JP3121337B2 - シャトルベクター - Google Patents
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/58—Aldonic, ketoaldonic or saccharic acids
- C12P7/60—2-Ketogulonic acid
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、大腸菌（Esherichia coli）、グルコノバ
クター（Gluconobacter）属及びアセトバクター（Aceto
bacter）属に属する微生物間のシャトルベクターとして
有用である新規組換えDNAシャトルベクターに関するも
のである。本発明は、また、該シャトルベクターDNAま
たはその誘導体を有するグルコノバクター属またはアセ
トバクター属の接合伝達体に関するものである。さら
に、本発明は、該シャトルベクターDNAを有するグルコ
ノバクター属またはアセトバクター属の接合伝達体の製
造方法に関するものである。
クター（Gluconobacter）属及びアセトバクター（Aceto
bacter）属に属する微生物間のシャトルベクターとして
有用である新規組換えDNAシャトルベクターに関するも
のである。本発明は、また、該シャトルベクターDNAま
たはその誘導体を有するグルコノバクター属またはアセ
トバクター属の接合伝達体に関するものである。さら
に、本発明は、該シャトルベクターDNAを有するグルコ
ノバクター属またはアセトバクター属の接合伝達体の製
造方法に関するものである。
従来の文献において、グルコノバクターオキシダンス
（Gluconobacter oxydans）への遺伝子導入系の報告
は、２、３あるのみである。室岡ら（J.Bacteriol.145,
358−368［1981］）は、RP4::Muを有する大腸菌株とグ
ルコノバクターオキシダンス株の接合伝達を報告した。
その接合伝達体出現頻度は、受容菌当たり10-10であっ
た。深谷ら（Agric.Biol.Chem.49,2407−2411［198
5］）は、グルコノバクターオキシダンスの内在性プラ
スミドと大腸菌のプラスミドから構築された組換えプラ
スミドでのグルコノバクターオキシダンスの軽質転換を
報告した。その軽質転換頻度は非常に低い（μg DNA当
たり約102形質転換体、言い換えれば、受容菌当たり約1
0-9形質転換体）ものであった。この様に、これらの系
は、グルコノバクターオキシダンスへの遺伝子導入に対
して満足できる程効率的ではなかった。
（Gluconobacter oxydans）への遺伝子導入系の報告
は、２、３あるのみである。室岡ら（J.Bacteriol.145,
358−368［1981］）は、RP4::Muを有する大腸菌株とグ
ルコノバクターオキシダンス株の接合伝達を報告した。
その接合伝達体出現頻度は、受容菌当たり10-10であっ
た。深谷ら（Agric.Biol.Chem.49,2407−2411［198
5］）は、グルコノバクターオキシダンスの内在性プラ
スミドと大腸菌のプラスミドから構築された組換えプラ
スミドでのグルコノバクターオキシダンスの軽質転換を
報告した。その軽質転換頻度は非常に低い（μg DNA当
たり約102形質転換体、言い換えれば、受容菌当たり約1
0-9形質転換体）ものであった。この様に、これらの系
は、グルコノバクターオキシダンスへの遺伝子導入に対
して満足できる程効率的ではなかった。
通常、実用的には、たとえば遺伝子ライブラリー構築
のための一実験において、数千個の接合伝達体や形質転
換体の取得が要求される。
のための一実験において、数千個の接合伝達体や形質転
換体の取得が要求される。
本発明によれば、新規で非常に有用なシャトルベクタ
ーは、マーカー遺伝子、大腸菌内で機能できる複製起
点、グルコノバクターオキシダンス内で機能できる複製
起点及びMob部位を組み合せて得られる。
ーは、マーカー遺伝子、大腸菌内で機能できる複製起
点、グルコノバクターオキシダンス内で機能できる複製
起点及びMob部位を組み合せて得られる。
この様に本発明の一面は、大腸菌内で機能できる複製
起点、グルコノバクターオキシダンス内で機能できる複
製起点、一つもしくはそれ以上のマーカー遺伝子及びMo
b部位を含む新規組換えDNAベクターに関するものであ
る。該ベクターは、さらにマルチクローニング部位を有
するDNA配列、発現制御配列、cos部位、ターミネーター
配列、リボゾーム結合部位、シグナルペプチド及び／ま
たは蛋白質をコードするDNA配列からなるグループから
選択される一つもしくはそれ以上の挿入断片を含む。本
発明の他の面は、該ベクターが導入されているグルコノ
バクター属またはアセトバクター属の接合伝達体に関す
る。本発明のさらに別の面は、接合伝達条件下におい
て、グルコノバクター属もしくはアセトバクター属の一
株を該ベクターで形質転換された大腸菌の一株と接触さ
せることを含む、該接合伝達体の製造方法に関する。
起点、グルコノバクターオキシダンス内で機能できる複
製起点、一つもしくはそれ以上のマーカー遺伝子及びMo
b部位を含む新規組換えDNAベクターに関するものであ
る。該ベクターは、さらにマルチクローニング部位を有
するDNA配列、発現制御配列、cos部位、ターミネーター
配列、リボゾーム結合部位、シグナルペプチド及び／ま
たは蛋白質をコードするDNA配列からなるグループから
選択される一つもしくはそれ以上の挿入断片を含む。本
発明の他の面は、該ベクターが導入されているグルコノ
バクター属またはアセトバクター属の接合伝達体に関す
る。本発明のさらに別の面は、接合伝達条件下におい
て、グルコノバクター属もしくはアセトバクター属の一
株を該ベクターで形質転換された大腸菌の一株と接触さ
せることを含む、該接合伝達体の製造方法に関する。
本発明のシャトルベクターは、大腸菌、グルコノバク
ター属及びアセトバクター属に属するいずれの株の間で
も移動させることが可能であり、また、これらのいずれ
の株の中でも複製可能である。
ター属及びアセトバクター属に属するいずれの株の間で
も移動させることが可能であり、また、これらのいずれ
の株の中でも複製可能である。
本発明のシャトルベクターの宿主として好適な大腸菌
は、組換えDNA技術で用いられる何れの大腸菌でもよ
く、たとえば、大腸菌Ｋ−12、大腸菌C600、大腸菌HB10
1、大腸菌ED8767または大腸菌S17−１などである。本発
明のシャトルベクターの宿主として好適なグルコノバク
ターは、グルコノバクター属に属する何れの株でもよ
い。最新の分類に従えば、グルコノバクター属に属する
株は、全てのグルコノバクターオキシダンス種に分類さ
れる（Bergy's Manual of Systematic Bacteriology,Vo
l.I,275−278［1984］;F.Gosseleら、International J.
System.Bacteriol.33,65−81［1983］）。本発明のシャ
トルベクターの宿主として好適なアセトバクターではア
セトバクター属に属する何れの株でもよい。好ましいア
セトバクター属の株は、アセトバクターアセチ（Acetob
acter aceti）、アセトバクターリクェファシエンス（A
cetobacter liquefaciens）及びアセトバクターパスト
ゥリアヌス（Acetobacter pasteurianus）である。
は、組換えDNA技術で用いられる何れの大腸菌でもよ
く、たとえば、大腸菌Ｋ−12、大腸菌C600、大腸菌HB10
1、大腸菌ED8767または大腸菌S17−１などである。本発
明のシャトルベクターの宿主として好適なグルコノバク
ターは、グルコノバクター属に属する何れの株でもよ
い。最新の分類に従えば、グルコノバクター属に属する
株は、全てのグルコノバクターオキシダンス種に分類さ
れる（Bergy's Manual of Systematic Bacteriology,Vo
l.I,275−278［1984］;F.Gosseleら、International J.
System.Bacteriol.33,65−81［1983］）。本発明のシャ
トルベクターの宿主として好適なアセトバクターではア
セトバクター属に属する何れの株でもよい。好ましいア
セトバクター属の株は、アセトバクターアセチ（Acetob
acter aceti）、アセトバクターリクェファシエンス（A
cetobacter liquefaciens）及びアセトバクターパスト
ゥリアヌス（Acetobacter pasteurianus）である。
挿入DNAを含む本発明のベクターは、簡略で経済的な
工業プロセスに有用で、抗生物質やその同等物での選択
圧非存在下でさえ上述の微生物、特にグルコノバクター
株の中で安定に維持され得る。
工業プロセスに有用で、抗生物質やその同等物での選択
圧非存在下でさえ上述の微生物、特にグルコノバクター
株の中で安定に維持され得る。
大腸菌内で機能できる複製起点及びグルコノバクター
オキシダンス内で機能できる複製起点を有する本発明の
ベクターは、大腸菌、グルコノバクターおよびアセトバ
クター株のいずれの内部でも機能できる点もまた非常に
有用である。大腸菌は、ベクターDNAの増幅及び組換えD
NA操作を簡便かつ迅速な方法で行なうための効率良い宿
主として知られている。他方、グルコノバクターは、グ
ルコノバクター遺伝子の発現用宿主として用いることが
できる。本発明の該ベクターは、この様な機能的構築物
であるため、グルコノバクターもしくはアセトバクター
の特定遺伝子を大腸菌内でクローニングし、その後の、
グルコノバクターやアセトバクター内で効果的に発現さ
せることが可能である。さらに、この様な機能的構築物
は、また、接合伝達に必須なDNA領域（Mob部位）を含む
ことが好ましい。それ故に、本発明のベクターは、最初
に大腸菌内で構築され、次いで大腸菌からプラスミドDN
Aを単離することなく直接にグルコノバクターやアセト
バクターへ接合伝達により導入することができる。
オキシダンス内で機能できる複製起点を有する本発明の
ベクターは、大腸菌、グルコノバクターおよびアセトバ
クター株のいずれの内部でも機能できる点もまた非常に
有用である。大腸菌は、ベクターDNAの増幅及び組換えD
NA操作を簡便かつ迅速な方法で行なうための効率良い宿
主として知られている。他方、グルコノバクターは、グ
ルコノバクター遺伝子の発現用宿主として用いることが
できる。本発明の該ベクターは、この様な機能的構築物
であるため、グルコノバクターもしくはアセトバクター
の特定遺伝子を大腸菌内でクローニングし、その後の、
グルコノバクターやアセトバクター内で効果的に発現さ
せることが可能である。さらに、この様な機能的構築物
は、また、接合伝達に必須なDNA領域（Mob部位）を含む
ことが好ましい。それ故に、本発明のベクターは、最初
に大腸菌内で構築され、次いで大腸菌からプラスミドDN
Aを単離することなく直接にグルコノバクターやアセト
バクターへ接合伝達により導入することができる。
本発明のシャトルベクターに好適なマーカー遺伝子
は、大腸菌、グルコノバクターもしくはアセトバクター
内で発現する全ての抗生物質耐性遺伝子、例えば、カナ
マイシン耐性（Kmr）、ストレプトマイシン耐性（S
mr）、アンピシリン耐性（Apr）及びテトラサイクリン
耐性（Tcr）遺伝子などがある。
は、大腸菌、グルコノバクターもしくはアセトバクター
内で発現する全ての抗生物質耐性遺伝子、例えば、カナ
マイシン耐性（Kmr）、ストレプトマイシン耐性（S
mr）、アンピシリン耐性（Apr）及びテトラサイクリン
耐性（Tcr）遺伝子などがある。
これらの抗生物質耐性遺伝子は、天然もしくは人工的
に構築されたプラスミド、トランスポゾン、染色体DNA
及び合成DNAから単離してもよい。該抗生物質耐性遺伝
子の供給源としては、限定されるものではないが、プラ
スミドRP4（Dattaら、J.Bacteriol.108,1244−1249［19
71］;NRRL B−1 8147）,RK2（ATCC37125）,RSF1010（長
張および坂口、J.Bacteriol.133,1527−1529［1978］;N
RRLB−18146）,pACYC177（ATCC37031），トランスポゾ
ンTn3（Bergら、Proc.Nat.Acad.Sci.72,3628−3632［19
75］）,Tn10（Fosterら、J.Bacteriol.124,1153−1158
［1975］）及びそれらの誘導体が含まれる。マーカー遺
伝子としては、色素産生遺伝子（たとえば、プラスミド
pIJ702上のmel遺伝子）もまた役立つであろう。
に構築されたプラスミド、トランスポゾン、染色体DNA
及び合成DNAから単離してもよい。該抗生物質耐性遺伝
子の供給源としては、限定されるものではないが、プラ
スミドRP4（Dattaら、J.Bacteriol.108,1244−1249［19
71］;NRRL B−1 8147）,RK2（ATCC37125）,RSF1010（長
張および坂口、J.Bacteriol.133,1527−1529［1978］;N
RRLB−18146）,pACYC177（ATCC37031），トランスポゾ
ンTn3（Bergら、Proc.Nat.Acad.Sci.72,3628−3632［19
75］）,Tn10（Fosterら、J.Bacteriol.124,1153−1158
［1975］）及びそれらの誘導体が含まれる。マーカー遺
伝子としては、色素産生遺伝子（たとえば、プラスミド
pIJ702上のmel遺伝子）もまた役立つであろう。
本発明のシャトルベクターに適する大腸菌内で機能で
きる複製起点は、たとえば、大腸菌の、もしくは、大腸
菌内で自律複製できる何れのプラスミドまたはファージ
の複製起点を含むDNA断片である。この様な複製起点は
たとえば、プラスミドRP4、RSF1010、pBR322、pACYC17
7、pACYC184、pSC101、λファージ（たとえばファージ
λ）、P1ファージなど（たとえばP1）もしくはＴ−コリ
ファージ（たとえばコリファージT4）などから単離して
もよい。
きる複製起点は、たとえば、大腸菌の、もしくは、大腸
菌内で自律複製できる何れのプラスミドまたはファージ
の複製起点を含むDNA断片である。この様な複製起点は
たとえば、プラスミドRP4、RSF1010、pBR322、pACYC17
7、pACYC184、pSC101、λファージ（たとえばファージ
λ）、P1ファージなど（たとえばP1）もしくはＴ−コリ
ファージ（たとえばコリファージT4）などから単離して
もよい。
本発明のシャトルベクターに適するグルコノバクター
およびアセトバクター内で機能できる複製起点は、例え
ば、グルコノバクターオキシダンスの、又はグルコノバ
クターオキシダンス内で自律的に複製できる何れの内在
性ラスミドもしくはファージの複製起点を含むDNA断片
である。この様な複製起点は、例えば、グルコノバクタ
ーオキシダンスIFO3293（FERM P−8356）、グルコノバ
クターオキシダンスIFO3293の内在性プラスミド、もし
くは、グルコノバクターオキシダンスの内在性ファージ
DNA（Schocherら、Arch.Microbiol.121,193−197［197
9］）から分離してもよい。
およびアセトバクター内で機能できる複製起点は、例え
ば、グルコノバクターオキシダンスの、又はグルコノバ
クターオキシダンス内で自律的に複製できる何れの内在
性ラスミドもしくはファージの複製起点を含むDNA断片
である。この様な複製起点は、例えば、グルコノバクタ
ーオキシダンスIFO3293（FERM P−8356）、グルコノバ
クターオキシダンスIFO3293の内在性プラスミド、もし
くは、グルコノバクターオキシダンスの内在性ファージ
DNA（Schocherら、Arch.Microbiol.121,193−197［197
9］）から分離してもよい。
Mob部位は、移動起点（ori T）を含み、ある種の可動
性プラスミドの移動機能の認識部位として作用すると考
えられている（R.Simonら、Bio/Technology １,784−79
1［1983］）。このMob部位は、結合プラスミド例えば、
プラスミドRK2、RP4、RSF1010またはそれらの誘導体か
ら得られる。Mob部位含有プラスミドは、二親間接合伝
達又は三親間接合伝達を用い、Trの遺伝子の助けによ
り、その本来の宿主から、他の宿主へ移動可能である。
このTrの遺伝子は、RP4及びRK2の様な、広宿主域IncP型
プラスミドの移動遺伝子としてよく知られている。二親
間接合伝達においては、Mob部位含有プラスミドを保持
するTr遺伝子含有株、たとえば、大腸菌S17−１（R.Sim
onや、前述文献）を、受容菌と混合する。三親間接合伝
達においては、Mob部位含有プラスミドを保持する供与
株を、RP4やRK2の様なTrの遺伝子を含有するプラスミド
を保持する株及び受容株と混合する。
性プラスミドの移動機能の認識部位として作用すると考
えられている（R.Simonら、Bio/Technology １,784−79
1［1983］）。このMob部位は、結合プラスミド例えば、
プラスミドRK2、RP4、RSF1010またはそれらの誘導体か
ら得られる。Mob部位含有プラスミドは、二親間接合伝
達又は三親間接合伝達を用い、Trの遺伝子の助けによ
り、その本来の宿主から、他の宿主へ移動可能である。
このTrの遺伝子は、RP4及びRK2の様な、広宿主域IncP型
プラスミドの移動遺伝子としてよく知られている。二親
間接合伝達においては、Mob部位含有プラスミドを保持
するTr遺伝子含有株、たとえば、大腸菌S17−１（R.Sim
onや、前述文献）を、受容菌と混合する。三親間接合伝
達においては、Mob部位含有プラスミドを保持する供与
株を、RP4やRK2の様なTrの遺伝子を含有するプラスミド
を保持する株及び受容株と混合する。
本発明のシャトルベクターは、さらに所望の機能を付
加するために一つもしくはそれ以上の挿入断片、たとえ
ば、マルチクローニング部位を有するDNA配列、リボゾ
ーム結合部位、シグナルペプチド及び／もしくは蛋白質
をコードするDNA配列を含めてもよい。
加するために一つもしくはそれ以上の挿入断片、たとえ
ば、マルチクローニング部位を有するDNA配列、リボゾ
ーム結合部位、シグナルペプチド及び／もしくは蛋白質
をコードするDNA配列を含めてもよい。
さらに詳細には、本発明のシャトルベクターは、クロ
ーニングに便利なようにpUC18（Boehringer Mannheim社
製）もしくはM13mp8（Boehringer Mannheim社製）の様
な種々のプラスミドやファージまたは合成DNA配列から
得られる一つもしくはそれ以上のマルチクローニング部
位（Messingら、Methods in Enzymology,101,20［198
3）］を含むDNA配列を含有してもよい。さらに、該シャ
トルベクターは、広範囲に渡る発現制御部位、たとえ
ば、Maniatisらのテキスト（Molecular cloning,A Labo
ratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring
Harbor,N.Y.,USA［1982］）で知られる様なlac,trp,ta
cもしくはβ−ラクタマーゼ発現制御系、ファージ起源
の制御配列またはグルコノバクター株から得られる発現
制御配列を含有してもよい。さらに、該シャトルベクタ
ーは、in vitroパッケージング用のcos部位を含んでも
よい。さらに、該シャトルベクターは、本発明の効率の
良いグルコノバクター及びアセトバクターの宿主ベクタ
ー系を構築するために用いる効率的終結のためのターミ
ネーター配列、効率的翻訳のための天然もしくは合成リ
ポゾーム結合部位、クローン化した蛋白質の効率的局在
化のためのシグナルペプチドをコードするDNA配列及び
マーカー蛋白の構造遺伝子を含んでもよい。
ーニングに便利なようにpUC18（Boehringer Mannheim社
製）もしくはM13mp8（Boehringer Mannheim社製）の様
な種々のプラスミドやファージまたは合成DNA配列から
得られる一つもしくはそれ以上のマルチクローニング部
位（Messingら、Methods in Enzymology,101,20［198
3）］を含むDNA配列を含有してもよい。さらに、該シャ
トルベクターは、広範囲に渡る発現制御部位、たとえ
ば、Maniatisらのテキスト（Molecular cloning,A Labo
ratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring
Harbor,N.Y.,USA［1982］）で知られる様なlac,trp,ta
cもしくはβ−ラクタマーゼ発現制御系、ファージ起源
の制御配列またはグルコノバクター株から得られる発現
制御配列を含有してもよい。さらに、該シャトルベクタ
ーは、in vitroパッケージング用のcos部位を含んでも
よい。さらに、該シャトルベクターは、本発明の効率の
良いグルコノバクター及びアセトバクターの宿主ベクタ
ー系を構築するために用いる効率的終結のためのターミ
ネーター配列、効率的翻訳のための天然もしくは合成リ
ポゾーム結合部位、クローン化した蛋白質の効率的局在
化のためのシグナルペプチドをコードするDNA配列及び
マーカー蛋白の構造遺伝子を含んでもよい。
概略的には、本発明のシャトルベクターは、本記載に
記述されている通りの材料を用いた次の順番により、Ma
niatisら（上述）により述べられている組換えDNA技術
を用いて取得できる： （１） マーカー遺伝子を含むDNAを調製し、 （２） 大腸菌内で機能できる複製起点を含むDNAを調
製し、 （３） グルコノバクター内で機能できる複製起点を含
むDNAを調製し、 （４） Mob部位を含むDNAを調製し、 （５） 本発明のシャトルベクターを得るために、
（１）から（４）で述べられているDNAを適当な制限酵
素で切断し、それらをリガーゼで連結することにより結
合する。
記述されている通りの材料を用いた次の順番により、Ma
niatisら（上述）により述べられている組換えDNA技術
を用いて取得できる： （１） マーカー遺伝子を含むDNAを調製し、 （２） 大腸菌内で機能できる複製起点を含むDNAを調
製し、 （３） グルコノバクター内で機能できる複製起点を含
むDNAを調製し、 （４） Mob部位を含むDNAを調製し、 （５） 本発明のシャトルベクターを得るために、
（１）から（４）で述べられているDNAを適当な制限酵
素で切断し、それらをリガーゼで連結することにより結
合する。
これらの手順により、マーカー遺伝子、大腸菌内で機
能できる複製起点、グルコノバクター由来の複製起点及
び機能的Mob部位を含むシャトルベクターを構築可能で
ある。
能できる複製起点、グルコノバクター由来の複製起点及
び機能的Mob部位を含むシャトルベクターを構築可能で
ある。
本発明のシャトルベクターは、大腸菌からグルコノバ
クターもしくはアセトバクターへ、ベクターDNAの単離
精製することなく接合伝達により、非常に高頻度（受容
菌あたり約10-2から10-1の接合伝達体）で導入すること
が可能である。これらのベクターを用いて、大腸菌で構
築した遺伝子ライブラリー（103から105クローン）は、
一回の実験でグルコノバクターやアセトバクターに導入
できる。この様に、本発明のシャトルベクターはクロー
ニング実験の単純化という観点から高度に効率的であ
る。
クターもしくはアセトバクターへ、ベクターDNAの単離
精製することなく接合伝達により、非常に高頻度（受容
菌あたり約10-2から10-1の接合伝達体）で導入すること
が可能である。これらのベクターを用いて、大腸菌で構
築した遺伝子ライブラリー（103から105クローン）は、
一回の実験でグルコノバクターやアセトバクターに導入
できる。この様に、本発明のシャトルベクターはクロー
ニング実験の単純化という観点から高度に効率的であ
る。
本発明のシャトルベクターの最も有利な特質は、選択
圧の非存在下においてさえ、大腸菌、グルコノバクター
およびアセトバクター株内で安定であることである。さ
らに、該ベクターは宿主細胞の増殖や醗酵生成物の産生
に悪影響を及ぼさない。
圧の非存在下においてさえ、大腸菌、グルコノバクター
およびアセトバクター株内で安定であることである。さ
らに、該ベクターは宿主細胞の増殖や醗酵生成物の産生
に悪影響を及ぼさない。
まとめれば、本発明のシャトルベクターは、遺伝子ク
ローニングのためのならびに所望の原核および真核生物
のポリペプチドの生産のためのベクターとして工業プロ
セスで使用することが可能である。所望の原核および真
核生物のポリペプチドは、発現制御配列と効果的に連結
させた。該ポリペプチドをコードするDNA配列を含む本
発明のシャトルベクターを接合伝達により、グルコノバ
クター属もしくはアセトバクター属の株へ導入し、適当
な増殖条件下で、接合伝達体を培養し、その培養液から
所望のポリペプチドを単離することにより、取得でき
る。
ローニングのためのならびに所望の原核および真核生物
のポリペプチドの生産のためのベクターとして工業プロ
セスで使用することが可能である。所望の原核および真
核生物のポリペプチドは、発現制御配列と効果的に連結
させた。該ポリペプチドをコードするDNA配列を含む本
発明のシャトルベクターを接合伝達により、グルコノバ
クター属もしくはアセトバクター属の株へ導入し、適当
な増殖条件下で、接合伝達体を培養し、その培養液から
所望のポリペプチドを単離することにより、取得でき
る。
図面の概略説明 第１図は、シャトルベクターpGE1の構築を示す。
第２図は、プラスミドpGE1への膜結合型Ｌ−ソルボソ
ン脱水素酵素遺伝子の挿入を示す。
ン脱水素酵素遺伝子の挿入を示す。
第３図は、プラスミドpGE1とpGE1−SNB2の制限酵素地
図を示す。
図を示す。
第４図は、プラスミドp7A6Δ２、p7A6Δ３、p7A6Δ４
の制限酵素地図を示す。
の制限酵素地図を示す。
第５図は、プラスミドp7A6Δ４のSSE断片の制限酵素
地図を示す。
地図を示す。
実施例１ シャトルベクターpGE1の構築 グルコノバクターオキシダンスIFO3293は、いかなる
選択圧の非存在下でも細胞中で安定に維持される２種類
のクリプティックプラスミドを有している。pGO3293Sと
命名された小型プラスミドは、リラックス型プラスミド
（コピー数は10以上）で、その分子サイズは9.9kbであ
る。pGO3293Lと命名された大型プラスミドは、ストリン
ジェント型プラスミド（コピー数は１から２）で、その
分子サイズは約60kbである。該ベクターの適当なコピー
数とDNAサイズを考慮してpGO3293Sが、グルコノバクタ
ーオキシダンス内で機能できる複数起点の供給源として
選択された。
選択圧の非存在下でも細胞中で安定に維持される２種類
のクリプティックプラスミドを有している。pGO3293Sと
命名された小型プラスミドは、リラックス型プラスミド
（コピー数は10以上）で、その分子サイズは9.9kbであ
る。pGO3293Lと命名された大型プラスミドは、ストリン
ジェント型プラスミド（コピー数は１から２）で、その
分子サイズは約60kbである。該ベクターの適当なコピー
数とDNAサイズを考慮してpGO3293Sが、グルコノバクタ
ーオキシダンス内で機能できる複数起点の供給源として
選択された。
プラスミドpSUP301は、大腸菌内で機能できる複製起
点、抗生物質耐性遺伝子（KmrとApr遺伝子）及びMob部
位の供給源として用いられた。プラスミドpSUP301は、p
ACYC177とRK2由来のMob部位を結合して構築された（R.S
imonら、上述）。それ故、プラスミドpACYC177とRK2も
しくはその同等物が、プラスミドpSUP301の替わりに使
用できる。
点、抗生物質耐性遺伝子（KmrとApr遺伝子）及びMob部
位の供給源として用いられた。プラスミドpSUP301は、p
ACYC177とRK2由来のMob部位を結合して構築された（R.S
imonら、上述）。それ故、プラスミドpACYC177とRK2も
しくはその同等物が、プラスミドpSUP301の替わりに使
用できる。
Ａ）プラスミドpGO3293SおよびpSUP301の調製 プラスミドpSUP301は、pSUP301を保持する大腸菌細胞
からアルカリ法（H.C.BirnboimとJ.Doly,Nucleic Acids
Research,７,1513−1523［1979］）により調製され
た。
からアルカリ法（H.C.BirnboimとJ.Doly,Nucleic Acids
Research,７,1513−1523［1979］）により調製され
た。
プラスミドpGO3293Sは、グルコノバクターオキシダン
スIFO3293細胞からアルカリ法により以下に述べるよう
に調製された： グルコノバクターオキシダンス細胞は、25g/マンニ
トール、5g/酵母エキス（Difco）及び3g/バクトペ
プトン（Difco）を含むマンニトールブロス（MB）5mlを
含有する試験管内で24時間30℃で培養された。次に、そ
の培養液4mlが、鮮明MB培地50mlを含有する500ml容エー
レンマイヤーフラスコに移植された。そのフラスコは、
180rpmで運転される回転振盪機上で、30℃15時間培養さ
れた。得られた培養液は、5,000rpm（3,000g）15分間遠
心分離した。細胞は10mlの溶液Ｉ（2mg/mlリゾチーム、
5mMグルコース、10mM EDTAを含む25mM Tris−HCl、pH7.
9）に懸濁し、その懸濁液を氷上30分間静置した。次
に、20mlの溶液II（１％SDSを含む18mM NaOH）を添加
し、その溶液を氷上10分間静置し、ついで15mlの3M酢酸
ナトリウムpH4.8を添加した。得られた溶液を、氷上60
分間静置した後、13,000rpm（21,000g）で10分間遠心分
離した。この上清（40ml）に40mlのイソプロパノールを
添加した。この混合液を氷上60分間静置後、15分間、1
5,000rpm（28,000g）で遠心分離して得た沈澱物を乾燥
後、2mlの蒸溜水に溶解した。プラスミドDNAを、さらに
エタノール沈澱により精製し、最終プラスミドDNA溶液
を得た。
スIFO3293細胞からアルカリ法により以下に述べるよう
に調製された： グルコノバクターオキシダンス細胞は、25g/マンニ
トール、5g/酵母エキス（Difco）及び3g/バクトペ
プトン（Difco）を含むマンニトールブロス（MB）5mlを
含有する試験管内で24時間30℃で培養された。次に、そ
の培養液4mlが、鮮明MB培地50mlを含有する500ml容エー
レンマイヤーフラスコに移植された。そのフラスコは、
180rpmで運転される回転振盪機上で、30℃15時間培養さ
れた。得られた培養液は、5,000rpm（3,000g）15分間遠
心分離した。細胞は10mlの溶液Ｉ（2mg/mlリゾチーム、
5mMグルコース、10mM EDTAを含む25mM Tris−HCl、pH7.
9）に懸濁し、その懸濁液を氷上30分間静置した。次
に、20mlの溶液II（１％SDSを含む18mM NaOH）を添加
し、その溶液を氷上10分間静置し、ついで15mlの3M酢酸
ナトリウムpH4.8を添加した。得られた溶液を、氷上60
分間静置した後、13,000rpm（21,000g）で10分間遠心分
離した。この上清（40ml）に40mlのイソプロパノールを
添加した。この混合液を氷上60分間静置後、15分間、1
5,000rpm（28,000g）で遠心分離して得た沈澱物を乾燥
後、2mlの蒸溜水に溶解した。プラスミドDNAを、さらに
エタノール沈澱により精製し、最終プラスミドDNA溶液
を得た。
Ｂ）プラスミドpGO3293SとpSUP301を用いた組換えプラ
スミドの構築 150ngのpSUP301 DNAと200ngのpGO3293s DNAをHinc II
で完全分解し、T4DNAリガーゼで結合した。得られた結
合混合物は、E.coli S17−１を形質転換するのに用い
た。
スミドの構築 150ngのpSUP301 DNAと200ngのpGO3293s DNAをHinc II
で完全分解し、T4DNAリガーゼで結合した。得られた結
合混合物は、E.coli S17−１を形質転換するのに用い
た。
Kmrの形質転換体を、まずLK（50μg/mlのカナマイシ
ンを含むルリアブロス；ルリアブロス（LB）:10g/バ
クトペプトン、5g/酵母エキス、5g/NaCl）寒天平板
上で選択した。次にApsKmrのクローンすなわち、Apr遺
伝子内に挿入断片を有するプラスミドを保持する形質転
換体をLK寒天平板及びLA（50μg/mlのアンピシリンを含
むLB培地）寒天平板の両者を用いて選択した。
ンを含むルリアブロス；ルリアブロス（LB）:10g/バ
クトペプトン、5g/酵母エキス、5g/NaCl）寒天平板
上で選択した。次にApsKmrのクローンすなわち、Apr遺
伝子内に挿入断片を有するプラスミドを保持する形質転
換体をLK寒天平板及びLA（50μg/mlのアンピシリンを含
むLB培地）寒天平板の両者を用いて選択した。
Ｃ）二親間接合伝達による組換えプラスミドの大腸菌か
らのグルコノバクターオキシダンスへの導入 全KmrAps形質転換体から得られた組換えプラスミド混
合物をグルコノバクターオキシダンスN44−１（ヨーロ
ッパ特許出願公開番号第213591号に記載されている様に
変異処理によりグルコノバクターオキシダンスIFO3293
より取得した２−KGA高生産株）へ、二親間接合伝達に
より導入した。二親間接合伝達は、次の様に行なわれ
た： MB培地で増殖させた受容菌グルコノバクターオキシダ
ンスN44−１の対数増殖期培養液200μを、５μg/mlの
カナマイシンと10μg/mlのストレプトマイシンを含むLB
培地で増殖させた全Kmr形質転換体の対数増殖期培養液1
00μと混合し、FB（50g/フラクトース、10g/酵母
エキス、10g/ポリペプトン）寒天平板上のニトロセル
ロース表面にスポットした。この寒天平板を、30℃で一
晩培養した。生じた混合コロニーを、適当に希釈した
後、10μg/mlのポリミキシンＢ及び50μg/mlのカナマイ
シンを含むMB（MPK）寒天平板ならびに10μg/mlのポリ
ミキシンＢを含むMB（MP）寒天平板に塗布し、30℃で４
日間培養した。
らのグルコノバクターオキシダンスへの導入 全KmrAps形質転換体から得られた組換えプラスミド混
合物をグルコノバクターオキシダンスN44−１（ヨーロ
ッパ特許出願公開番号第213591号に記載されている様に
変異処理によりグルコノバクターオキシダンスIFO3293
より取得した２−KGA高生産株）へ、二親間接合伝達に
より導入した。二親間接合伝達は、次の様に行なわれ
た： MB培地で増殖させた受容菌グルコノバクターオキシダ
ンスN44−１の対数増殖期培養液200μを、５μg/mlの
カナマイシンと10μg/mlのストレプトマイシンを含むLB
培地で増殖させた全Kmr形質転換体の対数増殖期培養液1
00μと混合し、FB（50g/フラクトース、10g/酵母
エキス、10g/ポリペプトン）寒天平板上のニトロセル
ロース表面にスポットした。この寒天平板を、30℃で一
晩培養した。生じた混合コロニーを、適当に希釈した
後、10μg/mlのポリミキシンＢ及び50μg/mlのカナマイ
シンを含むMB（MPK）寒天平板ならびに10μg/mlのポリ
ミキシンＢを含むMB（MP）寒天平板に塗布し、30℃で４
日間培養した。
接合伝達頻度は、MP寒天平板上のコロニー数に対する
MPK寒天平板上のコロニー数の比として計算した。
MPK寒天平板上のコロニー数の比として計算した。
本実験の接合伝達頻度は、0.06から0.1％（受容菌当
たりの接合伝達体）であった。プラスミドDNAを５つの
接合伝達株からミニアルカリ法により調製し、アガロー
スゲル電気泳動により分析した。結果として、全てのプ
ラスミドが、同じ構造を有していた。一つのプラスミド
をpGE1と命名した。
たりの接合伝達体）であった。プラスミドDNAを５つの
接合伝達株からミニアルカリ法により調製し、アガロー
スゲル電気泳動により分析した。結果として、全てのプ
ラスミドが、同じ構造を有していた。一つのプラスミド
をpGE1と命名した。
Ｄ）新規分離プラスミドpGE1の分析 pGE1が、グルコノバクターオキシダンスと大腸菌間の
シャトルベクターであることを確証するために、pGE1保
持グルコノバクターオキシダンスN44−１の細胞から調
製したプラスミドpGE1を大腸菌C600株へ形質転換法で導
入した。プラスミドpGE1は、大腸菌C600株をμgDNA当り
106形質転換体という頻度で形質転換した。このことか
らpGE1は、大腸菌とグルコノバクターオキシダンス間の
シャトルベクターとして働くことが示された。pGE1構築
の模式図を第１図に示す。
シャトルベクターであることを確証するために、pGE1保
持グルコノバクターオキシダンスN44−１の細胞から調
製したプラスミドpGE1を大腸菌C600株へ形質転換法で導
入した。プラスミドpGE1は、大腸菌C600株をμgDNA当り
106形質転換体という頻度で形質転換した。このことか
らpGE1は、大腸菌とグルコノバクターオキシダンス間の
シャトルベクターとして働くことが示された。pGE1構築
の模式図を第１図に示す。
pGE1を保持するグルコノバクターオキシダンスN44−
１と大腸菌の細胞から調製したpGE1 DNAをAva I,Hinc I
I,Pst I,Pvu IもしくはPvu IIで切断し、アガロース電
気泳動で分析した。Hinc II断片、Pst I断片、及び未切
断DNAを32P−ラベルpSUP301とハイブリダイズし、一
方、Pvu I,Pvu II及びAva I断片を32P−ラベルpGO3293S
とハイブリダイズした。
１と大腸菌の細胞から調製したpGE1 DNAをAva I,Hinc I
I,Pst I,Pvu IもしくはPvu IIで切断し、アガロース電
気泳動で分析した。Hinc II断片、Pst I断片、及び未切
断DNAを32P−ラベルpSUP301とハイブリダイズし、一
方、Pvu I,Pvu II及びAva I断片を32P−ラベルpGO3293S
とハイブリダイズした。
オートラジオグラムは、pGE1がpSUP301とpG03293S両
者から由来するDNA断片を含有すること、及びpGE1は、
大腸菌ならびにグルコノバクターオキシダンス両株内で
同構造で存在していることを明らかに示した。修飾も欠
失も観察されなかった。
者から由来するDNA断片を含有すること、及びpGE1は、
大腸菌ならびにグルコノバクターオキシダンス両株内で
同構造で存在していることを明らかに示した。修飾も欠
失も観察されなかった。
実施例２ プラスミドpGE1及び他のプラスミドのグルコノバクター
オキシダンスへの接合伝達 プラスミドpGE1を特性づけるために、種々ベクターの
接合伝達効率を比較した。
オキシダンスへの接合伝達 プラスミドpGE1を特性づけるために、種々ベクターの
接合伝達効率を比較した。
５つのプラスミドすなわちRP4、RSF1010、pVK102（AT
CC37158）、pSUP301及びpGE1を、接合伝達系下で大腸菌
からグルコノバクターオキシダンスへ導入した。各々の
プラスミドの最も良い接合伝達頻度を第１表に示す。プ
ラスミドpSUP301は、このプラスミド内にグルコノバク
ター用の複製起点がないため、グルコノバクター内に導
入されなかった。他方、プラスミドpGE1は、プラスミド
RP4、RSF1010、pVK102と同様に10-2から10-1（受容菌当
りの接合伝達体）という高頻度で、グルコノバクターへ
導入された。
CC37158）、pSUP301及びpGE1を、接合伝達系下で大腸菌
からグルコノバクターオキシダンスへ導入した。各々の
プラスミドの最も良い接合伝達頻度を第１表に示す。プ
ラスミドpSUP301は、このプラスミド内にグルコノバク
ター用の複製起点がないため、グルコノバクター内に導
入されなかった。他方、プラスミドpGE1は、プラスミド
RP4、RSF1010、pVK102と同様に10-2から10-1（受容菌当
りの接合伝達体）という高頻度で、グルコノバクターへ
導入された。
実施例３ プラスミドpGE1の細胞増殖と２−KGA生産へ及ぼす影響 新規プラスミドpGE1及びプラスミドRP4、RSF1010なら
びにpVK102を実施例１−Ｃ）に述べた様にしてグルコノ
バクターオキシダンスN44−１へ導入した。得られた接
合伝達体を、抗生物質を含むMB寒天平板から、抗生物質
含有もしくは非含有の5mlのNo.5培地（80g/Ｌ−ソル
ボース、0.5g/グリセロール、15g/酵母エキス、2.5
g/硫酸マグネシウム、15g/炭酸カルシウム）を含む
試験管へ移植した。この試験管を、30℃で５日間振盪培
養機上で培養した。N44−１も又対照として同じ様に抗
生物質非存在下No.5培地で培養した。醗酵液の550nmで
の光学密度（OD550）および２−KGA量を決定することに
より細胞増殖として２−KGA生産の分析を行なった。
びにpVK102を実施例１−Ｃ）に述べた様にしてグルコノ
バクターオキシダンスN44−１へ導入した。得られた接
合伝達体を、抗生物質を含むMB寒天平板から、抗生物質
含有もしくは非含有の5mlのNo.5培地（80g/Ｌ−ソル
ボース、0.5g/グリセロール、15g/酵母エキス、2.5
g/硫酸マグネシウム、15g/炭酸カルシウム）を含む
試験管へ移植した。この試験管を、30℃で５日間振盪培
養機上で培養した。N44−１も又対照として同じ様に抗
生物質非存在下No.5培地で培養した。醗酵液の550nmで
の光学密度（OD550）および２−KGA量を決定することに
より細胞増殖として２−KGA生産の分析を行なった。
第２表に示す様に、プラスミドpGE1は、増殖と２−KG
A生産の維持に対して、試験に供したベクターの中で、
最良のベクターである。反対に、RP4の存在は、細胞増
殖の低下（20％減）及び２−KGA生産の低下（45％減）
を低起こした。さらに、RP4には、他の欠陥が見つかっ
た;RP4がグルコノバクター中で複製した時に、RP4の欠
失が起った。
A生産の維持に対して、試験に供したベクターの中で、
最良のベクターである。反対に、RP4の存在は、細胞増
殖の低下（20％減）及び２−KGA生産の低下（45％減）
を低起こした。さらに、RP4には、他の欠陥が見つかっ
た;RP4がグルコノバクター中で複製した時に、RP4の欠
失が起った。
RSF1010及びpVK102は、増殖には影響をおよぼさなか
ったが、しばしばN44−１の２−KGA生産を標準レベル
の、各々、80％及び90％まで低下させた。
ったが、しばしばN44−１の２−KGA生産を標準レベル
の、各々、80％及び90％まで低下させた。
実施例４ プラスミドpGE1の培養中の安定性 実施例３に記述のN44−１接合伝達体を、Km非存在培
地で培養し、希釈後MB寒天平板に塗沫した。この寒天平
板を30℃で、５日間培養した。プラスミドpGE1保持大腸
菌S17−１株を、Km非存在LB培地で培養し、希釈後LB寒
天平板に塗沫した。この寒天平板を37℃で１日培養し
た。
地で培養し、希釈後MB寒天平板に塗沫した。この寒天平
板を30℃で、５日間培養した。プラスミドpGE1保持大腸
菌S17−１株を、Km非存在LB培地で培養し、希釈後LB寒
天平板に塗沫した。この寒天平板を37℃で１日培養し
た。
生じたコロニーを用いて、次の様にプラスミドの安定
性を決定した： プラスミド安定性は、抗生物質非含有寒天平板上に成
育したコロニー数に対する、抗生物質含有寒天平板上に
成育したコロニー数の比と定義した。
性を決定した： プラスミド安定性は、抗生物質非含有寒天平板上に成
育したコロニー数に対する、抗生物質含有寒天平板上に
成育したコロニー数の比と定義した。
培養の種々の段階で培養液から試験液体を抜きとり、
適当に希釈後、抗生物質非含有寒天平板に塗沫し、37℃
で１日（大腸菌）、もしくは28℃で５日間（グルコノバ
クターオキシダンス）培養した。これらの寒天平板に成
育した100個のコロニーを、抗生物質含有及び非含有寒
天平板に移植し、上述と同様の培養条件で培養後、プラ
スミド安定性を計算するためにコロニー数を計数した。
適当に希釈後、抗生物質非含有寒天平板に塗沫し、37℃
で１日（大腸菌）、もしくは28℃で５日間（グルコノバ
クターオキシダンス）培養した。これらの寒天平板に成
育した100個のコロニーを、抗生物質含有及び非含有寒
天平板に移植し、上述と同様の培養条件で培養後、プラ
スミド安定性を計算するためにコロニー数を計数した。
第３表（ａ）は、RP4は２−KGA高生産株N44−１中で
は極めて不安定であるが、２−KGA非生産株C20（ヨーロ
ッパ特許出願公開番号第213591号に記述の変異処理によ
り、グルコノバクターIFO3293から取得した変異株）中
では安定であることを示す。他のベクターは、両株中で
かなり安定であった。
は極めて不安定であるが、２−KGA非生産株C20（ヨーロ
ッパ特許出願公開番号第213591号に記述の変異処理によ
り、グルコノバクターIFO3293から取得した変異株）中
では安定であることを示す。他のベクターは、両株中で
かなり安定であった。
しかし、我々の以前の実験で、挿入断片を有するRSF1
010はしばしば脱落したり、欠失することが観察されて
いた（データは示していない）、それ故、pGE1とpVK102
を培養中の安定性に関してさらに検討した。
010はしばしば脱落したり、欠失することが観察されて
いた（データは示していない）、それ故、pGE1とpVK102
を培養中の安定性に関してさらに検討した。
プラスミドpVK102、p7A6Δ４（膜結合ソルボソン脱水
素酵素遺伝子を含むpVK102の誘導体；構築法は実施例８
参照）もしくはpGE1を保持するN44−１細胞を50μg/ml
のカナマイシン含有MB液体培地で、試験管内で２日間培
養し、種培養液を調製した。この種培養液1/10mlを試験
管内の5mlのカナマイシン非含有MB培地に移植した。こ
の試験管を試験管培養機上において、30℃で１日培養し
た。この移植及び培養をMB培地において３回繰返した。
素酵素遺伝子を含むpVK102の誘導体；構築法は実施例８
参照）もしくはpGE1を保持するN44−１細胞を50μg/ml
のカナマイシン含有MB液体培地で、試験管内で２日間培
養し、種培養液を調製した。この種培養液1/10mlを試験
管内の5mlのカナマイシン非含有MB培地に移植した。こ
の試験管を試験管培養機上において、30℃で１日培養し
た。この移植及び培養をMB培地において３回繰返した。
２−KGA生産条件下でのプラスミド安定性を試験する
ために、10分の1mlの同じ種培養液を試験管中の5mlのカ
ナマイシン非含有No.5培地にも移植した。移植及び培養
（30℃で２日から３日間）をNo.5培地内で３回繰返し
た。用いたプラスミドの安定性を決定するために、各培
養後、培養液を適当に希釈し、MB寒天平板に塗沫した。
ために、10分の1mlの同じ種培養液を試験管中の5mlのカ
ナマイシン非含有No.5培地にも移植した。移植及び培養
（30℃で２日から３日間）をNo.5培地内で３回繰返し
た。用いたプラスミドの安定性を決定するために、各培
養後、培養液を適当に希釈し、MB寒天平板に塗沫した。
第３表（ｂ）は、プラスミドpGE1が検討した条件下で
極めて安定（100％）であり、一方pVK102とp7A6Δ４は
かなり安定ではあったが、pGE1より不安定（74−100
％）であったことを示している。これらの結果は、２−
KGA醗酵を、種培養が２−３回繰返される実用工程にお
いてもカナマイシン無添加でpGE1保持２−KGA高生産株
により実施可能であることを示している。プラスミドpG
E1は、大腸菌内においても、３回の抗生物質非存在培養
中、非常に安定（100％）であった。
極めて安定（100％）であり、一方pVK102とp7A6Δ４は
かなり安定ではあったが、pGE1より不安定（74−100
％）であったことを示している。これらの結果は、２−
KGA醗酵を、種培養が２−３回繰返される実用工程にお
いてもカナマイシン無添加でpGE1保持２−KGA高生産株
により実施可能であることを示している。プラスミドpG
E1は、大腸菌内においても、３回の抗生物質非存在培養
中、非常に安定（100％）であった。
各プラスミド保持N44−１をMB培地で１日、No.5培地
で２−３日間培養後、培養液の２％を各新鮮培地に移植
した。
で２−３日間培養後、培養液の２％を各新鮮培地に移植
した。
実施例５ プラスミドpGE1とプラスミドpVK102の和合性 一宿主に２−KGA醗酵関連遺伝子を導入するために、
おそらく和合性を有する二つもしくはそれ以上のベクタ
ーを必要とするだろうから、プラスミドpGE1のプラスミ
ドpVK102との和合性を検討した。
おそらく和合性を有する二つもしくはそれ以上のベクタ
ーを必要とするだろうから、プラスミドpGE1のプラスミ
ドpVK102との和合性を検討した。
プラスミドpVK102を、二親間接合伝達により、大腸菌
S17−１からプラスミドpGE1を保持するグルコノバクタ
ーオキシダンスIFO3293へ導入した。接合伝達体は、カ
ナマシンとテトラサイクリンの両耐性を示す細菌という
基準で選択された、Kmr及びTcrの接合伝達体中の、両プ
ラスミドの存在を確証するために両耐性を示す接合伝達
体から調製したプラスミドDNAを用いて、大腸菌S17−１
を形質転換した。形質転換体の中には、期待通り、pGE1
及びpVK102を保持するものが存在した。この発見は、プ
ラスミドpGE1が、グルコノバクター中で、プラスミドpV
K102と和合性を有することを示している。
S17−１からプラスミドpGE1を保持するグルコノバクタ
ーオキシダンスIFO3293へ導入した。接合伝達体は、カ
ナマシンとテトラサイクリンの両耐性を示す細菌という
基準で選択された、Kmr及びTcrの接合伝達体中の、両プ
ラスミドの存在を確証するために両耐性を示す接合伝達
体から調製したプラスミドDNAを用いて、大腸菌S17−１
を形質転換した。形質転換体の中には、期待通り、pGE1
及びpVK102を保持するものが存在した。この発見は、プ
ラスミドpGE1が、グルコノバクター中で、プラスミドpV
K102と和合性を有することを示している。
実施例６ プラスミドpGE1の宿主域 プラスミドpGE1を、実施例1C）に示す二親間接合伝達
により、大腸菌S17−１からグルコノバクター属に属す
る種々の株、すなわち、グルコノバクターオキシダンス
IFO3293、グルコノバクターオキシダンスIFO3462、グル
コノバクターオキシダンスIFO3268、グルコノバクター
オキシダンスIFO3271、グルコノバクターオキシダンスI
FO3287、グルコノバクターオキシダンスIFO3172及びグ
ルコノバクターオキシダンスATCC9937ならびにアセトバ
クターに属する種々の株、すなわち、アセトバクターア
セトーサス（A.acetosus）IFO3129、アセトバクターパ
スチュリアヌス（A.pasteurianus）IFO3170、アセトバ
クターパスチュリアヌスIFO3223及びアセトバクターパ
スチュリアヌスIFO3225へ、接合伝達した。
により、大腸菌S17−１からグルコノバクター属に属す
る種々の株、すなわち、グルコノバクターオキシダンス
IFO3293、グルコノバクターオキシダンスIFO3462、グル
コノバクターオキシダンスIFO3268、グルコノバクター
オキシダンスIFO3271、グルコノバクターオキシダンスI
FO3287、グルコノバクターオキシダンスIFO3172及びグ
ルコノバクターオキシダンスATCC9937ならびにアセトバ
クターに属する種々の株、すなわち、アセトバクターア
セトーサス（A.acetosus）IFO3129、アセトバクターパ
スチュリアヌス（A.pasteurianus）IFO3170、アセトバ
クターパスチュリアヌスIFO3223及びアセトバクターパ
スチュリアヌスIFO3225へ、接合伝達した。
Kmrコロニーを全てのグルコノバクター株及びアセト
バクター株から取得した。次に得られたKmr株のプラス
ミドDNAを、元のプラスミドpGE1とその性状を比較する
ために分析した。
バクター株から取得した。次に得られたKmr株のプラス
ミドDNAを、元のプラスミドpGE1とその性状を比較する
ために分析した。
プラスミドDNAをアガロースゲル電気泳動に供した。
この分析は、全てのプラスミドがプラスミドpGE1と同じ
分子サイズを有していることを示した。このアガロース
ゲル中のDNAバンドをナイロンフィルターに移し、サザ
ンハイブリダイゼーション分析に供した。全DNAバンド
が、32P−ラベルしたプラスミドpGE1 DNAとハイグリダ
イズした。この様に、グルコノバクター及びアセトバク
ター株から取得した全Kmr壁が、プラスミドpGE1を保持
する接合伝達体であることが確証された。
この分析は、全てのプラスミドがプラスミドpGE1と同じ
分子サイズを有していることを示した。このアガロース
ゲル中のDNAバンドをナイロンフィルターに移し、サザ
ンハイブリダイゼーション分析に供した。全DNAバンド
が、32P−ラベルしたプラスミドpGE1 DNAとハイグリダ
イズした。この様に、グルコノバクター及びアセトバク
ター株から取得した全Kmr壁が、プラスミドpGE1を保持
する接合伝達体であることが確証された。
各接合伝達体から単離したプラスミドDNAを、大腸菌C
600株を形質転換するのに用いた。得られたKmrの形質転
換体をLK液体培地で37℃一晩培養した。プラスミドDNA
を各形質転換体から抽出し、Bgl IIで切断後、アガロー
スゲル電気泳動により分析した。調べた全てのプラスミ
ドDNAは、プラスミドpGE1と同等であると確証された。D
NAの欠失や挿入は観察されなかった。結果として、プラ
スミドpGE1は、種々のグルコノバクター及びアセトバク
ター株に対してシャトルベクターとして機能すると言え
る。
600株を形質転換するのに用いた。得られたKmrの形質転
換体をLK液体培地で37℃一晩培養した。プラスミドDNA
を各形質転換体から抽出し、Bgl IIで切断後、アガロー
スゲル電気泳動により分析した。調べた全てのプラスミ
ドDNAは、プラスミドpGE1と同等であると確証された。D
NAの欠失や挿入は観察されなかった。結果として、プラ
スミドpGE1は、種々のグルコノバクター及びアセトバク
ター株に対してシャトルベクターとして機能すると言え
る。
実施例７ グルコノバクター属及びアセトバクター属に属する種々
の株におけるプラスミドpGE1の安定性 実施例６で述べた、カナマイシン（50μg/ml）含有MB
寒天平板上に維持されている全接合伝達体を、試験管内
の50μg/mlのカナマイシンを含有するMB液体培地へ移植
し、２日間培養し、種培養液を調製した。1/10mlの種培
養液を、5mlのカナマイシン非含有MB培地に移植した。
この試験管を、試験管振盪培養機上で、30℃１日培養し
た。この移植及び培養をMB培地内で３回繰返し行なっ
た。実施例４に示される様に、プラスミドpGE1の安定性
を決定するために種培養液、一番目及び三番目の培養液
を適当に希釈し、MB寒天培地上に塗沫した。
の株におけるプラスミドpGE1の安定性 実施例６で述べた、カナマイシン（50μg/ml）含有MB
寒天平板上に維持されている全接合伝達体を、試験管内
の50μg/mlのカナマイシンを含有するMB液体培地へ移植
し、２日間培養し、種培養液を調製した。1/10mlの種培
養液を、5mlのカナマイシン非含有MB培地に移植した。
この試験管を、試験管振盪培養機上で、30℃１日培養し
た。この移植及び培養をMB培地内で３回繰返し行なっ
た。実施例４に示される様に、プラスミドpGE1の安定性
を決定するために種培養液、一番目及び三番目の培養液
を適当に希釈し、MB寒天培地上に塗沫した。
第４表は、プラスミドpGE1は、カナマイシン選択なし
で３回の移植後においても尚グルコノバクターオキシダ
ンスIFO3293、グルコノバクターオキシダンスIFO3268及
びアセトバクターアセトーサスIFO3129中で極めて安定
（100％）であり、グルコノバクターオキシダンスIFO34
62、グルコノバクターオキシダンスIFO3271、グルコノ
バクターオキシダンスIFO3287、グルコノバクターオキ
シダンスIFO3172、グルコノバクターオキシダンスATCC9
937、アセトバクターパスチュリアヌスIFO3170、アセト
バクターパスチュリアヌスIFO3223及びアセトバクター
パスチュリアヌスIFO3225中でかなり安定（68−98％）
であったことを示している。
で３回の移植後においても尚グルコノバクターオキシダ
ンスIFO3293、グルコノバクターオキシダンスIFO3268及
びアセトバクターアセトーサスIFO3129中で極めて安定
（100％）であり、グルコノバクターオキシダンスIFO34
62、グルコノバクターオキシダンスIFO3271、グルコノ
バクターオキシダンスIFO3287、グルコノバクターオキ
シダンスIFO3172、グルコノバクターオキシダンスATCC9
937、アセトバクターパスチュリアヌスIFO3170、アセト
バクターパスチュリアヌスIFO3223及びアセトバクター
パスチュリアヌスIFO3225中でかなり安定（68−98％）
であったことを示している。
実施例８ プラスミドpGE1のクローニングベクターとしての使用 Ａ）膜結合Ｌ−ソルボソン脱水素酵素遺伝子のプラスミ
ドpGE1への組込み クローン化されたアセトバクターリクェファシエンス
IFO12258の膜結合Ｌ−ソルボソン脱水素酵素遺伝子を、
プラスミドpGE1のクローニングベクターとしての有用性
を示すために、プラスミドpGE1中で導入した。
ドpGE1への組込み クローン化されたアセトバクターリクェファシエンス
IFO12258の膜結合Ｌ−ソルボソン脱水素酵素遺伝子を、
プラスミドpGE1のクローニングベクターとしての有用性
を示すために、プラスミドpGE1中で導入した。
膜結合Ｌ−ソルボソン脱水素（SNDH）遺伝子を含むBg
l II断片（5.5kb）をプラスミドp7A6Δ４から単離し、B
gl IIで部分分解したプラスミドpGE1と結合した。得ら
れたDNA混合液を大腸菌S17−１を形質転換するのに用い
た。500個の形質転換体を拾い、LSK（100μg/mlのスト
レプトマイシン及び50μg/mlのカナマイシンを含有する
LB培地）の表面に置いたニトロセルロースフィルター上
に移植し、37℃で一晩培養した。得たフィルターを0.5M
NaOH−1.5M NaCl溶液で５分間処理し、3M酢酸ナトリウ
ム（pH4.8）で５分間中和した。コロニーブロットした
フィルターを、p7A6Δ４から単離し、アセトバクターリ
クェファシエンスIFO12258のDNAのみを含む、1.8kb Sal
I断片を32Pでラベルしたものとのハイブリダイゼーシ
ョンに用いた。15個のポジティブクローンを選択し、そ
のプラスミドをBgl IIもしくはPvu II切断により分析し
た。
l II断片（5.5kb）をプラスミドp7A6Δ４から単離し、B
gl IIで部分分解したプラスミドpGE1と結合した。得ら
れたDNA混合液を大腸菌S17−１を形質転換するのに用い
た。500個の形質転換体を拾い、LSK（100μg/mlのスト
レプトマイシン及び50μg/mlのカナマイシンを含有する
LB培地）の表面に置いたニトロセルロースフィルター上
に移植し、37℃で一晩培養した。得たフィルターを0.5M
NaOH−1.5M NaCl溶液で５分間処理し、3M酢酸ナトリウ
ム（pH4.8）で５分間中和した。コロニーブロットした
フィルターを、p7A6Δ４から単離し、アセトバクターリ
クェファシエンスIFO12258のDNAのみを含む、1.8kb Sal
I断片を32Pでラベルしたものとのハイブリダイゼーシ
ョンに用いた。15個のポジティブクローンを選択し、そ
のプラスミドをBgl IIもしくはPvu II切断により分析し
た。
第２図に示す様に３タイプのサブクローンが得られ、
これらを以後pGE−SNB1,pGE−SNB2及びpGE−SNB3と称す
る。これら全ては、5.5kbのBgl II断片一本を含んでい
た。しかし、それらは、同時に、３本のBgl II断片（9.
8kb,1.7kb及び0.4kb）から成っているプラスミドpGE1の
1.7kb及び／または0.4kbのBgl II断片を失っていた。そ
れ故、プラスミドpGE1は、Bgl II切断により機能するこ
とが可能なベクターとして9.8kbまで短縮することが可
能である。pGE1及びpGE1−SNB2の詳細な切断酵素地図を
第３図に示す。
これらを以後pGE−SNB1,pGE−SNB2及びpGE−SNB3と称す
る。これら全ては、5.5kbのBgl II断片一本を含んでい
た。しかし、それらは、同時に、３本のBgl II断片（9.
8kb,1.7kb及び0.4kb）から成っているプラスミドpGE1の
1.7kb及び／または0.4kbのBgl II断片を失っていた。そ
れ故、プラスミドpGE1は、Bgl II切断により機能するこ
とが可能なベクターとして9.8kbまで短縮することが可
能である。pGE1及びpGE1−SNB2の詳細な切断酵素地図を
第３図に示す。
Ｂ）サブクローンの休止系での２−KGA生産への効果 N44−１に保持されているSNDH遺伝子を含むpGE1誘導
体の２−KGA生産に及ぼす効果をN44−１に保持されてい
るプラスミドpGE1,pVK102,もしくはp7A6Δ４の効果と比
較して検討した。対照株として、効率良い膜結合Ｌ−ソ
ルボソン脱水素を有する二つの天然株、アセトバクター
リクェファシエンス（A.liquefaciens）（ATCC23750）
及びシュードモナスプチダ（P.putida）（ATCC21812;マ
コーバーら、Biotechnol.Bioeng.17,1485−1514［197
5］）を用いた。
体の２−KGA生産に及ぼす効果をN44−１に保持されてい
るプラスミドpGE1,pVK102,もしくはp7A6Δ４の効果と比
較して検討した。対照株として、効率良い膜結合Ｌ−ソ
ルボソン脱水素を有する二つの天然株、アセトバクター
リクェファシエンス（A.liquefaciens）（ATCC23750）
及びシュードモナスプチダ（P.putida）（ATCC21812;マ
コーバーら、Biotechnol.Bioeng.17,1485−1514［197
5］）を用いた。
SNDH遺伝子を含むプラスミドpGE−SNB1,pGE−SNB2及
びpGE−SNB3の３つのサブクローンを、プラスミドpGE1,
pVK102及びp7A6ΔＡと同様、二親間接合伝達により大腸
菌S17−１からグルコノバクターオキシダンスIFO3293へ
導入した。接合伝達体、アセトバクターリクェファシエ
ンス（ATCC23750）及びシュードモナスプチダ（ATCC218
12）をMB中で一晩培養した。次に細胞をOD550＝２に希
釈し、その細胞液4mlから集めた細胞を18g/Ｌ−ソル
ボソン、10g/CaCO3及び3g/NaClを含む反応混液4ml
に再懸濁し、30℃で保温した。第５表は、２、20及び63
時間後の２−KGA生産量を示している。
びpGE−SNB3の３つのサブクローンを、プラスミドpGE1,
pVK102及びp7A6ΔＡと同様、二親間接合伝達により大腸
菌S17−１からグルコノバクターオキシダンスIFO3293へ
導入した。接合伝達体、アセトバクターリクェファシエ
ンス（ATCC23750）及びシュードモナスプチダ（ATCC218
12）をMB中で一晩培養した。次に細胞をOD550＝２に希
釈し、その細胞液4mlから集めた細胞を18g/Ｌ−ソル
ボソン、10g/CaCO3及び3g/NaClを含む反応混液4ml
に再懸濁し、30℃で保温した。第５表は、２、20及び63
時間後の２−KGA生産量を示している。
SNDH遺伝子を含むサブクローンpGE−SNB1,pGE−SNB2
及びpGE−SNB3を保持する接合伝達体の２−KGA生産性
は、アセトバクターリクェファシエンス（ATCC23750）
及びシュードモナスプチダ（ATCC21812）の生産性より
良好であった。さらに、これらのサブクローンによる２
−KGA生産性プラスミドp7A6Δ４の２−KGA生産性とほぼ
同等であった。
及びpGE−SNB3を保持する接合伝達体の２−KGA生産性
は、アセトバクターリクェファシエンス（ATCC23750）
及びシュードモナスプチダ（ATCC21812）の生産性より
良好であった。さらに、これらのサブクローンによる２
−KGA生産性プラスミドp7A6Δ４の２−KGA生産性とほぼ
同等であった。
該サブクローンを、２−KGA高生産株のN44−１に導入
した場合には、それらは、休止系においてＬ−ソルボー
スもしくはＬ−ソルボソンいずれからも第６表に示す様
にN44−１より良好な２−KGA収量を示した。SNDH遺伝子
を含むプラスミドを有する株によるＬ−ソルボソンから
の２−KGAのモル収率は90％であり、一方、ベクタープ
ラスミドのみを有する株によるモル収率は、20％であっ
た。SNDH遺伝子を含む株によるＬ−ソルボースからの２
−KGAへのモル収率は60から70％であり、一方SNDH遺伝
子を含まない株のモル収率は約40％であった。
した場合には、それらは、休止系においてＬ−ソルボー
スもしくはＬ−ソルボソンいずれからも第６表に示す様
にN44−１より良好な２−KGA収量を示した。SNDH遺伝子
を含むプラスミドを有する株によるＬ−ソルボソンから
の２−KGAのモル収率は90％であり、一方、ベクタープ
ラスミドのみを有する株によるモル収率は、20％であっ
た。SNDH遺伝子を含む株によるＬ−ソルボースからの２
−KGAへのモル収率は60から70％であり、一方SNDH遺伝
子を含まない株のモル収率は約40％であった。
実施例９ プラスミドp7A6Δ４の構築 Ａ）大腸菌S17−１中でのコスミド遺伝子ライブラリー
の構築 グルコノバクターオキシダンスIFO12258を200mlのマ
ンニトールブロス（MB）（25g/マンニトール、3g/
バクトペプトン5g/酵母エキス）中で48時間30℃で培
養した。細胞を遠心分離により集菌し、100mlのTris（1
0mM）−EDTA（1mM）緩衝液pH7.5,で洗浄後、50mlのTris
（10mM）−EDTA（20mM）緩衝液pH7.5,に再懸濁した。
の構築 グルコノバクターオキシダンスIFO12258を200mlのマ
ンニトールブロス（MB）（25g/マンニトール、3g/
バクトペプトン5g/酵母エキス）中で48時間30℃で培
養した。細胞を遠心分離により集菌し、100mlのTris（1
0mM）−EDTA（1mM）緩衝液pH7.5,で洗浄後、50mlのTris
（10mM）−EDTA（20mM）緩衝液pH7.5,に再懸濁した。
この様に調製した細胞懸濁液を2mlのリゾチーム溶液
（10mg/ml）で37℃30分間処理した後、プロナーゼ（400
0ユニット）で37℃30分間、次いで10mlの５％SDSで37℃
１時間処理した。この時点で透明溶菌液を得た。DNAを
中性フェノール:4％オクタノール含有クロロホルム（1:
1）の60mlで４℃で30分間ゆっくり回転させて抽出し
た。この混合物を15000rpm（28,000g）で15分間遠心分
離し、得られた上清を60mlのクロロホルム：オクタノー
ル（96:4）で４℃10分間ゆっくり回転させて抽出した。
（10mg/ml）で37℃30分間処理した後、プロナーゼ（400
0ユニット）で37℃30分間、次いで10mlの５％SDSで37℃
１時間処理した。この時点で透明溶菌液を得た。DNAを
中性フェノール:4％オクタノール含有クロロホルム（1:
1）の60mlで４℃で30分間ゆっくり回転させて抽出し
た。この混合物を15000rpm（28,000g）で15分間遠心分
離し、得られた上清を60mlのクロロホルム：オクタノー
ル（96:4）で４℃10分間ゆっくり回転させて抽出した。
15000rpm（28,000g）での15分間の遠心分離により取
得した50mlの上澄に、3Mの酢酸ナトリウム5ml及び冷エ
タノール55mlを添加した。粗精製DNAは、ガラス棒で巻
きとって取得し、次に再びRNase T1及びＡ（37℃、30分
間）及びプロナーゼ（37℃、30分間）で処理した。フェ
ノールとクロロホルム抽出を繰返して、純品染色体DNA
を取得した。
得した50mlの上澄に、3Mの酢酸ナトリウム5ml及び冷エ
タノール55mlを添加した。粗精製DNAは、ガラス棒で巻
きとって取得し、次に再びRNase T1及びＡ（37℃、30分
間）及びプロナーゼ（37℃、30分間）で処理した。フェ
ノールとクロロホルム抽出を繰返して、純品染色体DNA
を取得した。
グルコノバクターオキシダンスIFO12258の該染色体DN
AをSal Iで部分分解した。生じた15kbから30kbの断片を
電気泳動によりアガロースゲルから分離した。プラスミ
ドpVK102（ATCC37158）DNAをSal Iで完全分解し、牛小
腸アルカリフォスファターゼで脱リン酸酸化した。15kb
から35kbのDNA断片と直鎖状pVK102DNAをT4DNAリガーゼ
で連結した。
AをSal Iで部分分解した。生じた15kbから30kbの断片を
電気泳動によりアガロースゲルから分離した。プラスミ
ドpVK102（ATCC37158）DNAをSal Iで完全分解し、牛小
腸アルカリフォスファターゼで脱リン酸酸化した。15kb
から35kbのDNA断片と直鎖状pVK102DNAをT4DNAリガーゼ
で連結した。
連結断片をパッケージングキット（アマシャム社製）
を用いてインビトロパッケージングに用い、生じたファ
ージ粒子を大腸菌ED8767（Murrayら、Mol.Gen.Genet.15
0,53,1977）と保０し、感染させた。この細胞懸濁液を5
0μg/mlのカナマイシンを含有するLB寒天平板に塗沫し
た。
を用いてインビトロパッケージングに用い、生じたファ
ージ粒子を大腸菌ED8767（Murrayら、Mol.Gen.Genet.15
0,53,1977）と保０し、感染させた。この細胞懸濁液を5
0μg/mlのカナマイシンを含有するLB寒天平板に塗沫し
た。
1000個のkmrコロニーを、かきとり、組換えプラスミ
ド混合物を調製するために用いた。このプラスミドDNA
を用い、大腸菌S17−１（Smr,Tra+）を形質転換した。1
400個の形質転換体を拾い上げ、100μg/mlのストレプト
マイシン及び50μg/mlのカナマイシンを含有するLB培地
を含むマイクロタイタープレートへ移植し、一晩培養
し、15％グリセロールを添加し、大腸菌（S17−１）内
でのグルコノバクターオキシダンスIFO12258の遺伝子ラ
イブラリーとして−80℃で保存した。この挿入断片の平
均長は、25kbから30kbであった。
ド混合物を調製するために用いた。このプラスミドDNA
を用い、大腸菌S17−１（Smr,Tra+）を形質転換した。1
400個の形質転換体を拾い上げ、100μg/mlのストレプト
マイシン及び50μg/mlのカナマイシンを含有するLB培地
を含むマイクロタイタープレートへ移植し、一晩培養
し、15％グリセロールを添加し、大腸菌（S17−１）内
でのグルコノバクターオキシダンスIFO12258の遺伝子ラ
イブラリーとして−80℃で保存した。この挿入断片の平
均長は、25kbから30kbであった。
Ｂ）大腸菌S17−１内のコスミド遺伝子ライブラリーの
グルコノバクターオキシダンスOX−４への接合伝達 大腸内グルコノバクターオキシダンスIFO12258コスミ
ド遺伝子ライブラリーを、グルコノバクターオキシダン
スOX−４（ヨーロッパ特許出願公開番号第213591号に記
述の変異処理によりグルコノバクターオキシダンスIFO3
293から取得したＬ−ソルボソン蓄積変異株）へ両株間
での二親間接合伝達により導入した。
グルコノバクターオキシダンスOX−４への接合伝達 大腸内グルコノバクターオキシダンスIFO12258コスミ
ド遺伝子ライブラリーを、グルコノバクターオキシダン
スOX−４（ヨーロッパ特許出願公開番号第213591号に記
述の変異処理によりグルコノバクターオキシダンスIFO3
293から取得したＬ−ソルボソン蓄積変異株）へ両株間
での二親間接合伝達により導入した。
マンニトールブロス内で増殖させた受容菌グルコノバ
クターオキシダンスOX−４の対数増殖期の培養液200μ
を、挿入DNAを有するpVK102保持大腸菌S17−１全ての
対数増殖期培養液100μに別々に混合し、フラクトー
スブロス（50g/フラクトース、5g/酵母エキス、5g/
ポリペプトン）寒天平板表面上のニトロセルロースフ
ィルター上にスポットした。この寒天平板を一晩30℃で
培養した。混合コロニーを、10μg/mlのポリミキシンＢ
及び50μg/mlのカナマイシンを含むMB（MPK）寒天平板
に広げ、４日間30℃で培養した。生じた接合伝達体をMP
K寒天平板に再び広げ純化した。
クターオキシダンスOX−４の対数増殖期の培養液200μ
を、挿入DNAを有するpVK102保持大腸菌S17−１全ての
対数増殖期培養液100μに別々に混合し、フラクトー
スブロス（50g/フラクトース、5g/酵母エキス、5g/
ポリペプトン）寒天平板表面上のニトロセルロースフ
ィルター上にスポットした。この寒天平板を一晩30℃で
培養した。混合コロニーを、10μg/mlのポリミキシンＢ
及び50μg/mlのカナマイシンを含むMB（MPK）寒天平板
に広げ、４日間30℃で培養した。生じた接合伝達体をMP
K寒天平板に再び広げ純化した。
スクリーニングは、ミニ休止系を用いて行なった。約
1400株の挿入DNAを有するpVK102を保持するグルコノバ
クターオキシダンスOX−４を別々に3g/のNaCl、10g/
のCaCO3及び30g/のＬ−ソルボースまたはＬ−ソル
ボリンを含む反応混液50μに懸濁し、30℃で１から５
日間保温した。２−KGA生産の分析は、シリカゲルの薄
層クロマトグラフィーにより行ない、一つのポジティブ
クローン、p7A6を取得した。
1400株の挿入DNAを有するpVK102を保持するグルコノバ
クターオキシダンスOX−４を別々に3g/のNaCl、10g/
のCaCO3及び30g/のＬ−ソルボースまたはＬ−ソル
ボリンを含む反応混液50μに懸濁し、30℃で１から５
日間保温した。２−KGA生産の分析は、シリカゲルの薄
層クロマトグラフィーにより行ない、一つのポジティブ
クローン、p7A6を取得した。
組換えプラスミドp7A6をBirnboimおよびDoly（Nuclei
c Acids Research ７,1513−1523［1979］）のアルカリ
法で調製し、次の制限酵素で切断した： EcoR I,EcoR V,Hae III,Hinc II,Nru I,Sal I,Sau3A,
Xho II,BamH I,Bgl II,Dra I,Hind III及びSma I,EcoR
I,Hinc II,Nru I及びSal Iは、p7A6の挿入DNA（25kb）
を８から11断片に切断した。Hae III,Sau3A及びXho II
では多数の断片が生じた。Sal Iをサブクローニングの
第一段階用に選択した。
c Acids Research ７,1513−1523［1979］）のアルカリ
法で調製し、次の制限酵素で切断した： EcoR I,EcoR V,Hae III,Hinc II,Nru I,Sal I,Sau3A,
Xho II,BamH I,Bgl II,Dra I,Hind III及びSma I,EcoR
I,Hinc II,Nru I及びSal Iは、p7A6の挿入DNA（25kb）
を８から11断片に切断した。Hae III,Sau3A及びXho II
では多数の断片が生じた。Sal Iをサブクローニングの
第一段階用に選択した。
p7A6をSal Iで部分分解し、脱リン酸化したSal I切断
pVK102DNAと結合した。このDNA混合物を形質転換により
大腸菌S17−１へ導入し、次に二親間結合伝達によりグ
ルコノバクターオキシダンスOX−４へ導入した。200ケ
の接合伝達体をミニ休止系でスクリーニングして最小の
サブクローニン,p7A6Δ２を分離し、その挿入断片長は
9.2kbであった（第４図−（ａ））。サブクローニング
第二段階は、p7A6Δ２のE1−E2断片の欠失により行なっ
た。この様にして得たp7A6Δ３（第４図−（ｂ））をさ
らにＥ1/2−Sm3断片の欠失により短縮化した。生じたサ
ブクローン,p7A6Δ４（第４図−（Ｃ））は、ベクターp
VK102内にSm2−Sm3の小欠失の起ったベクターDNAに3.1k
bを有していた。3.1kbのS1−S2−Ｅ1/2（SSE）断片の詳
細な制限酵素地図を第５図に示す。
pVK102DNAと結合した。このDNA混合物を形質転換により
大腸菌S17−１へ導入し、次に二親間結合伝達によりグ
ルコノバクターオキシダンスOX−４へ導入した。200ケ
の接合伝達体をミニ休止系でスクリーニングして最小の
サブクローニン,p7A6Δ２を分離し、その挿入断片長は
9.2kbであった（第４図−（ａ））。サブクローニング
第二段階は、p7A6Δ２のE1−E2断片の欠失により行なっ
た。この様にして得たp7A6Δ３（第４図−（ｂ））をさ
らにＥ1/2−Sm3断片の欠失により短縮化した。生じたサ
ブクローン,p7A6Δ４（第４図−（Ｃ））は、ベクターp
VK102内にSm2−Sm3の小欠失の起ったベクターDNAに3.1k
bを有していた。3.1kbのS1−S2−Ｅ1/2（SSE）断片の詳
細な制限酵素地図を第５図に示す。
第１図は、シャトルベクターpGE1の構築のスキームを示
す図、 第２図は、プラスミドpGE1への膜結合型Ｌ−ソルボソン
脱水素酵素遺伝子の挿入を示す制限酵素地図、 第３図は、プラスミドpGE1およびpGE−SNB2の制限酵素
地図、 第４図は、プラスミドp7A6Δ２、p7A6Δ３およびp7A6Δ
４の制限酵素地図、ならびに 第５図は、プラスミドp7A6Δ４のSSE断片の制限酵素地
図である。
す図、 第２図は、プラスミドpGE1への膜結合型Ｌ−ソルボソン
脱水素酵素遺伝子の挿入を示す制限酵素地図、 第３図は、プラスミドpGE1およびpGE−SNB2の制限酵素
地図、 第４図は、プラスミドp7A6Δ２、p7A6Δ３およびp7A6Δ
４の制限酵素地図、ならびに 第５図は、プラスミドp7A6Δ４のSSE断片の制限酵素地
図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:01） (56)参考文献 特開 昭63−202389（ＪＰ，Ａ) 欧州特許出願公開292303（ＥＰ，Ａ １) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (9)
- 【請求項１】１つ以上のマーカー遺伝子、大腸菌内で機
能できる複製起点、グルコノバクターオキシダンスに由
来する複製起点及びMob部位を有するシャトルベクタ
ー。 - 【請求項２】前記グルコノバクターオキシダンスが、グ
ルコノバクターオキシダンスIFO3293（FERM P−8356）
である請求項１に記載のベクター。 - 【請求項３】１つ以上の挿入断片を有する請求項１また
は２に記載のベクター。 - 【請求項４】前記挿入断片が、マルチクローニング部位
を有するDNA配列、発現制御配列、cos部位、ターミネー
ター配列、リボソーム結合部位、シグナルペプチド及び
／又は蛋白質をコードするDNA配列からなる群より選択
される請求項３に記載のベクター。 - 【請求項５】pGE1である請求項１ないし３項の何れか１
項に記載のベクター。 - 【請求項６】請求項１ないし５に記載のベクターが導入
されたグルコノバクター属又はアセトバクター属の接合
伝達体。 - 【請求項７】グルコノバクター属又はアセトバクター属
に属する菌株を、接合伝達条件下において、請求項１な
いし５項のいずれかに定義されたベクターで形質転換さ
れた大腸菌の菌株と接触させることを特徴とする請求項
６に記載の接合伝達体の製造方法。 - 【請求項８】（ａ）マーカー遺伝子を含むDNAを調製
し； （ｂ）大腸菌内で機能できる複製起点を含むDNAを調製
し； （ｃ）グルコノバクターオキシダンスに由来する複製起
点を含むDNAを調製し； （ｄ）Mob部位を含むDNAを調製し；及び （ｅ）（ａ）から（ｄ）に記載のDNAを適当な制限酵素
により消化し、連結させることにより結合させる ことを特徴とする請求項１ないし５に記載のシャトルベ
クターの製造方法。 - 【請求項９】グルコノバクター属又はアセトバクター属
に属する菌株に、発現制御配列に作用的に連結された前
記ポリペプチドをコードするDNA配列を含む請求項１な
いし５に記載のシャトルベクターを接合伝達法により導
入し、該接合伝達体を適当な生育条件下にて培養し、該
培養液より所望のポリペプチドを単離することを特徴と
する原核性又は真核性ポリペプチドの製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP89101771.7 | 1989-02-02 | ||
| EP89101771 | 1989-02-02 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02268686A JPH02268686A (ja) | 1990-11-02 |
| JP3121337B2 true JP3121337B2 (ja) | 2000-12-25 |
Family
ID=8200932
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02020526A Expired - Fee Related JP3121337B2 (ja) | 1989-02-02 | 1990-02-01 | シャトルベクター |
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|---|---|
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| JP (1) | JP3121337B2 (ja) |
| AT (1) | ATE115186T1 (ja) |
| DE (1) | DE69014657T2 (ja) |
| DK (1) | DK0381027T3 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7828687B2 (en) | 2006-10-25 | 2010-11-09 | Remy Technologies, L.L.C. | Modular planetary gear assembly and drive |
| CN101705982B (zh) * | 2009-10-08 | 2011-11-09 | 陈广强 | 延伸转臂行星传动 |
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|---|---|---|---|---|
| WO1994020626A1 (en) * | 1993-03-08 | 1994-09-15 | Bio-Polymer Research Co., Ltd. | Acetobacter, plasmid originating therein, and shuttle vector constructed from said plasmid |
| US5834231A (en) | 1996-10-24 | 1998-11-10 | Archer Daniels Midland Co. | Bacterial strains and use thereof in fermentation process for 2-keto-L-gulonic acid production |
| EP1024194A4 (en) * | 1997-10-16 | 2002-10-16 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Plasmid vectors. |
| JP2000050869A (ja) * | 1998-08-11 | 2000-02-22 | Ajinomoto Co Inc | グルコノバクター属細菌由来プラスミド及びベクター |
| DE19963126A1 (de) * | 1999-12-24 | 2001-07-12 | Suedzucker Ag | Verfahren zur Herstellung von 6-O-alpha-D-Glucopyranosyl-D-sorbit |
| US7033824B2 (en) | 2000-04-05 | 2006-04-25 | Archer-Daniels-Midland Company | Ketogulonigenium shuttle vectors |
| AU2001251342A1 (en) | 2000-04-05 | 2001-10-23 | Archer-Daniels-Midland Company | Ketogulonigenium endogenous plasmids |
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|---|---|---|---|---|
| JPS5526960A (en) * | 1978-08-18 | 1980-02-26 | Toray Industries | Method of providing physiological action of organism body with stimulus |
| JPS584494Y2 (ja) * | 1980-12-15 | 1983-01-26 | 和光電研株式会社 | 治療具 |
| JPS58216067A (ja) * | 1982-06-09 | 1983-12-15 | 杉山 紀行 | 貼付治療器 |
| JPS607835U (ja) * | 1983-06-24 | 1985-01-19 | 永尾 彰 | 電気刺激装置 |
| US4680264A (en) * | 1983-07-01 | 1987-07-14 | Lubrizol Genetics, Inc. | Class II mobilizable gram-negative plasmid |
| US5008193A (en) * | 1984-06-14 | 1991-04-16 | Genentech, Inc. | Ascorbic acid intermediates and process enzymes |
| US5082785A (en) | 1987-01-30 | 1992-01-21 | Hoffmann-La Roche Inc. | Biosynthesis of 2 keto-l-gulonic acid |
| US5352599A (en) * | 1988-01-14 | 1994-10-04 | Hoffmann-La Roche Inc. | Co-enzyme-independent L-sorbosone dehydrogenase of gluconobacter oxydans: isolation, characterization, and cloning and autologus expression of the gene |
-
1990
- 1990-01-24 EP EP90101371A patent/EP0381027B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-01-24 AT AT90101371T patent/ATE115186T1/de active
- 1990-01-24 DE DE69014657T patent/DE69014657T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-01-24 DK DK90101371.4T patent/DK0381027T3/da active
- 1990-02-01 JP JP02020526A patent/JP3121337B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7828687B2 (en) | 2006-10-25 | 2010-11-09 | Remy Technologies, L.L.C. | Modular planetary gear assembly and drive |
| CN101705982B (zh) * | 2009-10-08 | 2011-11-09 | 陈广强 | 延伸转臂行星传动 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69014657D1 (de) | 1995-01-19 |
| DE69014657T2 (de) | 1995-05-11 |
| ATE115186T1 (de) | 1994-12-15 |
| EP0381027B1 (en) | 1994-12-07 |
| DK0381027T3 (da) | 1995-04-10 |
| JPH02268686A (ja) | 1990-11-02 |
| EP0381027A1 (en) | 1990-08-08 |
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