JP2830030B2 - 耐熱性ペルオキシダーゼの遺伝情報を有するｄｎａおよびその用途 - Google Patents
耐熱性ペルオキシダーゼの遺伝情報を有するｄｎａおよびその用途Info
- Publication number
- JP2830030B2 JP2830030B2 JP1089469A JP8946989A JP2830030B2 JP 2830030 B2 JP2830030 B2 JP 2830030B2 JP 1089469 A JP1089469 A JP 1089469A JP 8946989 A JP8946989 A JP 8946989A JP 2830030 B2 JP2830030 B2 JP 2830030B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- amino acid
- peroxidase
- thermostable
- thermostable peroxidase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、耐熱性ペルオキシダーゼの遺伝情報を有す
るDNAおよびその用途に関し、詳しくは耐熱性ペルオキ
シダーゼをコードするDNA、該DNAを含有する組換プラス
ミド、該プラスミドにより形質転換された形質転換体お
よび該形質転換体を用いて耐熱性ペルオキシダーゼを製
造する方法に関する。
るDNAおよびその用途に関し、詳しくは耐熱性ペルオキ
シダーゼをコードするDNA、該DNAを含有する組換プラス
ミド、該プラスミドにより形質転換された形質転換体お
よび該形質転換体を用いて耐熱性ペルオキシダーゼを製
造する方法に関する。
（従来の技術） 従来よりペルオキシダーゼは過酸化水素の存在下で種
々の化合物を酸化する酵素であり、近年臨床診断薬用と
してグルコース、コレステロール、リン脂質及び尿酸な
ど体液成分の定量に種々のオキシダーゼと共に使用され
ており、又、酵素免疫試験法における標識酵素としても
使用されている。
々の化合物を酸化する酵素であり、近年臨床診断薬用と
してグルコース、コレステロール、リン脂質及び尿酸な
ど体液成分の定量に種々のオキシダーゼと共に使用され
ており、又、酵素免疫試験法における標識酵素としても
使用されている。
ここで言うペルオキシダーゼとは、酵素番号EC1.11.1
7であり、系統名Donor:hydrogenperoxide oxidoreducta
seのことである。ペルオキシダーゼの供給源としては西
洋ワサビ、大根等の植物が広く知られている。しかしな
がら、これらの植物由来のペルオキシダーゼには性質が
異なるアイソサイムが含まれるため、診断試薬に用いる
純粋な酵素を得るにはアイソザイムを分離する必要があ
り、非常に手間を要するという問題がある。
7であり、系統名Donor:hydrogenperoxide oxidoreducta
seのことである。ペルオキシダーゼの供給源としては西
洋ワサビ、大根等の植物が広く知られている。しかしな
がら、これらの植物由来のペルオキシダーゼには性質が
異なるアイソサイムが含まれるため、診断試薬に用いる
純粋な酵素を得るにはアイソザイムを分離する必要があ
り、非常に手間を要するという問題がある。
微生物起源のペルオキシダーゼも各種知られており、
オイデイオデンドロン（Oidiodendron）属（特開昭59−
179075号）、アイスロマイセス属（特開昭61−43987
号）、ヒトヨタケ（特開昭61−128887号）存在すること
が報告されている。又、本発明者らは熱安定性の優れた
ペルオキシダーゼを広く検索し、バチルス・ステアロサ
ーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）から60
℃において10分間加温処理をしても95％以上のペルオキ
シダーゼ残存活性を有する耐熱性ペルオキイダーゼを見
出しすでに提案している（特開昭63−207384号）。
オイデイオデンドロン（Oidiodendron）属（特開昭59−
179075号）、アイスロマイセス属（特開昭61−43987
号）、ヒトヨタケ（特開昭61−128887号）存在すること
が報告されている。又、本発明者らは熱安定性の優れた
ペルオキシダーゼを広く検索し、バチルス・ステアロサ
ーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）から60
℃において10分間加温処理をしても95％以上のペルオキ
シダーゼ残存活性を有する耐熱性ペルオキイダーゼを見
出しすでに提案している（特開昭63−207384号）。
（発明が解決しようとする問題点） しかしながら、微生物起源のペルオキシダーゼの生産
性は低く未だ工業化されていない現状である。その生産
性を向上させる方法の開発が望まれている。
性は低く未だ工業化されていない現状である。その生産
性を向上させる方法の開発が望まれている。
（問題点を解決するための手段） 本発明者らは組換DNA技術によって耐熱性ペルオキシ
ダーゼを多量に生産するべく種々鋭意検討した。
ダーゼを多量に生産するべく種々鋭意検討した。
まず、本発明者らはバチルス・ステアロサーモフィラ
スIAM11001の有する耐熱性ペルオキシダーゼ遺伝子をク
ローニングし、該遺伝子のDNA配列を決定した。次いで
該DNAを有するプラスミドを構築し、さらに該プラスミ
ドにより細胞を形成転換して形質転換体を創製し、該形
質転換体を用いる耐熱性ペルオキシダーゼの製造方法を
応用することによって高生産性である製造法を完成し
た。
スIAM11001の有する耐熱性ペルオキシダーゼ遺伝子をク
ローニングし、該遺伝子のDNA配列を決定した。次いで
該DNAを有するプラスミドを構築し、さらに該プラスミ
ドにより細胞を形成転換して形質転換体を創製し、該形
質転換体を用いる耐熱性ペルオキシダーゼの製造方法を
応用することによって高生産性である製造法を完成し
た。
すなわち本発明は第１図ａ〜ｄに示されるアミノ酸配
列を有する耐熱性ペルオキシダーゼ、または第１図ａ〜
ｄに示されるアミノ酸配列において１もしくは複数のア
ミノ酸残基が挿入、欠失または置換されているアミノ酸
配列を有する耐熱性ペルオキシダーゼ活性を有するポリ
ペプチドをコードするDNAである。また、本発明は上記D
NAを含有することを特徴とする組換プラスミドである。
さらに、本発明は上記組換プラスミドにより形質転換さ
れた形質転換体である。本発明は上記形質転換体を培養
し、該培養物から耐熱性ペルオキシダーゼまたは耐熱性
ペルオキシダーゼ活性を有するポリペプチドを採取する
ことを特徴とする耐熱性ペルオキシダーゼの製造法であ
る。
列を有する耐熱性ペルオキシダーゼ、または第１図ａ〜
ｄに示されるアミノ酸配列において１もしくは複数のア
ミノ酸残基が挿入、欠失または置換されているアミノ酸
配列を有する耐熱性ペルオキシダーゼ活性を有するポリ
ペプチドをコードするDNAである。また、本発明は上記D
NAを含有することを特徴とする組換プラスミドである。
さらに、本発明は上記組換プラスミドにより形質転換さ
れた形質転換体である。本発明は上記形質転換体を培養
し、該培養物から耐熱性ペルオキシダーゼまたは耐熱性
ペルオキシダーゼ活性を有するポリペプチドを採取する
ことを特徴とする耐熱性ペルオキシダーゼの製造法であ
る。
本発明の耐熱性ペルオキシダーゼとは、60℃において
10分間加温しても95％以上のペルオキシダーゼ活性を有
している酵素である。本発明の耐熱性ペルオキシダーゼ
のその他の理化学的性質は、下記の通りである。
10分間加温しても95％以上のペルオキシダーゼ活性を有
している酵素である。本発明の耐熱性ペルオキシダーゼ
のその他の理化学的性質は、下記の通りである。
（１） 作用特異性：過酸化水素の存在下で水素供与体
の酸化を触媒する。
の酸化を触媒する。
（２） 至適pH:pH6付近にある。
（３） 至適温度:50℃付近にある。
本発明の耐熱性ペルオキシダーゼ活性を有するポリペ
プチドとは、60℃において、10分間加温しても95％以上
のペルオキシダーゼ活性を有するポリペプチドである。
プチドとは、60℃において、10分間加温しても95％以上
のペルオキシダーゼ活性を有するポリペプチドである。
本発明の耐熱性ペルオキシダーゼはバチルス・ステロ
サーモフィラスIAM11001から得たDNA配列から演繹して
第１図ａ〜ｄに示すアミノ酸配列を有する。本発明の耐
熱性ペルオキシダーゼをコードするDNAは第１図ａ〜ｄ
に示されるアミノ酸配列をコードする。このようなDNA
としては例えば第２図ａ〜ｄに示される塩基配列があ
る。
サーモフィラスIAM11001から得たDNA配列から演繹して
第１図ａ〜ｄに示すアミノ酸配列を有する。本発明の耐
熱性ペルオキシダーゼをコードするDNAは第１図ａ〜ｄ
に示されるアミノ酸配列をコードする。このようなDNA
としては例えば第２図ａ〜ｄに示される塩基配列があ
る。
よく知られているように、多くのポリペプチドはそれ
をコードするDNA配列は複数存在する。その塩基配列は
一義的に決まらず、多数の可能性があり得る。本発明者
らにより明らかにされたバチルス・ステアロサーモフィ
ルサIAM11001株の耐熱性ペルオキシダーゼのアミノ酸配
列をコードするDNAの場合もその塩基配列は天然の遺伝
子の塩基配列以外にも多数の可能性があり、本発明のDN
Aは上記菌株の本来有するDNAのみに限定されるものでは
なく、本発明により明らかにされた耐熱性ペルオキシダ
ーゼのアミノ酸配列をコードする他のDNAも含む。
をコードするDNA配列は複数存在する。その塩基配列は
一義的に決まらず、多数の可能性があり得る。本発明者
らにより明らかにされたバチルス・ステアロサーモフィ
ルサIAM11001株の耐熱性ペルオキシダーゼのアミノ酸配
列をコードするDNAの場合もその塩基配列は天然の遺伝
子の塩基配列以外にも多数の可能性があり、本発明のDN
Aは上記菌株の本来有するDNAのみに限定されるものでは
なく、本発明により明らかにされた耐熱性ペルオキシダ
ーゼのアミノ酸配列をコードする他のDNAも含む。
また、組換DNA技術によれば基本となるDNAの特定の部
位に該DNAがコードするものの基本的な特性を変化させ
ることなく、あるいはその特性が改善するように、人為
的に変化を起こすことが出来る。本発明により提供され
る耐熱性ペルオキシダーゼをコードする天然の塩基配列
を有するDNAあるいは天然のものとは異なるが同じアミ
ノ酸配列をコードするDNAに関しても、同様に人為的に
１もしくは複数のDNAが挿入、欠失または置換を行うこ
とにより、本発明の耐熱性ペルオキシダーゼと生物学的
に同等の性質を有するポリペプチドを得ることが可能で
あり、本発明はこのような変異遺伝子をも含有する。
位に該DNAがコードするものの基本的な特性を変化させ
ることなく、あるいはその特性が改善するように、人為
的に変化を起こすことが出来る。本発明により提供され
る耐熱性ペルオキシダーゼをコードする天然の塩基配列
を有するDNAあるいは天然のものとは異なるが同じアミ
ノ酸配列をコードするDNAに関しても、同様に人為的に
１もしくは複数のDNAが挿入、欠失または置換を行うこ
とにより、本発明の耐熱性ペルオキシダーゼと生物学的
に同等の性質を有するポリペプチドを得ることが可能で
あり、本発明はこのような変異遺伝子をも含有する。
本発明のDNAを含有する組換プラスミドを得る方法と
しては、まず例えばバチルス・ステアロサーモフィラス
IAM11001株を栄養培地にて培養し、該培養物からRecomb
inant DNA Techniques（Rodringuez R.L.et al,Addison
−Wesley Publishing Company,1983）などに記載される
方法に従い染色体DNAを得る。次にこの染色体DNAを制限
酵素により切断し、ベクターと切断された染色体DNAを
両DNAの平滑または接着末端部においてDNAリガーゼなど
により結合閉環させ、組換えられたDNAベクターを複製
可能な宿主細胞に形質転換し、培養して遺伝子・ライブ
ラリーを作成する。形質転換体を培養して得られたコロ
ニー上でペルオキシダーゼ活性を発現させる方法にて目
的のDNAを含有するコロニーを採取し、該コロニーを培
養して得られた培養物より本発明の組換プラスミドを分
離精製する。
しては、まず例えばバチルス・ステアロサーモフィラス
IAM11001株を栄養培地にて培養し、該培養物からRecomb
inant DNA Techniques（Rodringuez R.L.et al,Addison
−Wesley Publishing Company,1983）などに記載される
方法に従い染色体DNAを得る。次にこの染色体DNAを制限
酵素により切断し、ベクターと切断された染色体DNAを
両DNAの平滑または接着末端部においてDNAリガーゼなど
により結合閉環させ、組換えられたDNAベクターを複製
可能な宿主細胞に形質転換し、培養して遺伝子・ライブ
ラリーを作成する。形質転換体を培養して得られたコロ
ニー上でペルオキシダーゼ活性を発現させる方法にて目
的のDNAを含有するコロニーを採取し、該コロニーを培
養して得られた培養物より本発明の組換プラスミドを分
離精製する。
さらに発現べクター、例えば、lacプロモーターを保
持する発現ベクターpUC18（東洋紡）、大腸菌の強力な
プロモーターであるtacプロモーターとrrnBリボソームR
NAのターミネーターを保持する発現ベクターpKK223−３
（ファルマシア社）、trpプロモーターを保持する発現
ベクターpDR720（ファルマシア社）、誘導可能な発現ベ
クターpPL−Lambda（ファルマシア社）等に上記DNAを連
絡することにより、大腸菌等の微生物菌体内で本発明の
耐熱性ペルオキシダーゼを生産させる組換プラスミドを
構築することができる。さらに例えば枯草菌と大腸菌と
のシャトル・ベクターpHY300PLK（東洋紡）やプラスミ
ドベクターpUB110（J.Bacteriol.,134,318−329,1978）
などに上記DNAを連結することにより枯草菌の微細物菌
体内及び培養液中でバチルス・ステアロサーモフィラス
IAM11001の耐熱性ペルオキシダーゼを生産させる組換プ
ラスミドを構築することができる。
持する発現ベクターpUC18（東洋紡）、大腸菌の強力な
プロモーターであるtacプロモーターとrrnBリボソームR
NAのターミネーターを保持する発現ベクターpKK223−３
（ファルマシア社）、trpプロモーターを保持する発現
ベクターpDR720（ファルマシア社）、誘導可能な発現ベ
クターpPL−Lambda（ファルマシア社）等に上記DNAを連
絡することにより、大腸菌等の微生物菌体内で本発明の
耐熱性ペルオキシダーゼを生産させる組換プラスミドを
構築することができる。さらに例えば枯草菌と大腸菌と
のシャトル・ベクターpHY300PLK（東洋紡）やプラスミ
ドベクターpUB110（J.Bacteriol.,134,318−329,1978）
などに上記DNAを連結することにより枯草菌の微細物菌
体内及び培養液中でバチルス・ステアロサーモフィラス
IAM11001の耐熱性ペルオキシダーゼを生産させる組換プ
ラスミドを構築することができる。
本発明の耐熱性ペルオキシダーゼをコードするDNAを
含有する組換プラスミドを細胞へ導入することにより、
菌体内及菌体外で耐熱性ペルオキシダーゼを生産する形
質転換体を得ることができる。該細胞としては大腸菌や
枯草菌などの細菌、酵母、動物細胞などが使用できる。
含有する組換プラスミドを細胞へ導入することにより、
菌体内及菌体外で耐熱性ペルオキシダーゼを生産する形
質転換体を得ることができる。該細胞としては大腸菌や
枯草菌などの細菌、酵母、動物細胞などが使用できる。
この様にして製造された形質転換体を適当な培地条件
で培養することにより耐熱性ペルオキシダーゼを大量に
生産することが可能である。この場合、例えば培養初期
に誘導剤、イソプロピルチオガラクトシド等を添加する
ことにより耐熱性ペルオキシダーゼの生産を有利に行う
ことができる。培養後の耐熱性ペルオキシダーゼの単離
は、例えば菌体をリゾチームで処理するかあるいは超音
波等の手段を用いて破砕したり、または培養液より抽出
・分離・精製することにより行うことができる。
で培養することにより耐熱性ペルオキシダーゼを大量に
生産することが可能である。この場合、例えば培養初期
に誘導剤、イソプロピルチオガラクトシド等を添加する
ことにより耐熱性ペルオキシダーゼの生産を有利に行う
ことができる。培養後の耐熱性ペルオキシダーゼの単離
は、例えば菌体をリゾチームで処理するかあるいは超音
波等の手段を用いて破砕したり、または培養液より抽出
・分離・精製することにより行うことができる。
また、大腸菌や枯草菌の宿主−ベクター系のみなら
ず、酵母、シュードモナス菌あるいは放線菌等の宿主−
ベクター系を利用可能であり、各々の宿主−ベクター系
の特徴を生かした耐熱性ペルオキシダーゼの大量生産が
行える。
ず、酵母、シュードモナス菌あるいは放線菌等の宿主−
ベクター系を利用可能であり、各々の宿主−ベクター系
の特徴を生かした耐熱性ペルオキシダーゼの大量生産が
行える。
以下に実施例を挙げ、さらに本発明を詳細に説明す
る。本発明は以下の実施例のみに限定されるものではな
い。
る。本発明は以下の実施例のみに限定されるものではな
い。
実施例１ （１） バチルス・ステアロサーモフィラスIAM11001株
の染色体DNAの調製 バチルス・ステアロサーモフィラスIAM11001株をLuri
a−Bertani（LB）培地（ペプトン１％，酵母エキス0.5
％，食塩１％,pH7.0）100mlに接種し、55℃で12時間振
盪培養して培養液を得た。この培養物を12,000rpm、10
分間遠心分離して湿菌体約1gを得た後、該菌体からReco
mbinant DNA Techniques（Rodriguez R.L.et al,Addiso
n−Wesley Pubblishing Company,1983）記載の方法によ
り染色体DNA約750μｇ調製した。
の染色体DNAの調製 バチルス・ステアロサーモフィラスIAM11001株をLuri
a−Bertani（LB）培地（ペプトン１％，酵母エキス0.5
％，食塩１％,pH7.0）100mlに接種し、55℃で12時間振
盪培養して培養液を得た。この培養物を12,000rpm、10
分間遠心分離して湿菌体約1gを得た後、該菌体からReco
mbinant DNA Techniques（Rodriguez R.L.et al,Addiso
n−Wesley Pubblishing Company,1983）記載の方法によ
り染色体DNA約750μｇ調製した。
次にこの染色体DNA100μｇを制限酵素EcoR I（東洋紡
製）50ユニットで37℃、３時間切断した。切断後５〜20
％ショ糖密度勾配遠心分離を行なって１〜10kb画分のDN
A断片約10μｇを調製した。
製）50ユニットで37℃、３時間切断した。切断後５〜20
％ショ糖密度勾配遠心分離を行なって１〜10kb画分のDN
A断片約10μｇを調製した。
（２） 耐熱性ペルオキシダーゼをコードするDNAを含
有する組換プラスミドの調製 プラスミドベクターpBR322（東洋紡製）１μｇをEcoR
I5ユニットで37℃、２時間切断した後、上記（１）で
調製した染色体DNA2μｇと混合し、T4DNAリガーゼ（東
洋紡製）１ユニットで16℃、12時間反応させてDNAを連
結した。次いで得られた組換プラスミドを用い、Molecu
lar Cloning（Maniatis T.et al.,Cold Spring Harbor,
1982）記載の方法によりＥ．ColiUM228を形質転換し
た。
有する組換プラスミドの調製 プラスミドベクターpBR322（東洋紡製）１μｇをEcoR
I5ユニットで37℃、２時間切断した後、上記（１）で
調製した染色体DNA2μｇと混合し、T4DNAリガーゼ（東
洋紡製）１ユニットで16℃、12時間反応させてDNAを連
結した。次いで得られた組換プラスミドを用い、Molecu
lar Cloning（Maniatis T.et al.,Cold Spring Harbor,
1982）記載の方法によりＥ．ColiUM228を形質転換し
た。
使用DNA1μｇ当り約１×105個の形質転換体のコロニ
ーが得られた。耐熱性ペルオキシダーゼをコードするDN
Aを含有する組換プラスミドの検索は、コロニー・アッ
セイにより行なった。すなわち下記の組成の反応液を調
製した。
ーが得られた。耐熱性ペルオキシダーゼをコードするDN
Aを含有する組換プラスミドの検索は、コロニー・アッ
セイにより行なった。すなわち下記の組成の反応液を調
製した。
4mM ４−アミノアンチピリン 0.5ml 24.6mM 2,4−ジクロロフェノール 0.5ml 8.8mM H2O2 1.0ml 100mM リン酸緩衝液,pH6.0 1.0ml 次いで上記反応液をろ紙（Advantec製131 90mm）に浸
み込ませ、前記LB寒培地上に生育した形質転換体をコロ
ニーに接触させ、強い呈色を示すコロニーを選択した。
み込ませ、前記LB寒培地上に生育した形質転換体をコロ
ニーに接触させ、強い呈色を示すコロニーを選択した。
1,500コロニーから検索したところ２個の強い呈色を
示すコロニーが得られた。この２種の形質転換体よりMo
lecular Cloning（Maniatis T.et al.,Cold Spring Har
bor,1982）記載の方法により組換えプラスミドを抽出
し、EcoR Iで切断すると２種の組換えプラスミドに共通
な約3.1kbのDNA断片が見い出された。この約3.1kbの断
片を単離し、再びEcoR Iで切断して開環したpBR322前記
の方法で連結し、組換えプラスミドpOD10を得た。この
約3.1kbのEcoR I断片は種々の制限酵素により特徴付け
られた（第３図参照）。pOD10は生物学的活性の耐熱性
ペルオキシダーゼをコードする。
示すコロニーが得られた。この２種の形質転換体よりMo
lecular Cloning（Maniatis T.et al.,Cold Spring Har
bor,1982）記載の方法により組換えプラスミドを抽出
し、EcoR Iで切断すると２種の組換えプラスミドに共通
な約3.1kbのDNA断片が見い出された。この約3.1kbの断
片を単離し、再びEcoR Iで切断して開環したpBR322前記
の方法で連結し、組換えプラスミドpOD10を得た。この
約3.1kbのEcoR I断片は種々の制限酵素により特徴付け
られた（第３図参照）。pOD10は生物学的活性の耐熱性
ペルオキシダーゼをコードする。
一方約3.1kbのEcoR I断片は、EcoR Iで断片したM13mp
18ファージDNA（東洋紡製）に連結した後、Bal31ヌクレ
アーゼ（東洋紡製）でディレーションを行ない、さまざ
まな大きさのDNA断片を得、情報に従い一本鎖DNAを調製
した。得られた一本鎖DNAについて、M13・シークエンシ
ングキット（M14 Sequencing Kit,東洋紡製）を用いて
塩基配列の決定を行なった。
18ファージDNA（東洋紡製）に連結した後、Bal31ヌクレ
アーゼ（東洋紡製）でディレーションを行ない、さまざ
まな大きさのDNA断片を得、情報に従い一本鎖DNAを調製
した。得られた一本鎖DNAについて、M13・シークエンシ
ングキット（M14 Sequencing Kit,東洋紡製）を用いて
塩基配列の決定を行なった。
決定した塩基配列及ひアミノ酸配列を第２図ａ〜ｄお
よび第１図ａ〜ｄに示した。
よび第１図ａ〜ｄに示した。
（３） 耐熱性ペルオキシダーゼをコードするDNAを含
有する組換プラスミドを用いた形質転換体の調製。
有する組換プラスミドを用いた形質転換体の調製。
上記耐熱性ペルオキシダーゼをコードするDNAを含有
する組換プラスミドであるpOD10を用い、前記Molecular
Cloning記載の方法によりＥ．coliUM28を形質転換して
Ｅ．coliUM228（pOD10）を得た。この形質転換体は耐熱
性ぺルオキシダーゼを生産していることを確認した。
する組換プラスミドであるpOD10を用い、前記Molecular
Cloning記載の方法によりＥ．coliUM28を形質転換して
Ｅ．coliUM228（pOD10）を得た。この形質転換体は耐熱
性ぺルオキシダーゼを生産していることを確認した。
次に各菌株による耐熱性ペルオキシダーゼの生産性を
第１表に示す。耐熱性ペルオキシダーゼの活性測定は、
次の方法に従った。
第１表に示す。耐熱性ペルオキシダーゼの活性測定は、
次の方法に従った。
4mM ４−アミノアンチピリン 0.5ml 24.6mM 2,4−ジクロロフェノール 0.5ml 8.8mM H2O2 1.0ml 100mM リン酸緩衝液,pH6.0 1.0ml を混合し、約５分間、50℃で予備加温後、酵素液10μ
を添加し、500nmにおける吸光度の増加を測定した。分
子吸光係数は1.36×104M-1cm-1を用いた。
を添加し、500nmにおける吸光度の増加を測定した。分
子吸光係数は1.36×104M-1cm-1を用いた。
また、培養は、前記LB培地でＥ．coliは37℃、バチル
ス・ステロアサーモモフィラスIAM11001は55℃で12時間
振盪培養して菌体内酵素活性を測定した。
ス・ステロアサーモモフィラスIAM11001は55℃で12時間
振盪培養して菌体内酵素活性を測定した。
上記データよりＥ．coliUM228（pOD10）が耐熱性ペル
オキシダーゼを生産していることが明らかである。
オキシダーゼを生産していることが明らかである。
（４） Ｅ．coliUM228（pOD10）による耐熱性ペルオキ
シダーゼの生産、及び該酵素の精製。
シダーゼの生産、及び該酵素の精製。
前記LB培地６を10ジャーファメンターに分注し、
121℃、15分間オートクレーブを行ない放冷後、50mg/ml
アンピシリン（ナカライテスク製）を無菌的に6ml添加
した。この培地に上記と同一組成の培地で予め37℃で16
時間振盪培養したＥ．coliUM228（pOD10）の培養液60ml
を接種し、37℃で16時間通気撹拌培養した。培養終了時
の耐熱性ペルオキシダーゼ活性は1.5U/mlであった。
121℃、15分間オートクレーブを行ない放冷後、50mg/ml
アンピシリン（ナカライテスク製）を無菌的に6ml添加
した。この培地に上記と同一組成の培地で予め37℃で16
時間振盪培養したＥ．coliUM228（pOD10）の培養液60ml
を接種し、37℃で16時間通気撹拌培養した。培養終了時
の耐熱性ペルオキシダーゼ活性は1.5U/mlであった。
培養液６を遠心分離にて集菌し、20mMリン酸緩衝液
pH7.0に懸濁し、常法により超音波破砕した後、15,000r
pmで20分間遠心分離して耐熱性ペルオキシダーゼの粗酵
素液を得られた。このようにして得た粗酵素液を硫安分
画（35％飽和〜55％飽和）して活性画分36mlを得、100m
Mリン酸緩衝液pH7.0に対して透析して脱塩した。
pH7.0に懸濁し、常法により超音波破砕した後、15,000r
pmで20分間遠心分離して耐熱性ペルオキシダーゼの粗酵
素液を得られた。このようにして得た粗酵素液を硫安分
画（35％飽和〜55％飽和）して活性画分36mlを得、100m
Mリン酸緩衝液pH7.0に対して透析して脱塩した。
さらに20mMリン酸緩衝液pH7.0で緩衝化したDEAE−セ
ファデックスＡ−50（ファルマシア製）に吸着させた。
20mMリン酸緩衝液pH7.0で洗浄後、０〜0.5MNaClを含む2
0mMリン酸緩衝液pH7.0で溶出し、活性画分を集め、310m
lを得た。再度脱塩後、DEAE−セファデックスA50クロマ
トグラフィーを行い、活性画分200mlを得た。
ファデックスＡ−50（ファルマシア製）に吸着させた。
20mMリン酸緩衝液pH7.0で洗浄後、０〜0.5MNaClを含む2
0mMリン酸緩衝液pH7.0で溶出し、活性画分を集め、310m
lを得た。再度脱塩後、DEAE−セファデックスA50クロマ
トグラフィーを行い、活性画分200mlを得た。
さらに、20mMリン緩衝液pH7.0で緩衝化したトヨパー
ルHW455（東洋曹達製）で分子節を行い、活性画分60ml
を得た。次いでTSK−DEAE−3SW（東洋曹達製）高速液体
クロマトグラフィーで吸着溶出し、高純度品128mlを得
た。得られた酵素液は14.77U/ml、比活性9.9U/mg蛋白質
であり収率は21％であった。
ルHW455（東洋曹達製）で分子節を行い、活性画分60ml
を得た。次いでTSK−DEAE−3SW（東洋曹達製）高速液体
クロマトグラフィーで吸着溶出し、高純度品128mlを得
た。得られた酵素液は14.77U/ml、比活性9.9U/mg蛋白質
であり収率は21％であった。
上記精製手段により得られる耐熱性ペルオキシダーゼ
の理化学的性質は、DNA供与株であるバチルス・ステア
ロサーモフィラスIAM11001株の生産する耐熱性ペルオキ
シダーゼの理化学的性質と全く同様であった。
の理化学的性質は、DNA供与株であるバチルス・ステア
ロサーモフィラスIAM11001株の生産する耐熱性ペルオキ
シダーゼの理化学的性質と全く同様であった。
（発明の効果） 上述したことにより明らかなように、本発明の耐熱性
ペルオキシダーゼをコードするDNAを含有する組換プラ
スミドを用いた形質転換体を栄養培地にて培養すること
により、耐熱性ペルオキシダーゼを効率よく多量に得る
ことが可能となる。
ペルオキシダーゼをコードするDNAを含有する組換プラ
スミドを用いた形質転換体を栄養培地にて培養すること
により、耐熱性ペルオキシダーゼを効率よく多量に得る
ことが可能となる。
第１図はａ〜ｄはバチルス・ステアロサーモフィラスIA
M11001株の耐熱性ペルオキシダーゼをコードするDNA配
列に対応するアミノ酸配列を示す。 第２図ａ〜ｄはバチルス・ステアロサーモフィラスIAM1
1001株の耐熱性ペルオキシダーゼをコードするDNAを示
す。 第３図はバチルス・ステアロサーモフィラスIAM11001株
からの約3.1kbDNA断片及びプラスミトpBR322よりのpOD1
0の構造を示す。
M11001株の耐熱性ペルオキシダーゼをコードするDNA配
列に対応するアミノ酸配列を示す。 第２図ａ〜ｄはバチルス・ステアロサーモフィラスIAM1
1001株の耐熱性ペルオキシダーゼをコードするDNAを示
す。 第３図はバチルス・ステアロサーモフィラスIAM11001株
からの約3.1kbDNA断片及びプラスミトpBR322よりのpOD1
0の構造を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/08 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (4)
- 【請求項１】第１図ａ〜ｄに示されるアミノ酸配列を有
する耐熱性ペルオキシダーゼ、または第１図ａ〜ｄに示
されるアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸
残基が挿入、欠失または置換されているアミノ酸配列を
有する耐熱性ペルオキシダーゼ活性を有するポリペプチ
ドをコードするDNA。 - 【請求項２】第１図ａ〜ｄに示されるアミノ酸配列を有
する耐熱性ペルオキシダーゼ、または第１図ａ〜ｄに示
されるアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸
残基が挿入、欠失または置換されているアミノ酸配列を
有する耐熱性ペルオキシダーゼ活性を有するポリペプチ
ドをコードするDNAを含有することを特徴とする組換プ
ラスミド。 - 【請求項３】第１図ａ〜ｄに示されるアミノ酸配列を有
する耐熱性ペルオキシダーゼ、または第１図ａ〜ｄに示
されるアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸
残基が挿入、欠失または置換されているアミノ酸配列を
有する耐熱性ペルオキシダーゼ活性を有するポリペプチ
ドをコードするDNAを含有する組換プラスミドにより形
質転換された形質転換体。 - 【請求項４】第１図ａ〜ｄに示されるアミノ酸配列を有
する耐熱性ペルオキシダーゼ、または第１図ａ〜ｄに示
されるアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸
残基が挿入、欠失または置換されているアミノ酸配列を
有する耐熱性ペルオキシダーゼ活性を有するポリペプチ
ドをコードするDNAを含有することを特徴とする組換プ
ラスミドにより形質転換された形質転換体を培養し、該
培養物から耐熱性ペルオキシダーゼまたは耐熱性ペルオ
キシダーゼ活性を有するポリペプチドを採取することを
特徴とする耐熱性ペルオキシダーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1089469A JP2830030B2 (ja) | 1989-04-07 | 1989-04-07 | 耐熱性ペルオキシダーゼの遺伝情報を有するｄｎａおよびその用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1089469A JP2830030B2 (ja) | 1989-04-07 | 1989-04-07 | 耐熱性ペルオキシダーゼの遺伝情報を有するｄｎａおよびその用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02268684A JPH02268684A (ja) | 1990-11-02 |
| JP2830030B2 true JP2830030B2 (ja) | 1998-12-02 |
Family
ID=13971575
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1089469A Expired - Fee Related JP2830030B2 (ja) | 1989-04-07 | 1989-04-07 | 耐熱性ペルオキシダーゼの遺伝情報を有するｄｎａおよびその用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2830030B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5665222A (en) * | 1995-10-11 | 1997-09-09 | E. Heller & Company | Soybean peroxidase electrochemical sensor |
| US6689265B2 (en) | 1995-10-11 | 2004-02-10 | Therasense, Inc. | Electrochemical analyte sensors using thermostable soybean peroxidase |
-
1989
- 1989-04-07 JP JP1089469A patent/JP2830030B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02268684A (ja) | 1990-11-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2799380B2 (ja) | 新規酵素 | |
| EP0654084A1 (en) | Molecular cloning of the genes reponsible for collagenase production from clostridium histolyticum | |
| JP3380133B2 (ja) | 新規なニトリルヒドラターゼ | |
| US5550046A (en) | DNA encoding α-glucosidase and method of producing same by genetic engineering | |
| JP2830030B2 (ja) | 耐熱性ペルオキシダーゼの遺伝情報を有するｄｎａおよびその用途 | |
| EP0537553B1 (en) | Farnesyl pyrophosphate synthetase and DNA sequence encoding the same | |
| JP2004313074A (ja) | 新規α−１，２−マンノシダーゼおよびその遺伝子、ならびに該酵素を用いたα−マンノシル糖化合物の製造方法 | |
| JPS6047683A (ja) | プロモ−タ− | |
| JP3429569B2 (ja) | 環状イソマルトオリゴ糖合成酵素遺伝子を含有するｄｎａ、組み換え体ｄｎａ、及び環状イソマルトオリゴ糖合成酵素の製造法 | |
| JP3399685B2 (ja) | コレステロールオキシダーゼ活性を有する改変酵素 | |
| JP3097795B2 (ja) | 新規なコレステロールオキシダーゼ | |
| JP4021123B2 (ja) | ラフィノースの新規製造方法 | |
| JP2833793B2 (ja) | ヘパリナーゼをコードするプラスミド、このプラスミドを保持するヘパリナーゼ生産株及びヘパリナーゼの製造法 | |
| JP4161236B2 (ja) | 新規なＬ−α−グリセロホスフェートオキシダーゼおよびその製造方法 | |
| US5514587A (en) | DNA fragment encoding a hydrogen peroxide-generating NADH oxidase | |
| JPH02286077A (ja) | バチルス・エス・ピー、ｌ―乳酸脱水素酵素遺伝子を含有するｄｎａ断片およびそれを含有する組み換え体プラスミド並びにｌ―乳酸脱水素酵素遺伝子およびそれを含有する組み換え体プラスミド。 | |
| US5712139A (en) | Pyranose oxidase, pyranose oxidase gene, novel recombinant DNA and process for producing pyranose oxidase | |
| JPH10248574A (ja) | 新規な乳酸酸化酵素 | |
| JPH1052274A (ja) | 耐熱性β−グルコシダーゼ遺伝子、新規な組み換え体ＤＮＡ及び耐熱性β−グルコシダーゼの製造法 | |
| Kettleborough et al. | Chimaeras of the Rubisco large subunit from wheat and Anacystis do not assemble into active enzyme in E. coli | |
| JP3829950B2 (ja) | 新規なクレアチニンアミドヒドロラーゼ | |
| JP3113947B2 (ja) | 胆汁酸硫酸サルファターゼ遺伝子、新規な組み換え体ｄｎａ及び胆汁酸硫酸サルファターゼの製造法 | |
| JPH0353883A (ja) | 耐熱性β‐１，３‐グルカナーゼ遺伝子ＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換え体プラスミド及び形質転換体と耐熱性β‐１，３‐グルカナーゼ及びその製法 | |
| JP2001275685A (ja) | α−アガラーゼおよびその製造方法 | |
| JPH07143881A (ja) | クレアチニンデイミナーゼ活性を有する蛋白質の遺伝情報を有するｄｎａ並びにクレアチニンデイミナーゼの製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20070925 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080925 Year of fee payment: 10 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |