１6.７％グルコー
スと１6.７％ペプトンを含む溶液を少量ずつ連続的に
発酵槽に添加し、培養液中のグルコース濃度が0.１％以
下であるように保った。

【００６７】培養終了後、集菌体から無細胞抽出液を調
製し、この無細胞抽出液中のウリカーゼ活性を測定し
た。その結果、本培養物中には、３００Ｕ／mlのウリカ
ーゼが生産されていた。この培養物の一部を遠心分離処
理し、湿菌体約１０ｇを得た。これを１００mlの精製用
緩衝液〔５０mM ほう酸−炭酸ナトリウム−塩化カリウ
ム緩衝液（ｐＨ8.５）〕（以下、緩衝液ａ）に懸濁し、
超音波破砕機（ブランソン）にて菌体を破砕した。破砕
液を遠心分離し、上清１００mlを得た。得られた上清に
終濃度50mMとなるように硫酸マグネシウムを添加し、水
酸化カリウム溶液でｐＨ8.５に調整した後、６０℃で３
０分間保温した。この液を遠心分離し、夾雑蛋白などを
沈澱として除去した。得られた上清を予め緩衝液ａにて
平衡化したＤＥＡトヨパール６５０Ｓカラム（直径2.２
cm、長さ２０cm) に通塔した後、充分量の緩衝液ａで洗
浄した。その後、ＯＭ→0.４ＭのＮａＣｌ直線濃度勾配
を有す緩衝液ａ８００mlで溶出し活性画分１００mlを
得た。この活性画分を緩衝液ａで透析、脱塩し、最終的
に25,000Ｕのウリカーゼを取得した。一方、親株である
カタラーゼ活性のある大腸菌ＭＣ１０００株にｐＵＴ１
１８を導入したＭＣ１０００／ｐＵＴ１１８株の培養液
より精製を行った場合、ＤＥＡＥトヨパール６５０Ｓで
得られた画分には、カタラーゼ活性が混在するため、こ
のタカラーゼ活性を除去するためには、さらにＢｕｔｙ
１トヨパール６５０Ｓカラムによる分画を必要とした。
この精製操作の導入により、最終的に１５４００Ｕのウ
リカーゼしか取得できなかった。

【００６８】参考例１．染色体ＤＮＡの単離セルロモナス・フラビジェナＳＫ−４（ＦＥＲＭＢＰ
−１５７５）を培地〔ペプトン1.０％、コーンスティー
プリカー1.０％、サンヨー核酸（山陽国策パルプ社製）
0.５％、肉エキス0.５％、酵母エキス0.３％、シューク
ロース0.７％、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 0.０５％、Ｆｅ
ＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 0.０５％（ｐＨ7.２）〕３００mlを
含む三角フラスコに植菌し、３０℃で１６時間振盪培養
した。得られた培養物を遠心分離し、湿菌体を得た。培
養菌体約１５ｇを２mM ＥＤＴＡを含む２０mMトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ7.５）１２０mlに懸濁した。この懸濁
液にリゾチーム溶液〔リゾチームを２０mg／mlの割合
で、２mM ＥＤＴＡを含む２０mMトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ7.５）に溶解したもの〕１５mlを加え、３０℃で
１時間放置した。これに２０％ラウリル硫酸ナトリウム
溶液１５mlを加え、ゆっくりと攪拌した。次にこの溶液
に１mM ＥＤＴＡを含む１０mMトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ7.５）を飽和したフェノール１５０mlを加え、充分に
攪拌した。この溶液を遠心分離にかけ、水層１５０mlを
分取した。ついで、このフェノール抽出の操作を３回繰
り返した。得られた水層１５０mlに2.５Ｍ酢酸ナトリウ
ム溶液１５mlを加えた後、さらにエタノール３００mlを
加えた。析出した染色体ＤＮＡをガラス棒にて巻取り、
乾燥した。次いで、これを１mM ＥＤＴＡを含む１０mM
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.５）３０mlに溶解した。こ
れにリボヌクレアーゼを５０μｇ／mlとなるように加
え、３７℃で３０分間放置した。前述と同様のフェノー
ル抽出操作を行った後、水層に2.５Ｍ酢酸ナトリウム溶
液３mlおよびエタノール６０mlを加えた後、−２０℃に
て１６時間放置した。遠心分離し、得られたペレットを
７０％エタノール溶液にて洗浄し、乾燥させ精製染色体
ＤＮＡを得た。これを１mM ＥＤＴＡを含む１０mMトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.５）に懸濁し、−２０℃で保存
した。

【００６９】２．ウリカーゼ遺伝子クローニング用のプローブの調製１）プローブ用ＤＮＡ断片の増幅セルロモナス・フラビジェナＳＫ−４から精製したウリ
カーゼのＮ末アミノ酸配列及びリジルペプチダーゼ消化
断片のＮ末アミノ酸配列に相当する塩酸配列をもつ配列
番号１１のＰＣＲ用５’側プライマーと配列番号１２の
３’側プライマーを設計し、リン酸アミダイド法による
固相合成法〔S. L. Beaucageら、テトラヘドロン・レタ
ー(Tetrahedron Lett.)、22, 1859(1981)〕に従い、Ｄ
ＮＡ自動合成機３８０Ａ（アプライドバイオシステム社
製）を用いて合成した。ＰＣＲはジーンＡｍｐＤＮＡア
ンプリフィケーションリージェントキット（宝酒造社
製）を用い、前記１項で調製したセルロモナス・フラビ
ジェナの染色体ＤＮＡ１ng／100 μl を鋳型として、
上記の合成ＤＮＡ各1.０μM をプライマーとして、ｄＡ
ＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを各２００μM 、
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを2.５Ｕ／100 μl にして９
４℃で1.５分間、４０℃で２分間、７２℃で２分間の反
応を３０回繰り返し、約７００bpのＤＮＡ断片を取得し
た。

【００７０】２）プローブＤＮＡ断片のクローニング上記のごとく反応して得られたＰＣＲ反応物ＤＮＡ断片
１μｇを含む溶液２０μｌにＨｉｎｄIII およびＥｃｏ
ＲＩを加えて消化を行った。別にベクターｐＵＣ１９
〔ＧＥＮＥ，33 , 103(1985)〕１μｇを含む溶液２０μ
ｌにＨｉｎｄIIIおよびＥｃｏＲＩを加えて消化した。
消化された上記ＤＮＡ断片およびベクターＤＮＡをフェ
ノール抽出およびエタノール沈澱操作により精製した。
精製ＤＮＡ１００ngおよび精製ベクターＤＮＡ２０ngを
６６mMトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.６）、６６mM塩化マ
グネシウム、１０mM ＤＴＴおよび0.１mM ＡＴＰを含
有する溶液に懸濁した。これにＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝
酒造社製）を１０Ｕ添加した後、１４℃で１６時間反応
させ、両方のＤＮＡを連結させ、組換え体ＤＮＡを得
た。

【００７１】E. coliＤＨ５α〔Focus, 8 , 9 (1986)
〕をＬＢ液体培地〔１％トリプトン、0.５％酵母エキ
ス、１％塩化ナトリウム（ｐＨ7.５）〕５０mlを含む三
角フラスコに植菌し、３７℃で４時間振盪培養した。つ
いで遠心分離（３０００rpm 、７分間）して集めた菌体
を０℃の５０mM塩化カルシウム溶液２０mlに懸濁し０℃
にて２０分静置した後、上記と同様の遠心分離にて集菌
し、０℃、５０mMの塩化カルシウム溶液４０mlに懸濁し
た。この懸濁液と上記の組換え体ＤＮＡを含む溶液を混
ぜた後、０℃で１０分間静置した。次いで４２℃で９０
秒間熱処理した後、この混合液を１００μｇ／mlのアン
ピシリンと２０μｇ／mlの５−ブロモ−４−クロロ−イ
ンドリル−β−ガラクトサイド（Ｘｇａｌ）を含むＬＢ
寒天平板培地に塗布した。この平板培地を３７℃にて約
２４時間保温した。

【００７２】出現したコロニーのうちの白色コロニーを
別々にＬＢ液体培地で培養し、集菌した後、常法により
プラスミドＤＮＡを抽出した。このプラスミドＤＮＡの
挿入断片の塩酸配列を決定しウリカーゼ遺伝子のクロー
ニング用プローブとして適していることを確認した。

【００７３】３．ウリカーゼ遺伝子のクローニング１）ジーン・バンクの調製上記１項で得られた染色体ＤＮＡ１μｇを含む溶液に
ＳｃａＩを加えて消化を行った。別にベクターｐＵＣ１
９１μｇを含む溶液にＳｍａＩを加えて消化を行った
後、消化液２０μｌに１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ8.
０）およびアルカリフォスファターゼ１０Ｕを加え、６
５℃で１時間処理した。消化された染色体ＤＮＡおよび
ベクターＤＮＡを常法によりフェノール抽出およびエタ
ノール沈澱操作を行い精製した。精製染色体ＤＮＡ１０
０ngおよび精製ベクターＤＮＡ２０ngを６６mMトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ7.６）、６６mM塩化マグネシウム、１
０mM ＤＴＴおよび0.１mM ＡＴＰを含有する溶液の３
０μｌに溶解した後、これにＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒
造社製）を１０Ｕ添加し、１４℃で１６時間反応させ、
両方のＤＮＡを連結させ組換えＤＮＡをえた。

【００７４】２）コロニーハイブリダイゼイション上記２の２）項で調製したプローブ用ＤＮＡ１μｇを
ノンラジオシステムＤＮＡ標識および検出キット（ＤＩ
Ｇ−ＥＬＩＳＡ法、カタログ番号1093657 ：：ベーリン
ガー・マンハイム社製）に従い標識し、これをウリカー
ゼ検出用プローブとした。

【００７５】次に、E. coliＤＨ５αをＬＢ液体培地５
０mlを含む三角フラスコに植菌し37℃で４時間振盪培養
した。ついで遠心分離（３０００rpm 、 7分間) して集
めた菌体を０℃の５０mM塩化カルシウム溶液２０mlに懸
濁し、０℃にて２０分静置した後、前記と同様に遠心分
離にて集菌し、０℃、５０mMの塩化カルシウム溶液４０
mlに懸濁した。この懸濁液と上記の組換え体ＤＮＡを含
む溶液を混ぜ０℃で１０分間静置した。次いで４２℃で
９０秒間熱処理した後、この混合液を１００μｇ／mlの
アンピシリンと２０μｇ／mlのＸｇａｌを含むＬＢ寒天
平板培地に塗布した。この平板培地を３７℃にて約２４
時間保温した。

【００７６】上記平板培地上にコロニーが形成された
後、この上にナイトラン膜などのメンブラン・フィルタ
ーＮＹ１３Ｎ（Schleicher＆ Scheull社製) をのせ、す
ぐに剥離した。これをうらがえして、新しい１００μｇ
／mlのアンピシリンを含むＬＢ寒天平板培地に載せ、３
７℃にて約１２時間保温した。上面にコロニーが形成し
たメンブラン・フィルターを、平板培地より剥離し、0.
５ＮＮａＯＨを含む濾紙上に１０分間、0.５Ｍトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ7.３）を含む濾紙上に５分間、0.５
ＭＮａＣｌを含む0.５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.
３）を含む濾紙上に５分間、２×ＳＳＣ（0.３ＭＮａ
Ｃｌ、0.０３Ｍクエン酸三ナトリウム、ｐＨ7.０）を含
む濾紙上に５分間、順次静置した後、８０℃で約３時間
加熱した。このメンブラン・フィルターをノンラジオシ
ステムＤＮＡ標識および検出キット（ＤＩＧ−ＥＬＩＳ
Ａ法、カタログ番号１０９３６５７）に従い処理し、上
記ウリカーゼ検出用プローブにて検出した。この一連の
操作により約１００００コロニーから４株の陽性クロー
ン（形質転換体）を得た。

【００７７】３）クローン化遺伝子の確認上記検出で陽性であった形質転換体を、１００μｇ／ml
のアンピシリン含むＬＢ培地１０mlを入れた試験管に植
菌し、３７℃にて約２４時間振盪培養した。培養物か
ら、遠心分離により培養菌体を得、無細胞抽出液を調製
した。かくして得られた無細胞抽出液を用いウリカーゼ
活性を測定したところ、２〜４Ｕ／mg蛋白の活性が検出
された。さらに、上記集菌体から常法に従いプラスミド
ＤＮＡを調製した。このプラスミド１μｇを含む溶液２
０μｌにＨｉｎｄIII およびＥｃｏＲＩを加えて消化を
行った。この反応液を0.５μｇ／mlエチジウムブロマイ
ドを含む0.８％アガロース・ゲルにて電気泳動を行い、
挿入断片の断片長を測定し、常法に従いナイトラン膜な
どのメンブラン・フィルターに移した。このメンブラン
・フィルターをノンラジオシステムＤＮＡ標識および検
出キット（ＤＩＧ−ＥＬＩＳＡ法、カタログ番号１０９
３６５７）に従い処理し、上記ウリカーゼ検出用プロー
ブにて検出した結果、すべて陽性を示した。

【００７８】これらの陽性であった形質転換体から１つ
を選び、常法に従いプラスミドを抽出した。このプラス
ミド中のウリカーゼ構造遺伝子を配列番号１３に示す。
得られたウリカーゼをコードする遺伝子を含む組換え体
プラスミドをｐＵＳＣ３−５と命名した。このｐＵＳＣ
３−５の制限酵素地図を第１図に示す。

【００７９】４．ウリカーゼ高発現プラスミドの造成上記で得られたウリカーゼ構造遺伝子の上流にトリプト
ファンプロモーター配列およびｔｒｐＬのＳＤ配列を導
入するために、配列番号１４のＰＣＲ用５’側プライマ
ーと配列番号１５の３’側プライマーを合成した。これ
らのプライマーを用い、ｐＵＳＣ３−５のＥｃｏＲＩ消
化物を鋳型としてＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ
反応物ＤＮＡ断片１μｇを含む溶液２０μｌおよびベク
ターｐＴｒＳ３３（特開平２−２２７０７５号公報）１
μｇを含む溶液２０μｌにＨｉｎｄIII およびＢａｍＨ
Ｉを加えて消化を行った。消化された上記ＤＮＡ断片お
よびベクターＤＮＡを連結させ、プラスミドｐＵＴ２１
を作成した。このｐＵＴ２１の制限酵素地図を第２図に
示す。

【００８０】さらに、ベクターｐＴｒＳ３３のＳＤ配列
をｌａｃＺのＳＤ配列に変更するために、配列番号１６
のＰＣＲ用５’側プライマーと配列番号１７の３’側プ
ライマーを合成した。これらのプライマーを用いｐＴｒ
Ｓ３３のＰｓｔＩ消化物を鋳型としてＰＣＲ反応を行っ
た。得られたＰＣＲ反応物ＤＮＡ断片１μｇを含む溶液
２０μｌおよびベクターｐＴｒＳ３３１μｇを含む溶
液２０μｌにＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII を加えて消
化を行った。消化された上記ＤＮＡ断片およびベクター
ＤＮＡを連結させ、プラスミドｐＴＬ３３を作成した。
このｐＴＬ３３の制限酵素地図を第３図に示す。

【００８１】さらに、ウリカーゼのＮ末に相当する配列
番号１８の塩基配列をコードするアミノ酸に変化が生じ
ないように配列番号１９の塩基配列に変更し、また、ス
トップ・コドンをＴＧＡからＴＡＡＴＡＡ（二重ストッ
プ・コドン）に置換し、ウリカーゼの構造遺伝子以外の
セルロモナス・フラビジェナ由来のＤＮＡを削除したも
のを得るために、配列番号２０のＰＣＲ用５’側プライ
マーと配列番号２１の３’側プライマーを合成した。

【００８２】このプライマーを用いｐＵＴ２１のＥｃｏ
ＲＩ消化物を鋳型として、ＰＣＲ反応を行った。得られ
たＰＣＲ反応物ＤＮＡ断片１μｇを含む溶液２０μｌお
よびベクタープラスミドｐＴＬ３３１μｇを含む溶液
２０μｌにＨｉｎｄIII およびＢａｍＨＩを加えて消化
を行った。消化された上記ＤＮＡ断片およびベクターＤ
ＮＡを連結させ、プラスミドｐＵＴ１１８を作成した。
このｐＵＴ１１８の制限酵素地図を第４図に示す。

【００８３】

【発明の効果】本発明によりカタラーゼ活性の存在しな
いオキシダーゼを収率よく得ることができる。

【００８４】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：３１配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列：AAGCTTAATTAAGATCAATTTGATCTACATC

【００８５】配列番号：２配列の長さ：３０配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列：：CGACGAGAGATCTTCTCGAACTCAGGATCA

【００８６】配列番号：３配列の長さ：３０配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列：GGCGCAATCCAGTTCGAAGCGGTAGACGCA

【００８７】配列番号：4 配列の長さ：３1 配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列：TCGCGAAATATTGCCCAGGTCGCAGGCGTTC

【００８８】配列番号：５配列の長さ：３1 配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列：ACGGAAGATCACTTCGCAGAATAAATAAATC

【００８９】配列番号：６配列の長さ：３1 配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列：TCGAATTTCTGCCATTCATCCGCTTATTATC

【００９０】配列番号：７配列の長さ：３０配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列：CTGCAGCCTTTCTTTAAAAGAGTCGAAAGC

【００９１】配列番号：８配列の長さ：３０配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列：CGGCATTAATCAGGCGGAAGGTGTGAATAC

【００９２】配列番号：９配列の長さ：３０配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列：CTCTGCACAACGTGATGTGGGCGATGTCGG

【００９３】配列番号：１０配列の長さ：３０配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列：ATCGATAATACTATCCGTCAGAGTGCTTAC

【００９４】配列番号：１１配列の長さ：３１配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列：GGGAATTCGGATCCGGSGCSATCGTSCTSGG

【００９５】配列番号：１２配列の長さ：４１配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列：AAAAGCTTCTGCAGGATCTCSGCGATCTCSGGGATS GCCTC

【００９６】配列番号：１３配列の長さ：９４２配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：セルロモナス・フラビジェナ(Cellulomonas fl
avigena) 株名：ＳＫ−４ ATGAGCACGA CCACCCCGAC CGCCGAGCAG CCGGCGGCCA CGCAGAGCAG CGGGGCCATC 60 GTCCTGGGCG ACAACCAGTG GGGCAAGGCG GAGGTGCGCC TCGTGCGCGT CGACCGCGCC 120 ACGCCTCGCC ACGAGATCAC GGACGTCAAC GTCTCCTCGC AGCTGCGGGG CGGGCAGGAG 180 GCCACGCACC TGGAGGGCGA CAACTCCCGG TGCGTCGCCA CCGACACCCA GAAGAACACG 240 ATCTACGCCT TCGCCCGCGA CGGCGTCGGC GCGATCGAGG ACTTCGCGAT CCGCCTCGGT 300 CAGCACTTCG TCGAGGACTT CGAGTGGATC GAGGGCGGCC GCTGGGAGAT CGAGCAGTAC 360 ACCTGGAACC GCATCGAGAC CGCCGACGGC GAGCACGACC ACGCGTTCGT CCGGAACAAC 420 CAGGAGACGC GCACGACGGT CGTCCAGCGC GACGGCGACG AGGTCTTCGT CGTCTCGGGA 480 CTCACGGACC TCGTCGTGCT CAAGTCCACC GGCTCGGAGT TCCACGGGTT CCCGCGCGAC 540 CGCTACACGA CGCTCGTGGA GACCAACGAC CGCATCCTCG CGACGTCGGT CACCTCGCGG 600 TGGCGCTACA CGACCACCGA CGTCGACTTC GACGCCGTGT ACGCGAAGGT CCGCGCGATC 660 CAGCTCGAGG CGTTCGCGAC GACCCACTCC CTCGCGCTCC AGCAGACGCT GTTCGCGATG 720 GGCAAGGCGG TCCTCGAGGC GATCCCGGAG ATCGCCGAGA TCAAGTTCTC GATGCCGAAC 780 AAGCACCACT TCCTCGTGGA CCTCGCGCCG TTCGGCCTCG ACAACCCGAA CGAGGTCTTC 840 TACGCGGCCG ACCGCCCGTA CGGCCTCATC GAGGCGACGG TCCAGCGCGA GGGCGAGCCG 900 GCCGAGCCGC GCGCCTGGGC GACCGTCACC GGGTTCTGCT GA 942

【００９７】配列番号：１４配列の長さ：４０配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列：GGGAAAGCTTATGAGCACGACCACCCCGACCGCCGA GCAG

【００９８】配列番号：１５配列の長さ：３６配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列：：CGACTCTAGAGGATCCTCCGCGGTCGGGCAGGGCGC

【００９９】配列番号：１６配列の長さ：３５配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列：CTTCAAGAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCG

【０１００】配列番号：１７配列の長さ：３６配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列：CTCATAAGCTTTTCCTGTATAGGTCGAGTTGCGTAC

【０１０１】配列番号：１８配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：２本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Ｎ末６アミノ酸をコードするＤＮＡ配列：ATGAGCACGACCACCCCG

【０１０２】配列番号：１９配列の長さ：１８配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列：ATGTCTACTACTACTCCG

【０１０３】配列番号：２０配列の長さ：４０配列の型：核酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列：GGGAAAGCTTATGTCTACTACTACTCCGACCGCCGA GCAG

【０１０４】

【図面の簡単な説明】

【図１】第１図はプラスミドｐＵＳＣ３−５の制限酵素
地図を示す。

【図２】第２図はプラスミドｐＵＴ２１の制限酵素地図
を示す。

【図３】第３図はプラスミドｐＴＬ３３の制限酵素地図
を示す。

【図４】第４図はウリカーゼ構造遺伝子の５’−末端の
上流部分、Ｎ−末部分およびストップ・コドンの塩基配
列を変化させたウリカーゼ高発現プラスミドｐＵＴ１１
８の制限酵素地図を示す。

【符号の説明】

＊Ｎ末４アミノ酸のコドンの３番目の塩基をＴに置換
した。＊＊ストップ・コドンをＴＡＡＴＡＡ（２重ストップ・
コドン）に置換した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/06 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＡＣ１２Ｒ 1:01） (56)参考文献特開平２−53488（ＪＰ，Ａ) 特開平６−38766（ＪＰ，Ａ) 英国特許2218099（ＧＢ，Ｂ) 欧州特許出願公開545688（ＥＰ，Ａ２) ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， 1988，Ｖｏｌ．170, Ｎｏ．９，ｐ．4415−4419 ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， 1991，Ｖｏｌ．173, Ｎｏ．２，ｐ．514−520 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆ＧｅｎｅｒａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ， 1991，Ｖｏｌ．277，ｐ．424−432 Ｇｅｎｅ， 1992，Ｖｏｌ．114，ｐ．109−114 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 C12N 15/00 - 15/90 ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳｅｑＰｕｂＭｅｄＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号２２で表されるアミノ酸配列を
有する蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡ
によって形質転換され、カタラーゼ遺伝子の発現が欠損
している微生物を培地に培養し、培養物中にウリカーゼ
を生成蓄積させ、該培養物からウリカーゼを採取するこ
とを特徴とするウリカーゼの製造法。
【請求項２】微生物がエッシェリヒア属に属する微生
物である、請求項１記載のウリカーゼの製造法。
【請求項３】カタラーゼ遺伝子の発現が欠損している
微生物が、ＫａｔＧ遺伝子およびＫａｔＥ遺伝子の発現
が欠損している微生物である、請求項１または２記載の
ウリカーゼの製造法。
【請求項４】カタラーゼ遺伝子の発現が欠損している
微生物が、染色体上のＫａｔＧ遺伝子およびＫａｔＥ遺
伝子がＫａｔＧ：：ＣＡＴ遺伝子およびＫａｔＥ：：Ｋ
ＡＭ遺伝子で置換されることによりカタラーゼ遺伝子の
発現が欠損したエッシェリヒア属に属する微生物であ
る、請求項１記載のウリカーゼの製造法。
【請求項５】配列番号２２で表されるアミノ酸配列を
有する蛋白質をコードするＤＮＡが、配列番号１３で表
される塩基配列を有するＤＮＡである、請求項１〜４の
いずれかに記載の製造法。
【請求項６】配列番号２２で表されるアミノ酸配列を
有する蛋白質をコードするＤＮＡを含む組換え体ＤＮＡ
を有し、かつＫａｔＧ遺伝子およびＫａｔＥ遺伝子の発
現が欠損している微生物。
【請求項７】微生物が、染色体上のＫａｔＧ遺伝子お
よびＫａｔＥ遺伝子がＫａｔＧ：：ＣＡＴ遺伝子および
ＫａｔＥ：：ＫＡＭ遺伝子で置換されることによりカタ
ラーゼ遺伝子の発現が欠損した微生物である、請求項６
記載の微生物。
【請求項８】微生物が、エッシェリヒア属に属する微
生物である、請求項６または７記載の微生物。
【請求項９】配列番号２２で表されるアミノ酸配列を
有する蛋白質をコードするＤＮＡが、配列番号１３で表
される塩基配列を有するＤＮＡである、請求項６〜８の
いずれかに記載の微生物。