JP2562169B2 - 耐熱性β−グルコシダーゼ遺伝子ＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換え体プラスミド、該プラスミドを含む形質転換微生物及び耐熱性β−グルコシダーゼの製造法 - Google Patents
耐熱性β−グルコシダーゼ遺伝子ＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換え体プラスミド、該プラスミドを含む形質転換微生物及び耐熱性β−グルコシダーゼの製造法Info
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- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
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- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は耐熱性β−グルコシダーゼ遺伝子DNA、該DNA
をベクタープラスミドに連結した組換え体プラスミド及
び該プラスミドを導入した形質転換微生物及び該形質転
換微生物による耐熱性グルコシダーゼの製造法に関す
る。
をベクタープラスミドに連結した組換え体プラスミド及
び該プラスミドを導入した形質転換微生物及び該形質転
換微生物による耐熱性グルコシダーゼの製造法に関す
る。
β−グルコシダーゼは、セルロースをセルラーゼ処理
した際の分解産物であるセロビオース又はセロオリゴ糖
に作用し、それらをグルコース単位に加水分解する酵素
である。このような性質からβ−グルコシダーゼはバイ
オマスとしてのセルロースを食糧又は燃料資源として利
用する場合、有用な酵素として知られている。
した際の分解産物であるセロビオース又はセロオリゴ糖
に作用し、それらをグルコース単位に加水分解する酵素
である。このような性質からβ−グルコシダーゼはバイ
オマスとしてのセルロースを食糧又は燃料資源として利
用する場合、有用な酵素として知られている。
β−グルコシダーゼは植物、かび、酵母あるいは細菌
等自然界に広く分布しているが、工業的に利用するため
には熱及び薬剤に対して安定であることが要求される。
従来種々の微生物のβ−グルコシダーゼについて研究さ
れているが、サーマス（Thermus）属に属する微生物の
β−グルコシダーゼについては知られていない。
等自然界に広く分布しているが、工業的に利用するため
には熱及び薬剤に対して安定であることが要求される。
従来種々の微生物のβ−グルコシダーゼについて研究さ
れているが、サーマス（Thermus）属に属する微生物の
β−グルコシダーゼについては知られていない。
本発明者等は先にサーマス属に属する細菌株を見出し
特許出願した（特願昭62−26216）が、これらの菌株が
耐熱性を有するβ−グルコシダーゼを産出することを見
出した。しかしながら、これらの新菌株（例えばサーマ
ス属ZK−001（FERM P−9184サーマス属ZK−002（FERM P
−9185）、サーマス属ZK−003（FERM P−9186等）から
β−グルコシダーゼを採取する場合次のような問題があ
った。
特許出願した（特願昭62−26216）が、これらの菌株が
耐熱性を有するβ−グルコシダーゼを産出することを見
出した。しかしながら、これらの新菌株（例えばサーマ
ス属ZK−001（FERM P−9184サーマス属ZK−002（FERM P
−9185）、サーマス属ZK−003（FERM P−9186等）から
β−グルコシダーゼを採取する場合次のような問題があ
った。
サーマス属に属する菌株の成育適温は65〜75℃であ
り、培養には高温用に設計された特殊な装置を使用しな
ければならないこと。
り、培養には高温用に設計された特殊な装置を使用しな
ければならないこと。
培養は高温で行わなければならないこと。
培養物からのβ−グルコシダーゼの精製が繁雑であ
ること。
ること。
培地に特殊な成分（セロビオース）を添加しなけれ
ば収量が低いこと。
ば収量が低いこと。
本発明者等は簡易な方法で耐熱性β−グルコシダーゼ
をサーマス属に属する微生物から取得するための研究を
重ねた結果、遺伝子工学の手法によりサーマス属に属す
る微生物の遺伝子からβ−グルコシダーゼ産生に関する
DNAを特定し、そのDNAを単離し、単離したDNAをベクタ
ープラスミドに組込み、このプラスミドを通常の微生
物、例えばエッシェリヒア（Esherichia）属に属する微
生物に導入し、その微生物を通常の方法で培養し、耐熱
性のβ−グルコシダーゼを高い収量で得ることを見出
し、本発明を完成した。
をサーマス属に属する微生物から取得するための研究を
重ねた結果、遺伝子工学の手法によりサーマス属に属す
る微生物の遺伝子からβ−グルコシダーゼ産生に関する
DNAを特定し、そのDNAを単離し、単離したDNAをベクタ
ープラスミドに組込み、このプラスミドを通常の微生
物、例えばエッシェリヒア（Esherichia）属に属する微
生物に導入し、その微生物を通常の方法で培養し、耐熱
性のβ−グルコシダーゼを高い収量で得ることを見出
し、本発明を完成した。
本発明の目的は耐熱性β−グルコシダーゼを簡易な方
法で、高収量で得ることにある。
法で、高収量で得ることにある。
本発明の他の目的な新規な耐熱性β−グルコシダーゼ
遺伝子DNAを得ることにある。
遺伝子DNAを得ることにある。
本発明の他の目的は新規な耐熱性β−グルコシダーゼ
遺伝子DNAを含む組換え体プラスミドを得ることにあ
る。
遺伝子DNAを含む組換え体プラスミドを得ることにあ
る。
更に本発明の他の目的は新規な耐熱性β−グルコシダ
ーゼ遺伝子DNAを含む組換え体プラスミドを導入した微
生物を得ることにある。
ーゼ遺伝子DNAを含む組換え体プラスミドを導入した微
生物を得ることにある。
耐熱性β−グルコシダーゼの遺伝子情報を担うDNA
（以下β−glu.DNAと略記する）はサーマス属に属する
微生物から次のようにして単離する。サーマス属に属す
る微生物としては、例えばサーマス属ZK−001（FERM P
−9184）、サーマス属ZK−002（FERM P−9185）、サー
マス属ZK−003（FERM P−9186）等を用いることができ
る。サーマス属に属する微生物からのβ−glu.DNAの単
離、精製は常法、例えばサイトウ及びミウラの方法（Bi
ochimica Biophysica Acta,72巻619ページ、1693年）に
より行うことができる。即ち、リゾチーム（生化学工業
社製）により菌体を溶菌し、SDS含有アルカリ性緩衝液
とフェノールでβ−glu.DNAを抽出し、更に混在するRNA
をRNアーゼで分解し、β−glu.DNAを単離、精製する。
（以下β−glu.DNAと略記する）はサーマス属に属する
微生物から次のようにして単離する。サーマス属に属す
る微生物としては、例えばサーマス属ZK−001（FERM P
−9184）、サーマス属ZK−002（FERM P−9185）、サー
マス属ZK−003（FERM P−9186）等を用いることができ
る。サーマス属に属する微生物からのβ−glu.DNAの単
離、精製は常法、例えばサイトウ及びミウラの方法（Bi
ochimica Biophysica Acta,72巻619ページ、1693年）に
より行うことができる。即ち、リゾチーム（生化学工業
社製）により菌体を溶菌し、SDS含有アルカリ性緩衝液
とフェノールでβ−glu.DNAを抽出し、更に混在するRNA
をRNアーゼで分解し、β−glu.DNAを単離、精製する。
得られたβ−glu.DNAのベクターDNAへの組込みは次の
ように行う。β−glu.DNA及びベクターDNAを制限酵素で
切断し、β−glu.DNA断片及びベクターDNA断片を調製す
る。次いでこれらの混合物をDNAリガーゼ（いずれも東
洋紡社製）で処理し、組換え体を得る。
ように行う。β−glu.DNA及びベクターDNAを制限酵素で
切断し、β−glu.DNA断片及びベクターDNA断片を調製す
る。次いでこれらの混合物をDNAリガーゼ（いずれも東
洋紡社製）で処理し、組換え体を得る。
用いるベクターDNAとしてはpBR322（宝酒造社製品、
カタログ番号3050）、pUC18（宝酒造社製品、カタログ
番号3128）、pUC19（同、3219）、pHSG398（同、339
8）、pHSG399（同、3399）、pDR540ファルマシア製品、
カタログ番号27−4932−01）、pKK223−３（宝酒造社製
品）があり、特にpHSG399が望ましい。制限酵素として
は、Sau 3A I、Hind III等（いずれも東洋紡社製）が用
いられ、DNAリガーゼとしてはT4ファージ由来のDNAリガ
ーゼ（東洋紡社製）が望ましい。
カタログ番号3050）、pUC18（宝酒造社製品、カタログ
番号3128）、pUC19（同、3219）、pHSG398（同、339
8）、pHSG399（同、3399）、pDR540ファルマシア製品、
カタログ番号27−4932−01）、pKK223−３（宝酒造社製
品）があり、特にpHSG399が望ましい。制限酵素として
は、Sau 3A I、Hind III等（いずれも東洋紡社製）が用
いられ、DNAリガーゼとしてはT4ファージ由来のDNAリガ
ーゼ（東洋紡社製）が望ましい。
得られた組換え体のエッシェリヒア属に属する微生物
への導入は、例えばコーエン等の方法（Proceedlngs of
National Academy of Science of USA.69巻、2110ペー
ジ、1972年）により行うことができる。即ち、30mM塩化
カルシウムの存在下でエッシェリヒア・コリ（Esherich
ia coli）JM101株（東洋紡社製。商標EPICURIAN COLIJM
1−01）のコンビテント細胞に組換え体DNAを混合し、氷
上に１時間保持し、42℃で60〜75秒間ヒーショックを与
え、外来DNAを微生物に導入する。
への導入は、例えばコーエン等の方法（Proceedlngs of
National Academy of Science of USA.69巻、2110ペー
ジ、1972年）により行うことができる。即ち、30mM塩化
カルシウムの存在下でエッシェリヒア・コリ（Esherich
ia coli）JM101株（東洋紡社製。商標EPICURIAN COLIJM
1−01）のコンビテント細胞に組換え体DNAを混合し、氷
上に１時間保持し、42℃で60〜75秒間ヒーショックを与
え、外来DNAを微生物に導入する。
β−glu.DNAを組込んだベクターDNAを有する菌株の選
択方法は、当該組換え体DNAを調製するのに使用した制
限酵素及びベクターDNAの種類により異なるが、例えば
制限酵素としてKpn Iを用い、ベクターDNAとしてpHSG39
9を用いた場合には次のように行う。即ち、エッシェリ
ヒア・コリＫ−12株（例えばJM101株）を宿主とした形
質転換株をトリプトン、イーストエキストラクト、食
塩、クロラムフェニコール、寒天を含み、IPTG（イソプ
ロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）を238μg/ml添加
し、更にβ−グルコシダーゼの検出指示薬としてβ−グ
ルコシダーゼにより青変する５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドリルβ−Ｄ−グルコピラノシド（以下Ｘ−gl
uと略記する）を2mg/ml添加した平板培地に培養し、平
板上に出現したクロラムフェニコール耐性コロニーの中
からコロニーが青色に変化した株を選択する。以上のよ
うにして得られた組換え体DNA含有菌株を単離する。
択方法は、当該組換え体DNAを調製するのに使用した制
限酵素及びベクターDNAの種類により異なるが、例えば
制限酵素としてKpn Iを用い、ベクターDNAとしてpHSG39
9を用いた場合には次のように行う。即ち、エッシェリ
ヒア・コリＫ−12株（例えばJM101株）を宿主とした形
質転換株をトリプトン、イーストエキストラクト、食
塩、クロラムフェニコール、寒天を含み、IPTG（イソプ
ロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）を238μg/ml添加
し、更にβ−グルコシダーゼの検出指示薬としてβ−グ
ルコシダーゼにより青変する５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドリルβ−Ｄ−グルコピラノシド（以下Ｘ−gl
uと略記する）を2mg/ml添加した平板培地に培養し、平
板上に出現したクロラムフェニコール耐性コロニーの中
からコロニーが青色に変化した株を選択する。以上のよ
うにして得られた組換え体DNA含有菌株を単離する。
前記のようにして得られた新規な遺伝子組換え微生物
を、20μg/mlのクロラムフェニコール及び238μg/mlのI
PTG（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）を含
有したＬ−ブロスを用いて37℃で５〜24時間培養し、培
養液から菌体を集め、菌体を超音波で破壊するか又はリ
ゾチームで溶菌し、75℃で30分間加熱する。次いで遠心
分離して沈澱を除去し、上清を市販のイオン交換樹脂、
例えばDEAE−セファデックス（ファルマシア社製）、DE
AE−トヨパール650M（東ソー社製）等を用いてβ−グル
コシダーゼを分別する。更にβ−グルコシダーゼを含有
する画分をゲル濾過カラムクロマトグラフィー［例えば
セファクリルＳ−300（ファルマシア社製）を充填した
カラムを使用］により精製し、アクリルアミドゲル電気
泳動法で単一なβ−グルコシダーゼを得ることもでき
る。
を、20μg/mlのクロラムフェニコール及び238μg/mlのI
PTG（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）を含
有したＬ−ブロスを用いて37℃で５〜24時間培養し、培
養液から菌体を集め、菌体を超音波で破壊するか又はリ
ゾチームで溶菌し、75℃で30分間加熱する。次いで遠心
分離して沈澱を除去し、上清を市販のイオン交換樹脂、
例えばDEAE−セファデックス（ファルマシア社製）、DE
AE−トヨパール650M（東ソー社製）等を用いてβ−グル
コシダーゼを分別する。更にβ−グルコシダーゼを含有
する画分をゲル濾過カラムクロマトグラフィー［例えば
セファクリルＳ−300（ファルマシア社製）を充填した
カラムを使用］により精製し、アクリルアミドゲル電気
泳動法で単一なβ−グルコシダーゼを得ることもでき
る。
次に試験例を示した本発明を詳述する。
〔試験例１〕 この試験は形質転換微生物から得られたプラスミド中
の遺伝子DNAとサーマス属に属する微生物から得られた
それとの同一性について行った。実施例３で得た形質転
換株Ｅ−001株からプラスミドをアルカリ−SDS法により
調製し、このプラスミドをpBLA21と命名した。このpBLA
21を制限酵素Sac Iで切断し、アガロース電気泳動で1.0
5キロベースペア（Kb）の断片を回収し、フェノール−
クロロホルムにより精製した。この精製断片と同様に制
限酵素Sac Iで切断したZK−001の染色体DNAとの間でDNA
ディテクション・システム（DNA Ditecti on Suste
m）、ビオチン−11−αUTP及びニックトランスレーショ
ン・リエイテジェント・キット（Nick Translation Rea
gent Kit.いずれもベスタリサーチ・ラボラトリー社
製）を用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。
その結果pBLA21より制限酵素Sac Iを用いて切りだした
1.05KbのDNA断片はサーマス属に属するZK−001株由来の
染色体DNAを制限酵素Sac Iで切断したとき生成した1.05
Kbの断片とハイブリッドすることが示され、pBLA21はZK
−001株のβ−グルコシダーゼ遺伝子を挿入遺伝子とし
て有することが明らかになった。
の遺伝子DNAとサーマス属に属する微生物から得られた
それとの同一性について行った。実施例３で得た形質転
換株Ｅ−001株からプラスミドをアルカリ−SDS法により
調製し、このプラスミドをpBLA21と命名した。このpBLA
21を制限酵素Sac Iで切断し、アガロース電気泳動で1.0
5キロベースペア（Kb）の断片を回収し、フェノール−
クロロホルムにより精製した。この精製断片と同様に制
限酵素Sac Iで切断したZK−001の染色体DNAとの間でDNA
ディテクション・システム（DNA Ditecti on Suste
m）、ビオチン−11−αUTP及びニックトランスレーショ
ン・リエイテジェント・キット（Nick Translation Rea
gent Kit.いずれもベスタリサーチ・ラボラトリー社
製）を用いてサザンハイブリダイゼーションを行った。
その結果pBLA21より制限酵素Sac Iを用いて切りだした
1.05KbのDNA断片はサーマス属に属するZK−001株由来の
染色体DNAを制限酵素Sac Iで切断したとき生成した1.05
Kbの断片とハイブリッドすることが示され、pBLA21はZK
−001株のβ−グルコシダーゼ遺伝子を挿入遺伝子とし
て有することが明らかになった。
〔試験例２〕 この試験は本発明により得た耐熱性β−グルコシダー
ゼの酵素学的性質について行った。実施例３で得た培養
液１を8,000rpmで20分間遠心分離し、菌体17.5gを得
た。この菌体を100mlの0.01Mリン酸緩衝液（pH6.5）に
分散し、超音波処理して菌体を破砕した。菌体破砕液を
75℃で30分間加熱し、15,000rpmで30分間遠心し、菌体
残渣及び変性蛋白質を除去した。次いで上清を0.01Mリ
ン酸緩衝液（pH6.5）に対して充分透析し、同一の緩衝
液で平衡化したDEAE−トヨパール650Mカラム（5X100c
m）にかけ、０〜0.2M塩化ナトリウム・グラジェントで
β−グルコシダーゼ活性画分を分離した。この画分はポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法によりほぼ単一な蛋白
質であり、12.3mgの蛋白質を含み、後述する試験方法に
よる測定で840単位のβ−グルコシダーゼ活性を示し
た。
ゼの酵素学的性質について行った。実施例３で得た培養
液１を8,000rpmで20分間遠心分離し、菌体17.5gを得
た。この菌体を100mlの0.01Mリン酸緩衝液（pH6.5）に
分散し、超音波処理して菌体を破砕した。菌体破砕液を
75℃で30分間加熱し、15,000rpmで30分間遠心し、菌体
残渣及び変性蛋白質を除去した。次いで上清を0.01Mリ
ン酸緩衝液（pH6.5）に対して充分透析し、同一の緩衝
液で平衡化したDEAE−トヨパール650Mカラム（5X100c
m）にかけ、０〜0.2M塩化ナトリウム・グラジェントで
β−グルコシダーゼ活性画分を分離した。この画分はポ
リアクリルアミドゲル電気泳動法によりほぼ単一な蛋白
質であり、12.3mgの蛋白質を含み、後述する試験方法に
よる測定で840単位のβ−グルコシダーゼ活性を示し
た。
得られたβ−グルコシダーゼは第１及び第２図に示す
ように至適温度が80〜85℃、至適pHが4.5〜6.5であり、
サーマス属に属する細菌ZK−001が生産するβ−グルコ
シダーゼとほぼ同一の性質であることが確認された。
ように至適温度が80〜85℃、至適pHが4.5〜6.5であり、
サーマス属に属する細菌ZK−001が生産するβ−グルコ
シダーゼとほぼ同一の性質であることが確認された。
β−グルコシダーゼ活性の測定は次のようにして行っ
た。
た。
パラニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを基
質として使用し、β−グルコシダーゼによって遊離され
るパラニトロフェノールを分光光度計で測定した。即
ち、酵素液0.02mlに0.98mlの基質液（5mMパラニトロフ
ェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、0.05Mリン酸緩衝
液、pH6.5）を加え、70℃で５分間保持し、のち2mlの1M
炭酸ナトリウム液を加えて反応を停止し、400nmの吸光
値を測定した。１分間に１μmoleのパラニトロフェノー
ルを遊離する酵素量を１単位とした。
質として使用し、β−グルコシダーゼによって遊離され
るパラニトロフェノールを分光光度計で測定した。即
ち、酵素液0.02mlに0.98mlの基質液（5mMパラニトロフ
ェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、0.05Mリン酸緩衝
液、pH6.5）を加え、70℃で５分間保持し、のち2mlの1M
炭酸ナトリウム液を加えて反応を停止し、400nmの吸光
値を測定した。１分間に１μmoleのパラニトロフェノー
ルを遊離する酵素量を１単位とした。
〔試験例３〕 この試験は得られたβ−glu.DNAの制限酵素認識部位
について行った。試験例１と同一の方法で得たプラスミ
ドpBLA21を制限酵素BamH I、Kpn I、Sac I、EcoR I、Ps
t I、Hind III、Sal I及びXba I（いずれも東洋紡社
製）を単一又は二重に作用させ、これらの制限酵素によ
る認識部位を決定した。その結果、第３図に示すように
β−glu.DNAはBamH I認識部位を４箇所、Sac I確認部位
を２箇所及びKpn I確認部位を１箇所を有し、EcoR I、P
st I、Hind III、Sal I及びxba I認識部位を有せず、2.
75KbのDNAであることが判明した。
について行った。試験例１と同一の方法で得たプラスミ
ドpBLA21を制限酵素BamH I、Kpn I、Sac I、EcoR I、Ps
t I、Hind III、Sal I及びXba I（いずれも東洋紡社
製）を単一又は二重に作用させ、これらの制限酵素によ
る認識部位を決定した。その結果、第３図に示すように
β−glu.DNAはBamH I認識部位を４箇所、Sac I確認部位
を２箇所及びKpn I確認部位を１箇所を有し、EcoR I、P
st I、Hind III、Sal I及びxba I認識部位を有せず、2.
75KbのDNAであることが判明した。
本発明により、耐熱性β−グルコシダーゼ遺伝子DN
A、該DNAを含む組換え体プラスミド、該組換え体プラス
ミドで形質転換された形質転換体微生物及び該形質転換
体微生物を培養して耐熱性β−グルコシダーゼを工業的
に有利に製造する方法が提供された。
A、該DNAを含む組換え体プラスミド、該組換え体プラス
ミドで形質転換された形質転換体微生物及び該形質転換
体微生物を培養して耐熱性β−グルコシダーゼを工業的
に有利に製造する方法が提供された。
次に実施例を示して本発明を更に詳述する。
実施例１ サーマル属に属する微生物ZK−001（FERM P−9184）
をCastenholzのTYE Medium（ATCC MEDIA HANDBOOK,1st
edition,page22,1984.American Type Culture Collecti
on,Maryland,USA）1.5で70℃、20時間通気攪拌培養
し、遠心して菌体約10gを得た。得られた菌体をTE緩衝
液（pH7.5の5mME DTA/20mMトリス塩酸）50ml分散し、リ
ゾチーム（生化学工業社製）を1mg/mlの割合で加え、37
℃で10分間保持した。次いでSDSを0.5％の割合で加え、
約５分間同温度で保持し、のち60℃で10分間保持して溶
菌した。反応液に等容のフェノール（TEで飽和）を加
え、５℃で10分間緩やかに混合した。次いで8000gで20
分間遠心し、水層を集め、再度フェノール処理を行っ
た。得られた水層に等容のクロロホルムを加え、５℃で
10分間緩やかに混合し、8000gで10分間遠心し、水層を
集めた。再度クロロホルム処理を行い、得られた水層に
２倍量の冷エタノールを加え、生じた沈澱をガラス棒に
巻付けて集めた。この沈澱を10倍希釈SSC（SSC:150mM食
塩、15mMクエン酸ナトリウム）70mlに分散し、４℃で１
晩放置して充分に溶解した。この溶液に10倍濃度のSSC8
mlを加え、SSCの濃度を１倍に調整し、RNアーゼ（シグ
マ社製。DNアーゼフリー）を50μg/mlの割合で加え、37
℃で30分間保持して混入RNAを分解し、上記と同様にエ
タノールを加えて沈澱を集めた。此沈澱を10倍希釈SSC
に溶解し、染色体DNA標品を得た。得られた染色体DNA1
0.0μｇに制限酵素Sau3A1（東洋紡社製）１単位を添加
し、Medium buffer（東洋紡社製）100μ中で37℃、５
分間保持し、部分分解した。次いで65℃で10分間加熱し
て酵素を失活させ、反応液をフェノール・クロロホルム
処理し、エタノールで染色体DNAを沈澱、分離し、β−g
lu.DNAを含む染色体DNA断片約7.6μｇを得た。
をCastenholzのTYE Medium（ATCC MEDIA HANDBOOK,1st
edition,page22,1984.American Type Culture Collecti
on,Maryland,USA）1.5で70℃、20時間通気攪拌培養
し、遠心して菌体約10gを得た。得られた菌体をTE緩衝
液（pH7.5の5mME DTA/20mMトリス塩酸）50ml分散し、リ
ゾチーム（生化学工業社製）を1mg/mlの割合で加え、37
℃で10分間保持した。次いでSDSを0.5％の割合で加え、
約５分間同温度で保持し、のち60℃で10分間保持して溶
菌した。反応液に等容のフェノール（TEで飽和）を加
え、５℃で10分間緩やかに混合した。次いで8000gで20
分間遠心し、水層を集め、再度フェノール処理を行っ
た。得られた水層に等容のクロロホルムを加え、５℃で
10分間緩やかに混合し、8000gで10分間遠心し、水層を
集めた。再度クロロホルム処理を行い、得られた水層に
２倍量の冷エタノールを加え、生じた沈澱をガラス棒に
巻付けて集めた。この沈澱を10倍希釈SSC（SSC:150mM食
塩、15mMクエン酸ナトリウム）70mlに分散し、４℃で１
晩放置して充分に溶解した。この溶液に10倍濃度のSSC8
mlを加え、SSCの濃度を１倍に調整し、RNアーゼ（シグ
マ社製。DNアーゼフリー）を50μg/mlの割合で加え、37
℃で30分間保持して混入RNAを分解し、上記と同様にエ
タノールを加えて沈澱を集めた。此沈澱を10倍希釈SSC
に溶解し、染色体DNA標品を得た。得られた染色体DNA1
0.0μｇに制限酵素Sau3A1（東洋紡社製）１単位を添加
し、Medium buffer（東洋紡社製）100μ中で37℃、５
分間保持し、部分分解した。次いで65℃で10分間加熱し
て酵素を失活させ、反応液をフェノール・クロロホルム
処理し、エタノールで染色体DNAを沈澱、分離し、β−g
lu.DNAを含む染色体DNA断片約7.6μｇを得た。
実施例２ ベクターpHSG399（宝酒造社製品、カタログ番号339
9）２μｇを制限酵素Bam H I（東洋紡社製）５単位によ
りHigh buffer（東洋紡社製）20μ中で37℃、３時間
保持し、完全に分解した。次いで反応液に細菌由来のア
ルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）３単位を添加
し、60℃で30分間保持し、脱リン酸処理し、以下実施例
１の染色体DNA断片の分離法と同様の方法でベクターDNA
断片を抽出し、ベクター断片約1.6μｇを得た。
9）２μｇを制限酵素Bam H I（東洋紡社製）５単位によ
りHigh buffer（東洋紡社製）20μ中で37℃、３時間
保持し、完全に分解した。次いで反応液に細菌由来のア
ルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）３単位を添加
し、60℃で30分間保持し、脱リン酸処理し、以下実施例
１の染色体DNA断片の分離法と同様の方法でベクターDNA
断片を抽出し、ベクター断片約1.6μｇを得た。
このベクターDNA断片0.1μｇと実施例１で得たDNA断
片0.3μｇとをT4ファージ由来のDNAリガーゼ（宝酒造社
製。商標 タカラライゲーション・キット）により連結
し、組換え体プラスミド液75μを得た。
片0.3μｇとをT4ファージ由来のDNAリガーゼ（宝酒造社
製。商標 タカラライゲーション・キット）により連結
し、組換え体プラスミド液75μを得た。
実施例３ 実施例２で得た組換え体プラスミド75μに300mM塩
化カルシウム液7.5μを加え、200μの大腸菌JM101
のコンビテントセル（東洋紡社製。商標 EPICURIAN CO
LI JM1−01）と混合し、氷上に60分間保持した。次いで
42℃で75秒間保持し、のち10倍量のＢ培地を加え、37℃
で５時間振盪し、Ｘ−glu含有寒天培地に接種した。こ
の平板を37℃で24時間培養し、β−グルコシダーゼの発
現を示す青色のコロニー１個を得てこの菌株をEK001株
と命名した。
化カルシウム液7.5μを加え、200μの大腸菌JM101
のコンビテントセル（東洋紡社製。商標 EPICURIAN CO
LI JM1−01）と混合し、氷上に60分間保持した。次いで
42℃で75秒間保持し、のち10倍量のＢ培地を加え、37℃
で５時間振盪し、Ｘ−glu含有寒天培地に接種した。こ
の平板を37℃で24時間培養し、β−グルコシダーゼの発
現を示す青色のコロニー１個を得てこの菌株をEK001株
と命名した。
実施例４ 実施例３で得たEK001株を、IPTG（イソプロピル−β
−Ｄ−チオガラクトシド）を238μg/mlの濃度で含有す
る2XTY液体培地１に接種し、37℃で20時間培養し、1.
1単位/mlの耐熱性β−グルコシダーゼを得た。尚、β−
グルコシダーゼ活性の測定は前記試験例２と同一の方法
によった。
−Ｄ−チオガラクトシド）を238μg/mlの濃度で含有す
る2XTY液体培地１に接種し、37℃で20時間培養し、1.
1単位/mlの耐熱性β−グルコシダーゼを得た。尚、β−
グルコシダーゼ活性の測定は前記試験例２と同一の方法
によった。
実施例５ 染色体DNAとしてサーマス属に属する細菌ZK−002（FE
RM P−9185）を用いたこと及びプラスミドベクターとし
てpUC18（宝酒造社製）を用いたことを除き実施例１、
実施例２及び実施例３と同一の方法により形質転換微生
物EK−002株を取得し、0.76単位/mlの耐熱性β−グルコ
シダーゼを得た。尚、β−グルコシダーゼ活性の測定は
前記試験例２と同一の方法によった。
RM P−9185）を用いたこと及びプラスミドベクターとし
てpUC18（宝酒造社製）を用いたことを除き実施例１、
実施例２及び実施例３と同一の方法により形質転換微生
物EK−002株を取得し、0.76単位/mlの耐熱性β−グルコ
シダーゼを得た。尚、β−グルコシダーゼ活性の測定は
前記試験例２と同一の方法によった。
第１図及び第２図はサーマス属に属する細菌ZK−001が
産生するβ−グルコシダーゼと本発明の形質転換体Ｅ−
001が産生するβ−グルコシダーゼについてそれぞれの
作用温度曲線並びに作用温度曲線を示す。第３図はβ−
グルコシダーゼ遺伝子DNAの制限酵素認識部位を示す。
産生するβ−グルコシダーゼと本発明の形質転換体Ｅ−
001が産生するβ−グルコシダーゼについてそれぞれの
作用温度曲線並びに作用温度曲線を示す。第３図はβ−
グルコシダーゼ遺伝子DNAの制限酵素認識部位を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:01）
Claims (4)
- 【請求項１】サーマス（Thermus）属に属する微生物に
由来し、４箇所の制限酵素バムエイチＩ（BamH I）認識
部位、２箇所の制限酵素サックＩ（Sac I）認識部位及
び１箇所の制限酵素ケーピーエヌＩ（Kpn I）認識部位
を有することを特徴とする耐熱性β−グルコシダーゼ遺
伝子DNA。 - 【請求項２】請求項１記載の耐熱性β−グルコシダーゼ
遺伝子DNAをベクタープラスミドに連結したことを特徴
とする組換え体プラスミド。 - 【請求項３】請求項２記載の組換え体プラスミドをエッ
シェリヒア（Esherichia）属に属する微生物に導入した
ことを特徴とする形質転換微生物。 - 【請求項４】請求項３記載の形質転換微生物を培地中で
培養し、培養物から耐熱性β−グルコシダーゼを採取す
ることを特徴とする耐熱性β−グルコシダーゼの製造
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5177888A JP2562169B2 (ja) | 1988-03-07 | 1988-03-07 | 耐熱性β−グルコシダーゼ遺伝子ＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換え体プラスミド、該プラスミドを含む形質転換微生物及び耐熱性β−グルコシダーゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5177888A JP2562169B2 (ja) | 1988-03-07 | 1988-03-07 | 耐熱性β−グルコシダーゼ遺伝子ＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換え体プラスミド、該プラスミドを含む形質転換微生物及び耐熱性β−グルコシダーゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01225484A JPH01225484A (ja) | 1989-09-08 |
| JP2562169B2 true JP2562169B2 (ja) | 1996-12-11 |
Family
ID=12896411
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5177888A Expired - Lifetime JP2562169B2 (ja) | 1988-03-07 | 1988-03-07 | 耐熱性β−グルコシダーゼ遺伝子ＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換え体プラスミド、該プラスミドを含む形質転換微生物及び耐熱性β−グルコシダーゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2562169B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102268421A (zh) * | 2011-08-03 | 2011-12-07 | 山西恩泽生物技术有限公司 | 一种β-葡萄糖苷酶基因的克隆、表达及应用 |
-
1988
- 1988-03-07 JP JP5177888A patent/JP2562169B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102268421A (zh) * | 2011-08-03 | 2011-12-07 | 山西恩泽生物技术有限公司 | 一种β-葡萄糖苷酶基因的克隆、表达及应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01225484A (ja) | 1989-09-08 |
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