JP2799380B2

JP2799380B2 - 新規酵素

Info

Publication number: JP2799380B2
Application number: JP1501447A
Authority: JP
Inventors: 亜紀子藤原; 達雄星野; 雅子新城
Original assignee: エフ・ホフマン‐ラロシユアーゲー
Priority date: 1988-01-14
Filing date: 1989-01-09
Publication date: 1998-09-17
Anticipated expiration: 2013-09-17
Also published as: JPH03500844A; WO1989006688A2; EP0373181B1; DK454689D0; ATE130030T1; EP0373181A1; DE68924761T2; WO1989006688A3; DK454689A; DE68924761D1; US5352599A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、新規酵素すなわちＬ−ソルボリン脱水素酵
素とその製造方法及び該酵素を用いた２−ケト−Ｌ−グ
ロン酸の製造方法に関するものである。さらに、本発明
は該酵素の遺伝子のクローニングおよび発現のための改
良された方法ならびに２−ケト−Ｌ−グロン酸を高収率
で生産可能な形質転換微生物を与える遺伝子工学的手法
に関するものである。

化合物２−ケト−Ｌ−グロン酸（２−KGA）は、アス
コルビン酸（ビタミンＣ）の合成における重要な中間体
である。数多くの微生物がＤ−ソルビトールもしくはＬ
−ソルボースから２−KGAを生産することが知られてお
り、例を示せば、２−KGA生産量は6g/L以下ではあるが
アセトバクター（Acetobacter）属やシユードモナス（P
seudomonas）属の菌が知られている（特公昭51−40,154
号）。一般的にＤ−ソルビトールから２−KGAへの経路
は下記の如くに考えられている（Makoverらの1975、Bio
technol.and Bioeng.17、第1485頁−第1514頁）。

Ｄ−ソルビトール→Ｌ−ソルボース→Ｌ−ソルボリン
→２−KGA微生物を用いてＬ−ソルボリンを２−KGAに変
換する反応が知られている。いくつかの先行文献におい
て、微生物の無細胞抽出液を用いたＬ−ソルボリンから
の２−KGA生産が報告されている。

米国特許明細書第3,907,639号には、アセトバクター
（Acetobacter）属、シユードモナス（Pseudomonas）
属、エシエリヒア（Escherichia）属、セラチア（Serra
tia）属、バチルス（Bacillus）属、スタフイロコツカ
ス（Staphylococcus）属、アエロバクター（Aerobacte
r）属、アルカリゲネス（Alcaligenes）属、ペニシリウ
ム（Penicillium）属、キヤンデイダ（Candida）属およ
びグルコノバクター属に属する微生物は、前記の様な変
換を行いうることが報告されている。

更に北村ら（Europ.J.Appl.Microbiol.第２巻、第１
頁、1975）は、グルコノバクター・メラノゲネス（Gluc
onobacter melanogenes）IFO3293から発見したＬ−ソル
ボリン酸化酵素が酵素活性発現に、補酵素や電子受容体
のいずれも要求しないと報告している。

しかしながら、これまでに、ニコチンアミド−アデニ
ンジヌクレオチド（NAD）もしくは、ニコチンアミド−
アデニンジヌクレオチド燐酸（NADP）等の補酵素に依存
せずに、Ｌ−ソルボリンを２−KGAに酸化する活性を有
する精製酵素に関する開示はなされていない。

特定の微生物の細胞の膜画分から単離精製した酵素
が、NADやNADPの様な補酵素に依存せずにＬ−ソルボリ
ンの２−KGAへの酸化を触媒することが見い出された。
本発明は、この発見に基いて完成されたものである。

本発明の目的は、Ｌ−ソルボリンの２−KGAへの酸化
を触媒する、新規な補酵素非依存型Ｌ−ソルボリン脱水
素酵素を提供することにある。また、それ以外の目的
は、発酵法による該新規Ｌ−ソルボリン脱水素酵素の製
造方法を提供することにある。更にまた、本発明の目的
は、該新規Ｌ−ソルボリン脱水素酵素もしくは該酵素を
生産する微生物を用いて、Ｌ−ソルボリンから２−KGA
を製造する改良された方法を提供することにある。

更に本発明の別の観点からの目的は、改良された方法
による該Ｌ−ソルボリン脱水素酵素の生産を可能にし、
かつまた組み換え微生物によって生産される該酵素もし
くは、発酵法による該組み換え微生物を用いてＬ−ソル
ボリンから２−KGA生産を可能ならしめる遺伝子工学技
術を提供することにある。この観点から、該新規Ｌ−ソ
リボリン脱水素酵素をコードする遺伝子を含むDNA、ベ
クターおよび該DNAを有する組換え体もまた本発明の範
囲に含まれる。

関連する該DNA、DNA断片、組換えDNA分子、組換え微
生物および製造方法に関連して与えられるアミノ酸部分
配列に関しては、前記アミノ酸配列の機能的同等物、即
ち同じ目的を達成する同等物も含まれると理解される。

図面の説明第１図は、プラスミドpVK102の制限酵素地図を示す。

第２図は、本発明のプラスミドの制限酵素地図を示
す。

第３図は、Ｌ−ソルボリン脱水素酵素をコードする構
造遺伝子を含むDNAの制限酵素地図を示す。

第４図は、グルコノバクター・オキシダンスIFO12258
由来のＬ−ソルボリン脱水素酵素をコードするDNAの塩
基配列を示す。

下線部は、該酵素蛋白質のペプチド断片のアミノ酸配
列分析から決定された部分的アミノ酸配列を示す。

本発明の新規Ｌ−ソルボリン脱水素酵素は、Ｌ−ソル
ボリンから２−KGAへの酸化反応において、NDA、NDAP、
フラビンモノヌクレオチド（FMN）、フラビン・アデニ
ンジヌクレオチド（FND）等の様な補酵素に依存しない
点に特徴がある。

本酵素の諸性質ならびにその製造方法を以下に示す。

（１）酵素活性本発明のＬ−ソルボリン脱水素酵素は、以下の反応様
式に示す様に、電子受容体の存下に、Ｌ−ソルボリンの
２−KGAへの酸化を触媒する。

本酵素は、分子状の酸素を受容体として利用しない。
受容体としては、2,6−ジクロロフエノールインドフエ
ノール（DCIP）、フエナジンメソサルフエイト、ヴルス
ターズ青、フエリシアナイド、補酵素Ｑまたはチトクロ
ームＣが使用可能である。

酵素活性測定は、25℃で、600nmにおけるDCIPの吸光
度の減少を吸光度計で測定することにより行なれる。１
ユニツトの酵素活性は、１分間あたり１マイクロモル
（μmole）のDCIPを還元する酵素の量と定義した。p7H.
0におけるDCIPの吸光係数は、1mM当り9.45である。基本
的な反応溶液を以下に示す。本反応溶液は、活性測定の
直前に調製した。

基本反応溶液： 0.3％トライトンＸ−100を含む0.1M燐酸カリ緩衝液
（pH7.0） 6ml 2.5mM DCIP 0.45ml H₂O 10.35ml 1cmの光路長のキユベツトに、0.4mlの基本反応溶液、
20μの10mMフエナジンメソサルフエイト、10μの酵
素溶液および20μの110mM Ｌ−ソルボリン溶液を入
れ最終液量を0.45mlとした。対照のキユベツトには、基
質以外の全ての成分を入れる。反応は、基質を添加する
ことによって開始した。酵素活性はDCIPの初期の還元速
度により測定した。

（２）基質特異性本酵素の基質特異性は上記（１）と同様の酵素活性測
定法により、各種基質溶液を用いて測定し得る。本発明
の酵素は、後に示す実施例３に例示するように、各種の
アルデヒド化合物の酸化を触媒する。

（３）物理化学的性質本発明の酵素は、以下の物理化学的性質を有する。

ａ）至適pH ：約7.0、ｂ）至適温度：約30℃〜約40℃、ｃ）分子構造：本酵素は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動によって測定された分子
量約47,500±5,000の１種類の型のひとつのユニツトか
ら成る。

ｄ）熱安定性:30℃以下で安定。

ｅ）阻害剤 :Cu²⁺イオンで阻害される。

至適温度の範囲は、本酵素が至適温度範囲内でより長
い時間培養した後分解されるかもしれないという事実と
は別に、酵素が高い初期反応速度を示す温度範囲と関係
することに注意すべきである。

（４）本酵素の生産本発明によりもたらされるＬ−ソルボリン脱水素酵素
は、適当な微生物を培養し、菌体を破壊し、破壊された
菌体の無細胞抽出液から、好ましくは、微生物の膜画分
から単離精製して調製することができる。

本発明に用いられる微生物は、グルコノバクター属に
属する微生物もしくはその突然変異株である。最新の分
類によれば、グルコノバクターに属する全ての株は、グ
ルコノバクター・オキシダンス種に帰属する。

グルコノバクター・オキシダンス種に属する菌株の形
態学的および生理学的特徴は、バージイズ・マニユアル
・オブ・システマテイツク・バクテリオロジー（Berge
y's Mamual of Systematic Bacteriology）第１巻、第2
75頁−第278頁、1984年およびエフ・ゴツセル（Gossell
e）等、インターナシヨナル・ジヤーナル・オブ・シス
テマテイツク・バクテリオロジー（International J.Sy
stem.Bacteriol.）第33巻、第65頁−第81頁、1983年に
記載されている。

本発明において使用するグルコノバクター属に属する
微生物は、自然界から単離することが出来、また寄託期
間からも入手可能である。また、それらから誘導された
変異株も本発明において使用可能である。

本発明において使用される変異株は、野生株を紫外線
照射、Ｘ線照射もしくは、γ線照射のような変異原性因
子処理するか、または亜硝酸もしくは他の適当な突然変
異原と接触させることにより、または自然的突然変異に
より生ずるクローンを単離することにより得ることがで
きる。これらの野生株またはその突然変異株の突然変異
は、その目的のために、それ自体当業者によく知られた
いずれの方法によって起すことができる。これらの方法
の多くは、例えば、田島、吉田および賀田編、講談社サ
イエンス社、1973年発光の“化学的変異原”等の種々の
出版物に記載されている。

本発明における突然変異株は、グルコノバクター・オ
キシダンス種に属する菌株の細胞融合および変異誘発お
よび／または細胞融合との組合せによっても得ることが
できる。

本発明において使用される最も好ましい菌株の例は、
グルコノバクター・オキシダンス（カタログにはメラノ
ゲネス（melanogenes）として収載されている）IFO1225
7、グルコノバクター・オキシダンス（カタログにはメ
ラノゲネス（melanogenes）として収載されている）IFO
12258等である。

これらの微生物は、好気的条件下、適当な栄養源を補
った液体培地中で培養することができる。培養は、pH4.
0〜約8.0、好ましくはpH5.5〜7.5で行うことができる。
培養時間は、用いる微生物および栄養培地によって異な
るが、好ましくは約10〜100時間である。培養を行うの
に好適な温度範囲は、約10℃〜40℃で、好ましくは25℃
〜30℃である。

培地は、通常、同化し得る炭素源；例えばグリセロー
ル、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、エリスリト
ール、リビトール、キシリトール、アラビトール、イノ
シトール、ズルシトール、Ｄ−リボース、マルトースお
よび遮糖、好ましくは、Ｌ−ソルボース、Ｄ−ソルビト
ールもしくはグリセロール、消化可能な窒素源；例えば
ペプトン、酵母エキス、大豆粉及びコーンスチープリカ
ー等の有機物質、例えば硫安、塩化アンモニウムおよび
硝酸カリ等の無機物質；ビタミン類および微量元素類等
の栄養源を含む必要がある。

以下、培養後に、該微生物からＬ−ソルボリン脱水素
酵素を単離および精製するための一実施態様を簡単に記
述する。

（１）遠心分離によって培養液から細胞を採取する。

（２）細胞を、緩衝液にけん濁し、ホモジナイザー、超
音波処理器またはリゾチーム処理等により破壊し、細胞
の破壊溶液を得る。

（３）破壊した細胞の無細胞抽出液、好ましくは微生物
の膜画分からＬ−ソルボリン脱水素酵素を単離精製す
る。

本発明により提供されるＬ−ソルボリン脱水素酵素
は、Ｌ−ソルボリンから２−KGAを生産するための触媒
として有用である。反応は、例えばDCIP、フナジンメソ
サルフエイト、ヴルスターズ青、フエリシアナイド、補
酵素Ｑ、チトクロームＣ等の電子受容体の存在下、燐酸
緩衝液、トリス−塩酸緩衝液等の溶液中、pH値約5.0〜
約10.0で行なわなければならない。反応を行なわせるに
好ましい温度範囲は、約10℃〜約50℃である。pHおよび
温度を各々、約7.0−8.0および30℃に設定した場合、反
応は最も好ましい結果をもたらす。溶液中のＬ−ソルボ
リンの濃度は他の反応条件によって種々異なるが、一般
的には、約10〜100g/が好ましく、約30〜40g/が最
も好ましい。

反応において、酵素は、適当な担体で固定化した状態
で使用することもできる。一般知られている酵素固定化
のいかなる手段も使用することができる。例えば、官能
基を有する樹脂の膜、微粒子等に酵素を直接結合しても
よく、または、グルタルアルデヒド等の二官能基を有す
る橋状化合物を介して樹脂に結合させてもよい。

本発明は、該酵素、酵素の製造方法および先に説明し
た酵素を用いた２−KGAの製造方法の外に、該酵素遺伝
子のクローニングおよび発現のための遺伝子工学技術、
酵素生産のために有用な遺伝子材料および該遺伝子材料
を用いた２−KGA生産のための改良された方法にも関す
る。

より詳しくは、本発明は該酵素活性を有するポリペプ
チドをコードする遺伝子を含む組換えDNA分子を導入し
た組換え微生物を用いた補酵素非依存型Ｌ−ソルボリン
脱水素酵素の生産ならびに該組換え微生物それ自体に関
する。

本発明は、更に該遺伝子および上記組換え微生物を構
築するために利用可能な該遺伝子を含む組換え分子にも
関する。

さらに本発明はＬ−ソルボリンを該組換え微生物から
生産される酵素と接触させることにより、２−ケト−Ｌ
−グロン酸を生産する方法および上記組換え微生物の発
酵により、Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ソルボースおよびＬ
−ソルボリンから２−KGAを製造する方法に関する。

最後に、本発明は、また、グルコノバクターの菌株を
用いて、上記組換え体としての接合伝達体を製造する方
法に関する。

概略的には、本発明で利用される組換え微生物は、次
の工程により得ることができる：（１）補酵素非依存型Ｌ−ソルボリン脱水素酵素を生産
しうる適切なグルコノバクター属に属する菌株の染色体
DNAから、遺伝子ライブラリーを構築し、（２）該酵素またはその誘導体を発現するクローンを得
るため、上記遺伝子ライブラリーをスクリーニングし、（３）必要に応じて、該酵素の発現に必須な極力小さい
サイズのDNA断片を含むサブクローンを得るために、上
記クローンのサブクローニングをし、および（４）必要に応じて、高生産ならしめるべく、組換えDN
A分子の再構築をする。

本発明の上記項目の中で用いられる材料および技術の
詳細な説明を次に示す。

新規Ｌ−ソルボソン脱水素酵素をコードする遺伝子のク
ローニングと組換え体の構築Ａ）該遺伝子の由来本発明の補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素を
コードする遺伝子は、該酵素を生産し得るゲルコノバク
ター属に属する微生物、好ましくはグルコノバクター・
オキシダンスIFO12258株、グルコノバクター・オキシダ
ンスIFO12257株もしくは、それらの変異株からクローン
化することができる。

Ｂ）遺伝子ライブラリーの構築公知の手法により、上記起源の菌株より単離された染
色体DNAを、制限酵素たとえば、Sal I、Hind III、Xho
IまたはEcoR Iなどで部分消化する。生じた大分子量を
有する好ましくは、15から35kbのDNA断片を集め、適切
なベクターを適当な制限酵素で切断され、好ましくは細
菌または牛腸のアルカリ性フオスフアターゼで処理され
た適当なベクターと、リガーゼ処理により結合する。該
ベクターとしては、プラスミドおよびフアージのいずれ
も利用できる。本発明において、最も望ましいベクター
は、たとえばpVK100（ATCC37156）、もしくはpVK102（A
TCC37158）またはそれらの誘導体、すなわち、λフアー
ジのCOS部位、Mob部位、RK2の複製オリジンおよび抗生
物質耐性遺伝子等の１つ以上のマーカー遺伝子を含有す
る誘導体等のコスミドベクターである。

かくして得られた、適切なベクター上に保持される組
換えDNAは、適切な宿主微生物へ形質転換法、形質導入
法または接合伝達法などの様なDNA導入系のいずれかに
より導入される。

本願においては、上の様にした得られた組換えDNAか
ら成る遺伝子ライブラリーを、グルコノバクター・オキ
シダンス株を宿主として、次の様な手順で構築すること
ができる。

（１）グルコノバクター・オキシダンス株を宿主とす
る遺伝子ライブラリーを得るためには、、組換えDNAを
まず、大腸菌（Esherichia coli）のいずれかの株に移
し、大腸菌での遺伝子ライブラリーを作成する。この目
的には、ベクターとしてコスミドベクターを用いるラム
ダ（λ）フアージのイン・ビトロ（in vitro）パッケー
ジング系を用いることができる。コスミドベクターを用
いるこの系は、大分子量のDNAのクローニングに適して
いる。該イン・ビトロパッケージング系に適した宿主に
は、大腸菌c600株大腸菌HB101株、もしくは大腸菌ED876
7株が挙げられる。このイン・ビトロパッケージング系
は、商業的に入手可能であり、使用の際しては、製造業
者の指示に従って、使用することができる。この様な系
は、文献記載の方法（たとえばT.Maniatisらの、Molecu
lar Cloning、A.Laboratory Manual、256−268（1982）
Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor、N.
Y.）に従ってもまた調製し、使用できる。

（２）次に組換えDNAを、DNA供与体としての大腸菌
（E.coli）から二親間接合伝達法もしくは三親間接合伝
達法により受容菌としてのグルコノバクター属の適切は
株へ、移す。

二親間接合伝達法を用いる際には、供与体の大腸菌
は、その染色体DNA上にTra遺伝子を有していることが必
要である。そして遺伝子ライブラリーが作成された大腸
菌が、このTra遺伝子を有していない場合には、該組換
えDNAを、Tra遺伝子を有する別の大腸菌（E.coli）に移
すことが要求される。Tra遺伝子を有する株としては、
大腸菌S17−１株が、好ましい。ある大腸菌中の組換えD
NAを、Tra遺伝子を有する別の大腸菌へ導入するには、
通常の形質転換法により行なうことができ、この様にし
て、次に行なう接合伝達時に、DNA供与体として用いら
れる大腸菌中で、新しい遺伝子ライブラリーを作成する
ことができる。

この二親間接合伝達を行なう際に、伝達されるビーク
ルがMob部位を有していることも必要である。前に記載
したベクターpVK100、pVK102またはMob部位を有するこ
れらの誘導体は、該Mob部位保持ビークルを構築するた
めにも好適である。

次に、DNA供与体として、上記の様に調製した大腸菌
中での、遺伝子ライブラリーの各々のクローンを液体培
養する。同時に、受容菌としてのグルコノバクター属菌
株も対数増殖期から、定常期初期まで適切な培値を含む
試験管中で培養する。このグルコノバクターの培養液
を、次いで大腸菌の培養液の各々と、約1:10から約10:1
までの種々の割合で混合する。各混合液をグルコノバク
ターおよび大腸菌両者の成育に適した培地の寒天平板の
表面に置いたニトロセルロース・フイルター上に、スポ
ットした後、３時間から７日間静置する。

（３）接合伝達体は、許容体である大腸菌、非接合伝
達されないグルコノバクターおよび接合伝達を受けたグ
ルコノバクターからなる混合体から適当な方法、たとえ
ば抗生物質耐性やアミノ酸要求性を利用した選択法によ
り、選ぶことができる。

（４）上記接合伝達体を適当な数集めることにより、
グルコノバクター属菌株中での遺伝子ライブラリーを作
成することができる。

接合伝達体は、供与体としての組換えプラスミドを保
持する大腸菌、ヘルパーとしてのRK2もしくはpRK2013の
様なTar遺伝子を有する大腸菌および受容菌としてのグ
ルコノバクター属、菌株を用いて、三親間接合伝達によ
っても得ることができる。

ここで用いる受容菌としてのグルコノバクター株は、
グルコノバクター属に属するいずれの菌株でもよい。特
に、２−ケト−Ｌ−グロン酸を生産するグルコノバクタ
ー・オキシダンスIFO3292株、グルコノバクター・オキ
シダンスIFO3293株（EFRM−No.8356）、グルコノバクタ
ー・オキシダンスIFO3294株およびそれらの誘導体、あ
るいはＬ−ソルボソンを蓄積するグルコノバクター・オ
キシダンスOX−４株や、２−ケト−Ｌ−グロン酸高生産
株のグルコノバクター・オキシダンスN44−１株もしく
はグルコノバクター・オキシダンスＵ−13株（FERM−BP
No.1269）およびそれらの誘導株を用いることができ
る。これらの誘導株は、前に記載の通常の変異処理によ
り得られる。

Ｃ）スクリーニング一般的に遺伝子ライブラリーは、次に示す方法を用い
て、スクリーニングすることが可能である。

（１）該酵素の適当なアミノ酸配列に従って合成した
オリゴヌクレオチドプローブを用いて遺伝子ライブラリ
ーをコロニーハイブリ・ダイゼーシヨンにより、スクリ
ーニングする方法。

（２）該酵素を抗原として用いて調製した抗体を利用
する遺伝子ライブラリーの免疫学的スクリーニング法。

（３）適切な宿主中での、遺伝子ライブラリーの直接
発現によるスクリーニング法。

本発明においては、前に記載の説明に従ってグルコノ
バクター中に作成した遺伝子ライブラリーを試験に供す
る直接発現スクリーニング法が好適に用いられる。この
直接発現スクリーニングは、以下に示す手順を用いて行
なうことができる。

グルコノバクター中で作成した遺伝子ライブラリーの
各々の株を、マーカーとして有用な適当な抗生物質を含
む寒天平板上で、10℃から40℃、好ましくは25℃から30
℃で、１日から７日間生育させる。得られた菌株を休止
菌体反応に供する。この反応系は、菌体を１から５％の
Ｌ−ソルボソンまたはＬ−ソルボース、0.3％NaClおよ
び１％CaCO₃を含む反応溶液に懸濁し、それを10℃から4
0℃、好ましくは25℃から30℃で１日から７日間静置し
て行なう。反応後の反応混合液を、薄層クロマトグラフ
イーに供し、陽性クローンとして、Ｌ−ソルボソン又は
Ｌ−ソルボースから２−ケト−Ｌ−グロン酸を蓄積する
クローンを、もしくはＬ−ソルボソン蓄積する宿主を用
いる時はＬ−ソルボースから蓄積するＬ−ソルボソンを
消費するクローンを、選択する。この様にクローン化さ
れた補酵素非依存型、Ｌ−ソルボソン脱水素酵素をコー
ドするDNAは、良く知られた方法に従って、制限酵素地
図の作成および／または塩基配列の決定により、特徴づ
けられる。

Ｄ）組替えプラスミドの安定性組換えDNA技術の分野で良く知られている通り、大部
分の組換え微生物は、外来プラスミドの脱落を防ぐため
には、抗生物質などの選択圧を必要とする。しかしなが
ら、醗酵液への抗生物質や他の薬剤の添加は、食品、飲
料、医薬品などの様な醗酵生産には極力避けられるべき
である。さらに生産工程の簡略化のためにも、薬剤添加
を避けるべきである。

したがって、現在まで組換え体の系の安定性改善に向
け、種々の技術たとえばプラスミドへのpar領域の導入
や低コピー数プラスミドの使用もしくは温度シフトやIP
IG（イソプロピルチオガラフトシド）添加による誘導な
どを用いて、様々な検討が行なわれきている。

プラスミドの安定性は、宿主微生物とプラスミドの組
合せに依存することが知られている。

プラスミドpVK100およびpVK102から誘導される組換え
プラスミドは、いかなる培養、たとえばMB培地、FB培地
および２−ケト−グロン酸培地における培養においてグ
ルコノバクター属の菌株中で、pVK100およびpVK102その
ものと同様の安定性を示すことを見出した。

この様に、本発明は、グルコノバクター中での補酵素
非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素生産、およびＤ−ソ
ルビトール、Ｌ−ソルボースまたはＬ−ソルボソンから
の２−ケト−Ｌ−グロン酸生産に有用なグルコノバクタ
ー属の菌株中で安定に保持される組換えプラスミドを提
供するものである。

本発明におけるこの安定な組換え発現プラスミドは、
少なくともプラスミドpVK100もしくはpVK102由来のDNA
断片、グルコノバクター属の菌株中で発現する構造遺伝
子、および所望ならば該構造遺伝子に機能的に接合され
た発現制御領域から成ることを特徴とする。

Ｅ）形質転換された微生物目的の酵素を発現できる形質転換体は、該酵素の構造
遺伝子を含む上記のクローン化されたプラスミドを適当
な宿主中に導入することにより取得できる。該プラスミ
ドが、その構造遺伝子用の適切な発現制御領域を有さな
い場合は、その構造遺伝子上流に機能的に連結する様、
プロモーター配列および/SD（シヤイン−ダルガルノ）
配列を導入することにより、発現プラスミドを再構築し
てもよい。

本発明の実施例においては、グルコノバクター属の菌
株からクローン化された該酵素の発現制御領域と構造遺
伝子との両者を含むDNA断片の例が示されている。この
場合、該DNA断片が挿入されるプラスミドは、宿主とし
てのグルコノバクターの菌株もしくは、適当な微生物中
で、目的の酵素の構造遺伝子を発現することができる。

形質転換された微生物を用いたＬ−ソルボソン脱水素酵
素生産Ａ）生産と単離上記のごとく得られた形質転換された微生物は、醗酵
および単離操作によってＬ−ソルボソン脱水素酵素生産
に用いることができる。

この形質転換体の醗酵条件は、通常、宿主微生物に依
存して選択される。宿主微生物がグルコノバクター属の
菌株である時は、前に記載の醗酵条件を該形質転換体に
適用することができる。

該形質転換体により生産されたＬ−ソルボソン脱水素
酵素の単離は、蛋白質化学の分野で周知の方法を用いて
行なうことができる。

Ｂ）組換え体生産物と天然型生産物との比較組換え体の生産するＬ−ソルボソン脱水素酵素と、天
然型酵素の同一性は、両酵素の触媒特性、たとえば至適
pH、至適温度、分子量、熱安定性などの性質の比較に加
えて周知の免疫学的試験によっても確認することができ
る。

以上の様に、本発明の組換え技術を用いて生産される
Ｌ−ソルボソン脱水素酵素は、Ｌ−ソルボソンからの２
−ケト−Ｌ−グロン酸生産の触媒として有用である。こ
のＬ−ソルボソンからの２−ケト−Ｌ−グロン酸生産
は、該酵素のみならず、組換え微生物の無細胞抽出液、
休止菌体および増殖菌体によっても、行なうことができ
る。

この組換え微生物は、また休止菌体系もしくは、増殖
菌体系を用いたＤ−ソルビトールやＬ−ソルボースから
の２−ケト−Ｌ−グロン酸生産にも、有用である。

単離された組換え酵素または、無細胞抽出液を用いた
Ｌ−ソルボソンから２−ケト−Ｌ−グロン酸への変換の
典型的な条件は、前に記載した天然型Ｌ−ソルボソン脱
水素酵素のものと同じである。

本発明の組換え微生物は、宿主微生物がグルコノバク
ター属の菌株である場合には、Ｄ−ソルビトールもしく
はＬ−ソルボースからの２−ケト−Ｌ−グロン酸生産に
おいて、その親株である微生物よりもかなり有利であ
る。この組換え微生物は、適当な栄養源を補った液体培
地中で、好気的条件下培養できる。この培養時、出発原
料としてのＤ−ソルビトールもしくはＬ−ソルボース
を、醗酵の適当な時期、好ましくは開始点で、加えるこ
とができる。この出発原料、たとえばＤ−ソルビトール
の濃度範囲は、10から400g/L程度であり、この培養液
は、約10℃から40℃、好ましくは、25℃から30℃に保
つ。この培養は、pH約4.0から8.0、好ましくは、5.5か
ら7.5で行なう。培養期間は、用いる組換え微生物およ
び栄養培地により変化しうるが、好ましくは、約20から
200時間である。

本発明を次に示す実施例によりさらに例示する。

実施例１グルコノバクター・オキシダンス株によるＬ−ソルボソ
ンからの２−ケト−Ｌ−グロン酸の生産グリセロール 5g/L、酵母エキス 5g/L−、MgSO₄・7
H₂O 5g/LからなるNo.4培地の寒天平板上で成育したグ
ルコノバクターオキシダンス株IFO3292、IFO3294、IF
O12257、IFO12258、ATCC9937及びIFO3293（FERM−Ｐ N
o.8356）を、グリセロール 70g/L、酵母エキス 15g/
L、MgSO₄・7H₂O 2.5g/L、およびCaCO₃ 10g/Lから成る
No.3B.G培地5mlを含む試験管に接種した。試験管振盪機
上で、30℃にて３日間培養した後、その培養液1mlは、
新鮮なNo.3B.G培地50mlを含む500ml容三角フラスコに接
種するために使用された。このフラスコを回転式振盪機
（180r.p.m）上で30℃３日間培養した。各培養液20ml
を、500rpmで15分間遠心し、細胞と残存CaCO₃を含む固
型分を集め、10mlの0.3％殺菌NaClで２度洗浄し、NaCl
3g/L、Ｌ−ソルボソン 30g/L、CaCO₃ 10g/Lを含む
反応溶液6mlに懸濁した。反応は、試験管中で30℃、23
時間、試験管振盪機上で行なった。２−KGAの収量を第
１表中に要約してある。培養中の蒸発損失は補正してい
ない。

実施例２グルコノバクター・オキシダンスIFO12258からのＬ−ソ
ルボリン脱水素酵素の単離および精製（１）グルコノバクター・オキシダンスIFO12258の培
養グルコノバクター・オキシダンスIFO12258の寒天斜面
培養を、グリセロール 70g/L、酵母エキス（オリエン
タル社製） 15g/LおよびMgSO₄・7H₂O 2.5g/Lよりなる
培地5mlを含む試験管に接種し、30℃で２日間、試験管
振盪機（280r.p.m）上で培養した。本培養液2mlを同一
の培地100mlを含む500mlの三角フラスコに接種し、30℃
で20時間、回転振盪機（180r.p.m）上で培養した。この
様して調製した培養液を20Lの同一の培地を仕込んだ30L
容ジヤーフアーメンターの種培養として用いた。ジヤー
フーメンターは、30℃、撹拌は250r.p.mおよび通気量は
20L/分で運転した。40時間培養後、培養液を集め、遠心
分離（8,000r.p.m）によって菌体を回収した。20Lの培
養液から、500g（湿重量）の菌体が得られた。菌体歯、
使用するまで−20℃で凍結保存した。

（２）膜画分の調製グルコノバクター・オキシダンスIFO12258の凍結菌体
（500g、湿重量）を溶解し、2,500mlの0.85％食塩水に
けん濁した。次いで、該細胞けん濁液を、ダイノミルホ
モジナイザー（Willy A.Bachofen Co、Basle）を用い、
ガラスビーズ（直径0.1mm）存在下、４℃で2,000r.p.m.
で４分間処理し、細胞を破砕した。

得られた細胞破砕液は、1,800gで10分間遠心して菌体
細片およびガラスビーズを除去した。得られた上清を8
0,000×ｇで60分間遠心し、得られた沈澱を膜画分（200
g、湿重量）として集めた。

（３）膜画分からのＬ−ソルボリン脱水素酵素の可溶
化膜画分（200g、湿重量）を、900mlの１％トライトン
Ｘ−100を含む50mM燐酸カリ緩衝液（pH、7.0）に懸濁
し、15時間撹拌した後80,000×ｇで１時間遠心し上清
（850ml）を得た。

（４） DEAE（ジエチルアミノエチル）−トヨパール
（ポリビニル型）650S（東洋ソーダ社製）カラムクロマ
トグラフイー前記の工程で得られた上清（330ml）を0.1％トライト
ンＸ−100を含む1mM燐酸カリ緩衝液20Lに15時間透析
後、同上の緩衝液であらかじめ平衡化しておいたDEAE−
トヨパール650Sカラム（2.3×40cm）にかけた。カラム
を同上の緩衝液で洗浄後、酵素を0.0Mから0.4Mまでの食
塩の直線濃度こう配を使って溶出した。

（５） DEAE−セフロアースCL−6Bカラムクロラトグラ
フイー前工程で得られた活性画分を合し、0.1％トライトン
Ｘ−100を含む1mM燐酸カリ緩衝液（pH7.0）に15時間透
析後、同上の緩衝液で平衡化したDEAEセフアロースCL−
6Bカラム（2.5×10cm）にかけた。カラムを同一の緩衝
液で洗浄後、酵素を0.0Mから0.4Mまでの食塩の直線濃度
勾配を用いて溶出した。

（６） CMセフアロースCL−6Bカラムクロマトグラフイ
ー前工程で得られた活性画分を合し、0.1％トライトン
Ｘ−100を含む1.0mM酢酸緩衝液（pH5.5）に15時間透析
後、同一の緩衝液で平衡化したCMセフアロースCL−6Bカ
ラム（2.5×14.5cm）にかけた。カラムを同一の緩衝液
で洗浄後、酵素を0.0Mから0.4Mまでの食塩の直線濃度勾
配で溶出した。

（７）ハイドロキシアパタイトHCA100Sカラムクロ
マトグラフイー前工程で得られた活性画分を合し、0.1％トライトン
Ｘ−100を含む1.0mM燐酸カリ緩衝液（pH7.0）に15時間
透析後、同一の緩衝液で平衡化したハイドロキシアパタ
イトHCA100Sカラム（1.7×18cm）にかけた。カラムを、
同一の緩衝液で洗浄後、酵素を0.1％トライトンＸ−100
を含む10mM燐酸カリ緩衝液（pH7.0）で溶出した。

（８） TSKゲルトヨパール HW60Sカラム（ポリビニ
ル型）クロマトグラフイー前工程で得られた活性画分を合し、メンブランフイル
ター（Daiflo PM−30、Amicon社製）を用いて限外ロ過
し、少量になるまで濃縮した（約1.5ml）、次いで、得
られた濃縮液を、0.1％トライトンＸ−100を含む50mM燐
酸カリ緩衝液で平衡化したTSKゲルトヨパールHW60sカラ
ム（1.5×80cm）にかけた。該カラムは、同一の緩衝液
で展開した。

膜結合型Ｌ−ソルボリン脱水素酵素の精製法の概要を
第２表に示した。

実施例３Ｌ−ソルボリン脱水素酵素の性質（１）電気泳動による分析比活性が6.7ユニット/mg淡白を示す精製された酵素を
ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）で処理し、SDS−ポリア
クリルアミド電気泳動によって該酵素の精製度を分析し
た。その結果、本酵素は分子量47,500±50,000の単一で
均質なサブユニットからなることが明らかになった。

（２）触媒作用に関する性質精製されたＬ−ソルボリン脱水素酵素は、2,6−ジク
ロロフエノールインドフエノールもしくはフエナジンメ
ソサルフエートの様な電子受容体の存在下でのみ活性を
示した。

精製された本酵素の基質特異性を第３表に示す。各種
のアルデヒド化合物が酸化された。その中でも、メチル
グリオキサールが最も効率良く酸化され、その反応速度
は、Ｌ−ソルボリンに対する時のそれの２倍高い値を示
した。

Ｌ−ソルボリンに対するみかけ上のミカエリス定数
は、pH7.0下で16.7mMであった。

第４表に示す様に、Ｌ−ソルボリン脱水素酵素のメチ
ルグリオキサールの酸化における至適温度は、30℃〜40
℃の間に認められた。

Ｌ−ソルボリンの酸化におけるpHの影響について第５
表に示した。本酵素は至適pHを7.0に示した。Ｌ−ソル
ボリンの酸化に対する金属の効果について検討したとこ
ろ、検討した金属の中で、Cu²⁺イオンが酵素を強く阻害
することが分かった（第６表）。第７表に示した様に、
モノヨード酢酸は、本酵素を中程度に阻害した。

精製された本酵素のpH安定性を調べた。本酵素を各種
のpHの緩衝液中で４℃で48時間処理した後、残存酵素活
性をpH7.0で測定した。第８表に示す様に、本酵素は、
調べたpHの領域では比較的安定であった。pH4.0におい
ては、約３分の１の活性が失なわれた。

Ｌ−ソルボリン脱水素酵素の熱安定性をしらべた。第
９表に示した様に、約70％の酵素活性が40℃10分間の処
理によって失なわれた。

実施例４グルコノバクターオキシダンス IFO12258株のＬ−ソ
ルボソン脱水素酵素遺伝子のクローニング（１）大腸菌（E.coli）S17−１株中でのコスミド遺
伝子ライブラリーの構築（１）−ａ）グルコノバクターオキシダンスIFO122
58株の染色体DNAの抽出グルコノバクターオキシダンス IFO12258株を、マ
ンニトール 25g/L、バクトペプトン 3g/L、酵母エキ
ス 5g/Lから成るマンニトールブロス（MB）培地200ml
中で、30℃、48時間培養した。得られた細胞を遠心分離
し、トリス（10mm）−EDTA（1mM）緩衝液100mlで洗浄
し、トリス（10mM）−EDTA（20mM）緩衝液50ml中に再懸
濁した。

この様にして調製した細胞懸濁液を2mlのリゾチーム
溶液（10mg/ml）を加えて、37℃、30分間処理し、続い
て4000ユニットのプロナーゼで、37℃、30分間処理後、
10mlの５％SDSを加え、37℃、１時間静置し、透明な溶
菌液を得た。該DNAは、４％オクタノールを含むクロロ
ホルムと中和したフエノールの1:1混液60mlで、４℃、3
0分間、ゆっくり回転させることにより、抽出した。こ
の混合液を15,000r.p.m.15分間遠心分離し、得られた上
清を、クロロホルム：オクタノール（96:4）を60ml用い
て、４℃、10分間ゆっくり回転させて抽出した。

この混合液を15,000r.p.m.15分間遠心分離後得られた
上清50mlに、3M酢酸ナトリウム5mlを加え続いて、冷エ
タノール55mlを静かに注いだ。粗精製DNAは、ガラス棒
でまきとった後、リボヌクレアーゼT₁及びリボヌクレア
ーゼＡ酵素により37℃30分間処理し、さらに再びプロナ
ーゼで37℃、30分間処理した。上記フエノール及びクロ
ロホルムによる抽出を繰返し、精製染色体DNAを得た。

（１）−ｂ）ベクタープラスミドの調製コスミドベクターpVK102（E.W.Nesterら、Plasmid
８、45−54、1982）は、アルカリ法（H.C.BirnboimとJ.
Doly、Nucleie Acids Research、７、1513−1523、197
9）により、pVK102保持大腸菌（E.coli）HB101より調製
した。その制限酵素地図を第１図に示す。

（１）−ｃ）インビトロパッケージンググルコノバクターオキシダンス IFO12258株の全染
色体DNAを、制限酵素Sal I（宝酒造社製）で部分消化
し、得られた15から35キロベース（kb）のDNA断片を、
アガロースゲル電気泳動により分離した。（１）−ｂ）
で調製したプラスミドpVK102は、制限酵素Sal Iで完全
消化し、牛腸アルカリフオスターゼ（Boehringer Mannh
eim GmbH）で処理した。次にこれら15kbから35kgのDNA
断片と直鎖状pVK102をT4DNAリガーゼ（宝酒造社製）
で、連結した。

該連結された断片は、パッケージングキット（Amersh
am International plc.）を用いたインビトロパッケー
ジングに使用した。得られたフアージ粒子を、大腸菌ED
8767株（Murray.N.E.らMol、Gen、Genet、150、53、197
7）に感染させ、その細胞懸濁液を、50mg/Lのカナマイ
シンを含むLB寒天平板に塗沫した。

（１）−ｄ）大腸菌S17−１株中での、遺伝子ライブ
ラリーの構築 50mg/Lのカナマイシンを含むLB寒天平板上の、Km^rTc^s
マーカー（カナマイシン耐性及びテトラサイクリン感受
性）を有する1,000コロニーをかきとり、組換えプラス
ミド混合物を調製した。該プラスミドDNAを大腸菌S17−
１株（Sm^r、Tra⁺）（サイモンら（Simon,R.ら、Bio/Tec
hhology１、784−791、1982）により構築されたの形質
転換に使用した。

1,400の形質転換株を、100μg/mlのストレプトマイシ
ン、50μg/mlのカナマイシン含有LB培地を含むマイクロ
タイタープレートに移植し、一晩静置培養後、グリセロ
ールを15％濃度になるよう添加し、大腸菌S17−１株中
でのグルコノバクターオキシダンス IFO12258株の遺
伝子ライブラリーとして−80℃で、凍結保存した。この
ライブラリーの平均挿入断片長は、25kbから30kbであっ
た。

（２）大腸菌S17−１株中のコスミド遺伝子ライブラ
リーのグルコノバクターオキシダンス OX−４株への
接合伝達大腸菌S17−１中のグルコノバクターオキシダンス I
FO12258のコスミド遺伝子ライブラリーを、Ｌ−ソルボ
リン蓄積変異株であるグルコノバクターオキシダンス
OX−４（ヨーロッパ特許出願公開第213,591号に記載さ
れているような突然変異処理により、グルコノバクター
オキシダンスIFO3293より得た）に、両株間の二親間接
合伝達によって導入した。

マンニトールブロスに生育した受容菌グルコノバクタ
ーオキシダンスOX−４株の対数増殖期の培養液200μ
を、個々の挿入DNA断片保持pVK102を有する大腸菌S17
−１株100μと混合し、その混液を50g/Lフラクトー
ス、5g/L酵母エキス、5g/Lポリペプトンから成るFB培地
の寒天平板表面に置いたニトロセルロースフイルター上
にスポットし、30℃で一晩静置培養した。生じたコロニ
ーを、10μg/mlポリミキシンＢ、50μg/mlカナマイシン
含有MB培地（MPK）寒天平板上に、移植し、30℃で４時
間静置培養した。生じた接合体を、更にMPK寒天平板上
に再移植し、純化した。

（３）グルコノバクターオキシダンス OX−４株注
の遺伝子ライブラリーのスリーニングこのスリーニングは、ミニ休止菌体反応により行なっ
た。約1400株の挿入DNA断片を有するグルコノバクター
オキシダンスOX−4/pVK102を、別々に、3g/L NaCl、10
g/L CaCo₃及び30g/L Ｌ−ソルボース又は、Ｌ−ソル
ボソンを含む50μの反応溶液に懸濁し、30℃で１から
５日間、静置培養した。２−KGA産生の分析は、シリカ
ゲルの薄層クロマトグラフイーで行なった。

その結果、陽性クローン、プラスミドp7A6を得た。

（４）プラスミドp7A6のサブクローニングと、得られ
たサブクローニングの特性組換えプラスミドp7A6をBirnboimおよびDolyのアルカ
リ法（Nucleic Acids Research、７、1513−1523（197
9））で調製し、次に示す制限酵素で断片化した:EcoR
I、EcoR V、Hae III、Hinc II、Nru I、Sal I、Sau3A、
Xho II（ベーリンガー、マンハイム社製）、BamH I、Ba
l II、Dar I、Hind III、Sma I（宝酒造社製）。この中
で、EcoR I、Hinc II、Nur I及びSal Iを用いた時、p7A
6の挿入断片（25kb）は、８から11本の断片に分解され
た。Hea III、Sau3A及びXho IIによる消化では、多数の
断片を生じた。サブクローニングの第一段階の制限酵素
として、Sal Iを選択した。

Sal Iで部分消化したプラスミドp7A6を、Sal Iで消化
後、脱リン酸化処理したベクターpVK102と結合した。そ
のDNA混合物を、形質転換法により、大腸菌S17−１株に
導入し、次に実施例４−（２）に述べている通り、二親
間接合伝達によりグルコノバクターオキシダンス OX
−４株に移した。得られた200株の接合伝達体の中から
ミニ休止菌体反応により最小のサブクローンp7A6△２
が、これは9.2kbの挿入断片を保持していた。（図２−
（ａ））。第二段階のサブクローニングでは、p7A6△２
のE₁−E₂断片を欠失させた。かくして得られたp7A6△３
（図２−（ｂ））のE 1/2−Sm₃断片を欠失させて、更に
短縮した。得られたサブクローンp7A6△４（図２−
（ｃ））は、pVK102の小欠失部分Sm₂−Sm₃を有する3.1k
b挿入物をベクターDNA中に含んでいる。この様にして得
られた3.1kbのS₁−S₂−E 1/2（SSE）残片の詳細な制限
酵素地図を第３図に示す。

（５）リコンビナントＬ−ソルボソン脱水素酵素の
生産とその性質プラスミドp7A6を実施例４−（２）に記
載されているように二親間接合伝達により、大腸菌S17
−1/p7A6株からグルコノバクターオキシダンスN44−１
株（該株は、グルコノバクターオキシダンスOX−４につ
いて述べたと同様にして得られる）へ導入した。得られ
た、接合伝達体グルコノバクターオキシダンスN44−1/p
7A6株を50mg/Lのカナマイシンを含む、100g/L−ソルボ
ース、15g/L酵母エキス、2.5g/L MgSo₄・7H₂O、0.5g/L
グリセロール及び20g/L CaCO₃から成るNo.5培地500m
l中にて、30℃で２日間培養した。得られた菌体を、リ
ン酸カルシウム緩衝液pH7.0中にてフレンチプレスホモ
ジナイザーを用いて破砕し、MgCl₂存在下デオキシリボ
ヌクレアーゼ処理した後、6,000r.p.m.で15分間遠心分
離処理した。この遠心上清を、45,000r.p.m.（80,000
g）における／時間の遠心分離処理により、粗膜画分を
得た。Ｌ−ソルボソン脱水素酵素を、２％のトライトン
Ｘ−100により膜画分から可溶化し、クロマト−フオー
カシング（すなわち等電的クロマトグラフイー：蛋白質
の等電点の差異に基づく、蛋白質のクロマト的分離方
法）及びハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフ
イーにより分離精製した。次に活性染色法によりポリア
クリドアミドゲル中に検出された活性蛋白を、ゲルから
溶出し、これをSDS−PAGEに供したところ、分子量47,50
0の明瞭な単一バンドを示した。従って、N44−1/p7A6由
来のＬ−ソルボソン脱水素酵素のサブユニットの分子量
は、47,500と測定され、この分子量は、実施例３−
（１）記載のグルコノバクターオキシダンス IFO122
58株から単離されたＬ−ソルボソン脱水素酵素の分子量
と同じであった。SDS−PAGEゲルから溶出した後、アセ
トン沈澱を行なって得た300μｇの酵素蛋白をアミノ酸
部分配列の決定に使用した。Ｎ−末端の15個のアミノ酸
配列が次のとおり決定された： Met−Thr−Arg−Ser−Gln−Ile−Arg−Leu−Leu−Val−
Ala−Thr−Thr−Ala−Val− 更に、該酵素蛋白質の蛋白消化物をHPLC上のクロマト
グラフイにかけた。

数個のピークを別々に集め、該蛋白質の内部アミノ酸
配列の決定に使用した。

こうして、６個のアミノ酸部分配列が次のように決定
された：これらの配列のＬ−ソルボソン脱水素酵素上の配置
は、第４図中に下線部分として資してある。

組換え体である、グルコノバクターオキシダンスN44
−１−p7A6株から精製した酵素蛋白は、免疫学的にも、
グルコノバクターオキシダンスIFO12258株の当該酵素と
同等であることをが示された。

（６）Ｌ−ソルボソン脱水素酵素遺伝子を有するSSE
（Sal II−Sal II−EcoR I）断片の配列決定第３図に示すSSE断片（3.1kb）から得られた種々の断
片を、ベクターM13mp8及びM13mp19（Messing、J.とVier
a、J.Gene、19、269−276、1982）へ、更にサブクロー
ン化し、市販のシークエンシングキツト（Amersham Int
ernational plc）を用いて、その両塩基鎖について配列
決定を行なつた。エキソヌクレアーゼ III酵素を用い
た、段階的欠失法（宝酒造社製のキロシークエンシング
キツト）も導入した。

クーデアザーdGTP（２′−デオキシグアノシン−５′
−三リン酸）（Boehringer Mannheim GmbH）をdGTPの替
わりに用いた。この酵素蛋白質のＮ−末端アミノ酸配列
が、次に示される様にSSE断片のDNA配列上で確認され
た： 1347塩基対より成るオープン・リーデイング・フレー
ムが見出され、その構造遺伝子のDNA配列及び該DNA配列
から推定されるアミノ酸配列を第４図に示した。

実施例５精製されたグルコノバクター・オキシダンスIFO12258の
膜結合型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素によるＬ−ソルボソ
ンから２−KGAの生産 100mlの精製された膜結合型Ｌ−ソルボリン脱水素酵
素（全活性、130ユニツト）、50mlの0.5燐酸カリ緩衝液
（pH7.0）、50mlの10％Ｌ−ソルボソン溶液、10mlの0.2
Mフエナジンメソサルフエイト溶液、および290mlの水か
らなる反応混液を、ゆるやかに撹拌しながら30℃で振盪
した。その結果、２−KGAは650mg/時間の速度で生成し
た。

実施例６休止菌体反応系での、組換え体によるＬ−ソルボソンか
らの２−ケト−Ｌ−グロン酸生産グルコノバクターオキシダンスIFO3292株、グルコノ
バクターオキシダンスIFO3294株、グルコノバクターオ
キシダンスIFO3293株、グルコノバクターオキシダンス
Ｕ−13株（FERM−BP No.1269）及び実施例４−（２）
記載の方法で調製された、p7A6△４を保持する上記株
を、MB寒天平板から5mlのNo.5培地へ接種し、30℃で48
時間培養した。得られた各培養液の1mlを同じ培地50ml
に移植し、30℃で48時間回転振盪（180r.p.m.）培養を
行なつた。この培養液の残存炭酸カルシウムを、500r.
p.m.5分間の遠心分離により除去した。菌体を集め、25m
lの殺菌3g/L食塩水で２回洗浄し、6mlの3g/L食塩水に懸
濁した。

3g/L NaCl、36g/L Ｌ−ソルボソン、10g/L CaCO₃
及び2mlの上記細胞懸濁液を含む反応溶液を、試験管中
で30℃４日間、振盪培養した。１日及び４日の培養で蓄
積された２−KGAの量を、第10表に示す。

実施例７休止菌体反応系での組換体によるＬ−ソルボースからの
２−ケト−Ｌ−グロン酸生産グルコノバクターオキシダンスＵ−13株（FERM−BP
No.1269）及びp7A6△４を保持するグルコノバクターオ
キシダンスＵ−13株を、基質が、40g/L Ｌ−ソルボー
スである点を除き、実施例６に記載したと同様に休止菌
体反応に供した。４日反応後の２−KGAの収量を第11図
に示した。

実施例８増殖系での組換体によるＬ−ソルボースからの２−ケト
−Ｌ−グロン酸生産 pVK102またはp7A6△４を保持するグルコノバクターオ
キシダンスN44−１株の接合伝達体を、実施例４−
（２）記載と同様な方法で調製した。各々の接合伝達体
の菌体をカナマイシン含有MB寒天平板からカナマイシン
を含むNo.5培地またはカナマイシンを含まないNo.5培地
各5mlを含む試験管中で、30℃にて48時間振盪培養し
た。得られた各培養液の0.1mlを、カナマイシン含有ま
たは非含有の新鮮なNo.5培地5mlに移植し、30℃で120時
間振盪培養した。

対照として、グルコノバクターオキシダンスN44−１
株を、カナマイシンを用いずに培養した点を除いて同様
に培養した。

生成した２−KGAの収量を、第12表に示す。

実施例９２−ケト−Ｌ−グロン酸醗酵中の組換えプラスミドの安
定性 pVK102を保持するグルコノバクターオキシダンスN44
−１株、またはp7A6△４を保持するグルコノバクターオ
キシダンスN44−１株の接合伝達体の菌体を、カナマイ
シン含有MB寒天平板から、カナマイシン非含有No.5培地
5mlを含む試験管に接種し、30℃で48時間振盪培養した
（一次培養）。各々の培養液の0.1ml分別量を、カナマ
イシン非含有の新鮮なNo.5培地5mlを含む試験管に移植
し、30℃で48時間振盪培養した（二次培養）。更に、三
次培養を、醗酵時間が120時間である点を除き二次培養
と同様の方法で行なつた。醗酵後の６サンプルを、適応
に希釈し、MB寒天平板に展開し、30℃で５日間培養し
た。生じたコロニーを釣り上げ（１サンプルあたり50コ
ロニー）、カナマイシン含有及び非含有MB寒天平板に、
移植し、30℃で３時間培養した。

プラスミドの安定性は、次の様に計算した：この結果を第13表に示す。

なお、本発明の主な特徴および態様を示せば次のとお
りである。

1.L−ソルボソンに作用して２−ケト−グロン酸を生成
し、グルコノバクター（Gluconobacter）属に属する微
生物に由来する均質な形態の補酵素非依存型Ｌ−ソルボ
ソン脱水素酵素。

2.以下の理化学的性質、ａ）至適pH ：約7.0、ｂ）至適温度：約30℃から約40℃ ｃ）分子構造：ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により測定された分子量が約47,500±
5,000の１種類のユニツトからなる、ｄ）熱安定性:30℃以下で安定、及び、ｅ）阻害剤 :Cu²⁺イオンにより阻害されるを有する上記第１項に記載のＬ−ソルボソン脱水素酵
素。

3.膜結合型酵素である上記第１項又は第２項に記載の補
酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素。

4.グルコノバクター・オキシダンス（Gluconobacter ox
ydans）IFO12257、グルコノバクター・オキシダンスIFO
12258又はその突然変異株の膜結合型酵素である上記第
２項又は第３項に記載の補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン
脱水素酵素。

5.細胞内において新規なＬ−ソルボソン脱水素酵素を産
生し得るグルコノバクター属に属する微生物又はその突
然変異株を培養し、細胞を破壊し、破壊された菌体の無
細胞抽出液、好ましくは微生物の膜画分から単離、精製
することを特徴とする新規な補酵素非依存型Ｌ−ソルボ
ソン脱水素酵素の製造方法。

6.前記微生物が、グルコノバクター・オキシダンスIFO1
2257、グルコノバクター・オキシダンスIFO12258又はそ
の突然変異株である上記第５項に記載の方法。

7.L−ソルボソンと補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水
素酵素を含んだグルコノバクター属に属する微生物由来
の新規な補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素とを
接触させることによりＬ−ソルボソンを２−ケト−Ｌ−
グロン酸に変換することからなる２−ケト−Ｌ−グロン
酸の製造方法。

8.前記微生物がグルコノバクター・オキシダンスIFO122
57、グルコノバクター・オキシダンスIFO12258又はその
突然変異株である上記第７項に記載の方法。

9.L−ソルボソンと該新規補酵素非依存型Ｌ−ソルボソ
ン脱水素酵素を含んだグルコノバクター属に属する微生
物とを接触させることによりＬ−ソルボソンを２−ケト
−Ｌ−グロン酸に変換することからなる２−ケト−Ｌ−
グロン酸の製造方法。

10.前記微生物がグルコノバクター・オキシダンスIFO12
257、グルコノバクター・オキシダンスIFO12258又はそ
の突然変異株である上記第９項に記載の方法。

11.L−ソルボソンを２−ケト−Ｌ−グロン酸に変換する
ことのできる新規な補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水
素酵素の活性を持つポリペプチドをコードするDNA。

12.下記アミノ酸部分配列、を有する新規な補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵
素の遺伝子をコードする上記第11項に記載のDNA。

13.L−ソルボソンを２−ケト−Ｌ−グロン酸に変換する
ことのできる新規な補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水
素酵素をコードする遺伝子を含む3.1kbのDNA断片。

14.該補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素が、下
記のアミノ酸部分配列、を有する上記第12項に記載のDNA断片。

15.下記の制限酵素地図により特徴付けられる上記第13項に記載のDNA断片。

16.L−ソルボソンを２−ケト−Ｌ−グロン酸に変換する
ことのできる新規な補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水
素酵素の活性を有するポリペプチドをコードするDNA配
列を含む組換えDNA分子。

17.該補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素が、下
記のアミノ酸部分配列、を有する上記第16項に記載の組換えDNA分子。

18.バクテリア・ベクターの配列を含む上記第16項に記
載の組換えDNA分子。

19.バクテリア・ベクターがコスミド・ベクターである
上記第18項に記載の組換えDNA分子。

20.該コスミド・ベクターがプラスミドpVK100、pVK102
又はその誘導体である上記第19項に記載の組換えDNA分
子。

21.p7A6、p7A6△２、p7A6△３又はp7A6△４である上記
第16項に記載の組換えDNA分子。

22.プラスミドpVK100、pVK102又はその誘導体から誘導
されるDNA断片を含むことを特徴とするグルコノバクタ
ー属に属する微生物内で安定である組換えDNA断片。

23.L−ソルボソンを２−ケト−Ｌ−グロン酸に変換する
ことができる新規な補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水
素酵素の活性を有するポリペプチドをコードするDNA配
列を有する組換えDNA分子が導入された組換え微生物。

24.該補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素が、下
記のアミノ酸部分配列、を有する上記第23項に記載の組換え微生物。

25.グルコノバクター属に属する上記第23項又は第24項
に記載の組換え微生物。

26.グルコノバクター・オキシダンスOX−4/p7A6、グル
コノバクター・オキシダンスN44−1/p7A6、グルコノバ
クター・オキシダンスN44−1/p7A6△４、グルコノバク
ター・オキシダンスＵ−13/p7A6△４、グルコノバクタ
ー・オキシダンスIFO3292/p7A6△４、グルコノバクター
・オキシダンスIFO3293/p7A6△４又はグルコノバクター
・オキシダンスIFO3294/p7A6△４である上記第25項に記
載の組換え微生物。

27.グルコノバクター属に属する菌株の接合伝達体であ
る上記第23項ないし第26項の何れかに記載の組換え微生
物。

28.グルコノバクター属に属する微生物を受容体として
使用し、該受容体をMBoサイトを含むプラスミドを有す
る供与体と接触させ、Tra遺伝子機能の助けにより該プ
ラスミドを該供与体から該受容体に転移させることを特
徴とする接合伝達体の製造方法。

29.該プラスミドが、pVK100、pVK102又はその誘導体で
ある上記第28項に記載の方法。

30.L−ソルボソンを２−ケト−Ｌ−グロン酸に変換する
ことのできるＬ−ソルボソン脱水素酵素の活性を有する
ポリペプチドをコードするDNA配列を有する組換えDNA分
子を導入した微生物を培養し、細胞を破壊し、破壊され
た細胞の無細胞抽出液、好ましくは微生物の膜画分から
単離、精製することを特徴とする新規な補酵素非依存型
Ｌ−ソルボソン脱水素酵素の活性を有するポリペプチド
の製造方法。

31.該補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素が、下
記のアミノ酸部分配列、を有する上記第30項に記載の方法。

32.該微生物がグルコノバクター属に属する上記第30項
に記載の方法。

33.該微生物が、グルコノバクター・オキシダンスOX−4
/p7A6、グルコノバクター・オキシダンスN44−1/p7A6、
グルコノバクター・オキシダンスN44−1/p7A6△４、グ
ルコノバクター・オキシダンスＵ−13/p7A6△４、グル
コノバクター・オキシダンスIFO3292/p7A6△４、グルコ
ノバクター・オキシダンスIFO3293/p7A6△４又はグルコ
ノバクター・オキシダンスIFO3294/p7A6△４である上記
第30項ないし第32項の何れかに記載の方法。

34.L−ソルボソンを、新規な補酵素非依存型Ｌ−ソルボ
ソン脱水素酵素の活性を有するポリペプチドをコードす
るDNA配列を有してなる組換えDNA分子が導入された微生
物由来の該ポリペプチドと接触させることによりＬ−ソ
ルボソンを２−ケト−Ｌ−グロン酸に変換することを特
徴とする２−ケト−Ｌ−グロン酸の製造方法。

35.該補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素が、下
記のアミノ酸部分配列、を有する上記第34項に記載の方法。

36.該微生物が、グルコノバクター属に属する上記第34
項に記載の方法。

37.該微生物が、グルコノバクター・オキシダンスOX−4
/p7A6、グルコノバクター・オキシダンスN44−1/p7A6、
グルコノバクター・オキシダンスN44−1/p7A6△４、グ
ルコノバクター・オキシダンスＵ−13/p7A6△４、グル
コノバクター・オキシダンスIFO3292/p7A6△４、グルコ
ノバクター・オキシダンスIFO3293/p7A6△４又はグルコ
ノバクター・オキシダンスIFO3294/p7A6△４である上記
第34項ないし第36項の何れかに記載の方法。

38.L−ソルボソンを、２−ケト−Ｌ−グロン酸に変換す
ることができる新規な補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱
水素酵素の活性を有するポリペプチドをコードするDNA
配列を有する組換えDNA分子が導入された微生物を用い
て、Ｌ−ソルボソンを２−ケト−Ｌ−グロン酸に変換す
ることを特徴とする２−ケト−Ｌ−グロン酸の製造方
法。

39.該補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素が、下
記のアミノ酸部分配列、を有する上記第38項に記載の方法。

40.該微生物が、グルコノバクター属に属する上記第38
項に記載の方法。

41.該微生物が、グルコノバクター・オキシダンスOX−4
/p7A6、グルコノバクター・オキシダンスN44−1/p7A6、
グルコノバクター・オキシダンスN44−1/p7A6△４、グ
ルコノバクター・オキシダンスＵ−13/p7A6△４、グル
コノバクター・オキシダンスIFO3292/p7A6△４、グルコ
ノバクター・オキシダンスIFO3293/p7A6△４又はグルコ
ノバクター・オキシダンスIFO3294/p7A6△４である上記
第38項ないし第40項の何れかに記載の方法。

42.L−ソルボソンを２−ケト−Ｌ−グロン酸に変換する
ことができる新規な補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水
素酵素の活性を有するポリペプチドをコードするDNA配
列を有する組換えDNA分子が導入された微生物を用いて
Ｌ−ソルボースを２−ケト−Ｌ−グロン酸に変換するこ
とを特徴とする２−ケト−Ｌ−グロン酸の製造方法。

43.該補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素が、下
記のアミノ酸部分配列、を有する上記第42項に記載の方法。

44.該微生物が、グルコノバクター属に属する上記第42
項に記載の方法。

45.該微生物が、グルコノバクター・オキシダンスOX−4
/p7A6、グルコノバクター・オキシダンスN44−1/p7A6、
グルコノバクター・オキシダンスN44−1/p7A6△４、グ
ルコノバクター・オキシダンスＵ−13/p7A6△４、グル
コノバクター・オキシダンスIFO3292/p7A6△４、グルコ
ノバクター・オキシダンスIFO3293/p7A6△４又はグルコ
ノバクター・オキシダンスIFO3294/p7A6△４である上記
第42項ないし第44項の何れかに記載の方法。

46.L−ソルボソンを、２−ケト−Ｌ−グロン酸に変換す
ることができる新規な補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱
水素酵素の活性を有するポリペプチドをコードするDNA
配列を有する組換えDNA分子が導入された微生物を用い
てＤ−ソルビトールを２−ケト−Ｌ−グロン酸に変換す
ることを特徴とする２−ケト−Ｌ−グロン酸の製造方
法。

47.該補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素が、下
記のアミノ酸部分配列、を有する上記第46項に記載の方法。

48.該微生物が、グルコノバクター属に属する上記第46
項に記載の方法。

49.該微生物が、グルコノバクター・オキシダンスOX−4
/p7A6、グルコノバクター・オキシダンスN44−1/p7A6、
グルコノバクター・オキシダンスN44−1/p7A6△４、グ
ルコノバクター・オキシダンスＵ−13/p7A6△４、グル
コノバクター・オキシダンスIFO3292/p7A6△４、グルコ
ノバクター・オキシダンスIFO3293/p7A6△４又はグルコ
ノバクター・オキシダンスIFO3294/p7A6△４である上記
第46項から第48項までの何れかに記載の方法。

50.前記の部分的アミノ酸配列の機能的同等物が使用さ
れている上記第11項、第14項、第17項、第31項、第35
項、第38項、第43項及び第47項に記載のDNA、DNA断片、
組換えDNA分子、組換え微生物及び製造方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 7/60 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｌ−ソルボソンに作用して２−ケト−グロ
ン酸を生成せしめ、そして下記の理化学的性質ａ）至適pH ：約7.0、ｂ）至適温度：約30℃ないし約40℃、ｃ）分子構造：ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により測定された分子量が約47,500±
5,000の１種類のユニツトからなる、ｄ）熱安定性:30℃以下で安定、及びｅ）阻害剤 :Cu²⁺イオンにより阻害されるを有する、グルコノバクター（Gluconobacter）属に属
する微生物由来の均質な形態の補酵素非依存型Ｌ−ソル
ボソン脱水素酵素。
【請求項２】細胞内において請求の範囲第１項記載のＬ
−ソルボソン脱水素酵素を産生し得るグルコノバクター
属に属する微生物又はその突然変異株を培養し、細胞を
破壊し、破壊された細胞の無細胞抽出液、好ましくは微
生物の膜画分から該酵素を単離、精製することを特徴と
する請求の範囲第１項記載の補酵素非依存型Ｌ−ソルボ
ソン脱水素酵素の製造方法。
【請求項３】Ｌ−ソルボソンを、補酵素非依存型Ｌ−ソ
ルボソン脱水素酵素を含んだグルコノバクター属に属す
る微生物由来の請求の範囲第１項記載の補酵素非依存型
Ｌ−ソルボソン脱水素酵素と接触させることにより、Ｌ
−ソルボソンを２−ケト−Ｌ−グロン酸に変換すること
を特徴とする２−ケト−Ｌ−グロン酸の製造方法。
【請求項４】Ｌ−ソルボソンを、請求の範囲第１項記載
の補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素を含んだグ
ルコノバクター属に属する微生物と接触させることによ
り、Ｌ−ソルボソンを２−ケト−Ｌ−グロン酸に変換す
ることを特徴とする２−ケト−Ｌ−グロン酸の製造方
法。
【請求項５】Ｌ−ソルボソンを２−ケト−Ｌ−グロン酸
に変換することができ且つ下記のアミノ酸部分配列を有する補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素のア
ミノ酸配列をコードするDNA。
【請求項６】Ｌ−ソルボソンを２−ケト−Ｌ−グロン酸
に変換することができる補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン
脱水素酵素をコードする遺伝子を含む請求の範囲第５項
記載の3.1kbのDNA断片。
【請求項７】請求の範囲第５項記載のDNA配列を含む組
換えDNA分子。
【請求項８】請求の範囲第５項又は第６項に記載のDNA
又はDNA断片を含むことを特徴とするグルコノバクター
属に属する微生物内で安定である組換えDNA断片。
【請求項９】請求の範囲第５項記載のDNA配列を有する
組換えDNA分子が導入された組換え微生物。
【請求項１０】請求の範囲第５項記載のDNA配列を有す
る組換えDNA分子を導入した微生物を培養し、細胞を破
壊し、破壊された細胞の無細胞抽出液、好ましくは微生
物の膜画分から酵素を単離、精製することを特徴とする
請求の範囲第１項記載の補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン
脱水素酵素の活性を有するポリペプチドの製造方法。
【請求項１１】Ｌ−ソルボソンを、請求の範囲第５項記
載のDNA配列を有してなる組換えDNA分子が導入された微
生物由来の補酵素非依存型Ｌ−ソルボソン脱水素酵素の
活性を有するポリペプチドと接触させることによりＬ−
ソルボソンを２−ケト−Ｌ−グロン酸に変換することを
特徴とする２−ケト−Ｌ−グロン酸の製造方法。
【請求項１２】請求の範囲第５項記載のDNA配列を有す
る組換えDNA分子が導入された微生物を用いて、Ｌ−ソ
ルボソンを２−ケト−Ｌ−グロン酸に変換することを特
徴とする２−ケト−Ｌ−グロン酸の製造方法。
【請求項１３】請求の範囲第５項記載のDNA配列を有す
る組換えDNA分子が導入された微生物を用いてＬ−ソル
ボースを２−ケト−Ｌ−グロン酸に変換することを特徴
とする２−ケト−Ｌ−グロン酸の製造方法。
【請求項１４】請求の範囲第５項記載のDNA配列を有す
る組換えDNA分子が導入された微生物を用いてＤ−ソル
ビトールを２−ケト−Ｌ−グロン酸に変換することを特
徴とする２−ケト−Ｌ−グロン酸の製造方法。