JP3097795B2 - 新規なコレステロールオキシダーゼ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、臨床的に内分泌疾患や
代謝異常の診断の指標となっている体液中のコレステロ
ールの測定等に用いられるコレステロールオキシダーゼ
活性を有する新規タンパク質に関する。

【０００２】

【従来の技術】コレステロールオキシダーゼ（EC 1.1.
3.6）は、ストレプトマイセス属（特開昭６２−２８５
７８９号公報）、ブレビバクテリウム属（特開平４−２
１８３６７号公報）、ロードコッカス属（特表平３−５
０３４８７号公報，特開昭６１−２４７３８１号公報）
等の細菌が生産することが知られている。これらの細菌
より生産されるコレステロールオキシダーゼは、臨床検
査用試薬に用いることが可能であり、実際にその目的で
利用されている。しかしながら、近年の臨床検査の発展
及び液状試薬への移行により、より安定な或いはより信
頼性の高いコレステロールオキシダーゼの開発が望まれ
ている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、熱安
定性に優れたコレステロールオキシダーゼ活性を有する
新規タンパク質を提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するため種々検討した結果、ストレプトマイセス
・エスピーＳＡ−ＣＯＯの産生するコレステロールオキ
シダーゼのアミノ酸配列のＮ末端部分にアミノ酸残基が
新たに付加されることにより、天然に存在する親酵素と
実質的に同等のコレステロールオキシダーゼ活性を有
し、さらに親酵素に対し熱安定性などの特性が優れた新
規タンパク質を造成することが可能であることを見いだ
した。

【０００５】すなわち本発明は、ｐＨ７．０において、
５０℃、１５分間の加熱条件で１００％のコレステロー
ルオキシダーゼ活性を有する新規なコレステロールオキ
シダーゼである。

【０００６】また本発明は配列番号２のアミノ酸配列１
〜２１をコードするＤＮＡを含む新規コレステロールオ
キシダーゼをコードするＤＮＡを組み込んだプラスミド
で形質転換した宿主細胞を培地で培養し、該培養物から
新規コレステロールオキシダーゼを採取することを特徴
とする新規コレステロールオキダーゼの製造法、および
配列番号３のアミノ酸配列１〜２２をコードするＤＮＡ
を含む新規コレステロールオキシダーゼをコードするＤ
ＮＡを組み込んだプラスミドで形質転換した宿主細胞を
培地で培養し、該培養物から新規コレステロールオキシ
ダーゼを採取することを特徴とする新規コレステロール
オキダーゼの製造法である。

【０００７】さらに本発明は配列番号４で表されるＤＮ
Ａ配列で特定されるＤＮＡおよび該ＤＮＡとハイブリダ
イズしかつ新規コレステロールオキシダーゼをコードす
るＤＮＡから選ばれるＤＮＡを組み込んだプラスミドで
形質転換した宿主細胞を培地で培養し、該培養物から新
規コレステロールオキシダーゼを採取することを特徴と
する新規コレステロールオキシダーゼの製造法および配
列番号５で表されるＤＮＡ配列で特定されるＤＮＡおよ
び該ＤＮＡとハイブリダイズしかつ新規コレステロール
オキシダーゼをコードするＤＮＡから選ばれるＤＮＡを
組み込んだプラスミドで形質転換した宿主細胞を培地で
培養し、該培養物から新規コレステロールオキシダーゼ
を採取することを特徴とする新規コレステロールオキシ
ダーゼの製造法である。

【０００８】本発明のコレステロールオキシダーゼはｐ
Ｈ７．０において、５０℃、１５分間の加熱条件で１０
０％のコレステロールオキシダーゼ活性を有することを
特徴とする。また本発明のコレステロールオキシダーゼ
は下記の理化学的性質を有する。 （Ａ）作用：コレステロールを酸化し、過酸化水素と４
−コレステン−３−オンを生成する反応を触媒する。 （Ｂ）安定性：ｐＨ７．０において、５０℃、１５分間
の加熱条件下で１００％活性を保持する。 （Ｃ）ミハエリス定数：コレステロールに対し0.09mMの
Ｋｍ値を示す。 （Ｄ）分子量：約５６．７Ｋｄまたは約５６．８Ｋｄ 本発明のコレステロールオキシダーゼ活性を有する新規
タンパク質としては、例えば配列表の配列番号２及び３
に記載されたアミノ配列から成るタンパク質を挙げるこ
とができる。これらのタンパク質は、親酵素であるスト
レプトマイセス・エスピーＳＡ−ＣＯＯ由来のコレステ
ロールオキシダーゼと同等の活性を有し、図２に示すよ
うに、親酵素に対し熱安定性に優れている。

【０００９】本発明のコレステロールオキシダーゼ活性
を有する新規タンパク質は、遺伝子工学的手法を用いる
ことにより造成が可能となる。具体的には、コレステロ
ールオキシダーゼ遺伝子を改変し、末端部分にアミノ酸
残基に相当する合成DNA を挿入する方法、或いは本発明
の実施例で述べるように、コレステロールオキシダーゼ
遺伝子を有する宿主微生物の作用により、コレステロー
ルオキシダーゼのアミノ末端部分にリーダーペプチドに
由来するアミノ酸残基が付加された新規タンパク質を産
生させる方法などがある。いずれの方法によっても、最
終的には、コレステロールオキシダーゼ活性を有する新
規タンパク質を生産する組換え微生物を作成し、これを
培養した後培養物より目的タンパク質を抽出，精製する
ことにより、コレステロールオキシダーゼ活性を有する
新規タンパク質を得ることが出来る。

【００１０】本発明のコレステロールオキシダーゼを製
造する具体的な方法としては、配列番号２のアミノ酸配
列１〜２１をコードするＤＮＡを含む新規コレステロー
ルオキシダーゼをコードするＤＮＡを組み込んだプラス
ミドで形質転換した宿主細胞を培地で培養し、該培養物
から新規コレステロールオキシダーゼを採取する方法ま
たは配列番号３のアミノ酸配列１〜２２をコードするＤ
ＮＡを含む新規コレステロールオキシダーゼをコードす
るＤＮＡを組み込んだプラスミドで形質転換した宿主細
胞を培地で培養し、該培養物から新規コレステロールオ
キシダーゼを採取する方法がある。

【００１１】また本発明の製造方法の一例としては、配
列番号４で表されるＤＮＡ配列で特定されるＤＮＡおよ
び該ＤＮＡとハイブリダイズしかつ新規コレステロール
オキシダーゼをコードするＤＮＡから選ばれるＤＮＡを
組み込んだプラスミドで形質転換した宿主細胞を培地で
培養し、該培養物から新規コレステロールオキシダーゼ
を採取する方法であり、また配列番号５で表されるＤＮ
Ａ配列で特定されるＤＮＡおよび該ＤＮＡとハイブリダ
イズしかつ新規コレステロールオキシダーゼをコードす
るＤＮＡから選ばれるＤＮＡを組み込んだプラスミドで
形質転換した宿主細胞を培地で培養し、該培養物から新
規コレステロールオキシダーゼを採取する方法である。

【００１２】本発明のコレステロールオキシダーゼ活性
を有する新規蛋白質の遺伝情報を含有するＤＮＡ（以
下、新規コレステロールオキシダーゼ遺伝子という）
は、ストレプトマイセス・エスピーＳＡ−ＣＯＯから抽
出してもよく、また合成することもできる。上記ＤＮＡ
配列としては、例えば配列番号４に記載されたアミノ酸
配列で特定されるＤＮＡまたは配列番号５に記載された
ＤＮＡ配列で特定されるＤＮＡを挙げることができる。
なお、本発明のＤＮＡは遺伝子組換技術により基本的な
特性を変化させることなく、或いはその特性を改善する
ように人為的に置換、削除、挿入などを起こさせたもの
も含むものである。

【００１３】本発明のＤＮＡは例えばストレプトマイセ
ス・エスピーＳＡ−ＣＯＯのＤＮＡを分離・精製した
後、超音波、制限酵素などを用いて、ＤＮＡを切断した
ものとリニアーな発現ベクターとを両ＤＮＡの平滑また
は接着末端部においてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉
環させて組換えベクターとする。このようにして得られ
た組換えベクターは複製可能な宿主微生物に移入した
後、ベクターのマーカーとコレステロールオキシダーゼ
活性とを指標としてスクリーニングして該組換えＤＮＡ
ベクターを保持する微生物を得る。該微生物を培養し、
該培養菌体から該組換えベクターを分離・精製し、次い
で該組換えベクターから新規コレステロールオキシダー
ゼ遺伝子を採取すればよい。

【００１４】以下にＤＮＡの採取方法をより詳細に説明
する。遺伝子の供与体である微生物に由来するＤＮＡは
次の如くにして採取される。すなわち供与微生物である
上述した細菌を例えば液体培地で約１〜３日間通気攪拌
培養し、得られる培養物を遠心分離して集菌し、次いで
これを溶菌させることによって新規コスレロールオキシ
ダーゼ遺伝子の含有溶菌物を調製することができる。溶
菌方法としては例えばリゾチームやβ−グルカナーゼな
どの細胞壁溶解酵素による処理が施され、必要によりプ
ロテアーゼなどの他の酵素やラウリル硫酸ナトリウムな
どの界面活性剤が併用され、更に細胞壁の物理的破砕法
である凍結融解やフレンチプレス処理を上述の溶菌法と
の組合せで行なってもよい。

【００１５】このようにして得られた溶菌物からＤＮＡ
を分離・精製するには常法に従って例えばフェノール抽
出による除蛋白処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレア
ーゼ処理、アルコール沈澱遠心分離などの方法を適宜組
み合わせることにより行なうことができる。微生物から
分離・精製されたＤＮＡを切断する方法は、例えば超音
波処理、制限酵素処理などを行なうことができるが、得
られる微生物ＤＮＡ断片ベクターとの結合を容易ならし
めるにため、制限酵素とりわけ特定ヌクレオチドに作用
する、例えばRcoRI, Hind III, BanHIなどのII型制限酵
素が適している。ベクターとしては宿主微生物で自律的
に増殖しうるファージまたはプラスミドから遺伝子組換
え用に構築されたものが適している。ファージとしては
例えばエシェリヒア・コリー(Escherichia coli)を宿主
微生物とする場合には、λgt-10, λgt-11 などを使用
できる。またプラスミドとしては例えばエシェリヒア・
コリーを宿主微生物とする場合には、pBR322, pUC18 な
どのバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis) を宿主
微生物とする場合には、 pUB110, pC194などを使用で
き、さらにエシェリヒア・コリーおよびバチルス・ズブ
チリスなどのグラム陰陽性にまたがる二種以上の宿主微
生物で自律的に増殖可能なシャトルベクター、例えばpH
Y300OLK などを利用することもできる。このようなベク
ターを上記した新規コレステロールオキシダーゼ遺伝子
の供与体である微生物のＤＮＡの切断に使用した制限酵
素と同じ制限酵素で切断して、ベクター断片を得ること
が望ましい。微生物ＤＮＡ断片をベクター断片と結合さ
せる方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であれ
ばよく、例えば微生物ＤＮＡ断片の接着末端とベクター
断片の接着末端とのアニーリングの後、適当なＤＮＡリ
ガーゼの使用により微生物ＤＮＡ断片との組換えベクタ
ーを作成する。必要ならばアニーリングの後、宿主微生
物に移入して生体内のＤＮＡリガーゼを利用し、組換え
ベクターを作成することもできる。

【００１６】宿主微生物としては、組換えベクターが安
定、かつ自律的に増殖可能で、さらに外来性ＤＮＡの形
質が発現できるものであればよく、例えば宿主微生物が
エシェリヒア・コリー W3110, エシェリヒア・コリー C
600, エシェリヒア・コリーJM109, バチルス・ズブチ
リス MI113, バチルス・ズブチリスMT-2などを利用でき
る。宿主微生物に組換えベクターを移入する方法として
は、例えば宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物
の場合には、カルシウムイオンの存在下で組換えＤＮＡ
の移入を行ない、またバチルス属に属する微生物の場合
には、コンピテントセル法またはプロトプラスト法など
を採用することができ、さらにマイクロインジェクショ
ンを用いてもよい。こうして得られた形質転換体である
微生物は、栄養培地で培養されることにより多量の新規
コレステロールオキシダーゼを安定して生産し得ること
を見出した。

【００１７】本発明のコレステロールオキシダーゼ活性
を有する新規タンパク質を生産する微生物を培養する方
法は、培地としては炭素源，窒素源，無機イオン，更に
必要に応じて硝酸塩，リン酸塩等を含有するものであ
る。炭素源としては、澱粉あるいは澱粉加水分解物，糖
密，ペプトン類等が用いられる。窒素源としては、ポリ
ペプトン，トリプトン，肉エキス，酵母エキス等が使用
できる。培養は好気的条件下で培地のpH及び温度を適宜
調節することが望ましいが、必ずしもその必要はない。
培養時間は培養物のコレステロールオキシダーゼ活性が
最高になるところまで行なわれる。

【００１８】培養物より、コレステロールオキシダーゼ
活性を有する新規タンパク質を精製するには、以下の様
な方法が用いられる。培養物を遠心分離して集菌し、次
いでこれを溶菌させることによってコレステロールオキ
シダーゼ含有溶菌物を調製する。溶菌方法としては、例
えばリゾチームやβ−グルカナーゼなどの細胞壁溶解酵
素による処理や超音波破砕，フレンチプレス処理等の物
理的破砕法が好適である。コレステロールオキシダーゼ
活性を有する新規タンパク質が培地上清に分泌生産され
る場合は、上記溶菌操作は不要であり、培養物を遠心分
離して上清を調製すればよい。

【００１９】この様にして得られた溶菌物，或いは上清
を硫安沈澱分画し、脱塩した後、DEAE Sepharose CL-6B
カラム（ファルマシアLKB ）等のイオン交換により分離
を行う担体にかけて分画を行う。このステップは省略し
てしまうことも可能である。また、分画したサンプル
は、疎水性クロマトグラフィーや高速液体クロマトグラ
フィー等を用い、さらに高純度とする事が可能である。
この精製標品は、SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動
(SDS-PAGE)で単一バンドになっている。尚、カラムクロ
マトグラフィーの組合せは上記ステップに限らず、その
組合せ，種類を変えることは可能である。

【００２０】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
る。実施例中、コレステロールオキシダーゼの活性測定
は以下のように行なった。すなわち、87mMリン酸カリウ
ム緩衝液(pH7.0) 、0.89mMコレステロール、1.4mM ４−
アミノアンチピリン、21mMフェノール、0.34% トリトン
Ｘ−１００、64mMコール酸ナトリウム、33μg/mlＢＳ
Ａ、5U/ml ペルオキシダーゼ中で酵素を３７℃，３〜４
分反応させ、500nm における吸光度の増加を測定する。
酵素活性の１単位は、この条件下で１分間当たり１マイ
クロモルの過酸化水素を生成する酵素量とした。

【００２１】〔実施例１〕 （１）コレステロールオキシダーゼ生産能の遺伝情報を
もつ染色体ＤＮＡの調製 コレステロールオキシダーゼを生産する能力を有するス
トレオプトマイセス(streptomyces)sp. ＳＡ−ＣＯＯ株
を（グルコース１％、酵母エキス0.2 ％、ＮａＣｌ 0.5
％、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 0.025％、ペプトン 0.4％、牛
肉エキス 0.2％、ｐＨ 7.0）で３０℃、３日間培養した
菌体を集菌後、Mumur 法で染色体ＤＮＡを抽出、精製
し、染色体ＤＮＡ20mgを調製した。 （２）染色体ＤＮＡ断片のベクターへの挿入 （１）で得た染色体ＤＮＡをとり、制限酵素BamHI を加
え部分消化した後、（10〜30％）蔗糖密度勾配遠心法
（32,000tpm ×22Hr、４℃）を行ない、分画して５Ｋｂ
以上のフラグメントを集めてエタノール沈澱をおこな
い、BamHI 消化ＤＮＡを得た。他方、ストレプトマイセ
ス・リビダンス(streptomyces lividans)3130 のベクタ
ーであるpIJ 702(Thio Resistance, mel＋)10 μg をBa
mHI 15u で37℃、１時間反応させた。フェノール処理を
２回操返しエーテルでフェニールを除去した後、−20℃
で酢酸ナトリウム0.1 容量と95％エタノール２容量を添
加してエタノール沈澱させた。ＤＮＡ沈澱物を４℃、1
2,000×Ｇで10分遠心分離によって集めた。沈澱物をＴ
Ｅ緩衝液17μｌ中再溶解した。この試料をライゲーショ
ンに用いた。次に前記したBamHI 染色体ＤＮＡ消化物と
BamHI で線状化したベクターを混合し、Ｔ₄ ファージ由
来のＤＮＡリガーゼ１単位を加え、反応液15℃、24時間
保持し、以後の形質転換に用いるライゲーション混合液
とした。 （３）コレステロールオキシダーゼの生産に関与した遺
伝情報を担うプラスミドによる形質転換 ストレプトマイセス・リビダンス(streptomyces livida
ns)3131 をＲ₂ 培地（ブドウ糖 1.0％、酵母エキス 0.2
％、ペプトン 0.4％、牛肉エキス 0.4％、ＮａＣｌ 0.5
％、ＭｇＣＯ₄・７Ｈ₂Ｏ 0.025％、グリシン 0.5％、ｐ
Ｈ7.0 からなる培地）で28℃、30時間生育させた後、次
いでこれをプトロプラスト化した後、（３）で得られた
ライゲーション混合液を添加して形質転換を得た。形質
転換及び再生方法はトンプソン等の方法によった〔トン
プソン他、ジャーナルオプバクテリオロジー(Thomp so
n, C.J.et. al,J.Bacteriol) 151 巻、668−677 ペー
ジ、1982年〕。即ち、形質転換後のプロトプラストは、
Ｒ２ＹＥ再生培地（Ｒ２培地に酵母エキス 0.5％添加し
たもの）に扁平培養した。２8 ℃で２４時間培養後、チ
オストレプトン50μg/mlを含む0.4 ％ Difco NAagar 培
地 2.5mlを重層し、さらに28℃で培養を続けた。次いで
目的のクローンの選択のため、 臨床検査法の原理

【００２２】

【化１】 を応用して、反応混液を濾紙にしませ、コロニー上にか
ぶせることにより、赤いコロニーをプジティブクローン
として選択した。以上の結果約８千個のThio耐性コロニ
ーより１株のクローンが得られた。クローンをストレプ
トマイセス・リビダンス(streptomyces lividans)1326
(pCO-1)とした。なお、組み換え頻度は約13％であっ
た。得られたクローンよりプラスミド(pCO1)を分離し、
各種制限酵母で消化した。次いでPastＩによる欠先法に
より2.1 Kbp 以内に本酵素生産遺伝子の必須領域がある
ことを明らかにした。なおこの領域を含むPastＩフラグ
メントをもつプラスミドをｐＣＯ２と命名した（図
１）。同様に SacＩによる欠失法によりｐＣＯ３と命名
したプラスミドを得た（図１３）。更にｐＣＯ２及びｐ
ＣＯ３を形質転換してストレプトマイセス・リビダンス
(strep tomyces lividans)1326(pCO-2) 及びストレプト
マイセス・リビダンス(strep tomyces lividans)(pCO-
3) （微工研菌寄第8789号）を得た。 〔実施例２〕 コレステロールオキシダーゼ遺伝子発現ベクターの構築 コレステロールオキシダーゼ遺伝子発現ベクターは、図
２に記載の流れに沿って構築した。すなわち、プラスミ
ドpUC19 （東洋紡製）を制限酵素EcoRI とSphIで完全分
解し、ＡＢＩ社DNA シンセサイザー381Aにて合成した配
列表の配列番号１記載のDNA と、T4DNA リガーゼにて連
結した。これによって作成したプラスミドpCO-105 を、
さらにSphIで分解し、コレステロールオキシダーゼ遺伝
子を有するプラスミドpCO-3 （Applied and Environmen
tal Microbiology Vol.52 No.6 1382-1385(1986) 及び
Journal of Bacteriology Vol.171 596-601(1989) ）を
SphIで切断して得られる断片と連結した。この操作で、
合成DNA を含むコレステロールオキシダーゼ遺伝子を有
するプラスミドpCO-104 が作成された。さらに、pCO-10
4 を制限酵素EcoRI とHind IIIで切断後、コレステロー
ルオキシダーゼ遺伝子を有する断片を抽出し、発現ベク
ターpKK223-3（ファルマシア製）をEcoRI とHindIII で
切断したものと連結することにより、コレステロールオ
キシダーゼ遺伝子発現ベクターpCO-117 を作成すること
が出来た。

【００２３】〔実施例３〕 新規コレステロールオキシダーゼの生産と特性評価 エシェリヒア・コリーJM109 のコンピテントセルをHana
han の方法により作成し、発現ベクターpCO-117 で形質
転換することにより、コレステロールオキシダーゼ生産
菌株を造成した。この菌株をＬ培地（1%ポリペプトン，
0.5%酵母エキス，0.5%塩化ナトリウム）で37℃，12時間
培養し、0.1U/ml のコレステロールオキシダーゼ活性を
得た。従来の方法(Journal of Bacteriology Vol.171 5
96-601(1989)) に従い、本コレステロールオキシダーゼ
を精製し、エドマン分解法にてアミノ酸分析を行った
処、配列表の配列番号２及び配列番号３に記載のアミノ
酸配列を有する新規なコレステロールオキシダーゼであ
ることが確かめられた。これらの新規コレステロールオ
キシダーゼは、Journal of Bacteriology Vol.171 596-
601(1989) に記載された親酵素のアミノ酸配列に対し、
リーダーペプチド由来の２１，２２アミノ酸残基がそれ
ぞれ付加されたものであった。このことにより、親酵素
に対し分子量が増加している。新規コレステロールオキ
シダーゼの特性評価を行った処、親酵素と実質的に同等
のコレステロールオキシダーゼ活性を有し、反応至適p
H，反応至適温度等の特性も親酵素と同等であった。し
かしながら、図３に示す様に、親酵素と比べ熱安定性が
明らかに向上しており、付加されたアミノ酸残基がもた
らす結果として、酵素性能の向上がみとめられた。

【００２４】

【発明の効果】本発明のコレステロールオキシダーゼ活
性を有する新規タンパク質は、親酵素に対し熱安定など
の酵素性能が向上している。従って、本発明のコレステ
ロールオキシダーゼ活性を有する新規タンパク質を臨床
検査用試薬等に用いることにより、より安定性の高い、
或いはより信頼性の高い試薬にする事が可能である。

【００２５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：２９２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 他の情報：従来のコレステロールオキシダーゼ構造遺伝
子にコードされたポリペプチド鎖に対応した合成ＤＮＡ
プローブ 配列 GAATTCATGA CTGCACAACA GCATCTGTCC CGTCGTCGTA TGCTGGGTAT GGCTGCATTC 60 GGCGCCGCAG CTCTGGCAGG GGGTACTACT ATTGCTGCTC CACGTGCTGC AGCTGCAGCT 120 AAGTCCGCGG CGGATAACGG TGGTTATGTA CCAGCTGTTG TAATTGGTAC CGGTTATGGT 180 GCTGCAGTTT CCGCTCTGCG TCTGGGTGAA GCTGGTGTAC AGACTCTGAT GCTCGAGATG 240 GGTCAGCTGT GGAACCAGCC AGGTCCAGAT GGTAACATTT TCTGCGGCAT GC 292

【００２６】配列番号：２ 配列の長さ：５２５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Ala Leu Ala Gly Gly Thr Thr Ile Ala Ala Pro Arg Ala Ala Ala Ala 1 5 10 15 Ala Lys Ser Ala Ala Asp Asn Gly Gly Tyr Val Pro Ala Val Val Ile 20 25 30 Gly Thr Gly Tyr Gly Ala Ala Val Ser Ala Leu Arg Leu Gly Glu Ala 35 40 45 Gly Val Gln Thr Leu Met Leu Glu Met Gly Gln Leu Trp Asn Gln Pro 50 55 60 Gly Pro Asp Gly Asn Ile Phe Cys Gly Met Leu Asn Pro Asp Lys Arg 65 70 75 80 Ser Ser Trp Phe Lys Asn Arg Thr Glu Ala Pro Leu Gly Ser Phe Leu 85 90 95 Trp Leu Asp Val Val Asn Arg Asn Ile Asp Pro Tyr Ala Gly Val Leu 100 105 110 Asp Arg Val Asn Tyr Asp Gln Met Ser Val Tyr Val Gly Arg Gly Val 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Leu Val Asn Gly Gly Met Ala Val Glu Pro Lys Arg 130 135 140 Ser Tyr Phe Glu Glu Ile Leu Pro Arg Val Asp Ser Ser Glu Met Tyr 145 150 155 160 Asp Arg Tyr Phe Pro Arg Ala Asn Ser Met Leu Arg Val Asn His Ile 165 170 175 Asp Thr Lys Trp Phe Glu Asp Thr Glu Trp Tyr Lys Phe Ala Arg Val 180 185 190 Ser Arg Glu Gln Ala Gly Lys Ala Gly Leu Gly Thr Val Phe Val Pro 195 200 205 Asn Val Tyr Asp Phe Gly Tyr Met Gln Arg Glu Ala Ala Gly Glu Val 210 215 220 Pro Lys Ser Ala Leu Ala Thr Glu Val Ile Tyr Gly Asn Asn His Gly 225 230 235 240 Lys Gln Ser Leu Asp Lys Thr Tyr Leu Ala Ala Ala Leu Gly Thr Gly 245 250 255 Lys Val Thr Ile Gln Thr Leu His Gln Val Lys Thr Ile Arg Gln Thr 260 265 270 Lys Asp Gly Gly Tyr Ala Leu Thr Val Glu Gln Lys Asp Thr Asp Gly 275 280 285 Lys Leu Leu Ala Thr Lys Glu Ile Ser Cys Arg Tyr Leu Phe Leu Gly 290 295 300 Ala Gly Ser Leu Gly Ser Thr Glu Leu Leu Val Arg Ala Arg Asp Thr 305 310 315 320 Gly Thr Leu Pro Asn Leu Asn Ser Glu Val Gly Ala Gly Trp Gly Pro 325 330 335 Asn Gly Asn Ile Met Thr Ala Arg Ala Asn His Met Trp Asn Pro Thr 340 345 350 Gly Ala His Gln Ser Ser Ile Pro Ala Leu Gly Ile Asp Ala Trp Asp 355 360 365 Asn Ser Asp Ser Ser Val Phe Ala Glu Ile Ala Pro Met Pro Ala Gly 370 375 380 Leu Glu Thr Trp Val Ser Leu Tyr Leu Ala Ile Thr Lys Asn Pro Gln 385 390 395 400 Arg Gly Thr Phe Val Tyr Asp Ala Ala Thr Asp Arg Ala Lys Leu Asn 405 410 415 Trp Thr Arg Asp Gln Asn Ala Pro Ala Val Asn Ala Ala Lys Ala Leu 420 425 430 Phe Asp Arg Ile Asn Lys Ala Asn Gly Thr Ile Tyr Arg Tyr Asp Leu 435 440 445 Phe Gly Thr Gln Leu Lys Ala Phe Ala Asp Asp Phe Cys Tyr His Pro 450 455 460 Leu Gly Gly Cys Val Leu Gly Lys Ala Thr Asp Asp Tyr Gly Arg Val 465 470 475 480 Ala Gly Tyr Lys Asn Leu Tyr Val Thr Asp Gly Ser Leu Ile Pro Gly 485 490 495 Ser Val Gly Val Asn Pro Phe Val Thr Ile Thr Ala Leu Ala Glu Arg 500 505 510 Asn Val Glu Arg Ile Ile Lys Gln Asp Val Thr Ala Ser 515 520 525

【００２７】配列番号：３ 配列の長さ：５２６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Ala Ala Leu Ala Gly Gly Thr Thr Ile Ala Ala Pro Arg Ala Ala Ala 1 5 10 15 Ala Ala Lys Ser Ala Ala Asp Asn Gly Gly Tyr Val Pro Ala Val Val 20 25 30 Ile Gly Thr Gly Tyr Gly Ala Ala Val Ser Ala Leu Arg Leu Gly Glu 35 40 45 Ala Gly Val Gln Thr Leu Met Leu Glu Met Gly Gln Leu Trp Asn Gln 50 55 60 Pro Gly Pro Asp Gly Asn Ile Phe Cys Gly Met Leu Asn Pro Asp Lys 65 70 75 80 Arg Ser Ser Trp Phe Lys Asn Arg Thr Glu Ala Pro Leu Gly Ser Phe 85 90 95 Leu Trp Leu Asp Val Val Asn Arg Asn Ile Asp Pro Tyr Ala Gly Val 100 105 110 Leu Asp Arg Val Asn Tyr Asp Gln Met Ser Val Tyr Val Gly Arg Gly 115 120 125 Val Gly Gly Gly Ser Leu Val Asn Gly Gly Met Ala Val Glu Pro Lys 130 135 140 Arg Ser Tyr Phe Glu Glu Ile Leu Pro Arg Val Asp Ser Ser Glu Met 145 150 155 160 Tyr Asp Arg Tyr Phe Pro Arg Ala Asn Ser Met Leu Arg Val Asn His 165 170 175 Ile Asp Thr Lys Trp Phe Glu Asp Thr Glu Trp Tyr Lys Phe Ala Arg 180 185 190 Val Ser Arg Glu Gln Ala Gly Lys Ala Gly Leu Gly Thr Val Phe Val 195 200 205 Pro Asn Val Tyr Asp Phe Gly Tyr Met Gln Arg Glu Ala Ala Gly Glu 210 215 220 Val Pro Lys Ser Ala Leu Ala Thr Glu Val Ile Tyr Gly Asn Asn His 225 230 235 240 Gly Lys Gln Ser Leu Asp Lys Thr Tyr Leu Ala Ala Ala Leu Gly Thr 245 250 255 Gly Lys Val Thr Ile Gln Thr Leu His Gln Val Lys Thr Ile Arg Gln 260 265 270 Thr Lys Asp Gly Gly Tyr Ala Leu Thr Val Glu Gln Lys Asp Thr Asp 275 280 285 Gly Lys Leu Leu Ala Thr Lys Glu Ile Ser Cys Arg Tyr Leu Phe Leu 290 295 300 Gly Ala Gly Ser Leu Gly Ser Thr Glu Leu Leu Val Arg Ala Arg Asp 305 310 315 320 Thr Gly Thr Leu Pro Asn Leu Asn Ser Glu Val Gly Ala Gly Trp Gly 325 330 335 Pro Asn Gly Asn Ile Met Thr Ala Arg Ala Asn His Met Trp Asn Pro 340 345 350 Thr Gly Ala His Gln Ser Ser Ile Pro Ala Leu Gly Ile Asp Ala Trp 355 360 365 Asp Asn Ser Asp Ser Ser Val Phe Ala Glu Ile Ala Pro Met Pro Ala 370 375 380 Gly Leu Glu Thr Trp Val Ser Leu Tyr Leu Ala Ile Thr Lys Asn Pro 385 390 395 400 Gln Arg Gly Thr Phe Val Tyr Asp Ala Ala Thr Asp Arg Ala Lys Leu 405 410 415 Asn Trp Thr Arg Asp Gln Asn Ala Pro Ala Val Asn Ala Ala Lys Ala 420 425 430 Leu Phe Asp Arg Ile Asn Lys Ala Asn Gly Thr Ile Tyr Arg Tyr Asp 435 440 445 Leu Phe Gly Thr Gln Leu Lys Ala Phe Ala Asp Asp Phe Cys Tyr His 450 455 460 Pro Leu Gly Gly Cys Val Leu Gly Lys Ala Thr Asp Asp Tyr Gly Arg 465 470 475 480 Val Ala Gly Tyr Lys Asn Leu Tyr Val Thr Asp Gly Ser Leu Ile Pro 485 490 495 Gly Ser Val Gly Val Asn Pro Phe Val Thr Ile Thr Ala Leu Ala Glu 500 505 510 Arg Asn Val Glu Arg Ile Ile Lys Gln Asp Val Thr Ala Ser 515 520 525

【００２８】配列番号：４ 配列の長さ：１５７５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA ハイポセティカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 起源 生物名：ストレプトマイセス・エスピー(Streptomyces
sp.) 株名：ＳＡ−ＣＯＯ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 特徴を決定した方法：Ｅ その他の情報：新規コレステロールオキシダーゼ構造遺
伝子 配列 GCC CTC GCC GGG GGC ACC ACC ATC GCC GCC CCC CGT GCG GCC GCC GCC 48 Ala Leu Ala Gly Gly Thr Thr Ile Ala Ala Pro Arg Ala Ala Ala Ala 1 5 10 15 GCC AAG TCC GCG GCG GAC AAC GGC GGT TAC GTC CCC GCC GTC GTC ATC 96 Ala Lys Ser Ala Ala Asp Asn Gly Gly Tyr Val Pro Ala Val Val Ile 20 25 30 GGC ACC GGC TAC GGC GCG GCC GTC TCC GCG CTG CGC CTC GGC GAG GCG 144 Gly Thr Gly Tyr Gly Ala Ala Val Ser Ala Leu Arg Leu Gly Glu Ala 35 40 45 GGT GTG CAG ACC CTG ATG CTG GAG ATG GGC CAG CTG TGG AAC CAG CCC 192 Gly Val Gln Thr Leu Met Leu Glu Met Gly Gln Leu Trp Asn Gln Pro 50 55 60 GGC CCC GAC GGC AAC ATC TTC TGC GGC ATG CTC AAC CCG GAC AAG CGG 240 Gly Pro Asp Gly Asn Ile Phe Cys Gly Met Leu Asn Pro Asp Lys Arg 65 70 75 80 TCC AGC TGG TTC AAG AAC CGC ACC GAG GCC CCG CTC GGC AGC TTC CTC 288 Ser Ser Trp Phe Lys Asn Arg Thr Glu Ala Pro Leu Gly Ser Phe Leu 85 90 95 TGG CTC GAC GTC GTC AAC CGG AAC ATC GAC CCC TAC GCG GGT GTC CTG 336 Trp Leu Asp Val Val Asn Arg Asn Ile Asp Pro Tyr Ala Gly Val Leu 100 105 110 GAC CGT GTG AAC TAC GAC CAG ATG TCG GTC TAC GTG GGC CGC GGC GTC 384 Asp Arg Val Asn Tyr Asp Gln Met Ser Val Tyr Val Gly Arg Gly Val 115 120 125 GGC GGC GGC TCG CTC GTC AAC GGC GGC ATG GCC GTG GAG CCC AAG CGC 432 Gly Gly Gly Ser Leu Val Asn Gly Gly Met Ala Val Glu Pro Lys Arg 130 135 140 TCG TAC TTC GAG GAG ATC CTC CCG CGG GTC GAC TCC TCC GAG ATG TAC 480 Ser Tyr Phe Glu Glu Ile Leu Pro Arg Val Asp Ser Ser Glu Met Tyr 145 150 155 160 GAC CGC TAC TTC CCC CGC GCC AAC TCC ATG CTC CGC GTC AAC CAC ATC 528 Asp Arg Tyr Phe Pro Arg Ala Asn Ser Met Leu Arg Val Asn His Ile 165 170 175 GAC ACC AAG TGG TTC GAG GAC ACC GAG TGG TAC AAG TTC GCC CGC GTC 576 Asp Thr Lys Trp Phe Glu Asp Thr Glu Trp Tyr Lys Phe Ala Arg Val 180 185 190 TCG CGC GAG CAG GCG GGC AAG GCC GGT CTC GGC ACC GTC TTC GTC CCC 624 Ser Arg Glu Gln Ala Gly Lys Ala Gly Leu Gly Thr Val Phe Val Pro 195 200 205 AAC GTC TAC GAC TTC GGC TAC ATG CAG CGC GAG GCC GCG GGC GAG GTG 672 Asn Val Tyr Asp Phe Gly Tyr Met Gln Arg Glu Ala Ala Gly Glu Val 210 215 220 CCC AAG TCC GCC CTG GCG ACC GAG GTC ATC TAC GGC AAC AAC CAC GGC 720 Pro Lys Ser Ala Leu Ala Thr Glu Val Ile Tyr Gly Asn Asn His Gly 225 230 235 240 AAG CAG AGC CTG GAC AAG ACC TAC CTG GCC GCC GCA CTC GGC ACC GGC 768 Lys Gln Ser Leu Asp Lys Thr Tyr Leu Ala Ala Ala Leu Gly Thr Gly 245 250 255 AAG GTC ACC ATC CAG ACC CTG CAC CAG GTC AAG ACG ATC CGT CAG ACG 816 Lys Val Thr Ile Gln Thr Leu His Gln Val Lys Thr Ile Arg Gln Thr 260 265 270 AAG GAC GGC GGC TAC GCG CTG ACC GTC GAG CAG AAG GAC ACC GAC GGC 864 Lys Asp Gly Gly Tyr Ala Leu Thr Val Glu Gln Lys Asp Thr Asp Gly 275 280 285 AAG CTC CTG GCC ACC AAG GAG ATC TCC TGC CGC TAC CTG TTC CTC GGC 912 Lys Leu Leu Ala Thr Lys Glu Ile Ser Cys Arg Tyr Leu Phe Leu Gly 290 295 300 GCG GGC AGC CTC GGC TCC ACC GAA CTG CTG GTG CGC GCC CGC GAC ACC 960 Ala Gly Ser Leu Gly Ser Thr Glu Leu Leu Val Arg Ala Arg Asp Thr 305 310 315 320 GGC ACC CTG CCG AAC CTC AAC TCC GAG GTG GGC GCG GGC TGG GGC CCC 1008 Gly Thr Leu Pro Asn Leu Asn Ser Glu Val Gly Ala Gly Trp Gly Pro 325 330 335 AAC GGC AAC ATC ATG ACC GCC CGG GCC AAC CAC ATG TGG AAC CCC ACC 1056 Asn Gly Asn Ile Met Thr Ala Arg Ala Asn His Met Trp Asn Pro Thr 340 345 350 GGC GCC CAC CAG TCC TCC ATC CCC GCC CTC GGC ATC GAC GCG TGG GAC 1104 Gly Ala His Gln Ser Ser Ile Pro Ala Leu Gly Ile Asp Ala Trp Asp 355 360 365 AAC AGC GAC TCC TCG GTC TTC GCG GAG ATC GCC CCC ATG CCG GCC GGC 1152 Asn Ser Asp Ser Ser Val Phe Ala Glu Ile Ala Pro Met Pro Ala Gly 370 375 380 CTG GAG ACG TGG GTC AGC CTC TAC CTC GCG ATC ACC AAG AAC CCC CAG 1200 Leu Glu Thr Trp Val Ser Leu Tyr Leu Ala Ile Thr Lys Asn Pro Gln 385 390 395 400 CGC GGC ACC TTC GTG TAC GAC GCC GCG ACG GAC CGC GCG AAG CTC AAC 1248 Arg Gly Thr Phe Val Tyr Asp Ala Ala Thr Asp Arg Ala Lys Leu Asn 405 410 415 TGG ACC CGT GAC CAG AAC GCC CCC GCG GTC AAC GCA GCC AAG GCG CTG 1296 Trp Thr Arg Asp Gln Asn Ala Pro Ala Val Asn Ala Ala Lys Ala Leu 420 425 430 TTC GAC CGG ATC AAC AAG GCG AAC GGC ACG ATC TAC CGG TAC GAC CTC 1344 Phe Asp Arg Ile Asn Lys Ala Asn Gly Thr Ile Tyr Arg Tyr Asp Leu 435 440 445 TTC GGC ACC CAG CTG AAG GCC TTC GCC GAC GAC TTC TGC TAC CAC CCG 1392 Phe Gly Thr Gln Leu Lys Ala Phe Ala Asp Asp Phe Cys Tyr His Pro 450 455 460 CTC GGC GGC TGC GTC CTG GGC AAG GCG ACG GAC GAC TAC GGC CGC GTC 1440 Leu Gly Gly Cys Val Leu Gly Lys Ala Thr Asp Asp Tyr Gly Arg Val 465 470 475 480 GCC GGT TAC AAG AAC CTC TAC GTG ACC GAC GGT TCG CTG ATC CCG GGT 1488 Ala Gly Tyr Lys Asn Leu Tyr Val Thr Asp Gly Ser Leu Ile Pro Gly 485 490 495 TCC GTC GGC GTC AAC CCG TTC GTG ACC ATC ACG GCG CTG GCC GAG CGG 1536 Ser Val Gly Val Asn Pro Phe Val Thr Ile Thr Ala Leu Ala Glu Arg 500 505 510 AAC GTC GAG CGC ATC ATC AAG CAG GAC GTC ACG GCG TCG 1575 Asn Val Glu Arg Ile Ile Lys Gln Asp Val Thr Ala Ser 515 520 525

【００２９】配列番号：５ 配列の長さ：１５７８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA ハイポセチカル配列：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 起源 生物名：ストレプトマイセス・エスピー(Streptomyces
sp.) 株名：ＳＡ−ＣＯＯ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 特徴を決定した方法：Ｅ その他の情報：新規コレステロールオキシダーゼ構造遺
伝子 配列 GCC GCC CTC GCC GGG GGC ACC ACC ATC GCC GCC CCC CGT GCG GCC GCC 48 Ala Ala Leu Ala Gly Gly Thr Thr Ile Ala Ala Pro Arg Ala Ala Ala 1 5 10 15 GCC GCC AAG TCC GCG GCG GAC AAC GGC GGT TAC GTC CCC GCC GTC GTC 96 Ala Ala Lys Ser Ala Ala Asp Asn Gly Gly Tyr Val Pro Ala Val Val 20 25 30 ATC GGC ACC GGC TAC GGC GCG GCC GTC TCC GCG CTG CGC CTC GGC GAG 144 Ile Gly Thr Gly Tyr Gly Ala Ala Val Ser Ala Leu Arg Leu Gly Glu 35 40 45 GCG GGT GTG CAG ACC CTG ATG CTG GAG ATG GGC CAG CTG TGG AAC CAG 192 Ala Gly Val Gln Thr Leu Met Leu Glu Met Gly Gln Leu Trp Asn Gln 50 55 60 CCC GGC CCC GAC GGC AAC ATC TTC TGC GGC ATG CTC AAC CCG GAC AAG 240 Pro Gly Pro Asp Gly Asn Ile Phe Cys Gly Met Leu Asn Pro Asp Lys 65 70 75 80 CGG TCC AGC TGG TTC AAG AAC CGC ACC GAG GCC CCG CTC GGC AGC TTC 288 Arg Ser Ser Trp Phe Lys Asn Arg Thr Glu Ala Pro Leu Gly Ser Phe 85 90 95 CTC TGG CTC GAC GTC GTC AAC CGG AAC ATC GAC CCC TAC GCG GGT GTC 336 Leu Trp Leu Asp Val Val Asn Arg Asn Ile Asp Pro Tyr Ala Gly Val 100 105 110 CTG GAC CGT GTG AAC TAC GAC CAG ATG TCG GTC TAC GTG GGC CGC GGC 384 Leu Asp Arg Val Asn Tyr Asp Gln Met Ser Val Tyr Val Gly Arg Gly 115 120 125 GTC GGC GGC GGC TCG CTC GTC AAC GGC GGC ATG GCC GTG GAG CCC AAG 432 Val Gly Gly Gly Ser Leu Val Asn Gly Gly Met Ala Val Glu Pro Lys 130 135 140 CGC TCG TAC TTC GAG GAG ATC CTC CCG CGG GTC GAC TCC TCC GAG ATG 480 Arg Ser Tyr Phe Glu Glu Ile Leu Pro Arg Val Asp Ser Ser Glu Met 145 150 155 160 TAC GAC CGC TAC TTC CCC CGC GCC AAC TCC ATG CTC CGC GTC AAC CAC 528 Tyr Asp Arg Tyr Phe Pro Arg Ala Asn Ser Met Leu Arg Val Asn His 165 170 175 ATC GAC ACC AAG TGG TTC GAG GAC ACC GAG TGG TAC AAG TTC GCC CGC 576 Ile Asp Thr Lys Trp Phe Glu Asp Thr Glu Trp Tyr Lys Phe Ala Arg 180 185 190 GTC TCG CGC GAG CAG GCG GGC AAG GCC GGT CTC GGC ACC GTC TTC GTC 624 Val Ser Arg Glu Gln Ala Gly Lys Ala Gly Leu Gly Thr Val Phe Val 195 200 205 CCC AAC GTC TAC GAC TTC GGC TAC ATG CAG CGC GAG GCC GCG GGC GAG 672 Pro Asn Val Tyr Asp Phe Gly Tyr Met Gln Arg Glu Ala Ala Gly Glu 210 215 220 GTG CCC AAG TCC GCC CTG GCG ACC GAG GTC ATC TAC GGC AAC AAC CAC 720 Val Pro Lys Ser Ala Leu Ala Thr Glu Val Ile Tyr Gly Asn Asn His 225 230 235 240 GGC AAG CAG AGC CTG GAC AAG ACC TAC CTG GCC GCC GCA CTC GGC ACC 768 Gly Lys Gln Ser Leu Asp Lys Thr Tyr Leu Ala Ala Ala Leu Gly Thr 245 250 255 GGC AAG GTC ACC ATC CAG ACC CTG CAC CAG GTC AAG ACG ATC CGT CAG 816 Gly Lys Val Thr Ile Gln Thr Leu His Gln Val Lys Thr Ile Arg Gln 260 265 270 ACG AAG GAC GGC GGC TAC GCG CTG ACC GTC GAG CAG AAG GAC ACC GAC 864 Thr Lys Asp Gly Gly Tyr Ala Leu Thr Val Glu Gln Lys Asp Thr Asp 275 280 285 GGC AAG CTC CTG GCC ACC AAG GAG ATC TCC TGC CGC TAC CTG TTC CTC 912 Gly Lys Leu Leu Ala Thr Lys Glu Ile Ser Cys Arg Tyr Leu Phe Leu 290 295 300 GGC GCG GGC AGC CTC GGC TCC ACC GAA CTG CTG GTG CGC GCC CGC GAC 960 Gly Ala Gly Ser Leu Gly Ser Thr Glu Leu Leu Val Arg Ala Arg Asp 305 310 315 320 ACC GGC ACC CTG CCG AAC CTC AAC TCC GAG GTG GGC GCG GGC TGG GGC 1008 Thr Gly Thr Leu Pro Asn Leu Asn Ser Glu Val Gly Ala Gly Trp Gly 325 330 335 CCC AAC GGC AAC ATC ATG ACC GCC CGG GCC AAC CAC ATG TGG AAC CCC 1056 Pro Asn Gly Asn Ile Met Thr Ala Arg Ala Asn His Met Trp Asn Pro 340 345 350 ACC GGC GCC CAC CAG TCC TCC ATC CCC GCC CTC GGC ATC GAC GCG TGG 1104 Thr Gly Ala His Gln Ser Ser Ile Pro Ala Leu Gly Ile Asp Ala Trp 355 360 365 GAC AAC AGC GAC TCC TCG GTC TTC GCG GAG ATC GCC CCC ATG CCG GCC 1152 Asp Asn Ser Asp Ser Ser Val Phe Ala Glu Ile Ala Pro Met Pro Ala 370 375 380 GGC CTG GAG ACG TGG GTC AGC CTC TAC CTC GCG ATC ACC AAG AAC CCC 1200 Gly Leu Glu Thr Trp Val Ser Leu Tyr Leu Ala Ile Thr Lys Asn Pro 385 390 395 400 CAG CGC GGC ACC TTC GTG TAC GAC GCC GCG ACG GAC CGC GCG AAG CTC 1248 Gln Arg Gly Thr Phe Val Tyr Asp Ala Ala Thr Asp Arg Ala Lys Leu 405 410 415 AAC TGG ACC CGT GAC CAG AAC GCC CCC GCG GTC AAC GCA GCC AAG GCG 1296 Asn Trp Thr Arg Asp Gln Asn Ala Pro Ala Val Asn Ala Ala Lys Ala 420 425 430 CTG TTC GAC CGG ATC AAC AAG GCG AAC GGC ACG ATC TAC CGG TAC GAC 1344 Leu Phe Asp Arg Ile Asn Lys Ala Asn Gly Thr Ile Tyr Arg Tyr Asp 435 440 445 CTC TTC GGC ACC CAG CTG AAG GCC TTC GCC GAC GAC TTC TGC TAC CAC 1392 Leu Phe Gly Thr Gln Leu Lys Ala Phe Ala Asp Asp Phe Cys Tyr His 450 455 460 CCG CTC GGC GGC TGC GTC CTG GGC AAG GCG ACG GAC GAC TAC GGC CGC 1440 Pro Leu Gly Gly Cys Val Leu Gly Lys Ala Thr Asp Asp Tyr Gly Arg 465 470 475 480 GTC GCC GGT TAC AAG AAC CTC TAC GTG ACC GAC GGT TCG CTG ATC CCG 1488 Val Ala Gly Tyr Lys Asn Leu Tyr Val Thr Asp Gly Ser Leu Ile Pro 485 490 495 GGT TCC GTC GGC GTC AAC CCG TTC GTG ACC ATC ACG GCG CTG GCC GAG 1536 Gly Ser Val Gly Val Asn Pro Phe Val Thr Ile Thr Ala Leu Ala Glu 500 505 510 CGG AAC GTC GAG CGC ATC ATC AAG CAG GAC GTC ACG GCG TCG 1578 Arg Asn Val Glu Arg Ile Ile Lys Gln Asp Val Thr Ala Ser 515 520 525

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＣＯ１プラスミドからｐＣＯ３プラスミドの
作成を示す。

【図２】コレステロールオキシダーゼ遺伝子発現ベクタ
ーpCO-117 作成の流れを示す。

【図３】リーダーペプチドが付加された新規タンパク質
と親酵素との酵素との熱安定性の比較を示す。

【符号の説明】

○−○ 親酵素、●−● 新規なコレステロールオキシ
ダーゼ

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:465） (56)参考文献 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒ ｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．171，（1989）, ｐ．596−601 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒ ｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．172，（1990）, ｐ．3644−3653 Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ ｅｎｖｉｒ ｏｎｍｅｎｔａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ｏｇｙ，Ｖｏｌ．52，（1986），ｐ. 1382−1385 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 C12N 15/00 - 15/90 C12N 1/00 - 1/38 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ｐＨ７．０において、５０℃、１５分間
   の加熱条件で１００％のコレステロールオキシダーゼ活
   性を有する下記（ａ）又は（ｂ）の新規なコレステロー
   ルオキシダーゼ。 （ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタン
   パク質 （ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは数個のア
   ミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列か
   らなり、かつコレステロールオキシダーゼ活性を有する
   タンパク質
2. 【請求項２】 ｐＨ７．０において、５０℃、１５分間
   の加熱条件で１００％のコレステロールオキシダーゼ活
   性を有する下記（ｃ）又は（ｄ）の新規なコレステロー
   ルオキシダーゼ。 （ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタン
   パク質 （ｄ）アミノ酸配列（ｃ）において１若しくは数個のア
   ミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列か
   らなり、かつコレステロールオキシダーゼ活性を有する
   タンパク質
3. 【請求項３】 下記の理化学的性質を有する請求項１記
   載の新規なコレステロールオキシダーゼ。 （Ａ）作用：コレステロールを酸化し、過酸化水素と４
   −コレステン−３−オンを生成する反応を触媒する。 （Ｂ）安定性：ｐＨ７．０において、５０℃、１５分間
   の加熱条件下で１００％活性を保持する。 （Ｃ）ミハエリス定数：コレステロールに対し0.09mMの
   Ｋｍ値を示す。 （Ｄ）分子量：約５６．７Ｋｄ
4. 【請求項４】 下記の理化学的性質を有する請求項２記
   載の新規なコレステロールオキシダーゼ。 （Ａ）作用：コレステロールを酸化し、過酸化水素と４
   −コレステン−３−オンを生成する反応を触媒する。 （Ｂ）安定性：ｐＨ７．０において、５０℃、１５分間
   の加熱条件下で１００％活性を保持する。 （Ｃ）ミハエリス定数：コレステロールに対し0.09mMの
   Ｋｍ値を示す。 （Ｄ）分子量：約５６．８Ｋｄ
5. 【請求項５】 配列番号２のアミノ酸配列１〜２１をコ
   ードするＤＮＡを含む新規コレステロールオキシダーゼ
   をコードするＤＮＡを組み込んだプラスミドで形質転換
   した宿主細胞を培地で培養し、該培養物から新規コレス
   テロールオキシダーゼを採取することを特徴とする新規
   コレステロールオキシダーゼの製造法。
6. 【請求項６】 配列番号３のアミノ酸配列１〜２２をコ
   ードするＤＮＡを含む新規コレステロールオキシダーゼ
   をコードするＤＮＡを組み込んだプラスミドで形質転換
   した宿主細胞を培地で培養し、該培養物から新規コレス
   テロールオキシダーゼを採取することを特徴とする新規
   コレステロールオキシダーゼの製造法。
7. 【請求項７】 下記（ｅ）又は（ｆ）のＤＮＡからなる
   遺伝子を組み込んだプラスミドで形質転換した宿主細胞
   を培地で培養し、該培養物から新規コレステロールオキ
   シダーゼを採取することを特徴とする新規コレステロー
   ルオキシダーゼの製造法。 （ｅ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ （ｆ）塩基配列（ｅ）において１若しくは数個の塩基が
   欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ
   コレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質を
   コードするＤＮＡ
8. 【請求項８】 下記（ｇ）又は（ｈ）のＤＮＡからなる
   遺伝子を組み込んだプラスミドで形質転換した宿主細胞
   を培地で培養し、該培養物から新規コレステロールオキ
   シダーゼを採取することを特徴とする新規コレステロー
   ルオキシダーゼの製造法。 （ｇ）配列番号５で表される塩基配列からなるＤＮＡ （ｈ）塩基配列（ｇ）において１若しくは数個の塩基が
   欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ
   コレステロールオキシダーゼ活性を有するタンパク質を
   コードするＤＮＡ