DE3750240T2

DE3750240T2 - Gen, das ein Insektizid-Protein kodiert, und Herstellung des Proteins durch Verwendung dieses Gens.

Info

Publication number: DE3750240T2
Application number: DE3750240T
Authority: DE
Inventors: Keiko Nakamura; Kenji Oeda; Hideo Ohkawa; Kazuyuki Oshie; Masatoshi Shimizu
Original assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date: 1986-08-19
Filing date: 1987-08-18
Publication date: 1994-10-27
Anticipated expiration: 2007-08-19
Also published as: JPH0817705B2; DE3750240D1; EP0256553A3; JPS6349085A; CA1338605C; EP0256553B1; EP0256553A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Gen, das ein insektizides Protein codiert, das von Bacillus thuringiensis aizawai a7A021 produziert wird, und ein Verfahren zur Herstellung des insektiziden Proteins durch Verwendung des Gens, wobei das Protein schädliche Insekten, beispielsweise die zur Ordnung Lepidoptera gehörenden Plutella xylostella und Spodoptera litura, töten kann. Die Erfindung betrifft außerdem ein das Gen enthaltendes Expressionsplasmid und einen mit dem Expressionsplasmid transformierten Mikroorganisums.

Hintergrund der Erfindung

Man weiß, daß ein Stamm von Bacillus thuringiensis während der Sporenbildung einen 1 bis 2 um großen Kristall des insektiziden Proteins produziert und daß die Aufnahme des Kristalls durch Insekten eine Beendigung der Nahrungsaufnahme, eine Darmruptur und den Tod der Insekten bewirkt. Stämme von Bacillus thuringiensis werden in 29 Unterarten gemäß den von ihnen produzierten Geißelantigenen und Esterase-Aktivitäten eingeteilt und jeder Stamm zeigt eine spezifische insektizide Aktivität.
Die Clonierung und Expression eines ein kristallines Protein codierenden Gens von einem 45 MD-Wirtsplasmid von Bacillus thuringiensis aizawai 7-29 und die Sequenz eines weiteren kristallinen Proteins von einem Plasmid von Bacillus thuringiensis var. kurstaki HD-1-Dipel sind von Klier et al. (Mol. Biol. Microb. Differ. Proc. Internat. Conf. 9th (1984) (veröffentl. 1985), Seite 217-224) bzw. Schnepf et al. (J. Biol. Chem. 260 (1985), Seite 6264-6272) beschrieben worden. EP-A1 224 331 offenbart ferner die Clonierung und Expression eines ein insektizides Protein codierenden Gens von Bacillus thuringiensis subsp. aizawai IPL Nr. 7, die 12 verschiedene Plasmide enthält.
Die Erfinder stellten fest, daß ein vom Stamm Bacillus thuringiensis aizawai a7A021 produziertes insektizides Protein eine intensive insektizide Aktivität bei Plutella xylostella und Spodoptera litura zeigt. Anschließend konnten die Erfinder ein das insektizide Protein codierendes, chromosomales Gen clonieren und das 3528 Basenpaare umfassende Strukturgen vollständig sequenzieren. Ausgehend von dieser erfolgreichen Arbeit gelang den Erfindern auch die Herstellung einer großen Menge des insektiziden Proteins durch Insertion des das Protein codierenden Gens in einen Expressionsvektor, Transformation eines Mikroorganismus mit dem erhaltenen Plasmid und Züchtung des transformierten Mikroorganismus unter geeigneten Bedingungen. Die Erfinder haben ferner die Primärstruktur des insektiziden Proteins ermittelt.
Die Erfindung stellt somit ein Gen bereit, das ein insektizides Protein codiert, das vom Stamm Bacillus thuringiensis aizawai a7A021 produziert wird. Die Erfindung stellt außerdem ein Expressionsplasmid bereit, das das Gen als Insertion trägt, und eine Wirtszelle, die mit dem Expressionsplasmid transformiert ist. Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung des insektiziden Proteins bereit, das die Züchtung des transformierten Mikroorganismus unter geeigneten Bedingungen umfaßt.

Beschreibung der Figuren

Fig. 1 ist eine Restriktionskarte von Fremd-DNA (3,5 kb), die in die Plasmide pCA1 und pCA5 inseriert ist, wobei die Fremd-DNA das insektizide Protein von Bacillus thuringiensis aizawai a7A021 codiert. Die Symbole Ps, C, E, Pv, S, H, K bzw. B bedeuten die Restriktionsenzyme PstI, ClaI, EcoRI, PvuII, SalI, HindIII, KpnI und BamHI.
Fig. 2 zeigt oberhalb die Basensequenz eines vollständigen Strukturgens (3528 bp) des insektiziden Proteins und unterhalb die entsprechende Aminosäuresequenz.
Fig. 3(A) bzw. (B) zeigt die densitometrische Messung von insektizidem Protein, das in Rohextrakten der Kulturen von E. coli JM103/pKC6 und E. coli JM103/pKK223-4 (Kontrolle) festgestellt wurde. Der Pfeil zeigt die Position des insektiziden Proteins.
Fig. 4 zeigt die Konstruktion des Expressionsplasmids pKC6. Die gestreiften Bereiche entsprechen dem das insektizide Protein codierenden Gen. Tac bedeutet Tac-Promotor. rrnB[T] bedeutet rrnB-Terminator. Die Symbole Kp, Pv, Bm und Ps bedeuten die Restriktionsenzyme KpnI, PvuII, BamHI bzw. PstI.
Das Gen, das das insektizide, vom Stamm Bacillus thuringiensis aizawai a7A021 produzierte Protein codiert, das durch die in Fig. 2 dargestellte Basensequenz und Aminosäuresequenz gekennzeichnet ist, ist in E. coli JM103/pKC6 (ATCC 67487) enthalten und kann von E. coli JM103/pKC6 oder durch Absuchen einer aus der chromosomalen DNA des Stamms hergestellten Genbank unter Verwendung einer geeigneten Sonde erhalten werden, die ausgehend von der in Fig. 2 dargestellten Basensequenz synthetisiert wurde. Die Sonde kann außerdem hergestellt werden, indem von der bekannten Basensequenz des Gens ausgegangen wird, das ein insektizides Protein codiert, das von einem verwandten Stamm, Bacillus thuringiensis kurstaki HD-1-Dipel, produziert wird.
Wie dem Fachmann bekannt sein dürfte, gibt es mit einigen Ausnahmen mehrere Codons für jede Aminosäure, und daher sind mehrere Basensequenzen oder DNA-Sequenzen für eine bestimmte Aminosäuresequenz möglich. Daher ist das erfindungsgemäße, das insektizide Protein codierende Gen nicht auf das natürlich vorkommende Gen beschränkt, das die in Fig. 2 dargestellte DNA-Sequenz wiedergibt. Das erfindungsgemäße Gen soll mit anderen Worten so aufgefaßt werden, daß es jedes Gen einschließt, das einen natürlichen oder künstlichen Ursprung hat und die in Fig. 2 dargestellte Aminosäuresequenz codiert. Andererseits kann eine Mutante des natürlichen Gens, die eine analoge Aminosäuresequenz codiert, die mit der in Fig. 2 dargestellten eng verwandt ist, durch Insertion, Deletion und/oder Substitution eines Nucleotids oder von Nucleotiden im natürlich vorkommenden Gen hergestellt werden. Eine derartige Mutation kann in üblicher Weise durchgeführt werden, indem die charakteristische Eigenschaft des natürlich vorkommenden, durch das natürliche Gen codierten Proteins entweder unverändert bleibt oder verbessert wird. Derartige Mutationen enthaltende, durch die vorstehend beschriebenen Verfahren erhältliche Gene sind ebenfalls in den erfindungsgemäßen Begriff "ein Gen, das ein insektizides Protein codiert" eingeschlossen.
Das Expressionsplasmid, das das insektizide Protein in Zellen von Mikroorganismen exprimieren kann, kann durch Insertion des erfindungsgemäßen Gens in einen Expressionsvektor konstruiert werden. Beispiele für geeignete Vektoren sind das Plasmid pUC18, das den lac-Promotor trägt (Pharmacia), Plasmid pKK223-4, das den tac-Promotor trägt, der ein aus Escherichia coli konstruierter starker Promotor ist, sowie einen rrnB-Terminator von ribosomaler RNA, Plasmid pDR720, das den trp-Promotor trägt (Pharmacia), und ein induzierbares Plasmid pPL-Lambda (Pharmacia).
Die Aufnahme des erhaltenen, das Gen des insektiziden Proteins tragenden Expressionsplasmids in einen Wirtsmikroorganismus, beispielsweise in E. coli JM103 (Pharmacia), liefert einen transformierten Mikroorganismus, der das Protein produziert, und die Züchtung der Transformante unter geeigneten Bedingungen liefert eine größere Menge des insektiziden Proteins. Die Züchtung kann beispielsweise unter Schütteln 8 bis 20 Stunden bei 37ºC in einem Kulturmedium durchgeführt werden, das 1 Liter destilliertes Wasser, 10 g Trypton, 5 g NaCl und 5 g Hefeextrakt bei einem pH-Wert von 7,5 umfaßt.
Nach Züchtungsende wird die Kultur beispielsweise mit Ultraschall homogenisiert und zentrifugiert, um das insektizide Protein als Kondensat zu erhalten.
Verschiedene Wirt-Vektor-Systeme, die von Bacillus, Saccharomyces, Pseudomonas und Actinomyces stammen, können anstelle der von E. coli verwendet werden.
Die nachstehend beschriebenen Beispiele erläutern und beschreiben die hier dargestellte Erfindung genauer. Der Schutzbereich der Erfindung ist durch das nachstehend beschriebene Beispiel nicht beschränkt.
Die im nachstehend beschriebenen Beispiel verwendeten Reagenzien und Materialien können von den nachstehend genannten Lieferanten bezogen werden: Trypton, Hefeextrakt, Stärkeagar und einzelsträngige Lachssperma-DNA von Sigma; NaCl, Dithiothreit und Adenosintriphosphat von Nakarai Chemical; Polynucleotidkinase von E. coli, alkalische Phosphatase von E. coli, T&sub4;-DNA-Ligase, Klenow-Puffer, Klenow- Fragmentenzym, CHASE-Lösung, dNTP, ddNTP und das Restriktionsenzym BamHI von Takara shuzo; [γ-³²P]ATP von Amersham Japan; DE-52-Säule von Whattman, Restriktionsenzym AhaIII, puC18-Vektorplasmid und der Expressionsvektor pKK223-3 von Pharmacia; LGT-Agarosegel von Bethesda Research Laboratory und Primer-DNA von PL-Biochemical.

Beispiel 1

A. Absuchen von Bacillus thuringiensis aizawai a7A021

Der Stamm Bacillus thuringiensis aizawai IPL Nr. 7, der nach den Bestimmungen des Budapester Vertrags unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-1150 beim Fermentation Research Institute in Japan hinterlegt worden ist, wurde über Nacht bei 30ºC in flüssigem, Acridinorange (0,04 ug/ml) enthaltenden PY-Medium (10 g Trypton, 5 g NaCl, 5 g Hefeextrakt, pH-Wert 7,0, Gesamtvolumen 11) gezüchtet. Eine Stärke enthaltende Agarplatte, die durch Auflösen von 25 g Stärke-Agar in 1 Liter destilliertem Wasser mit einer anschließenden Autoklavierung hergestellt worden war, wurde mit einer 10&sup5;- Verdünnung (0,1 ml) der Kultur beimpft, drei Tage bei 30ºC gezüchtet und die gewünschten Kolonien in der nachstehend beschriebenen Weise selektiert: die Spore und das Kristall wurden unter einem Phasenkontrastmikroskop beobachtet, die Plasmid-DNA durch das alkalische Schnellverfahren gewonnen und durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Diese Behandlungen lieferten einen a7A021-Stamm, der ein 52 MD- Plasmid verloren hat, das ein ein anderes insektizides Protein codierendes Gen enthielt.
Nachdem der a7A021-Stamm sieben Tage bei 30ºC in flüssigem PY-Medium gezüchtet worden war, wurden die Zellen gesammelt, dreimal eingefroren und aufgetaut, in destilliertem Wasser suspendiert und durch Ultraschall homogenisiert, um eine kristalline Suspension zu erhalten. Ein Blatt von Cymbidium Kanran wurde in ein Aliquot der Suspension, die 2,2 · 10&sup7; Sporen pro ml enthielt, oder in ein verdünntes Aliquot, das 2,2 · 10&sup6; Sporen pro ml enthielt, getaucht. Anschließend ließ man Raupen von Plutella xylostella im Entwicklungsstadium 3 ("3-instar") das Blatt fressen.
Der Test zeigte, daß die Suspension mit einer Konzentration von 2,2 · 10&sup7; Sporen/ml 20 von 20 getesteten Raupen und bei einer Konzentration von 2,2 · 10&sup6; 12 von 20 Raupen tötete. Ein ähnlicher Test wurde mit Raupen von Spodoptera litura im Entwicklungsstadium 4 ("4-instar") durchgeführt, und eine Konzentration von 2,6 · 10&sup8; Sporen/ml tötete sieben von 20 Raupen.
Diese Testergebnisse zeigten, daß Bacillus thuringiensis aizawai a7A021 eine starke insektizide Aktivität bei beiden vorstehend beschriebenen schädlichen Insekten besaß.

B. Clonierung des Gens, das das von Bacillus thuringiensis aizawai a7A021 produzierte, insektizide Protein codiert

Schritt 1: Herstellung einer synthetischen DNA-Sonde

Die synthetischen DNA-Sonden 5'-CACAAATCCAGCACCGGG-3' und 5'-CCTCCATAAGGAGTATTT-3' wurden ausgehend von der Nucleotidsequenz des Gens hergestellt, das das von Bacillus thuringiensis kurstaki HD-1-Dipel (Whiteley et al., J. Biol. Chem. 260 (1985), 6264-72) produzierte Protein codiert.
Die DNA-Oligomere wurden unter Verwendung des DNA- Synthesizers Model 380A (Applied Biosystem Co.) hergestellt.
Eine 27% NH&sub4;OH-Lösung (1 ml) wurde einem DNA-Kollektor zugesetzt, der anschließend 4 Stunden auf 55ºC erhitzt wurde. Nachdem die Lösung zur Trockne konzentriert worden war, wurde der Rückstand in 100 ul 0,01 M Triethylaminessigsäure (TEAA) (pH-Wert 7,2) gelöst. Das Gemisch wurde in eine Umkehrphasen-HPLC-Säule C18 injiziert und mit einem Acetonitril-0,1 M TEAA (pH-Wert 7,2) enthaltenden Lösungsmittelsystem eluiert. Die Fraktionen, die bei 260 nm einen Absorptionsgipfel aufwiesen, wurden gesammelt und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand, dem 100 ul Acetonitril- 80% Essigsäure zugesetzt worden war, wurde 15 Minuten stehengelassen, wobei das Gemisch eine blaß orangene Färbung annahm. Nach der Farbänderung wurde das Gemisch zur Trockne eingedampft und mit 100 ul 0,01 M TEAA (pH-Wert 7,2) und anschließend mit 100 ul Ethylacetat vermischt. Die Phase aus Ethylacetat wurde verworfen und dem Rückstand Diethylether zugesetzt. Nachdem diese Behandlung zweimal wiederholt worden war, wurde das Gemisch zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in 0,01 M TEAA (pH-Wert 7,2) gelöst und einer Umkehrphasen-HPLC unterzogen. Fraktionen, die bei 260 nm einen Absorptionsgipfel aufwiesen, wurden gesammelt, zur Trockne eingedampft und in einer Lösung aus 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5) + 1 mM EDTA (TE-Lösung) gelöst.
Die erhaltenen synthetischen DNA-Sonden wurden, wie nachstehend beschrieben, mit ³²P markiert. 5 ul synthetische DNA-Sonde (ca. 100 pmol) wurden 15 Einheiten E. coli- Polynucleotidkinase, 100 uCi [γ-³²P)ATP und 10 ul 10fach Reaktionsgemisch (0,5 M Tris-HCl, pH-Wert 7,6, 0,1 M MgCl&sub2; und 0,1 M 2-Mercaptoethanol) zugesetzt und anschließend destilliertes Wasser zu einem Gesamtvolumen von 100 ul zugesetzt. Das Gemisch wurde eine Stunde bei 37ºC umgesetzt, unter Rühren Chloroform und Phenol (1 : 1) zugesetzt und der überstand abgetrennt. Der Überstand wurde auf eine DE-52- Säule (Bettvolumen: 0,5 ml, Whattman) aufgetragen, die mit TE-Puffer (pH-Wert 7,5) äquilibriert worden war. Nachdem mit 3 ml TE-Puffer (pH-Wert 7,5) gewaschen worden war, wurde die Säule mit 0,7 M NaCl-TE-Puffer (pH-Wert 7,5) eluiert, wobei die radioaktiven Fraktionen abgetrennt wurden, um eine ³²P- markierte synthetische DNA-Sonde zu erhalten.

Schritt 2: Herstellung einer chromosomalen DNA-Bank von Bacillus thuringiensis aizawai a7A021

Bacillus thuringiensis aizawai a7A021 wurde in 250 ml flüssiges PY-Medium geimpft und über Nacht gezüchtet. Die Zellen wurden durch 10-minütige Zentrifugation der Kultur mit 6 000 Upm gesammelt und mit 100 ml einer Lösung aus 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,9) und 10 mM EDTA gewaschen. Die Zellen wurden erneut gesammelt, in 10 ml einer 150 mM NaCl und 100 mM EDTA (pH-Wert 7,9) enthaltenden Lösung suspendiert, und es wurde Lysozym zu einer Endkonzentration von 0,25 mg/ml zugesetzt. Nachdem das Gemisch eine Stunde bei 37ºC inkubiert worden war, wurden unter langsamem Rühren 13 ml einer Lösung aus 100 mM Tris-HCl (pH- Wert 7,9), 100 mM NaCl und 2% SDS zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wurde viermal mit einem Phenol-Chloroform (1 : 1)- Gemisch, das mit der vorstehend erwähnten SDS-Lösung gesättigt war, extrahiert und die obere Phase abgetrennt. Der Phase wurden 2 Volumina kaltes Ethanol zugesetzt und der erhaltene weiße Niederschlag unter Verwendung eines Glasstabes gewonnen. Der Niederschlag wurde dreimal mit 80% Ethanol gewaschen, getrocknet und in 200 ul destilliertem Wasser suspendiert.
Die gesamte erhaltene DNA (10 ug) wurde mit dem Restriktionsenzym AhaIII (10 Einheiten) eine Stunde bei 37ºC in einem 30 ul AhaIII-Reaktionsgemisch (10 mM Tris-HCl, pH- Wert 7,5, 60 mM NaCl, 7 mM MgCl&sub2;, 10 mM EDTA und 1 mM Dithiothreit) gespalten und das erhaltene Gemisch einer Agarose-Gelelektrophorese unter Verwendung eines 0,1 ug/ml Ethidiumbromid enthaltenden 0,8% LGT-Agarosegels unterzogen. Eine Bande, die 3,5 kb AhaIII-gespaltene DNA-Fragmente enthielt, wurde unter einer UV-Lampe aus dem Gel ausgeschnitten und das ausgeschnittene Gel 5 Minuten bei 65ºC in einem Teströhrchen erhitzt. Dem geschmolzenen Gel wurden zwei Volumina TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, und 0,5 mM EDTA) zugesetzt und das Gemisch wurde mit Phenol, das mit TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, und 1 mM EDTA) gesättigt war, extrahiert. Nach 5-minütiger Zentrifugation mit 10 000 Upm (7 000 g) wurde die obere Phase abgetrennt, 1/40 Volumen 4 M NaCl sowie 2 Volumina Ethanol zugesetzt und zur Ausfällung der DNA 10 Minuten bei -80ºC stehengelassen. Die DNA wurde nach einer 10-minütigen Zentrifugation (10 000 Upm, 7 000 g) gewonnen und in 10 ul destilliertem Wasser suspendiert.
Außerdem wurden 5 ug pUC18-Plasmid mit 5 Einheiten des Restriktionsenzyms HincII gespalten. Phenol, das mit dem gleichen Volumen TE-Puffer gesättigt war, wurde unter Schütteln zugesetzt und die obere Phase abgetrennt. Die DNA wurde mit Ethanol ausgefällt und in 20 ul destilliertem Wasser suspendiert. Der Suspension wurden 5 ul alkalische Phosphatase von E. coli (2 Einheiten), 50 ul 0,1 M Tris-HCl- Puffer (pH-Wert 8,0) und 1,5 ul destilliertes Wasser zugesetzt, das Gemisch eine Stunde bei 60ºC inkubiert und mit alkalischer Phosphatase behandelt. Anschließend wurde das Gemisch zweimal mit Phenol/Chloroform behandelt und die obere Phase abgetrennt. Die DNA wurde durch Zugabe von Ethanol ausgefällt und der Niederschlag in destilliertem Wasser suspendiert.
Die AhaIII-gespaltene DNA (10 ul) und die Hincll-gespaltene pUC18-Vektor-DNA (10 ul) wurden vereinigt. Dem Gemisch wurde 1 ul T4-DNA-Ligase (0,1 Einheiten), 7,5 ul 0,1 M Dithiothreit, 7,5 ul 10 mM Adenosintriphosphat, 3fach 25 ul Reaktionsgemisch (200 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,6, und 20 mM MgCl&sub2;) und 5 ul destilliertes Wasser zu einem Gesamtvolumen von 75 ul zugesetzt und das erhaltene Gemisch 6 Stunden bei 14ºC inkubiert. Das Reaktionsgemisch (10 ul) wurde mit 100 ul kompetenter Zellen (100 ul) von E. coli DH1 (ATCC 33849) vereinigt, die gemäß der Lehre von Scott, Cell Technology 2 (1983), 616-626, hergestellt worden waren, und das vereinigte Gemisch 15 Minuten bei 0ºC inkubiert. Nach einem 40- sekündigen Hitzeschock bei 42ºC wurden 0,9 ml flüssiges L- Brühemedium, das durch Zugabe von 10 g Trypton, 5 g NaCl, 5 g Hefeextrakt, 1 g Glucose und destilliertem Wasser zu einem Gesamtvolumen von 1 Liter hergestellt worden war, zugesetzt. Das Gemisch wurde eine Stunde bei 37ºC inkubiert und auf eine Agarplatte mit L-Brühe plattiert, die durch Zugabe von Agar zu einem flüssigen L-Brühemedium bis zu einer Konzentration von 1,2% hergestellt worden war, wobei sie eine Endkonzentration von 50 ug/ml Ampicillin enthielt.

Schritt 3: Identifizierung und Isolierung des das insektizide Protein codierenden Clons durch Koloniehybridisierung

Die Kolonien auf der Platte wurden auf zwei Nitrozellulosefilter Replika-plattiert. Diese Kolonien wurden außerdem auf eine 50 ug/ml Ampicillin und 600 ug/ml Chloramphenicol enthaltende Agarplatte transferiert und anschließend über Nacht inkubiert.
Jedes Filter wurde fünf Minuten mit 2,5 ml 0,5 N NaOH behandelt, an der Luft getrocknet und fünf Minuten nach der Zugabe des gleichen Volumens von 1 M Tris-HCl, pH-Wert 7,5, stehengelassen. Das Filter wurde an der Luft getrocknet, mit 2,5 ml 1 M Tris-HCl, pH-Wert 7,5, sowie fünf Minuten mit 1,5 M NaCl behandelt, erneut an der Luft getrocknet und drei Stunden im Vakuum bei 80ºC gehalten. Jedes der vier Filter wurde mit 10/4 mM/l 0,1% SDS-4 · SCC 15 Minuten bei 60ºC behandelt, wobei SCC aus 0,15 M NaCl-0,015 M Natriumcitrat, pH-Wert 7,5, bestand. Nachdem die Kolonien von den Filtern abgewaschen worden waren, wurden letztere drei Stunden bei 60ºC in 6 ml Vorhybridisierungslösung, die aus 4 · SCC, 10 · Denhardt-Lösung und 100 ug/ml einzelsträngiger DNA vom Lachshoden bestand, wobei die 10 · Denhardt-Lösung aus 0,2% Ficoll, 0,2% Polyvinylpyrrolidon und 0,2% BSA bestand. Anschließend wurden die Filter in eine Hybridisierungslösung getaucht, die aus der vorstehend beschriebenen Vorhybridisierungslösung und der in Schritt 1 hergestellten ³²P- markierten DNA-Sonde bestand, und über Nacht bei 56ºC inkubiert. Nach der Hybridisierung wurden die Filter viermal 15 Minuten bei 56ºC mit 4 · SCC-0,1% SDS-Lösung gespült, an der Luft getrocknet, zwischen Röntgenfilme gelegt und eine Autoradiographie durchgeführt. Die positiven Kolonien wurden von den Masterplatten selektiert. Die gleiche Koloniehybridisierung wurde wiederholt durchgeführt, um die positiven Clone E. coli DH1/pCA5 und DH1/pCA1 zu isolieren.

Schritt 4: Analyse des Gens, das das vom Stamm aizawai a7A021 produzierte insektizide Protein codiert

Die Plasmide pCA5 und pCA1 wurden jeweils gemäß der Lehre von Birnboim und Doly (Nucl. Acids. Res. 7 (1979), 1513-1523) aus den positiven Clonen E. coli DH1/pCA5 und DH1/pCA1 isoliert. Die Plasmide pCA5 und pCA1 wurden jeweils mit den Restriktionsenzymen ClaI, EcoRI, SacI, HindIII und KpnI gespalten und durch 0,7% Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Eine Restriktionskarte der inserierten DNA (ca. 3,5 kb) ist in Fig. 1 dargestellt. Die Analyse der DNA zeigte, daß sich die Plasmide pCA1 und pCA5 lediglich im Hinblick auf die Orientierung der inserierten DNA unterschieden.
Zur Ermittlung der Basensequenz wurde das Plasmid pCA5 mit mehreren Restriktionsenzymen gespalten und die erhaltenen Fragmente wurden gemäß dem von Birnboim und Doly (Nucl. Acids. Res. 7 (1979), 1513-1523) beschriebenen Verfahren in die Vektorplasmide pUC8 und pUC9 subcloniert. Die erhaltenen Plasmid-DNAs wurden in 18 ul TE-Puffer (pH-Wert 7,5) suspendiert, 2 ul 2 N NaOH zugesetzt und fünf Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Nach Zugabe von 8 ul 7,5 M Ammoniumacetat wurden die DNAs durch Zugabe von 100 ul kaltem Ethanol ausgefällt. Das Gemisch wurde fünf Minuten mit 12 000 Upm (7 000 g) zentrifugiert, um den Niederschlag zu gewinnen, der anschließend getrocknet und mit einer Konzentration von 0,5 pmol/5 ml in destilliertem Wasser gelöst wurde.
Den vorstehend erhaltenen DNAs (5 pmol) wurden 10 · 1,5 ul Klenow-Puffer, 1 ul Primer-DNA und 4,5 ul destilliertes Wasser zu einem Gesamtvolumen von 12 ul zugesetzt, das Gemisch wurde 15 Minuten bei 60ºC erhitzt und 20 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen.
Das vorstehend beschriebene Reaktionsgemisch wurde mit 2 ul [γ-³²P]ATP (400 Ci/mmol) und 1 ul Klenow-Fragmentenzym (2 Einheiten) vereinigt. Vom erhaltenen Gemisch wurden 4 Aliquots mit jeweils 3,2 ul jeweils einer von vier Arten von dNTP + ddNTP-Gemischen (2 ul) zugesetzt und die erhaltenen Lösungen 20 Minuten bei 42ºC stehengelassen. Jeder Lösung wurde 1 ul CHASE-Lösung zugesetzt, 20 Minuten bei 42ºC stehengelassen und diese schließlich mit 6 ul 95% Formamid-Farbstoff, der 0,1% Bromphenolblau und 0,1% Xylolcyanol enthielt, vereinigt. Jede so erhaltene Lösung (2 ul) wurde auf ein in üblicher Weise hergestelltes 6% Acrylamid/Harnstoffgel aufgetragen und sechs Stunden einer Elektrophorese mit 1 700 V unterzogen. Das Gel wurde getrocknet, zwischen Röntgenfilme gelegt, exponiert und die Basensequenz der DNA ermittelt (Fig. 2).
Wie in der Figur gezeigt ist, umfaßt das Gen, das das von Bacillus thuringiensis aizawai a7A021 produzierte insektizide Protein codiert, die aus 3 531 Basenpaaren bestehende codierende Region einschließlich des Startcodons ATG und des Stopcodons TAA. Das Gen codiert 1176 Aminosäuren.

C. Produktion von insektizidem Protein, das von Bacillus thuringiensis aizawai a7A021 von Natur aus produziert wird, in E. coli

(1) Produktion von insektizidem Protein durch E. coli JM 103/pCA1 und JM103/pCA5

Die Plasmide pCA5 und pCA1 wurden aus den vorstehend beschriebenen positiven Clonen DH1/pCA5 bzw. DH1/pCAl isoliert und in einer üblichen Weise in E. coli JM103 transformiert, wobei die Transformanten E. coli JM103/pCA5 bzw. JM103/pCA1 erhalten wurden.
E. coli JM103/pCA5 und JM103/pCA1 wurden über Nacht in einem flüssigen L-Brühemedium gezüchtet und 0,1 ml der Übernachtkultur in 10 ml flüssiges L-Brühemedium überführt, das anschließend 15 Stunden bei 37ºC gezüchtet wurde. Ein Aliquot (0,3 ml) der Kultur wurde 15 Minuten mit 3 000 Upm zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln, die anschließend in 50 ul eines Probenpuffers (62,5 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 2 % (Gew./Gew.) Natriumdodecylsulfat, 5% (Vol./Vol.) 2- Mercaptoethanol, 10% (Gew./Gew.) Glycerin und 0,01% Bromphenolblau) suspendiert wurden. Die Suspension wurde fünf Minuten auf 100ºC erhitzt und gemäß dem Verfahren von Laemmli et al., Nature 227, S. 680-685, eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese durchgeführt. Nach Abschluß der Elektrophorese wurde das Gel mit Coomassie-Brilliantblau angefärbt, getrocknet und an einem Filterpapier fixiert.
E. coli JM103/pCA1 wurde in der gleichen, vorstehend beschriebenen Weise behandelt.
Eine Bande, die das insektizide 130 kd-Protein enthielt, wurde sowohl in E. coli JM103/pCA5 als auch in JM103/pCA1 nachgewiesen. Die Bande zeigte eine Kreuzreaktion mit einem Antikörper (IgG) gegen das insektizide Protein. Eine quantitative Analyse der Bande durch ein Densitometer zeigte, daß E. coli JM103/pCA1 und JM103/pCA5 1% bzw. 8% des insektiziden Proteins pro Gesamtprotein produzierten. Es wurde angenommen, daß 72 Basenpaare der 5'-nichttranslatierten Region der inserierten DNA einen in E. coli funktionellen Promotor enthielten.

(2) Produktion des insektiziden Proteins durch E. coli JM103/pKC6

Schritt 1: Herstellung des Plasmidvektors

Etwa 5 ug des Expressionsvektors pKK223-3 wurden mit dem Restriktionsenzym BamHI (0,1 Einheiten) 15 Minuten bei 37ºC in einem BamHI-Reaktionsgemisch (10 mM Tris-HCl, pH- Wert 8,0, 7 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl, 2 mM 2-Mercaptoethanol und 0,01% Rinderserumalbumin) gespalten. Das erhaltene Gemisch wurde einer Agarose-Gelelektrophorese unter Verwendung eines 0,8% LGT-Agarosegels, das 0,1 ug/ml Ethidiumbromid enthielt, unterzogen. Eine Bande, die ein DNA-Molekül (4,6 kb) enthielt, von dem angenommen wurde, daß es durch partielle Spaltung einer von zwei Restriktionserkennungsstellen in pKK223-3 erzeugt worden war, wurde unter einer UV-Lampe ausgeschnitten, in ein Teströhrchen überführt und 5 Minuten bei 65ºC erhitzt. Das Gel wurde geschmolzen, mit Phenol extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Die gewonnene DNA wurde in 20 ul destilliertem Wasser suspendiert. Der DNA ( 1 ug) wurde T4-DNA-Ligase (3 Einheiten) zugesetzt und das Gemisch zwei Stunden bei 16ºC in 45 ul Ligase-Reaktionsgemisch (66 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,6, 6,6 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreit, 1 mM ATP) umgesetzt.
Anschließend wurde E. coli JM103 mit der erhaltenen Lösung gemäß dem von Cohen (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, S. 2110-2114) beschriebenen Verfahren transformiert. Die erhaltenen Ampicillin-resistenten Kolonien wurden zur Herstellung der Plasmid-DNAs gemäß dem von Birnboim und Doly (Nucl. Acids. Res. 7 (1979), 1513-23) beschriebenen Verfahren gezüchtet. Etwa 1 ug der Plasmid-DNAs wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI (3 Einheiten) eine Stunde bei 37ºC in einem BamHI-Reaktionsgemisch gespalten und eine Agarose- Gelelektrophorese durchgeführt. Ein Plasmid, das eine BamHI- Stelle zur Mehrfachclonierung behalten und die andere BamHI- Stelle, die im Plasmid pKK223-3 vorhanden war, verloren hatte, wurde selektiert und erhielt die Bezeichnung pKK223- 4. Die pKK223-4-DNA ( 5 ug) wurde mit den Restriktionsenzymen PstI (10 Einheiten) und BamHI (10 Einheiten) eine Stunde bei 37ºC in 50 ul PstI-Reaktionsgemisch (10 mM Tris- HCl, pH-Wert 7,5, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM 2- Mercaptoethanol und 100 ug/ml Rinderserumalbumin) gespalten. Nach einer Phenolextraktion und Ethanolfällung wurde die DNA gewonnen und in 20 ul destilliertem Wasser suspendiert.

Schritt 2: Herstellung des PstI-BamHI-Fragments, das das insektizide Protein codierende Gen enthielt

Etwa 5 ug des Expressionsplasmids pCA5, das das Gen enthielt, das das insektizide Protein codierte, wurden mit etwa 20 Einheiten PstI und etwa 20 Einheiten BamHI eine Stunde bei 37ºC in 50 ul PstI-Reaktionsgemisch (10 mM Tris- HCl, pH-Wert 7,5, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM 2-Mercaptoethanol und 100 ug/ml Rinderserumalbumin) gespalten und das erhaltene Gemisch mit 30 ul Phenol, das mit TE-Puffer gesättigt war, vereinigt. Die obere Phase wurde nach einer fünf-minütigen Zentrifugation mit 10 000 Upm (7 000 g) abgetrennt, 1/40 Volumina 4 M NaCl und zwei Volumina Ethanol zugesetzt und 10 Minuten bei -80ºC stehengelassen. Die DNA wurde durch 10-minütige Zentrifugation mit 10 000 Upm (7 000 g) gewonnen, getrocknet und in 20 ul destilliertem Wasser suspendiert.

Schritt 3: Konstruktion des Expressionsplasmids pKC6

Jeweils 1 ug des PstI-BamHI-gespaltenen Vektors pKK223-4 aus Schritt 1 und des PstI-BamHI-Fragments aus Schritt 2 wurden vereinigt. Das Gemisch wurde zwei Stunden bei 16ºC in 45 ul Ligase-Reaktionsgemisch nach Zugabe von 7,2 Einheiten T4-Ligase umgesetzt. Gemäß dem Verfahren von Cohen (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110-2114) wurde das erhaltene Gemisch zur Transformation von E. coli JM103 verwendet. Die Ampicillin-resistenten Kolonien wurden selektiert und gezüchtet, um Plasmid-DNA herzustellen. Etwa 1 ug des erhaltenen Plasmids wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI (3 Einheiten) eine Stunde bei 37ºC in 30 ul BamHI- Reaktionsgemisch gespalten und durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Ein Plasmid, das stromabwärts vom Tac- Promotor das Gen enthielt, das das insektizide Protein codierte, wurde selektiert und erhielt die Bezeichnung pKC6 (Fig. 4).

Schritt 4: Herstellung des insektiziden Proteins durch E. coli JM103/pKC6

Im wesentlichen gemäß dem in Beispiel 1-C-(1) beschriebenen Verfahren wurde mit der E. coli JM103/pKC6- Kultur eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese durchgeführt. Eine Bande, die das insektizide 130 kd-Protein enthielt, wurde beobachtet, die mit einem Antigen (IgG) des insektiziden Proteins eine spezifische Kreuzreaktion zeigte. Eine densitometrische Bestimmung der nachweisbaren Banden auf dem Gel zeigte, daß das durch den Stamm produzierte insektizide Protein 35% des Gesamtproteins ausmachte (Fig. 3). Somit bestätigte sich, daß E. coli JM103/pKC6 das durch Bacillus thuringiensis aizawai a7A021 natürlich erzeugte insektizide Protein effizient produzierte.

D. Beurteilung des in E. coli produzierten insektiziden Proteins

Der vorstehend erhaltene E. coli-Stamm wurde über Nacht in flüssigem L-Brühemedium gezüchtet. Die erhaltene Kultur (1,0 ml) wurde auf 100 ml flüssiges L-Brühemedium übertragen und 16 Stunden bei 37ºC gezüchtet. Die Zellen wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 37ºC mit 7 000 Upm (5 000 g) gesammelt. Anschließend wurden die Zellen bei -80ºC eingefroren und anschließend bei Raumtemperatur aufgetaut. Die Behandlung wurde dreimal wiederholt. Die Zellen wurden in 20 ml TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, und 1 mM EDTA) suspendiert und dreimal 60 Sekunden mit Ultraschall behandelt. Die Rohsuspension wurde 10 Minuten mit 7 000 Upm (5 000 g) zentrifugiert und die erhaltenen Niederschläge einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen, die zeigte, daß etwa 80% des in den Niederschlägen enthaltenen Gesamtproteins aus dem insektiziden Protein bestand.
Die vorstehend erhaltene Rohsuspension von E. coli JM103/pKC6 tötete neun von 10 Raupen von Spodoptera litura, wobei die Tests mit einer Konzentration von 4 mg/ml der Niederschläge pro Milliliter Suspension durchgeführt wurden, und zwei von 10 Raupen von Plutella xylostella bei einer Konzentration von 2 ug/ml.
Das vorstehend beschriebene Experiment hat gezeigt, daß durch Züchtung von E. coli JM103/pKC6 in einem geeigneten Kulturmedium eine signifikante Menge des insektiziden Proteins erhalten werden kann, das zur Bekämpfung von schädlichen Insekten, beispielsweise von Spodoptera litura und Plutella xylostella, nützlich ist.

Claims

1. Gen, das ein insektizides Protein mit der in Fig. 2 dargestellten Aminosäuresequenz codiert.

2. Gen nach Anspruch 1, das den codierenden Bereich der in Fig. 2 dargestellten DNA-Sequenz umfaßt.

3. Gen, das mit einem Gen von Anspruch 1 oder 2 verwandt ist durch Insertionen, Deletionen und/oder Substitutionen von einem oder mehreren Nucleotiden und das ein insektizides Protein mit der biologischen Aktivität des in Fig. 2 dargestellten insektiziden Proteins codiert.

4. Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das abgeleitet ist von Bacillus thuringiensis aizawai a7A021, wobei der Stamm erhältlich ist durch Züchten von Bacillus thuringiensis aizawai IPL Nr. 7 (FERM BP-1150) mit Acridinorange, wodurch ein 52 MD-Plasmid verlorengeht.

5. Plasmid pCA1 oder pCA5, umfassend die in Fig. 2 dargestellte DNA-Sequenz, inseriert in die HincII-Spaltstelle des Plasmids pUC18, wobei die Plasmide die in Fig. 1 angegebenen Restriktionskarten haben und die genannte DNA-Sequenz in unterschiedlichen Orientierungen enthalten.

6. Expressionsplasmid, das ein Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 4 umfaßt.

7. Expressionsplasmid nach Anspruch 6, das das Plasmid pKC6 (ATCC 67487) ist.

8. Wirtsmikroorganismus, der ein Plasmid nach einem der Ansprüche 5 bis 7 enthält.

9. Wirtsmikroorganismus nach Anspruch 8, der E. coli ist.

10. Insektizides Protein, das von einem Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert wird.

11. Verfahren zur Herstellung eines insektiziden Proteins nach Anspruch 10, umfassend das Züchten eines Wirtsmikroorganismus nach Anspruch 8 oder 9.