DE69014657T2

DE69014657T2 - Pendelvektoren, verwendbar für die Mikroorganismen, die zu den Escherichia coli, Gluconobacter und Acetobacter gehören.

Info

Publication number: DE69014657T2
Application number: DE69014657T
Authority: DE
Inventors: Akiko Parkcity Mizono Fujiwara; Tatsuo Hoshino; Masako Shinjoh
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 1989-02-02
Filing date: 1990-01-24
Publication date: 1995-05-11
Anticipated expiration: 2010-01-25
Also published as: EP0381027B1; DE69014657D1; ATE115186T1; DK0381027T3; JPH02268686A; EP0381027A1; JP3121337B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue rekombinante DNS Pendelvektoren, die sich als Pendelvektoren zwischen Mikroorganismen gehörend zu Escherichia coli, dem Genus Gluconobacter und dem Genus Acetobacter eignen. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Transkonjuganten des Genus Gluconobacter oder des Genus Acetobacter, die die Pendelvektor DNS oder ihre Derivate beherbergen. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Transkonjuganten des Genus Gluconobacter oder des Genus Acetobacter, die die Pendelvektor DNS beherbergen.
Von einigen Systemen der Genübertragung in Gluconobacter oxydans wurde in früheren Veröffentlichungen berichtet. Murooka et al. [J. Bacteriol. 145, 358-368 (1981)] berichtete von konjugaler Paarung von einem Stamm von Gluconobacter oxydans mit einem Stamm von Escherichia coli, der RP4::Mu beherbergt. Die Frequenz des Auftretens einer Transkonjuganten war 10&supmin;¹&sup0;/Empfänger. Fukaya et al. [Agric. Biol. Chem. 49, 2407-2411 (1985)] berichtete von einer Transformation von Gluconobacter oxydans mit einem rekombinanten Plasmid, das aus einem endogenen Plasmid von Gluconobacter oxydans und einem Plasmid von Escherichia coli hergestellt wurde. Die Transformationsfrequenz war sehr niedrig (etwa 10² Transformanten/ug DNS; mit anderen Worten etwa 10&supmin;&sup9; Transformanten/Empfänger). Somit sind diese Systeme nicht befriedigend effizient für eine Genübertragung in Gluconobacter oxydans.
Gewöhnlich muss man tausende von Transkonjuganten oder Transformanten in einem Experiment für die praktische Verwendung, beispielsweise zur Herstellung einer genomischen Bibliothek, erhalten.
Die Europäische Patentanmeldung mit der Publikationsnummer 276 832 (EP 276 832) offenbart bereits ein Plasmid mit zwei Markergenen, einer Mob-Stelle und einem Replikationsursprung, der in E. coli und Gluconobacter oxydans funktionsfähig ist.
In Uebereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung werden neue und sehr nützliche Pendelvektoren durch Kombinieren von Markergenen mit unterschiedlichen Replikationsursprüngen, einem in Escherichia coli funktionsfähigen und einem in Gluconobacter oxydans funktionsfähigen und einer Mob-Stelle erhalten. Solche Vektoren zeigen eine höhere Expressionsrate und Stabilität des Plasmids in der Wirtszelle als die in EP 276 832 offenbarten Plasmide.
Somit betrifft ein Aspekt der vorliegenden Erfindung neue rekombinante DNS Vektoren, die zwei verschiedene Replikationsurspünge, einer in Escherichia coli funktionsfähig und einer in Gluconobacter oxydans funktionsfähig, eine oder mehrere Markergene und eine Mob-Stelle umfassen.
Der DNS Vektor kann weiter ein oder mehrere Einfügungen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus DNS Sequenzen mit Vielfachklonierungsstellen, Expressionskontrollsequenzen, Cos-Stellen, Terminatorsequenzen, ribosomalen Bindungsstellen und DNS Sequenzen, die für Signalpeptide und/oder Proteine kodieren, enthalten. Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Transkonjuganten des Genus Gluconobacter oxydans oder des Genus Acetobacter, in die besagten Vektoren eingeführt wurden. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung besagter Transkonjuganten, der das Inkontaktbringen eines Stammes des Genus Gluconobacter oder des Genus Acetobacter mit einem mit besagtem Vektor transformierten Stamm Escherichia coli unter konjugalen Paarungsbedingungen umfasst.
Die Pendelvektoren der vorliegenden Erfindung können zwischen jeden Stämmen gehörend zu Escherichia coli, dem Genus Gluconobacter und dem Genus Acetobacter übertragen werden und sind in jedem dieser Stämme replizierbar.
Geeignete Escherichia coli Wirte für die Pendelvektoren der vorliegenden Erfindung sind jede Stämme von Escherichia coli, die in der rekombinanten DNS Technologie verwendet werden, beispielsweise E. coli K-12, E. coli C600, E. coli HB101, E. coli ED8767 oder E. coli S17-1. Geeignete Gluconobacter Wirte für die Pendelvektoren der vorliegenden Erfindung sind jede Stämme, die zum Genus Gluconobacter gehören. Gemäss der neuesten Klassifizierung gehören alle Stämme des Genus Gluconobacter zu der Spezies Gluconobacter oxydans [Bergy's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. I, 275-278 (1984); F. Gosselé et al., International J. System. Bacteriol. 33, 65-81 (1983)]. Geeignete Acetobacter Wirte für die Pendelvektoren der vorliegenden Erfindung sind jede Stämme, die zum Genus Acetobacter gehören. Bevorzugte Stämme des Genus Acetobacter sind Acetobacter aceti, Acetobacter liquefaciens und Acetobacter pasteurianus.
Vektoren der vorliegenden Erfindung, die eine Einfügungs-DNS enthalten, können stabil in den obengenannten Mikroorganismen, speziell in Gluconobacter Stämmen, selbst ohne Selektionsdruck mit Antibiotika und ähnlichem, für einen einfachen und wirtschaftlichen industriellen Prozess gehalten werden.
Es ist auch sehr nützlich, dass die Vektoren der vorliegenden Erfindung, die einen Ursprung funktionell in Escherichia coli und einen Ursprung funktionell in Gluconobacter oxydans enthalten, auch in Escherichia coli wie auch Gluconobacter und Acetobacter Stämmen fünktionsfähig sind. Escherichia coli ist bekannt als effizienter Wirt zur Vervielfachung von Vektor DNS und Manipulation von rekombinanter DNS durch einfache und schnelle Methoden. Andererseits kann Gluconobacter als Wirt zur Expression von Gluconobacter Genen verwendet werden. Da die Vektoren der vorliegenden Erfindung solche funktionsfähigen Konstrukte sind, ermöglichen sie die Klonierung von bestimmten Genen von Gluconobacter oder Acetobacter in Escherichia coli und anschliessend die wirksame Expression in Gluconobacter oder Acetobacter. Weiterhin ist es von Vorteil, dass solche funktionsfähigen Konstrukte auch eine DNS Region enthalten, die für den konjugalen Transfer (Mob-Stelle) nötig ist. Somit können die Vektoren der vorliegenden Erfindung zuerst in Escherichia coli zusammengefügt werden und anschliessend direkt in Gluconobacter oder Acetobacter durch konjugale Paarung ohne Isolierung der Plasmid DNS von Escherichia coli eingeführt werden.
Geeignete Markergene für die Pendelvektoren der vorliegenden Erfindung sind alle Antibiotikaresistenzgene, die in Escherichia coli, Gluconobacter oder Acetobacter exprimiert werden wie Kanamycinresistenz (Kmr), Streptomycinresistenz (Smr), Ampicillinresistenz (Apr) und Tetracyclinresistenz (Tcr).
Diese Antibiotikaresistenzgene können von natürlichen Quellen oder künstlich konstruierten Plasmiden, Transposons, chromosomaler DNS und synthetischer DNS isoliert werden. Spezielle Quellen für die Antibiotikaresistenzgene beinhalten, aber ohne darauf beschränkt zu sein, das Plasmid RP4 [Datta et al., J. Bacterial. 108, 1244-1249 (1971); NRRL B- 18147], RK2 (ATCC 37125), RSF1010 [Nagahari and Sakaguchi, J. Bacteriol. 133, 1527-1529 (1978); NRRL B-18146], pACYC177 (ATCC 37031), Transposons Tn3 [Berg et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 72, 3628-3632 (1975)], Tn10 [Foster et al., J. Bacteriol. 124, 1153-1158 (1975)] und ihre Derivate. Als Markergene können auch pigmentproduzierende Gene (beispielsweise das Mel Gen auf pIJ702) verwendet werden.
Geeignete Replikationsursprünge für die Pendelvektoren der vorliegenden Erfindung, die in Escherichia coli funktionsfähig sind, sind beispielsweise DNS Fragmente, die einen Replikationsursprung von Escherichia coli enthalten oder jedes Plasmid oder Phage, die autonom in Escherichia coli replizieren können. Solche Replikationsursprünge können beispielsweise von den Plasmiden RP4, RSF1010, pBR322, pACYC177, pACYC184, pSC101, λ Phagen (beispielsweise Phage λ), P1 Phagen (beispielsweise P1) oder T-Coliphagen (beispielsweise Coliphagen T4) isoliert werden.
Geeignete Replikationsursprünge für die Pendelvektoren der vorliegenden Erfindung, die in Gluconobacter und Acetobacter funktionell sind, sind beispielsweise DNS Fragmente, die einen Replikationsursprung von Gluconobacter oxydans enthalten oder jedes endogene Plasmid oder Phage, der autonom in Gluconobacter oxydans replizieren kann. Solche Replikationsursprünge können, beispielsweise von Gluconobacter oxydans IFO 3293 (FERM P-8356), dem endogenen Plasmid von Gluconobacter oxydans IFO 3293 oder von der endogenen Gluconobacter oxydans Phagen DNS [Schocher et al., Arch Microbiol. 121, 193-197 (1979)] isoliert werden.
Man glaubt, dass die Mob-Stelle den Ursprung des Transfers (ori T) beinhaltet und als Erkennungsstelle für bestimmte transaktive Plasmidtransferfunktionen fungiert [R. Simon et al., Bio/Technology 1, 784- 791 (1983)]. Die Mob-Stelle kann von konjugativen Plasmiden, wie beispielsweise den Plasmiden RK2, PR4, RSF1010 oder ihren Derivaten, erhalten werden. Das die Mob-Stelle enthaltende Plasmid kann von seinem ursprünglichen Wirt zu einem anderen Wirt durch die Hilfe der Tra Genfunktion mittels bi-parentaler Konjugationspaarung oder tri-parentaler Konjugationspaarung übertragen werden. Die Tra Gene sind gut bekannt als Transfergene der Breiten-Wirtsbereichs-Incp-Typ Plasmide, wie die Plasmide RP4 und RK2. Bei der bi-parentalen konjugalen Paarung werden Tra Gen enthaltende Stämme, wie beispielsweise E. coli S17-1 (R. Simon et al., s. oben), die die Mob-Stelle enthaltende Plasmide beherbergen, mit einem Empfängerstamm gemischt. Bei der tri-parentalen konjugalen Paarung wird ein Donorstamm, der die Mob-Stelle enthaltende Plasmide beherbergt, mit einem Stamm, der die Tra Gene enthaltende Plasmide beherbergt, wie beispielsweise RP4 und RK2, mit einem Empfängerstamm gemischt.
Die Pendelvektoren der vorliegenden Erfindung können auch ein oder mehrere Einfügungen, beispielsweise DNS Sequenzen mit Vielfachklonierungsstellen, Expressionskontrollsequenzen, Cos-Stellen, Terminatorsequenzen, ribosomale Bindungsstelle und DNS Sequenzen, die für Signalpeptide und/oder Proteine kodieren, umfassen, um weitere wünschenswerte Funktionen dem Pendelvektor beizufügen.
Mehr im Detail können die Pendelvektoren der vorliegenden Erfindung DNS Sequenzen umfassen, die ein oder mehrere Vielfachklonierungsstellen [Messing et al., Methods in Enzymology, 101, 20 (1983)], die von einer Vielzahl von Plasmiden und Phagen wie beispielsweise pUC18 (Boehringer Mannheim) oder M13mp8 (Boehringer Mannheim) oder von synthetischen DNS Sequenzen stammen, zur bequemen Klonierung enthalten. Weiterhin können die Pendelvektoren eine grosse Vielfalt von Expressionskontrollsequenzen, wie beispielsweise das lac, trp, tac oder β-lactamase Expressionskontrollsystem, Kontrollsequenzen, die von Phagenstämmen, die beispielsweise aus dem Textbuch von Maniatis et al. [Molecular cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (1982)] bekannt sind, oder Expressionskontrollsequenzen, die von Gluconobacterstämmen stammen, enthalten. Zusätzlich können die Pendelvektoren Cos-Stellen für die in vitro Verpackung enthalten. Weiterhin können sie Terminatorsequenzen zur effektiven Termination, natürliche oder synthetische ribosomale Bindungsstellen zur effektiven Translation, DNS Sequenzen, die Signalpeptide kodieren zur effizienten Lokalisierung des/der klonierten Proteins/Proteine und strukturelle Gene von Markerproteinen enthalten, die alle zur Konstruktion der effizienten Gluconobacter und Acetobacter Wirtsvektorsysteme der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Kurz gefasst, die Pendelvektoren der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung von wie in der vorliegenden Beschreibung beschriebenen Material und durch Verwendung wie von Maniatis et al. beschriebener rekombinanter DNS Techniken (s.oben) durch die folgenden Schritte erhalten werden:
(1) Herstellen von einer DNS, die Markergene enthält.
(2) Herstellen von einer DNS, die einen in E. coli funktionsfähigen Replikationsursprung enthält.
(3) Herstellen von DNS, die einen in Gluconobacter funktionsfähigen Replikationsursprung enthält.
(4) Herstellen von DNS, die eine Mob-Stelle enthält.
(5) Zusammenfügen der in (1) bis (4) beschriebenen DNS durch Verdauen dieser besagten DNS mit geeigneten Restriktionsenzymen und Verbindung derselben, um die rekombinanten Pendelvektoren der vorliegenden Erfindung zu erhalten.
Durch diese Schritte können die Pendelvektoren enthaltend Markergene, zwei verschiedene Replikationsursprünge, einer in Escherichia coli funktionsfähig und einer in Gluconobacter funktionsfähig, und eine funktionelle Mob-Stelle konstruiert werden.
Die Pendelvektoren der vorliegenden Erfindung können von Escherichia coli auf Gluconobacter oder Acetobacter mit einer sehr hohen Frequenz (etwa 10&supmin;² bis 10&supmin;¹ Transkonjugante pro Empfänger) durch konjugale Paarung ohne die Isolation und Reinigung der Vektor DNS transferiert werden. Mit diesen Vektoren kann eine in Escherichia coli konstruierte genomische Bank (10³-10&sup5; Klone) in einem Experiment auf Gluconobacter oder Acetobacter übertragen werden. Somit sind die Pendelvektoren der vorliegenden Erfindung hocheffizient bezüglich der Einfachheit eines Klonierungsexperiments.
Die vorteilhafteste Eigenschaft der Pendelvektoren der vorliegenden Erfindung ist ihre Stabilität in Escherichia coli, Gluconobacter und Acetobacterstämmen selbst in Abwesenheit von Selektionsdruck. Weiterhin beeinträchtigen die Vektoren weder das Wachstum der Wirtszellen noch die Bildung des Fermentationsproduktes.
Zusammenfassend, die Pendelvektoren der vorliegenden Erfindung können in industriellen Prozessen als Vektoren zur Genklonierung und für die Herstellung von gewünschten pro- und eukaryotischen Polypeptiden verwendet werden. Die gewünschten pro- und eukaryotischen Polypeptide können durch Einfügen durch Transkonjugation in einen Stamm des Genus Gluconobacter oder des Genus Acetobacter eines Pendelvektors der vorliegenden Erfindung der die DNS Sequenz kodierend für besagtes Polypeptid in wirksamer Verbindung, mit einer Expressionskontrollsequenz enthält, Kultivierung der Transkonjuganten unter geeigneten Wachstumsbedingungen und Isolierung des gewünschten Polypeptides aus der Kultur, erhalten werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 veranschaulicht die Konstruktion des Pendelvektors pGE1.
Figur 2 veranschaulicht die Einfügung des Membrangebundenen-L- Sorboson Dehydogenasegens in das Plasmid pGE1.
Figur 3 stellt die Restriktionskarte der Plasmide pGE1 und pGE-SNB2 dar.
Figur 4 veranschaulicht die Restriktionskarten der Plasmide p7A6Δ2, p7A6Δ3 und p7A6Δ4.
Figur 5 veranschaulicht die Restriktionskarte des SSE Fragments des Plasmids p7A6Δ4.

Beispiel 1

Herstellung des Pendelvektors pGE1

Gluconobacter oxydans (G. oxydans) IFO 3293 enthält zwei Sorten von kriptischen Plasmiden, die ohne Selektionsdruck stabil in der Zelle gehalten werden. Das kleinere Plasmid mit der Bezeichnung pGO3293S ist ein relaxed Typ Plasmid (die Kopienzahl ist grösser als 10) und sein Molekulargewicht ist 9.9 kb. Das grössere Plasmid mit der Beizeichung pGO3293L ist ein stringent Typ Plasmid (die Kopienzahl ist 1 oder 2) und sein Molekulargewicht ist etwa 60kb. In Anbetracht der geeigneten Kopienzahl und DNS Grösse der besagten Vektoren wurde pGO3293S als Quelle für den in G. oxydans funktionsfähigen Replikationsursprung ausgewählt.
Das Plasmid pSUP301 wurde als Quelle für den in Escherichia coli (E. coli) funktionsfähigen Replikationsursprung, die Antibiotikaresistenzgene (Kmr Gen und Apr Gen) und die Mob-Stelle gewählt. Plasmid pSUP301 wurde durch Verbinden von pACY177 mit der Mob-Stelle, die von RK2 (R. Simon et al., s. oben) stammt, hergestellt. Deshalb können Plasmide pACYC177 und RK2 oder ähnliche anstelle des Plasmids pSUP301 verwendet werden.

A) Herstellung der Plasmide pGO3293S und pSUP301

Das Plasmid pSUP301 wurde aus E. coli Zellen, die das Plasmid pSUP301 beherbergen, durch die alkalische Methode erhalten [HC. Birnboim und J. Doly, Nucleic Acids Research 7, 1513-1523 (1979)].
Das Plasmid pGO3293S wurde aus G. oxydans IFO 3293 Zellen durch die alkalische Methode wie im Folgenden beschrieben erhalten:
G. oxydans Zellen wurden in einem Teströhrchen, das 5 ml Mannitolbrühe (MB) Medium enthaltend 25 g/l Mannitol, 5 g/l Hefeextrakt (Difco) und 3 g/l Bactopeptone (Difco) enthält, 24 Stunden bei 30ºC kultiviert. Dann wurden 4 ml der Kulturbrühe in einen 500 ml Erlenmeyerkolben, der 50 ml frisches MB Medium enthält, übertragen. Der Kolben wurde bei 30ºC 15 Stunden auf einem Rotationsschüttler, der bei 180 rpm arbeitet, inkubiert. Die erhaltene Brühe wurde bei 5000 rpm (3000 g) 15 Minuten zentrifugiert. Die Zellen wurden in 10 ml der Lösung I (25 mM Tris-HCl, pH 7.9, enthaltend 2 mg/ml Lysozyme, 5 mM Glucose, 10 mM EDTA) suspendiert. Die Zellsuspension wurde 30 Minuten auf Eis gehalten. Dann wurden 20 ml der Lösung II (18 mM NaOH enthaltend 1 % SDS) zugegeben. Die Lösung wurde 10 Minuten auf Eis gehalten und 15 ml 3M Natrium Acetat pH 4.8 wurden zugegeben. Die erhaltene Lösung wurde 60 Minuten auf Eis gehalten und bei 13000 rpm (21000 g) 10 Minuten zentrifugiert. 40 ml Isopropanol wurden zum Ueberstand (40 ml) zugegeben. Die Mischung wurde 60 Minuten auf Eis gehalten und bei 15000 rpm (28000 g) 15 Minuten zentrifugiert. Der Niederschlag wurde getrocknet und in 2 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Die Plasmid DNS wurde weiter durch Ethanolfällung gereinigt, um die endgültige Plasmid DNS Lösung zu erhalten.

B) Konstruktion von einem zusammengesetzten Plasmid unter Verwendung der Plasmide pGO3293S und pSUP301

150 ng von pSUP301 DNS und 200 ng von pGO3293S DNS wurden vollständig mit HincII verdaut und mit T4 DNS Ligase ligiert. Die erhaltene Ligationsmischung wurde zur Transformation von E. coli S17-1 verwendet.
Kmr Transformanten wurden zuerst auf LK [Luriabrühe enthaltend 50 ug/ml Kanamycin; Luriabrühe (LB): 10 g/l Bactotryptone, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl] Agarplatten selektiert. Dann wurden ApsKmr Klone, d.h. Transformanten, die ein Plasmid mit einer Einfügung im Apr Gen enthalten, durch LK Agarplatten und LA Agarplatten (LB Medium enthaltend 50 ug/ml Ampicillin) selektiert.

C) Transfer von zusammengesetzten Plasmiden von E. coli auf G. oxydans durch bi-parentale Konjugation

Eine Mischung von zusammengesetzten Plasmiden erhalten von allen Kmr, Aps Transformanten wurden auf G. oxydans N44-1 (ein 2-KGA hochproduzierender Mutantenstamm erhalten von G. oxydans IFO 3293 durch wie in der Europäischen Patentanmeldung Publikationsnummer 213 591 beschrieben Mutagenese erhalten) durch bi-parentale konjugale Paarung übertragen. Bi-parentale konjugale Paarung wurde wie folgt ausgeführt:
Zweihundert ul einer in der logarithmischen Phase befindlichen in MB Medium gewachsenen Kultur des Empfängers G. oxydans N44-1 wurden mit 100 ul einer in der logarithmischen Phase befindlichen Kultur aller in LB Medium enthaltend 5 ug/ml Kanamycin und 10 ug/ml Streptomycin gewachsenen Kmr Transformanten gemischt und auf Nitrocellulosefilter auf der Oberfläche von FB Agarplatten (50 g/l Fructuose, 10 g/l Hefeextrakt, 10 g/l Polypeptone) ausgetupft. Die Platten wurden über Nacht bei 30ºC inkubiert. Die gemischten Kolonien wurden auf MB enthaltend 10 ug/ml Polymyxin B und 50 ug/ml Kanamycin (MPK) Agarplatten und MB enthaltend 10 ug/ml Polymyxin B (MP) Agarplatten nach geeigneter Verdünnung ausplatiert und für 4 Tage bei 30ºC inkubiert.
Die Frequenz der Konjugation wurde als Verhältnis der Anzahl der Kolonien auf den MPK Agarplatten zur Anzahl der Kolonien auf den MP Agarplatten berechnet.
Die Frequenz dieses Experiments war 0.06-0.1% (Tanskonjugante pro Empfänger). Die Plasmid DNS wurden von fünf Transkonjuganten durch mini-alkalische Methode präpariert und durch Agarosegelelektrophorese analysiert. Folgerichtig hatten alle getesteten Plasmide die gleiche Struktur. Ein Plasmid wurde als pGE1 bezeichnet.

D) Charakterisierung des neu isolierten Plasmids pGE1

Das aus Zellen von G. oxydans N44-1, die pGE1 beherbergen, hergestellte pGE1 wurde in den E. coli Stamm C600 durch Transformation eingeführt, um zu Bestätigen, dass es ein Pendelvektor zwischen G. oxydans und E. coli ist oder nicht. E. coli Stamm C600 wurde mit dem Plasmid pGE1 mit einer Frequenz von 10&sup6; Transformanten pro ug DNS transformiert. Dies zeigt, dass pGE1 als Pendelvektor zwischen E. coli und G. oxydans arbeitet. Die schematische Darstellung einer Konstruktion von pGE1 ist in Figur 1 gezeigt.
pGE1 DNS hergestellt aus Zellen von G. oxydans N44-1, die das Plasmid pGE1 beherbergen, und E. coli S17-1 wurden mit AvaI, HincII, PstI, PvuI oder PvuII verdaut und durch Agarosegelelektrophorese analysiert. Die DNS Fragmente wurden auf Nitrozellulosefilter Sourthern-transferiert. Die HincII-Fragmente, PstI-Fragmente und nicht verdaute DNS wurden mit ³²P-markiertem pSUP301 hybridisiert, während die PvuI-, PvuII- und AvaI- Fragmente mit ³²P-markiertem pGO3293S hybridisiert wurden.
Die Autoradiogramme zeigten klar, dass pGE1 die von pSUP301 und pGO3293S stammenden DNS Fragmente beide enthält und dass pGE1 in der selben Struktur in E. coli und G. oxydans existiert. Weder Modifikationen noch Deletionen wurden bemerkt.

Beispiel 2

Konjugaler Transfer des Plasmids pGE1 und anderer Plasmide in G. oxydans

Die Effizienzen von konjugalem Transfer verschiedener Vektoren wurde verglichen, um das Plasmid pGE1 zu charakterisieren.
Fünf Plasmide, RP4, RSF1010, pVK102 (ATCC 37158), pSUP301 und pGE1, wurden aus E. coli auf G. oxydans N44-1 mittels des konjugalen Transferssystems übertragen. Die beste Frequenz konjugalen Transfers jeden Plasmids ist in Tabelle 1 gezeigt. Plasmid pSUP301 konnte nicht in Gluconobacter eingeführt werden, weil der Replikationsursprung für Gluconobacter in diesem Plasmid abwesend ist. Andererseits wurden das Plasmid pGE1 wie auch die Plasmide RP4, RSF1010, pVK102 in Gluconobacter mit einer hohen Frequenz von 10&supmin;² bis 10&supmin;¹ (Transkonjugante pro Empfänger) transferiert. Tabelle 1 Frequenz des konjugalen Transfers Vektor Molekulargewicht (kb) Frequenz (%) (Tanskonjuganten/Empfänger)

Beispiel 3

Wirkung des Plasmids pGE1 auf das Zellwachstum und 2-KGA Produktion

Das neue Plasmid pGE1 und die Plasmide RP4, RSF1010 und pVK102 wurden in G. oxydans N44-1 wie in Beispiel 1-(C) beschrieben eingeführt. Die Transkonjuganten wurden von MB Antibiotika enthaltenden Agarplatten auf Teströhrchen, die 5 ml des Nr. 5 Mediums (80 g/l L-Sorbose, 0.5 g/l Glycerol, 15 g/l Hefeextrakt, 2.5 g/l MgSO&sub4; 7H&sub2;0, 15 g/l CaCO&sub3;) mit oder ohne Antibiotika enthalten, übertragen. Die Teströhrchen wurden auf einem Schüttler bei 30ºC 5 Tage lang inkubiert. N44-1 wurde auch in Nr. 5 Medium in der selben Weise als Kontrolle aber ohne Antibiotika kultiviert. Die Fermentationsbrühe wurde auf Zellwachstum und 2-KGA Produktion durch Bestimmung der optischen Dichte bei 550 nm (OD&sub5;&sub5;&sub0;) und 2-KGA Menge untersucht.
Wie in Tabelle 2 gezeigt ist das Plasmid pGE1 der beste Vektor für die Aufrechterhaltung des Wachstums und die 2-KGA Herstellung unter den getesteten Vektoren. Im Gegensatz verursachte die Anwesenheit von RP4 die Reduzierung sowohl des Zellwachstums (um 20%) als auch der 2-KGA Herstellung (um 45 %). Zusätzlich wurde ein weiterer Defekt in RP4 gefunden; die Deletion von RP4 trat bei der Replikation in Gluconobacter auf.
RSF1010 und pVK102 beeinträchtigten nicht das Zellwachstum aber verminderten oft die 2-KGA Produktivität von N44-1 um respektive 80 % bzw. 90 % bezogen auf das Standardniveau. Tabelle 2 Wirkung der Gegenwart von verschiedenen Vektoren auf Wachstum und 2-KGA Produktion Antibiotikum* Wirt Vektor *Antibiotikum für RP4, pVK102 und pGE1 war Kanamycin (50 ug/ml) und das für RSF1010 war Streptomycin (50 ug/ml).

Beispiel 4

Stabilität des Plasmids pGE1 während der Kultivierung

N44-1-Transkonjuganten wie in Beispiel 3 beschrieben, wurden in Km- freier Brühe kultiviert, verdünnt und auf MB Agarplatten ausplatiert. Die Platten wurden 5 Tage bei 30ºC inkubiert. Der E. coli Stamm S17-1, der das Plasmid pGE1 beherbert, wurde im Km-freien LB-Medium kultiviert, verdünnt und auf LB-Agarplatten ausplatiert. Die Platten wurden einen Tag bei 37ºC inkubiert.
Die entstandenen Kolonien wurden verwendet, um die Stabilität der Plasmide wie im folgenden zu bestimmen:
Die Plasmidstabilität wurde definiert als das Verhältnis der Anzahl von Kolonien, die auf Antibiotika enthaltenden Agarplatten gewachsen sind, zu denen der Kolonien, die auf Agarplatten ohne Antibiotika gewachsen sind.
Flüssige Proben von der Kulturbrühe zu verschiedenen Stadien der Kultivierung wurden in geeigneter Weise verdünnt auf antibiotikafreien Agarplatten ausplatiert und bei 37ºC für einen Tag (E. coli) oder 28ºC für 5 Tage (G. oxydans) inkubiert. Einhundert auf diesen Platten gewachsenen Kolonien wurden auf Agarplatten mit und ohne Antibiotika übertragen. Die Platten wurden unter den selben Bedingungen wie oben beschrieben inkubiert und die Anzahl der sich zeigenden Kolonien wurde für die Berechnung der Plasmidstabilität gezählt.
Tabelle 3-(a) zeigt, dass RP4 extrem instabil in dem 2-KGA Hochproduzierer N44-1 aber stabil in dem 2-KGA Nichtproduzierer C20 war (eine aus G. oxydans IFO 3293 durch wie in der Europäischen Patentanmeldung Publikationsnummer 213 591 beschriebene Mutagenese erhaltene Mutante). Die anderen Vektoren waren beträchtlich stabil in beiden Stämmen.
Jedoch wurde in unseren früheren Experimenten festgestellt, dass RSF1010 mit einer Einfügung oft entweder geheilt oder deletiert wurde (Daten nicht gezeigt). Deshalb wurden pGE1 und pVK102 weiter bezüglich der Stabilität während der Kultivation untersucht.
N44-1 Zellen, die die Plasmide pVK102, p7A6Δ4 (Derivate von pVK102, die das Gen für die Membrangebundene-Sorboson-Dehydrogenase enthalten; zur Konstruktion siehe Beispiel 8) oder pGE1 beherbergen, wurden in MB flüssigen Medium mit 50 ug/ml Kanamycin in einem Teströhrchen zwei Tage lang kultiviert, um eine Saatkultur herzustellten. Ein Zehntel ml der Saatkultur wurde auf 5 ml Km-freies MB Medium in einem Teströhrchen übertragen. Das Teströhrchen wurde bei 30ºC einen Tag auf einem Röhrchenschüttler inkubiert. Drei Zykien dieses Transfers und Kultivation wurden in MB Medium ausgeführt. Ein Zehntel ml der selben Saatkultur wurde auch auf 5 ml eines Km-freien Nr. 5 Mediums in einem Teströhrchen übertragen, um die Plasmidstabilität unter 2-KGA produzierenden Bedingungen zu testen. Drei Zyklen des Transfers und der Kultivierung (bei 30ºC für 2 bis 3 Tage) wurden auch in Nr. 5 Mediums ausgeführt. Am Ende jeder Kultivierung wurde die Brühe in geeigneter Weise verdünnt und auf MB Agarplatten ausplatiert, um die Stabilität der verwendeten Plasmide zu bestimmen.
Tabelle 3-(b) zeigt, dass Plasmid pGE1 unter den untersuchten Bedingungen extrem stabil (100 %) war, während pVK102 und p7A6Δ4 deutlich aber zu einem geringeren Ausmass stabil (74-100 %) waren. Diese Resultate zeigen, dass die 2-KGA Fermentation mittels 2-KGA Hochproduzierer, die pGE1 beherbergen, ohne Zusatz von Kanamycin in das praktische Verfahren, das 2 bis 3 Zyklen Saatkultivierung beinhaltet, ausgeführt werden kann. Das Plasmid pGE1 war auch sehr stabil (100 %) in E. coli während drei Zyklen der Kultivierung ohne Antibiotika. Tabelle 3-(a) Stabilität von verschiedenen Vektoren während der Kultivierung Stabilität während der Kultivierung in Nr. 5 Medium (%) Vektor Wirt Tabelle 3-(b) Stabilität während der Kultivierung in MB Medium (%) und Nr. 5 Medium (%) Plasmid Transfer Nr. Plasmidstabilität in: MB Medium Nr. 5 Medium N44-1-beherbergend jedes Plasmid wurde in Mannitolbrühe (MB) für 1 Tag oder in Nr. 5 Medium für 2 bis 3 Tage kultiviert und 2 % der Brühe wurden jeweils in frisches Medium übertragen.

Beispiel 5

Kompatibilität des Plasmids pGE1 mit dem Plasmid pVK102

Die Kompatibilität des Plasmids pGE1 mit dem Plasmid pVK102 wurde untersucht, da die Einführung von 2-KGA fermentationsbetreffenden Genen in einen Wirtsstamm wahrscheinlich zwei oder mehrere Vektoren, die kompatible sind, benötigt.
Plasmid pVK102 wurde durch bi-parentale Konjugationspaarung von E. coli S17-1 auf G. oxydans IFO 3293, der das Plasmid pGE1 beherbergt, übertragen. Transkonjuganten wurden selektiert auf der Basis, dass die Bakterien sowohl Kanamycin- wie auch Tetracyclinresistenzen zeigten. Plasmid DNS präpariert von Kmr- und Tcr-Transkonjuganten wurden verwendet, um E. coli S17-1 zu transformieren, um die Anwensenheit von beiden Plasmiden in den Transkonjuganten zu bestätigen. Unter den Transformanten waren wie erwartet pGE1 und pVK102 beherbergende. Diese Befunde zeigen, dass das Plasmid pGE1 mit dem Plasmid pVK102 in Gluconobacter kompatible ist.

Beispiel 6

Wirtsbereich des Plasmids pGE1

Das Plasmid pGE1 wurde konjugal von E. coli S17-1 in verschiedene Stämme, die zum Genus Gluconobacter gehören, wie beispielsweise G. oxydans IFO 3293, G. oxydans IFO 3462, G. oxydans IFO 3268, G. oxydans IFO 3271, G. oxydans IFO 3287, G. oxydans IFO 3172 und G. oxydans ATCC 9937, und in verschiedene Stämme gehörend zu dem Genus Acetobacter, wie beispielsweise A. acetosus IFO 3129, A. pasteurianus IFO 3170, A. pasteurianus IFO 3223 und A. pasteurianus IFO 3225 durch bi-parentale konjugale Paarung wie in Beispiel 1(C) beschrieben übertragen.
Kmr Kolonien wurden von allen Stämmen von Gluconobacter und Acetobacter erhalten. Dann wurden die Plasmid DNS der erhaltenen Kmr Stämme bezüglich ihrer Charakteristika im Verhältnis mit dem ursprünglichen Plasmid pGE1 analysiert.
Die Plasmid DNS wurden der Agarosegelelektrophorese ausgesetzt. Die Analyse zeigte, dass alle Plasmide die selbe molekulare Grösse wie das Plasmid pGE1 hatten. Die DNS Banden auf dem Agarosegel wurden auf Nylonfilter übertragen und einer Southern-Hybridisierungsanalyse ausgesetzt. Alle DNS Banden hybridisierten mit ³²P-markierter Plasmid pGE1 DNS. Somit wurde für alle aus den Stämmen von Gluconobacter und Acetobacter erhaltenen Kmr Stämme bestätigt, dass sie Transkonjuganten sind, die das Plasmid pGE1 beherbergen.
Von jeder Transkonjuganten isolierte Plasmid DNS wurde verwendet, um den E. coli Stamm C600 zu transformieren. Erhaltene Kmr Transformanten wurden in LK flüssigem Medium bei 37º über Nacht kultiviert. Von jeder Transformanten wurde Plasmid DNS extrahiert und durch Agarosegelelektrophorese nach Verdauen mit Bgl II analysiert. Für jede untersuchte Plasmid DNS wurde bestätigt dass sie identisch ist mit der Plasmid DNS von pGE1. Weder Deletion noch Insertion von DNS wurde beobachtet. Konsequenterweise arbeitet Plasmid pGE1 als ein Pendelvektor für verschiedene Gluconobacter und Acetobacterstämme.

Beispiel 7

Stabilität des Plasmids pGE1 in verschiedenen Stämmen, die zum Genus Gluconobacter und Acetobacter gehören

Jede in Beispiel 6 beschriebene und auf MB Agarplatten, die Kanamycin (50 ug/ml) enthalten, aufrechterhaltene Transkonjugante wurde in MB Flüssigmedium enthaltend 50 ug/ml Kanamycin in ein Teströhrchen übertragen und 2 Tage kultiviert, um eine Saatkultur herzustellen. Ein Zehntel ml der Saatkultur wurde in 5 ml kanamycinfreies MB Medium überführt. Das Teströhrchen wurde bei 30ºC ein Tag auf einem Röhrchenschüttler inkubiert. Drei Zyklen dieses Transfers und dieser Kultivierung wurden in MB Medium ausgeführt. Die Saatkultur, die erste Kultur und dritte Kultur wurden in geeigneter Weise verdünnt und auf MB Agarplatten ausgebreitet, um die Stabilität des Plasmids pGE1, wie in Beispiel 4 gezeigt, zu bestimmen.
Tabelle 4 zeigt, dass das Plasmid pGE1 sehr stabil (100 %) war in G. oxydans IFO 3293, G. oxydans IFO 3268 und A. acetosus IFO 3129 und beträchtlich stabil (68-98 %) in G. oxydans IFO 3462, G. oxydans IFO 3271, G. oxydans IFO 3287, G. oxydans IFO 3172, G. oxydans ATCC9937, A. pasteurianus IFO 3170, A. pasteurianus IFO 3223 und A. pasteurianus IFO 3225 selbst nach drei Transfers ohne Kanamycinselektion. Tabelle 4 Stabilität des Plasmids pGE1 in verschiedenen Stämmen, die zum Genus Gluconobacter und Genus Acetobacter gehören Plasmidbeherbergende Stämme (%) in Saatkultur a) Kultur b) G. oxydans A. acetosus A. pasteurianus a) Saatkultur wurde in MB Medium enthaltend 50 ug/ml Kanamycin hergestellt. b) Erste und dritte Kulturen wurden in MB Medium ohne Kanamycin hergestellt.

Beispiel 8

Verwendung des Plasmids pGE1 als Klonierungsvektor

A) Integration des Membrangebundenen-L-Sorboson Dehydrogenasegens in das Plasmid pGE1

Das klonierte Gen der Membrangebundenen-L-Sorboson Dehydrogenase von A. liquefaciens IFO 12258 wurde in das Plasmid pGE1 eingeführt, um seine Verwendbarkeit als Klonierungsvektor zu zeigen.
Das BglII Fragment (5.5kb) enthaltend das Membrangebundene-L- Sorboson Dehydrogenasegen (SNDH) wurde vom Plasmid p7A6Δ4 isoliert und mit dem teilweise durch BglII verdauten Plasmid pGE1 verbunden. Die resultierende DNS Mischung wurde verwendet, um E. coli S17-1 zu transformieren. Fünfhundert (500) Transformanten wurden gepickt und auf Nitrozellulosefilter, die auf der Oberfläche von LSK (LB Medium enthaltend 100 ug/ml Streptomycin und 50 ug/ml Kanamycin) Agarplatten ausgebreitet waren transferiert und bei 37ºC über Nacht inkubiert. Die Filter wurden mit 0.5M NaOH - 1.5M NaCl Lösung 5 Minuten behandelt und mit 3M Natrium Acetat (pH 4.8) 5 Minuten neutralisiert. Die Filter mit den übertragenen Kolonien wurden für die Hybridisierung mit dem ³²P markierten 1.8kb SAlI Fragment verwendet, das von p7A6Δ4 isoliert wurde und nur DNS von A. liquefaciens IFO 12258 enthielt. Fünfzehn positive Klone wurden selektiert und ihre Plasmide wurden durch Verdauen mit BglII oder PvuI analysiert.
Wie in Figur 2 gezeigt wurden 3 Typen von Subklonen isoliert, die im folgenden als pGE-SNB1, pGE-SNB2 und pGE-SNB3 bezeichnet werden. Alle von ihnen enthielten ein 5.5kb BglII Fragment. Gleichzeitig verloren sie jedoch 1.7kb und/oder 0.4kb BglII Fragmente vom Plasmid pGE1, das aus 3 BglII Fragmenten (9.8kb, 1.7kb und 0.4kb) besteht. Deshalb kann das Plasmid pGE1 als ein lebensfähiger Vektor durch BglII Verdauung auf 9.8kb verkürzt werden. Die detailierte Restriktionskarten von pGE1 und pGE-SNB2 sind in Figur 3 gezeigt.

B) Wirkung von Subklonen auf die 2-KGA Produktion in einem ruhenden System

Der Effekt von in N44-1 enthaltend SNDH-genenthaltende pGE1 Derivate auf die 2-KGA Produktion wurde untersucht im Vergleich zu dem von N44-1 enthaltend das Plasmid pGE1, pVK102 oder p7A6Δ4. Zwei natürliche Stämme enthaltend eine effiziente Membrangebundene-L- Sorboson Deyhdrogenase, A. liquefaciens (ATCC 23750) und Pseudomonas putida (P. putida) [ATCC 21812; Makover et al., Biotechnol. Bioeng. 17, 1485- 1514 [1975]) wurden auch als Kontrollstämme verwendet.
Drei Subklone der SNDH-genenthaltenden Plasmide pGE-SNB1, pGE- SNB2 und pGE-SNB3 wie auch die Plasmide PGE1, pVK102 und p7A6Δ4 wurden von E. coli S17-1 auf G. oxydans IFO 3293 durch bi-parentale konjugale Paarung transferiert. Die Transkonjuganten, A. liquefaciens (ATCC 23750) und P. putida (ATCC 21812) wurden in MB über Nacht kultiviert. Zellen wurden dann verdünnt auf eine OD&sub5;&sub5;&sub0; = 2 und Zellen, gesammelt von 4 ml der Zellsuspension, wurden in 4 ml der Reaktionsmischung enthaltend 18 g/l L-Sorboson, 10 g/l CaCO&sub3; und 3 g/l NaCl resuspendiert und bei 30ºC inkubiert. Tabelle 5 zeigt die nach 2, 20 und 63 Stunden produzierte Menge 2-KGA.
Die 2-KGA Produktivitäten der das SNDH Gen enthaltenden Transkonjuganten enthaltend die Subklone pGE-SNB1, pGE-SNB2 und pGE- SNB3 waren besser wie solche von A. liquefaciens (ATCC 23750) und P. putida (ATCC 21812). Weiterhin war die 2-KGA Produktion durch diese Subklone fast so gut wie die 2-KGA Produktion des Plasmids p7A6Δ4.
Wenn besagte Subklone in N44-1, ein 2-KGA Hochproduzierer, eingeführt wurden, zeigten sie bessere 2-KGA Ausbeuten als N44-1 einerseits von L-Sorbose oder L-Sorboson unter dem ruhenden System wie in Tabelle 6 gezeigt. Die molare Ausbeute von 2-KGA von L-Sorboson durch den Stamm mit dem SNDH-genenthaltenden Plasmid war 90 %, wobei die molare Ausbeute durch den Stamm mit einem Vektorplasmid nur 20 % war. Die molare Ausbeute von 2-KGA von L-Sorboson des SNDH- genentahltenden Stammes war 60 bis 70 %, wobei die des SNDH-genfreien Stammes ungefähr 40 % war. Tabelle 5 Vergleich von 2-KGA Produktionsraten aus L-Sorboson bei einem ruhenden System G. oxydans IFO 3293 A. liquefaciens ATCC 23750 P. putida ATCC 21812 L-Sorboson: 18 g/l Temperatur: 30ºC Tabelle 6 2-KGA Prodkution von L-Sorboson oder L-Sorbose durch N44-1, die verschiedene Plasmide in einem ruhenden System trugen 2-KGA produziert (g/l) von 36 g L-Sorboson 40 g/l L-Sorbose G. oxydans N44-1 ND: nicht bestimmt
Reaktion von L-Sorboson oder L-Sorbose wurde ausgeführt bei 30ºC für 1 beziehungsweise 6 Tage.

Beispiel 9

Herstellung des Plasmids p7A6Δ4

A) Konstruktion einer cosmidgenomischen Bank in E. coli S17-1

G. oxydans IFO 12258 wurde in 200ml Mannitolbrühe (MB) (25 g/l von Mannitol, 3 g/l Bactopepton, 5g/l Hefeextrakt) 48 Stunden bei 30ºC kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt, mit 100ml Tris (10mM)- EDTA (1mM) Puffer, pH 7.5 gewaschen und in 50 ml Tris (10mM)-EDTA (20mM) Puffer, pH 7.5 resuspendiert.
Die so erhaltene Zellsuspension wurde mit 2ml von Lysozymlösung (10mg/ml) bei 37ºC 30 Minuten behandelt, gefolgt durch eine Behandlung mit Pronase (4000 Einheiten) bei 37ºC für 30 Minuten und 10ml 5% SDS bei 37ºC für eine Stunde. Zu diesem Zeitpunkt wurde ein klares Lysat erhalten. DNS wurde mit 60ml neutralen Phenols extrahiert: Chloroform enthaltend 4 % Octanol (1:1) bei langsamem Rotieren bei 4ºC für 30 Minuten. Die Mischung wurde bei 15000 rpm (28000g) 15 Minuten zentrifugiert und der erhaltene Ueberstand wurde mit 60ml Chloroform extrahiert: Octanol (96:4) bei langsamem Rotieren bei 4ºC für 10 Minuten.
Zu dem 50ml Ueberstand erhalten durch Zentrifugation bei 15000 rpm (28000 g) für 15 Minuten, wurden 5ml 3M Natriumacetat und 55ml kaltes Ethanol zugegeben. Die rohe DNS wurde durch Auswinden mit einem Glasstab erhalten, die dann mit RNase T1 und A (37ºC, 30 Minuten) und Pronase (37ºC, 30 Minuten) wieder behandelt wurde. Die Phenol- und Chloroformextraktionen wurden wiederholt, um reine chromosomale DNS zu erhalten.
Die chromosomale DNS von G. oxydans IFO 12258 wurde teilweise mit Sal I verdaut. Die erhaltenen Fragmente von 15kb bis 35 kb wurden durch Elektrophorese vom Agarosegel isoliert. Plasmid pVK102 (ATCC 37158) DNS wurde vollständig mit Sal I verdaut und mit Kalbsmagenalkalischerphosphatase dephosphoriliert. Die DNS Fragmente von 15 kb bis 35 kb und die lineare pVK102 DNS wurden mit T4 DNS Ligase ligiert.
Die ligierten Fragmente wurden für die in vitro Verpackung mittels eines Verpackungskits (Amersham International plc) verwendet und die erhaltenen Phagenpartikel wurden mit E. coli ED 8767 [Murray et al. Mol. Gen. Genet. 150, 53 (1977)] inkubiert. Die Zellsuspension wurde auf LB Agarplatten enthaltend 50 ug/ml Kanamycin ausplatiert.
Eintausend Kmr Kolonien wurden gekratzt und verwendet, um eine Mischung von rekombinanten Plasmiden herzustellen. Die Plasmid DNS wurden verwendet, um E. coli S17-1 (Smr Tra+) zu transformieren. Eintausendvierhundert Transformanten wurden in Microtiterplatten enthaltend LB Medium in 100 mg/ml von Streptomycin und 50 ug/ml Kanamycin gepickt, über Nacht inkubiert und mit 15ºC Glycerol bei -80ºC als die genomische Bank von G. oxydans IFO 12258 in E. coli S17-1 gelagert. Die durchschnittliche Grösse der Inserts war 25kb bis 30kb.

B) Konjugaler Transfer der cosmidgenomischen Bank in E. coli S17-1 auf G. oxydans OX-4

Die cosmidgenomische Bank von G. oxydans IFO 12258 in E. coli S17-1 wurde auf G. oxydans OX-4 (ein L-Sorboson akkumulierende Mutante erhalten von G. oxydans IFO 3293 durch wie in der Europäischen Patentanmeldung Publikationsnummer 213 591 beschriebenen Mutagenese) unter der Verwendung von bi-parentaler Paarung zwischen zwei Stämmen übertragen.
Zweihundert ul einer in der logarithmischer Phase sich befindenden Kultur von dem Empfänger G. oxydans OX-4, gewachsen in Mannitolbrühe, wurden mit 100 ul einer in logarithmischer Phase befindlichen Kultur von E. coli S17-1, die pVK102 mit der Insert DNS tragen, individuell gemischt und auf Nitrozellulosefilter auf der Oberfläche von Fructuosebruhe- Agarplatten (50 g/l Fructuose, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l Polypeptone) ausgespottet. Die Platten wurden über Nacht bei 30ºC inkubiert. Die gemischten Kolonien wurden auf MB enthaltend 10 ug/ml Polymyxin B und 50 ug/ml Kanamycin (MPK) Agarplatten ausgestrichen und 4 Tage bei 30ºC inkubiert. Die resultierenden Transkonjuganten wurden durch Neuausplatieren auf MPK Agarplatten gereinigt.
Das Screening wurde unter Verwendung eines mini-ruhenden Systemens durchgeführt. Etwa 1400 Stämme von G. oxydans OX-4/pVK102 mit eingefügter DNS wurden in der Reaktionsmischung enthaltend 50 ul von 3 g/l NaCl, 10 g/l CaCO&sub3; und 30 g/l L-Sorbose oder L-Sorboson individuell resuspendiert und für 1 bis 5 Tage bei 30ºC inkubiert. Nachweis auf 2-KGA Produktion wurde durch Dünnschichtchromatographie auf einem Kieselerdegel durchgeführt. Ein positiver Klon, p7A6, wurde erhalten.
Das rekombinante Plasmid p7A6 wurde durch die alkalische Methode von Birnboim und Doly [Nucleic Acids Research 7, 1513-1523 (1979)] hergestellt und mit den folgenden Restriktionsenzymen gespalten: EcoRI, EcoRV, HaeIII, HincII, NruI, Sal I, Sau 3A, XhoII, BamHI, BglII, Dra I, Hind III und Sma I. EcoRI, HincII, NruI und Sal I verdaute die eingefügte DNS von p7A6 (25kb) in 8 bis 11 Fragmente. Hae III, Sau 3A und XhoII generierten zahlreiche Fragmente. Sal I wurde selektiert für den ersten Schritt der Subklonierung.
p7A6 wurde teilweise mit Sal I verdaut und mit dephosphorilierter mit Sal I verdauter pVK102 DNS ligiert. Die DNS Mischung wurde in E. coli S17- 1 durch Transformation übertragen und dann auf G. oxydans OX-4 durch bi-partentale Konjugation übertragen. Der kürzeste Subklon p7A6Δ2 wurde von dem mini-ruhenden Screening von 200 Transkonjuganten isoliert und seine Insertgrösse war 9.2 kb [Fig. 4-(a)]. Die zweite Subklonierung wurde durchgeführt durch eine Deletion des Fragments E&sub1;-E&sub2; von p7A6Δ2. p7A6Δ3 [Fig. 4-(b)] so erhalten wurde weiter verkürzt durch Deletion des Fragments E1/2-Sm&sub3;. Der erhaltene Subklone p7A6Δ4 [Fig. 4-(c)] enthielt ein 3.1kb Insert in pVK102 mit einer kleinen Deletion von Sm&sub2;-Sm&sub3; in der Vektor DNS. Die detailierte Restriktionskarte des 3.1 kb S&sub1;-S&sub2;-E1/2 (SSE) Fragments ist in Fig. 5 veranschaulicht.

Claims

1. Ein Pendelvektor, der ein oder mehrere Markergene, zwei verschiedene Replikationsursprünge, wovon einer in Escherichia coli und einer in Gluconobacter oxydans funktionsfähig ist, und eine Mob-Stelle umfasst.

2. Ein wie in Anspruch 1 beanspruchter Vektor, worin besagte Markergene Antibiotikaresistenzgene sind.

3. Ein wie in Anspruch 1 oder 2 beanspruchter Vektor, der eine oder mehrere Einfügungen enthält.

4. Ein wie in Anspruch 3 beanspruchter Vektor, worin besagte Einfügungen aus der Gruppe bestehend aus DNS-Sequenzen mit Vielfachklonierungsstellen, Expressionskontrollsequenzen, cos-Stellen, Terminatorsequenzen, ribosomalen Bindungsstellen und DNS-Sequenzen, die für Signalpeptide und/oder Proteine kodieren, ausgewählt sind.

5. Eine Transkonjugante des Genus Gluconobacter oder des Genus Acetobacter, in die ein Vektor der Ansprüche 1-4 eingeführt ist.

6. Ein Verfahren zur Herstellung einer wie in Anspruch 5 beanspruchten Transkonjuganten, das das in Kontaktbringen eines zum Genus Gluconobacter oder zum Genus Acetobacter gehörenden Stammes mit einem mit einem in den Ansprüchen 1-4 definierten Vektor transformierten Stamm von Escherichia coli unter konjugalen Paarungsbedingungen umfasst.

7. Ein wie in den Ansprüchen 1-4 beanspruchtes Verfahren zur Herstellung eines Pendelvektors, das:

(a) die Herstellung von Markergenen enthaltender DNS;

(b) die Herstellung von einer einen in Escherichia coli funktionsfähigen Replikationsursprung enthaltenden DNS;

(c) die Herstellung von einer einen in Gluconobacter funktionsfähigen Replikationsursprung enthaltenden DNS;

(d) die Herstellung einer eine Mob-Stelle enthaltenden DNS; und

(e) die Zusammenfügung der in (a) bis (d) beschriebenen DNS durch Verdauen besagter DNS mit geeigneten Restriktionsenzymen und Verbinden umfasst.

8. Ein Verfahren zur Herstellung eines pro- oder eukaryotischen Polypeptids, welches Verfahren das Einführen durch Transkonjugation eines wie in den Ansprüchen 1-4 beanspruchten Pendelvektors, der die das besagte Polypeptid kodierende DNS-Sequenz wirksam mit einer Expressionskontrollsequenz verbunden enthält in einen Stamm des Genus Gluconobacter oder des Genus Acetobacter, die Kultivierung der Transkonjuganten unter geeigneten Wachstumsbedingungen und die Isolierung des gewünschten Polypeptids von der Kultur umfasst.