JP2913411B2 - セルラーゼ遺伝子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はセルラーゼ遺伝子に関するものであり、特
に、バチルス（Bacillus）属細菌由来であり、酸性側pH
領域に於いて最適の活性を示し、且つ中性領域で殆ど作
用しないセルラーゼをコードする遺伝子、並びに当該遺
伝子を含むDNA分子、更には当該DNA分子を含有する微生
物に関する。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕

一般に、セルラーゼはセルロースをグルコース、又は
セロビオース、或いはセロオリゴ糖まで分解する酵素反
応を触媒する複雑な酵素群として理解されており、その
作用機構により、C₁酵素、C_x酵素とβ−グルコシダー
ゼ、或いはエキソ−β−グルカナーゼ、エンド−β−グ
ルカナーゼ、セロビアーゼなどの名称で呼ばれる酵素を
含有すると言われる。過去数十年のセルラーゼの研究
は、バイオマス資源の有効利用、醸造業に於ける麦芽の
糖化などの観点から、例えばトリコデルマ属、アスペル
ギルス属、アクレモニウム属、フミコーラ属、イルペッ
クス属などの糸状菌類、或いは、クロストリジウム属、
シュードモナス属、ルミノコッカス属、セルロモナス属
等の細菌類などにその供給源を求めてきた（村尾沢夫ら
「セルラーゼ」、講談社（1987））。また最近、セルラ
ーゼの新規産業的用途として、衣料用洗浄剤組成物に関
するものがあり、バチルス属、セルロモナス属及びスト
レプトマイセス属細菌の生産するアルカリセルラーゼが
注目されている（特公昭50−28515号公報、特開昭58−2
24686号公報、Horikoshiら、J. Gen. Microbiol.,131
巻,3339頁，（1985）、特開昭61−280276号公報、特開
昭63−109771号公報、特開昭63−240785号公報など）。

一方、近年になって、微生物由来のセルラーゼ遺伝
子、具体的には、トリコデルマ属、クロストリジウム
属、セルロモナス属、バチルス属、ストレプトマイセス
属及びルミノコッカス属等の遺伝子が遺伝子操作技術を
用いて単離されている。こうした試みは、蛋白工学の手
法によるセルラーゼの機能及び特性の改良等を考慮した
場合、極めて意義のあることである。しかしながら、一
般のセルラーゼは、その立体構造や活性中心に関する知
見が殆ど皆無であり、従って、前述の目的を達成する為
には、機能や特性が異なるセルラーゼをコードしてお
り、且つそのヌクレオチド配列が明らかとなっている、
より多くのセルラーゼ遺伝子が必要とされている。とこ
ろが、これまでに、塩基配列が決定された遺伝子として
は、トリコデルマリイゼ（Trichoderma reesei（Pentti
laら，Gene,45巻,253頁，（1986））、クロストリジウ
ム サーモセラム（Clostridium thermocellum（Beguin
ら，J. Bacteriol.,162巻,102頁，（1985）、Joliff
ら，Nucleic Acids Res.,14巻,8605頁，（1986）及びGr
epinetら，Nucleic Acids Res.,14巻,1791頁，（198
6）））、セルロモナス フィミ（Cellulomonas fimi
（Wongら，Gene,44巻,315頁，（1986））、セルロモナ
ス ウダ（Cellulomonas uda（Nakamuraら，J. Biotech
nol.,4巻,247頁，（1986）））、枯草菌（バチルス ズ
ブチリス Bacillus subtilis（Robsonら，J. Bacterio
l.,169巻,2017頁，（1987）））、及び３種の好アルカ
リ性バチルス属細菌（Fukumoriら，J. Bacteriol.,168
頁,479頁，（1986）、Fukumoriら，J. Gen. Microbio
l.,132巻,2329頁，（1986）及び特公平１−281090）、
並びに好アルカリ性ストレプトマイセス（Streptomyce
s）属細菌（Nakaiら，Gene,65巻,229頁，（1988））等
の各微生物由来のものに限られていることから、決して
充分とは言えず、セルラーゼの改良に関する成功例は知
られていない。

〔課題を解決するための手段〕

斯かる実情において本発明者は、バチルス属細菌の染
色体DNAから新規なセルラーゼ遺伝子を含むDNA断片を得
べく、遺伝子操作の手法を用いてセルラーゼを生産する
組換えエシェリヒア（Escherichia）属菌株を調製し
た。次いで、当該菌株よりセルラーゼ遺伝子を含む約3.
1kbのDNA断片を単離し、更に当該DNA断片のヌクレオチ
ド配列を決定し、これをこれまでに知られている他のセ
ルラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列と比較した結果、本
発明のDNA断片が独自のヌクレオチド配列を有している
ことを見出し、本発明を完成した。

従って、本発明はセルラーゼ遺伝子を提供するもので
あり、更に当該遺伝子を含むDNA分子を提供するもので
ある。また、本発明はセルラーゼ遺伝子を含有する微生
物を提供するものである。

本発明に於いて、セルラーゼ遺伝子の供与体となる微
生物としては、例えば本発明者らが、菌体外に著量のセ
ルラーゼを生産する菌株として栃木県真岡市の土壌より
分離したバチルス属細菌の一種、バチルス エスピー
（Bacillus sp.）KSM−330が挙げられる。

このKSM−330株の分類学的性質は、以下の通りであ
る。

尚、菌株の分類に用いた培地は次の培地Ａ〜Ｌの12種
類である。

1.使用した培地の組成（表示は重量％） 培地A:バクトニュートリエント アガー，指示量 培地B:バクトニュートリエント ブロース，指示量 培地C:バクトニュートリエント ブロース，指示量；食
塩7.0 培地D:ポリペプトン,1.0;肉エキス,0.3;KNO₃,0.1 培地E:ポリペプトン,0.7;グルコース,0.5;食塩,0.5 培地F:ポリペプトン,1.5;肉エキス,0.4;乳糖,1.0;蔗糖,
1.0;グルコース,1.0;食塩,0.5;チオ硫酸ナトリウム,0.0
08;亜硫酸ナトリウム,0.04;硫酸第一鉄,0.02;フェノー
ル・レッド,0.002;バクト寒天,1.5 培地G:ポリペプトン,1.5;酵母エキス,0.5;可溶性澱粉,
2.0;K₂HPO₄,0.1;バクト寒天,1.5;MgSO₄・７H₂O,0.02
（別滅菌） 培地H:食塩,0.5;MgSO₄・７H₂O,0.02;(NH₄)₂HPO₄,0.1;K₂
HPO₄,0.1;クエン酸ナトリウム,0.2 培地I:肉エキス,1.0;ポリペプトン,1.0;食塩,0.5 菌接種5.、流動パラフィン−ワセリン1:1を上部約5cm重
層、固化 培地J:トリプトン（ディフコ社製）,0.2;食塩,0.5;K₂HP
O₄,0.03;ブロモチモールブルー,0.008;糖類,1.0（濾過
滅菌） 培地K:酵母エキス,0.5;グルコース,1.0（別滅菌）；K₂H
PO₄,0.1;MgSO₄・７H₂O,0.02（別滅菌）；バクト寒天,1.
5;脱脂粉乳,10.0（別滅菌） 培地L:下層：肉汁寒天培地（栄研），指示量 上層：肉汁培地（栄研），指示量；ゼラチン,25と肉汁
寒天培地，指示量の1:10混合物 （菌学的観察結果） （ａ）顕微鏡的観察結果 菌体の大きさは、0.9〜1.0μｍ×2.5〜3.0μｍの桿菌
であり、菌体内に中立乃至準端立芽胞（1.0〜1.3μｍ×
1.5〜2.0μｍ）を形成する。又、周鞭毛を有して運動性
があり、グラム染色では陽性を示した。

（ｂ）各種培地における生育状態 肉汁寒天培地（培地Ａ） 集落の形状は円形であり、集落の表面は偏平である。
又、集落の色調は白色乃至淡黄色の不透明であり、光沢
がない。

肉汁液体培地（培地Ｂ） 生育し、混濁する。

７％食塩肉汁液体培地（培地Ｃ） 生育し、混濁する。

（ｃ）生理学的性質 硝酸塩の還元（培地Ｄ） 硝酸還元する。

MRテスト（培地Ｅ） 陽性。

VPテスト（培地Ｅ） 陽性。

インドールの生成（培地Ｄ） 蓚酸紙を用いる試験により、陰性。

硫化水素の生成（培地F,培地Ｄ） 培地Ｆを黒変せず、また酢酸鉛試験紙により、陰性。

澱粉の加水分解（培地Ｇ） ヨウ素反応による検出法により、陰性。

クエン酸の利用（培地Ｈ） クエン酸を利用し、生育する。

カタラーゼ 陽性 生育温度範囲（培地Ｂ） 10℃から50℃の範囲で生育する。

嫌気条件下での生育（培地Ｉ） 生育せず。

グルコースからガスの生育（培地Ｊ） 陰性 糖類からの酸の生成（培地Ｊ） グルコース；陽性 アラビノース；陰性 キシロース；陰性 マンニトール；陰性 カゼインの加水分解（培地Ｋ） 平板培地上に生育し、集落周辺にカゼインの加水分解
による透明帯を形成。

ゼラチンの液化（培地Ｌ） 平板培地上に生育し、集落周辺のゼラチンを液化す
る。

以上の菌学的性質についてバージーズ・マニュアル・
オブ・ディターミネイティブ・バクテリオロジー（Berg
ey′s Mannual of Determinative Bacteriology）第８
版及びザ・ジーナス・バチルス（“The Genus Bacillu
s"Ruth,E.Gordon Agriculture Hand−book No.427,Agri
cultural Research Service,U.S.Department of Agricu
lturue Washington D.C.,（1973））を参照した結果、
本菌は有胞子桿菌であるバチルス（Bacillus）属の一種
であると認められた。更に、当該菌株を他のバチルス属
の菌株と比較すると、最も類縁の菌種として、バチルス
プミルス（Bacillus pumilus）及び枯草菌（バチルス
ズブチリス（Bacillus subtilis））が挙げられる。
しかしながら、いずれの菌株との比較に於いてもアラビ
ノース、キシロース及びマンニトールからの酸の生成の
有無の点で異なり、また、バチルスプミルスとは硝酸塩
の還元能の有無、更に、枯草菌とは澱粉の加水分解能の
有無の点でそれぞれ異なった性質を有していることか
ら、本菌株を新菌株であると判断し、工業技術院微生物
工業技術研究所に微工研菌寄第11223号として寄託し
た。

斯かる供与菌株から染色体DNAを得る方法としては、
例えば、マーマーの方法（Marmur,Mol. Biol.,3巻,208
頁，（1961））や斉藤と三浦の方法（Biochim. Biophy
s. Acta,72巻,619頁，（1963））等が挙げられるが、他
の類似な方法を用いることもできる。斯くして得られた
染色体DNAを制限酵素で切断することによって、本発明
のセルラーゼ遺伝子を含むDNA断片を調製することがで
きる。ここで用いる制限酵素の種類としては、当該遺伝
子を分断しないものであれば、如何なるものでも使用で
き、このような制限酵素の例としては、HindIII、EcoRI
或いはBamHI等の制限酵素が挙げられる。また、用いる
制限酵素が当該遺伝子上の酵素活性発現に必須な領域を
分断しないものであれば、当該遺伝子の一部を含むDNA
断片を調製できる。更に、当該遺伝子或いは活性必須領
域を切断する制限酵素を用いる場合においても、通常の
部分切断の条件を用いることによって当該遺伝子の全領
域を含むDNA断片を調製することが可能である。

一方、用いる宿主・ベクター系としては、宿主菌株が
本発明のセルラーゼ遺伝子を発現させることができ、ま
た組換えDNA分子が宿主菌中で複製可能であり、組み込
んだ当該遺伝子を安定に保持できるものであれば、如何
なるものも使用することができる。例えば、大腸菌（エ
シェリヒアコリ（Escherichia coli））Ｋ−12株を宿主
とするEK系や枯草菌（Bacillus subtilis）Marburg株を
宿主とするBM系等が挙げられるが、遺伝学的に最もよく
研究されており、ベクターの種類が豊富であるEK系を用
いると良い結果が得られる。宿主菌株の具体例として
は、EK系ではHB101株、C600株、JM109株等が、BM系では
BD170株、MI112株等が挙げられる。ベクターとしては、
染色体DNAを切断した制限酵素によって唯一ケ所で切断
されるプラスミドベクターを用いれば、染色体DNA断片
との結合の際に便利である。具体的には、供与菌株の染
色体DNAをHindIIIで切断した場合、EK系ではpBR322やpU
C12、pUC18等のベクター、またBM系ではpC194やpBD8等
のベクターを用いることができる。また、供与染色体DN
Aを切断する制限酵素が、用いるベクターを切断しない
場合についても、合成リンカーを用いる方法やホモポリ
マー結合法（NelsonとBrutlag,Methods in Enzymology,
68巻,41頁,Academic Press,New York,（1980））等を用
いることによって、実施することができる。

次いで、上述の染色体DNA断片と制限酵素によって切
断したベクターDNA分子を結合することにより、組換えD
NA分子を作製するが、結合の方法としては、例えばDNA
リガーゼを使用する方法やホモポリマー結合法等を用い
ることができる。

組換えDNA分子による宿主菌株の形質転換の方法は特
に限定されないが、例えばEK系宿主菌株の場合には、塩
化カルシウム法（MandelとHiga,J. Mol. Biol.,53巻,15
9頁，（1970））や塩化ルビシウム法（BolivarとBackma
n,Method in Enzymology,68巻,253頁,Academic Press
（1979））等を、またBM系宿主菌株の場合には、コンプ
テント・セル法（ContenteとDabnau,Mol. Gen. Genet.,
177巻,459頁，（1979））やプロトプラスト法（Changと
Cohen,Mol. Gen. Genet.,168巻,111頁，（1978））等を
用いることができる。

組換え微生物の選択は、先ずベクターDNA分子上にコ
ードされている抗生物質耐性等の形質のうち、外来染色
体DNA断片の挿入によって失活しない形質を指標とし
て、ベクター由来のDNA断片を含むDNA分子によって形質
転換されたものを一次選択する。具体的には、例えばベ
クターとしてEK系のpBR322を用い、このHindIII切断部
位に染色体DNAのHindIII断片を挿入した場合には、テト
ラサイクリン耐性遺伝子が失活するので、遺伝子中にHi
ndIII切断部位を持たないアンピシリン耐性を指標とし
て一次選択を行えば良い。

次にこれを適当な寒天プレートにレプリカ法等によっ
て移植して、培養によって集落を出現させた後、カルボ
キシメチルセルロース（CMC）とリゾチームを含み、適
当な緩衝液によってpHを５付近に調整した寒天（45℃乃
至50℃）を重層し、固化後、更に培養を継続する。この
後、例えばコンゴー・レッド法（TeatherとWood,Appl.
Environ. Microbiol.,43巻,777頁（1982））等によって
集落周辺のCMCを分解した菌株を目的の組換え微生物と
して選択することができる。

斯くして得られた組換え微生物が保持する組換えDNA
分子は、通常のプラスミド調製法或いはファージDNA調
製法（Maniatisら，Molecular Cloning,Cold Spring H
arbor Laboratory,New York,（1982）等）を用いて抽出
でき、更に各種制限酵素による切断パターンを電気泳動
法等によって解析することによって、組換えDNA分子が
ベクターDNA分子とセルラーゼ遺伝子を含むDNA断片が結
合したものであることを確認できる。本発明に於けるセ
ルラーゼ遺伝子は第２図に示した制限地図を有する約3.
1KbのDNA断片に含まれており、太線で示した約1.8Kbの
部分に存在している。

この約1.8Kb断片は第３図に示したヌクレオドド配列
を有している。本配列は第２図に太線で示した約1.8Kb
断片の右側から左側に向けての配列を５′から３′の方
向に示したものである。本配列中にヌクレオチド番号１
番のATGから翻訳を開始し、第１図に記載のアミノ酸463
残基から成る配列をコードするオープン・リーディング
・フレームが認められる。オープン・リーディング・フ
レームの12ベース（ｂ）上流に枯草菌の16SリボゾームR
NAの３′末端の配列（McLaughlinら，J. Biol. Chem.,2
56巻,11283頁，（1981））と相補性が高いGGAGATGA配列
が存在し、更に上流には、ヌクレオチド番号−191以降
にσ⁴³型プロモーターの共通配列（Gittら，J. Biol. C
hem.,260巻,7178頁，（1985）等）と相同性の高いTAGAA
A……19b………TATATT配列が存在する。また、ヌクレオ
チド番号1390〜1392番の翻訳終止コドンTAAの下流には
転写ターミネーターと思われるインバーティッド・リピ
ート配列が２箇所に存在する（ヌクレオチド番号1402〜
1426及び1466〜1506）。

本発明のセルラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列及び推
定されるセルラーゼのアミノ酸配列をこれまでに知られ
ているセルラーゼと比較したところ、本遺伝子は独自の
ヌクレオチド配列を有しており、且つコードされるアミ
ノ酸の配列も他のセルラーゼのものとは異なっており新
規なものであった。

本発明のセルラーゼ遺伝子の全領域を含む組換えDNA
分子の好適な例として、プラスミドpKC330（第４図）等
が挙げられる。本プラスミドはベクタープラスミドpBR3
22のHindIII切断部位にバチルス エスピー KSM−330
（FERM P−11223）株由来であり、第２図に示す約3.1Kb
のDNA断片を挿入したものである。尚、この約3.1KbのHi
ndIII断片がKSM−330由来であることは、プラスミドpKC
330より単離した当該DNA断片をプローブとしたサザン・
ハイブリダイゼーション実験によって確認されている
（第５図）。また、KSM−330株の培養液から精製したセ
ルラーゼ KC−Ｉのアミノ末端側20残基のアミノ酸配列
は、当該プラスミドpKC330より単離したDNA断片中のヌ
クレオチド配列から推定されるアミノ酸配列（第１図）
の56番以降の配列と一致した。

組換えDNA分子を含有する組換え微生物の好適な例と
しては、大腸菌HB101（pKC330）株が挙げられる。この
菌株は組換えプラスミドpKC330を大腸菌HB101株に通常
の形質転換法を用いて導入したものであり、エシェリヒ
ア層細菌の培養に通常用いられる培地で培養することに
より菌体内にセルラーゼを生産する。生産された当該酵
素の最適反応pHは５〜5.5であり、遺伝子の供与菌株で
あるバチルスエスピー KSM−330（FERM P−11223）が
生産するセルラーゼの値と良く一致する（第６図）。

上記の組換えプラスミドからセルラーゼ遺伝子の全領
域或いは活性必須領域を含むDNA断片を単離する方法と
しては、組換えプラスミドを制限酵素HindIIIによって
切断した後、アガロースゲル電気泳動法によって、DNA
断片を分離し、ゲルより抽出・精製することによって実
施できる。ゲルからDNA断片を抽出・精製する方法とし
ては、電気溶出法（McDonnellら，J. Mol. Biol.,110
巻,119頁，（1977））や低融点アガロースゲルを用いる
方法（Weislander,Anal. Biochem.,98巻,305頁，（197
9））などが挙げられる。

〔発明の効果〕

本発明によれば酸性側pH領域において最適の活性を示
すセルラーゼの遺伝子及びこれを含有する微生物が得ら
れ、これらを利用すれば当該セルラーゼの生産が可能で
ある。

〔実施例〕

以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。

尚、本発明においてセルラーゼ（CMCアーゼ）活性は
以下の様に測定した。即ち、2.5％CMC（山陽国策パルプ
社製 サンローズA01MC）0.4ml、0.5Mクエン酸緩衝液
（pH5.2）0.2ml及び脱イオン水0.3mlからなる基質溶液
に酵素液0.1mlを加え、40℃で反応した後、生成した還
元糖を3,5−ジニトロ−サリチル酸（3,5−dinitro−sal
icylic acid（DNS））法（SumnerとSomers,Laboratory
Experiments in Biological Chemistry,Academic Pres
s,New York,34頁，（1944））によって定量した。酵素
力価は、上記の条件下で１分間に１μmolのグルコース
に相当する還元糖を生成する酵素量を１単位とした。ま
た、蛋白定量はバイオ・ラド プロテイン アッセイ
キット（バイオ・ラド社製）を用いて行い、牛血漿アル
ブミンを標準蛋白として算出した。

実施例１ セルラーゼを生産するバチルス エスピー KSM−330
（FERM P−11223）を5mlのＰ培地（ポリペプトン（大五
栄養化学社製）1.0％、酵母エキス（ディフコ社製）0.5
％、KH₂PO₄ 0.1％、Na₂HPO₄・12H₂O 0.25％、MgSO₄・７
H₂O 0.02％）に接種し、30℃で24時間振盪培養を行った
後、この1mlを100mlの同培地に接種して30℃で更に12時
間振盪培養した。この後、遠心分離によって菌体を集
め、斉藤と三浦の方法（Biochem. Biophys. Acta,72巻,
619頁，（1963））に従って約50μｇの精製染色体DNAを
得た。

実施例２ 実施例１で得られた染色体DNA10μｇを制限酵素反応
液（10mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.5）、10mM MgCl₂、5
0mM NaCl、1mMジチオスレイトール）に溶解し、これに
制限酵素HindIII（ベーリンガー マンハイム社製）10
単位を加えて37℃で２時間インキュベーションし、染色
体DNAの切断を行った。フェノール処理によって制限酵
素を除去したのち、同じくHindIIIで切断したベクター
プラスミドpBR322（ベーリンガー マンハイム社製）１
μｇを加え、エタノール沈澱を行った。得られたDNAの
沈澱をリガーゼ反応液（20mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.
5）、10mM MaCl₂、10mMジチオスレイトール、1mM ATP）
50μｌに溶解した。これにT₄DNAリガーゼ（ベーリンガ
ー マンハイム社製）２単位を加え、16℃で12時間反応
を行い、染色体DNA断片とベクタープラスミドを結合さ
せて組換えプラスミドを作製した。

実施例３ 実施例２で作製した組換えプラスミドによる大腸菌の
形質転換は市販のE.coli HB101コンピテントセル（宝酒
造社製）を用いて行った。形質転換処理を行った菌懸濁
液をアンピシリン（ナトリウム塩、シグマ社製）50μg/
mlを含むLB寒天プレート培地（トリプトン（ディフコ社
製）1.0％、酵母エキス（ディフコ社製）0.5％、NaCl
1.0％、バクト寒天（ディフコ社製）1.5％）に塗抹し37
℃で12時間培養した。出現した形質転換体の各集落を、
それぞれ、２枚のLB寒天プレート培地（アンピシリンを
含む）にレプリカ法によって移植し、更に37℃で24時間
培養した。培養後、CMC0.5％、リゾチーム（シグマ社
製）1mg/mlを含み、100mMのクエン酸緩衝液によってpH
を５に調製した1.0％寒天液（加熱溶解後45℃〜50℃に
保温）を重層して固化後、更に培養を継続した。この結
果、集落周辺のCMCを分解した菌株をコンゴー・レッド
法（TeatherとWood,Appl. Environ. Microbiol.,43巻,7
77頁，（1982））を用いて選択し、目的の組換え微生物
１株を分離した。

実施例４ 実施例３で得られた組換え微生物を、アンピシリン
（50μg/ml）を含む5mlのLB培地（トリプトン（ディフ
コ社製）1.0％、酵母エキス（ディフコ社製）0.5％、Na
Cl 1.0％）にそれぞれ接種し、37℃で一夜静置培養した
後、これを500mlのM9CA培地（Na₂HPO₄ 0.6％、KH₂PO₄
0.3％、NaCl 0.05％、NH₄Cl 0.1％、カザミノ酸（ディ
フコ社製）0.2％、MgSO₄ 2mM（別滅菌）、CaCl₂ 0.1mM
（別滅菌）、グルコース0.2％（別滅菌）、アンピシリ
ン50μg/ml（除菌））に移植し、37℃で約５時間振盪培
養した。これにクロラムフェニコール（シグマ社製）17
0mgを添加し、更に37℃で15時間振盪培養した。この培
養液より遠心分離によって菌体を集め、常法（Maniatis
ら，Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laborator
y,（1982））に従って、組換えプラスミド約500μｇを
調製した。得られた組換えプラスミドの制限酵素切断地
図を作製したところ、第２図に示した約3.1KbのHindIII
断片が含まれていることが明らかになり、これをプラス
ミドpKC330と命名した。また、pKC330によって形質転換
された大腸菌HB101株をHB101（pKC330）と命名した。

実施例５ 組換えプラスミドpKC330 1μｇを10mM酢酸マグネシウ
ム、66mM酢酸カリウム及び0.5mMジチオスレイトールを
含む33mMトリス酢酸緩衝液（pH7.9）50μｌに溶解し、
制限酵素HpaI（ベーリンガー マンハイム社製）２単位
を加えて37℃で２時間反応させた。反応後フェノール処
理によってHpaIを除去し、エタノール沈澱を行った後、
沈澱をリガーゼ反応液（20mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.
5）、10mM MgCl₂、10mMジチオスレイトール、1mM ATP）
20μｌに溶解した。これにT₄DNAリガーゼ２単位を加
え、16℃で12時間の結合反応を行った。この後、実施例
３の方法に従って大腸菌HB101株の形質転換を行い、得
られた形質転換株のセルラーゼ生産性の有無を調べた。
また、形質転換株から、アルカリ溶菌法によってプラス
ミドを抽出し、目的のDNA断片がベクタープラスミドpBR
322に挿入されていることを確認した。この結果、第１
図に示した約3.1KbのDNA断片から約1.0KbのHpaI断片が
欠失した組換えプラスミドを有する組換え微生物が得ら
れ、この微生物がセルラーゼを生産することから、セル
ラーゼ遺伝子は第２図に示した制限地図に於いて左端の
HindIII切断点からHpaI切断点（２箇所のうち、左側）
に至る約1.8Kbの領域に存在する事が示唆された。

実施例６ 5mlのLB培地で一晩静置培養したHB101（pKC330）株の
培養液1mlを100mlのLB培地（アンピシリン50μg/mlを含
む）に接種し、37℃で24時間振盪培養した。培養後、培
養液を遠心分離し、沈澱した菌体を10mlのリン酸緩衝液
（pH7.0）に懸濁後、超音波破砕を行った。再度、遠心
分離によって不溶物を沈澱として取り除き、得られた上
清液のCMCアーゼ活性の作用pH範囲及び最適作用pHを求
めたところ（第６図）、本酵素はpH4.5〜6.5の範囲で作
用し、pH5.0〜5.5に最適作用pHを有することが明らかと
なり、セルラーゼ遺伝子の供与体であるバチルス エス
ピーKSM−330（FERM P−11223）株が生産するセルラー
ゼの性質と良く一致した。

実施例７ 約５μｇのpKC330を制限酵素HindIIIによって切断
後、アガロースゲル電気泳動を行い、ゲルから電気溶出
法（McDonnellら，J. Mol. Biol.,110巻,119頁，（197
7））によって、約3.1KbのHindIII断片約0.5μｇを単離
した。このHindIII断片をDNAラベリング＆ディテクショ
ン キット（ベーリンガー マンハイム社製）を用いて
ラベル化することによって、プローブDNAを調製した。
一方、HindIIIによって切断したバチルス エスピー K
SM−330（FERM P−11223）株由来の染色体DNA（各３μ
ｇ）をアガロースゲル電気泳動後、DNAバンドをエレク
トロ ブロッティング装置（バイオ・ラド社製）を用い
て、ゼータ・プローブ膜（バイオ・ラド社製）に移した
後、DNAラベリング＆ディテクション キットを用いて
プローブDNAとのハイブリダイゼーションを行った。

この結果、第５図に示したように、KSM−330株由来の
染色体DNAのHindIII切断物中には、用いたプローブDNA
とハイブリダイズする約3.1KbのDNA断片が存在すること
が認められ、この結果、プラスミドpKC330に含まれる約
3.1KbのHindIII断片は、バチルス エスピー KSM−330
（FERM P−11223）株の染色体DNA由来である事が確認さ
れた。

実施例８ 第２図に示した約1.8Kb断片をSpeI、ScaI或いはHpaI
の各制限酵素或いはKpnIとHpaIの２種類の制限酵素によ
って切断することにより、1.0Kb〜1.7Kbの小断片を調製
し、これらをM13ファージベクター（Messing,Methods i
n Enzymol.,101巻,20頁，（1983））の１種mp18及びmp1
9（ベーリンガー マンハイム社製）のマルチプルクロ
ーニング部位に挿入し、市販のE. coli JM109コンピテ
ントセルを用いて形質転換を行った。これを3mlのLB軟
寒天培地（バクト寒天0.8％、他はLB寒天培地と同組
成、加熱溶解後、45℃〜50℃に保温）に加え、更に指示
菌としてJM109株の対数増殖後期の培養液0.2mlを加えて
LB寒天プレート培地上に重層し、固化後、37℃で一夜培
養した。出現したプラークから爪楊枝によってファージ
を釣り上げ、対数増殖初期のJM109株を含む3mlの2xYT培
地（トリプトン（ディフコ社製）1.6％、酵母エキス
（ディフコ社製）1.0％、NaCl 0.5％）に接種して37℃
で５〜６時間振盪培養した。培養液を遠心分離して得ら
れた菌体からアルカリ溶菌法によって２本鎖の複製型
（RF）ファージDNAを抽出し、制限酵素による切断パタ
ーンから、目的のDNA小断片が含まれていることを確認
した。一方、培養上清液1mlに0.2mlの20％ポリエチレン
グリコール（シグマ社製、分子生物用、平均分子量約80
00）−1M NaCl溶液を加えて室温で15分間放置後、遠心
分離によって凝集沈澱したファージを分離し、フェノー
ル抽出によって目的の小断片を含む１本鎖DNAを調製
し、これをヌクレオチド配列決定用の試料とした。ヌク
レオチド配列の決定は蛍光プライマーを用いる方法（Sm
ithら，Nucleic Acids Res.,13巻,2399頁，（1985））
に従って、アプライド バイオ システム社製のモデル
370A DNAシークエンサーを用いて行った。更に、市販の
キロシークエンス用デレーションキット（宝酒造社製）
と適当な２種類の制限酵素を用いて、各小断片を含むRF
ファージDNAの欠失型変異DNAを作製し、これらをJM109
株へ導入して１本鎖DNAを調製し、同様にヌクレオチド
配列を決定した。各１本鎖DNA試料から得られた約300〜
450bのヌクレオチド配列を重ね合わせる事によって、セ
ルラーゼ遺伝子を含む全1816bの配列を決定した（第３
図）。

参考例１ 栃木県真岡市の土壌1gを滅菌生理食塩水10mlに懸濁
し、80℃で30分間加熱処理した。この熱処理液を適当に
希釈してＰ寒天プレート培地（ポリペプトン1.0％、酵
母エキス0.5％、KH₂PO₄ 0.1％、Na₂HPO₄・12H₂O 0.25
％、MgSO₄・７H₂O 0.02％、バクト寒天）に塗抹し30℃
で３日間培養し、集落を形成させた。レプリカ法によ
り、マスタープレートと同じ組成の培地に２％CMCを加
えた滅菌寒天培地に移植し、30℃で３〜４日間培養して
集落を形成させた後、コンゴー・レッド法によって、集
落周辺のCMCを分解する能力のある菌株を検出した。該
当する集落をマスタープレートより選択しセルラーゼ生
産菌を分離した。

上述の手法により、バチルス エスピー KSM−330
（FERM P−11223）を取得した。

参考例２ 10mlのＰ培地中、30℃で24時間振盪培養したバチルス
エスピー KSM−330（FERM P−11223）を1.0％の麦芽
糖を含むＰ培地に接種し、30℃で24時間振盪培養した。
その培養上清液１を限外濾過（ホローファイバー H1
P3−20、アミコン社製）によって約５倍に濃縮後、10mM
リン酸緩衝液（pH7.2）に対して透析し、これを粗酵素
溶液とした。

粗酵素溶液約150mlをCMC−バイオ・ゲルＡ カラム
（3.2×20cm）に通し、非吸着画分を350mlの10mMのリン
酸緩衝液（pH7.2）によって洗浄後、NaClの直線濃度勾
配（０〜0.2M）による溶出を行うことによって、２種の
セルラーゼ（KCI及びKCII）が分画された。両酵素はレ
ームリの方法（Laemmli,Nature,227巻,680頁，（197
0））に従ってドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動を行い、ゲルを電気泳動用銀染色キ
ット（関東化学社製）を用いて染色したところ、いずれ
も単一のバンドを与えた。得られた２種類の精製セルラ
ーゼの構成比（KCI:KCII）は約14:1であり、生産される
セルラーゼの主成分はKC−Ｉであることが認められた。

バチルス エスピー KSM−330（FERM P−11223）が
生産するセルラーゼの物理化学的性質は次の通りであ
る。

（酵素学的性質） 1.作用 セルロース類に作用し、これらを加水分解してセロビ
オース等の還元糖を生成する（KC−Ｉ及びKC−II）。

2.基質特異性 KC−ＩはCMCに対する活性を主活性として有する他
に、リン酸膨潤セルロース（CMCに対して約７％）、ア
ビセル（同約５％）、セルロース粉末（同約１％）に対
する活性を有している。一方、ｐ−ニトロフェニルセロ
ビオシド（PNPC）、及びｐ−ニトロフェニルグルコシド
（PNPG）に対しては殆ど作用しない。

3.作用pH及び至適作用pH KC−Ｉ、KC−II共に作用pHは4.5〜6.5、最適作用pHは
5.0〜5.5に認められる。

4.安定pH領域 pHの異なる緩衝液の下、５℃で24時間放置した時の安
定pH領域はKC−Ｉ、KC−IIいずれもpH3.0〜11.0の範囲
である。

5.作用温度範囲及び作用至適温度 KC−Ｉ及びKC−IIは10℃から60℃の広い範囲で作用す
るが、作用至適温度は45℃に認められる。

6.熱安定性 KC−Ｉ、KC−IIいずれも、クエン酸緩衝液（pH5）の
下で、各温度で10分間加熱処理した場合、50℃以下で殆
ど失活せず、55℃で約50％の残存活性を有するが、60℃
ではほぼ完全に失活する。

7.分子量 バイオゲル Ｐ−100（バイオ・ラド社製）を用いた
ゲル濾過法により約39000±3000、ドデシル硫酸ナトリ
ウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（SDS−PAG
E）により約42000±3000と推定される（KC−Ｉ及びKC−
II）。

8.UV吸収スペクトル KC−ＩとKC−IIのUV吸収スペクトルはいずれも約280n
mに最大吸収を示し、また、約290nmに肩吸収の存在が認
められる。

9.金属による影響（KC−Ｉ） 酵素反応液中に各種の金属イオンを共存させた場合、
水銀イオン（1mM）による酵素活性の阻害が認められ
る。一方、酵素活性はコバルトイオン（1mM）によって
若干活性化される。

10.各種薬剤の影響（KC−Ｉ及びKC−II） ３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（MOPS）
−水酸化ナトリウム緩衝液（pH7.2）中でＮ−ブロモコ
ハク酸イミド（1mM）による処理（30℃、20分間）を行
った場合、酵素の失活が認められる。

【図面の簡単な説明】

第１図はセルラーゼのアミノ酸配列を示す図面である。 第２図はセルラーゼ遺伝子を含む約3.1KbのDNA断片の制
限地図である。太線部分にアルカリセルラーゼ遺伝子が
含まれる。 第３図はセルラーゼ遺伝子を含む約3.1Kbの断片のヌク
レオチド配列である。 第４図は組換えプラスミドpKC330の制限地図であり、細
線部分はベクターpBR322由来、太線部分はバチルス エ
スピー KSM−330株由来のDNA断片を示している。 第５図はプラスミドpKC330由来の約3.1KbのHindIII断片
をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション実験の
結果である。 第６図はHB101（pKC330）株が菌体内に生産するアルカ
リセルラーゼの作用pH範囲及び最適作用pHを示すグラフ
である。●はHB101（pKC330）由来のセルラーゼ、○は
バチルス エスピー KSM−330株由来のセルラーゼ（粗
酵素）、△はKCI、▲はKCIIのデーターである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，10（６) （1988），Ｐ．347−351 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12C 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下に示すアミノ酸配列を有するセルラー
   ゼをコードするDNA断片。
2. 【請求項２】請求項１記載のアミノ酸配列の一部の領域
   が欠失した配列を有するセルラーゼをコードするDNA断
   片。
3. 【請求項３】欠失したアミノ酸配列の領域がアミノ酸番
   号１〜55までの領域である請求項２記載のDNA断片。
4. 【請求項４】請求項１〜３のいずれか１項に記載のアミ
   ノ酸配列を分子内の一部に含むセルラーゼをコードする
   DNA断片。
5. 【請求項５】請求項１〜４のいずれか１項に記載のアミ
   ノ酸配列に対して、アミノ酸の置換、欠失、逆位、及び
   挿入などによって関連づけられており、且つセルラーゼ
   活性を有する蛋白をコードする天然、合成、或いは半合
   成のDNA断片。
6. 【請求項６】請求項１〜５のいずれか１項に記載のDNA
   断片が、遺伝子の発現調節の為のDNA配列を含有するこ
   とを特徴とするDNA断片。
7. 【請求項７】請求項１〜６のいずれか１項に記載のDNA
   断片を分子内に含むことを特徴とするDNA分子。
8. 【請求項８】請求項７記載のDNA分子を含有する微生
   物。