DE69105188T2 - Asporogener Stamm von Bacillus substilis und seine Verwendung als Wirt in der Herstellung von heterologen Produkten. - Google Patents
Asporogener Stamm von Bacillus substilis und seine Verwendung als Wirt in der Herstellung von heterologen Produkten.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft den asporogenen Bacillus subtilis-Stamm SMS 275 CMS 432.90 und dessen Verwendung als Wirt in einem Wirts-Vektor-System für die Herstellung verschiedenartiger Produkte,
- Es ist bekannt, Proteine und Polypeptide mittels Fermentationsverfahren herzustellen, die sich bestimmter Produktionssysteme bedienen, wobei dieser Ausdruck die Kombination von einem Expressionsvektor, der das das Protein oder Polypeptid kodierende Gen enthält, und dem Wirt wiedergibt.
- Die meisten derzeit auf dem Markt befindlichen gentechnischen Produkte werden herstellt unter Verwendung von Produktionssystemen, bei denen Escherichia coli, CHO-Zellen oder Saccaromyces cerevisiae als Wirte eingesetzt werden.
- Diese Systeme sind jedoch nicht völlig zufriedenstellend, so daß ein Bedürfnis zur Bereitstellung von anderen Produktionssystemen für die Gewinnung von verschiedenartigen Produkten besteht, die im wesentlichen auf dem Einsatz von Bakterien, wie Bacillus und Streptomyces, oder Hefen und Pilzen, wie Kluyveromyces lactis und Yarrowia lipolytica oder Zellen von Insekten beruhen.
- Aus industrieller Sicht her sollte ein ideales Produktionssystem die Herstellung eines gentechnischen Produkts ermöglichen, das leicht zu reinigen ist und eine biologische Aktivität aufweist, die mit der des natürlichen Proteins übereinstimmt, und dies noch mit hoher Ausbeute und zu wirtschaftlich attraktiven Kosten.
- Ein solches System soll aufgebaut sein aus:
- 1) einem Vektor mit einem Gehalt an stark regulierenden Elementen (Promotor und Terminator), von dem viele Kopien in den Zellen vorhanden sind und der in den Zellen in einem stabilen Zustand bewahrt ist, so daß das erwünschte Produkt in hoher Ausbeute erhalten werden kann, und
- 2) einem Wirt, der die für die verschiedenen Gene erforderlichen Instruktionen genau erfüllt, so daß die Herstellung von einem mit dem Naturprodukt identischen Produkt ermöglicht wird, und der zur Kultur in kommerziellen Rahmen verwendbar ist, d. h. resistent ist, bis zu hohen Dichten wachsen kann, nicht viele Ansprüche in Bezug auf die Nährstoffe stellt und sicher ist, also keine toxischen Verunreinigungen bildet.
- Derzeit besteht ein beträchtliches Interesse an der Entwicklung von Expressionssystemen zur Herstellung von gentechnischen Produkten mittels Bacillus subtilis (B. subtilis).
- In der Tat ist aus biotechnologischer Sicht B. subtilis ein besonders attraktiver Mikroorganismus, und zwar auf Grund seiner völlig nicht-pathogenen Natur, seiner Fähigkeit zur Sekretion vom gentechnischen Produkt in das Kulturmedium und schließlich der Leichtigkeit, mit der die Vermehrung in einem breiten Bereich möglich ist.
- Die Verwendung von B. subtilis als Wirt für die Expression von verschiedenartigen, für die pharmazeutische und Lebensmittel-Industrie interessierenden Proteinen und Polypeptiden ist daher ein wichtiger Faktor für die Zulassung von Verfahren zur Gewinnung von diesen Produkten.
- Eine partielle Kontraindikation in Bezug auf den Einsatz von diesem Mikroorganismus besteht jedoch darin, daß er unter bestimmten physiologischen Wuchsbedingungen Sporen zu bilden vermag.
- Tatsächlich haben Sporen, die durch eine hohe Widerstandskraft gegen chemischphysikalische Mittel gekennzeichnet sind, ein hohes Überlebensvermögen unter den meisten normalen Umgebungsbedingungen.
- Die Verwendung eines rekombinanten B. subtilis-Stammes bei einem Verfahren zur Herstellung von auf dem Gebiet der Pharmazeutika und Ernährung im Interesse stehenden Produkten kann demzufolge auf rechtliche Schwierigkeiten stoßen, sofern nicht gezeigt wird, daß nur eine geringe Wahrscheinlichkeit für die Bildung und Abgabe jedweder Sporen in die äußere Umgebung besteht.
- Die Bildung von Endosporen bei B. subtilis ist ein Zell-Differenzierungsprozeß, der auf Grund von sequentiellen Änderungen in der Physiologie der Zellen und deren Ultrastruktur als Ergebnis von den Bedingungen, unter denen die Nährstoffe begrenzt sind, vor sich geht.
- Während der Sporenbildung, die durchschnittlich zwischen 6 und 8 Stunden bei 37 ºC erfolgt, durchläuft die Zelle eine Reihe von wohl-definierten morphologischen Stufen, die - innerhalb vom Sporangium - mit der Bildung von einer alternativen Zellform zu der vegetativen Gestalt, den Endosporen, endet.
- Diese Stufen, üblicherweise als Stufen 0 bis VII bezeichnet, erfordern eine Reihe von Substanzen, die durch verschiedene Gene die spo-Gene kodiert sind.
- Die Gewinnung von B. subtilis-Stämmen, die keine Sporen bilden (sogenannte asporogene Stämme), durch Mutation von einem spo-Gen mittels chemischer oder physikalischer Agentien oder Anwendung von mutagenen Techniken in vitro ist an sich bekannt.
- Die Mutanten, die nicht mehr länger die Bildung von Sporen ausreifen lassen, können theoretisch zur Gewinnung von heterologen Proteinen eingesetzt werden.
- Indessen wurde gefunden, daß einige der Mutanten nicht völlig zufriedenstellende Wirte für die Entwicklung von Systemen zur asporogenen Expression von B. subtilis waren, und zwar wegen der Instabilität des spo&supmin;-Phänotyps, wegen des Unvermögens den Expressionsvektor in stabilem Zustand zu halten und schließlich wegen der geringen Anzahl von Kopien des in dem Stamm vorliegenden Vektors.
- Eine asporogene Mutante von B. subtilis, die die zuvor beschriebenen Probleme überwindet, wurde nun isoliert. Diese Mutante, bekannt als SMS 275, wurde am 5. Oktober 1990 bei dem Centraalbureau Voor Schimmelcultures hinteriegt und erhielt dort die Nummer CBS 432.90.
- Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher der asporogene Bacillus subtilis- Stamm SMS 275.
- Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung dieses Stammes als Wirt in einem Wirts-Vektor-System bei der Herstellung von heterologen Produkten.
- Ein noch weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von verschiedenartigen interessanten Produkten, das die Transformation des asporogenen Bacillus subtilis-Stammes SMS 275 durch einen Expressionsvektor mit dem Gehalt an dem Gen zur Kodierung des heterologen Produkts die Vermehrung des transformierten Bacillus subtilis-Stammes SMS 275 in einem geeigneten Kulturmedium und schließlich die Abtrennung und Reinigung des gebildeten Gen-Expressions- Produkts umfaßt.
- Insbesondere ist der erfindungsgemäße asporogene Stamm Bacillus subtilis SMS 275 charakterisiert durch die Genmarker spoII:D&supmin;, leu (Unfähigkeit zum Wachsen im Minimalmedium in Abwesenheit von Leucin), pyrD1 (Unfähigkeit zum Wachsen im Minimalmedium in Abwesenheit von Uracil), apr&supmin; und npr&supmin; (Unfähigkeit zur Bildung von serinischer Protease und neutraler Protease).
- Der Stamm kann auch den spo&supmin;-Phänotyp in einem stabilen Zustand bewahren und tatsächlich die Bildung von Sporen auf eine Frequenz von weniger als etwa 10&supmin;&sup8; zurückschlagen und vermag eine große Anzahl von Kopien von einem replizierbaren Expressionsvektor in stabilem Zustand zu halten.
- Die für die Bildung des erfindungsgemäßen asporogenen Stammes angewendete Vorgehensweise beruht auf der Mutation eines asporogenen Stammes von B. subtilis durch ein Transposon und der Isolierung der so gebildeten asporogenen Mutanten.
- Transposone sind Elemente der DNA, die an verschiedene Stellen des Genoms gebracht und eingefügt werden können und dem Wirtsstamm neue erbliche Eigenschaften verleihen. In der Tat übertragen Transposone, die Gene zum Kodieren der Resistenz gegen Antibiotika enthalten, nach ihrer Insertion in die Genomstellen ebenso wie die Unterbrechung der Gensequenz als Folge der phänotypischen Mutation an den Wirt die Beständigkeit gegen ein bestimmtes Antibiotikum.
- Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Transposon TN 917 (Tomich und Clewell, J. Bacteriol., 141 (1980), 1366-1574), das unter anderem die Beständigkeit gegen das Antibiotikum Erythromycin (Em) kodiert, eingesetzt.
- Die Mutation durch Insertion von einem Transposon kann durch Konjugation oder Transformation gemäß den bekannten Techniken vorgenommen werden.
- Der asporogene Stamm gemaß der vorliegenden Erfindung wird insbesondere hergestellt durch Transformieren des Wildtyp(sporogenen)-Stammes B. subtilis SMS 118 mit einem Plasmid, das in Bacillus nicht replikabel ist und das Transposon TN 917 enthält, und Auswahl der mutierten Stämme auf einem mit Erythromycin versetzten Medium.
- Genau gesagt, können nach der Theorie nur die Klone mit dem in die Chromosomen- DNA vom sporogenen Stamm integrierten Transposon TN 917 auf diesem Medium wachsen.
- Für diesen Zweck geeignete Plasmide sind z. B. : pTV1TS, pTV32TS oder pTV51TS (Youngmann et al, "Regulation of Prokaryotic development", ed. I. Smith, R. A. Slepacky und P. Settlow, American Soc. for Microbiology, 65-87 (1989)). Alternativ kann das Transposon TN 917 aus dem Plasmid pAD2 (Tomich und Clewell, J. Bacteriol., 141, 1366-1574 (1980)) isoliert und in ein in B. subtilis nicht replikables Plasmid eingebracht werden.
- Das Unvermögen der erythromycin-resistenten Klone zur Sporenbildung wurde sowohl durch Analyse mittels eines optischen Mikroskops als auch durch direkte Wiedergabe auf einem Sprulationsmedium untersucht, wo die Kolonien mit Sporenbildungsvermögen nach einigen Tagen eine braune Färbung zeigten, wohingegen die asporogenen Kolonien weiß blieben und zum Lysieren tendierten.
- Einige Em-resistenten (Emr) Transformanten zeigten bei der Analyse den spo&supmin;- Phänotyp.
- Einer der spo&supmin;-Transformanten, als SMS 275 bezeichnet, mit der Mutation in dem spoII:D-Gen wurde weiter überprüft auf Stabilität in Bezug auf leu, pyrD1, apr&supmin; und npr&supmin;-Genotyp.
- Die Analyse der leu und pyrD1-Marker wurde bewirkt durch Vermehrung des Stammes SMS 275 auf einem Minimalmedium in Abwesenheit und in Gegenwart von Leucin und Uracil. Die Fähigkeit des Stammes zum alleinigen Wachsen in dem Medium mit beiden Verbindungen belegt die Stabilität der Marker.
- Die Analyse der apr&supmin; und npr&supmin;-Marker wurde bewirkt durch Aufbringen des Stammes SMS 275 auf ein Maximalmedium, wie z. B. VY oder TBAB (DIFCO) mit einem Caseingehalt von 1 %. Die Abwesenheit von Ringen um die SMS 275-Kolonien beweist das Unvermögen des Stammes, die beiden Proteasen zu bilden.
- Schließlich wurde noch die Stabilität vom spo&supmin;-Phänotyp des Stammes SMS 275 durch Behandlung des Stammes bei hohen Temperaturen untersucht.
- Dieser Test basiert auf der Tatsache, daß Stämme, die keine Sporen bilden können (spo&supmin;-Phänotyp), eine verminderte Beständigkeit gegen kurze Behandlungen bei einer hohen Temperatur zeigen.
- Nachdem die Hitzebehandlung die Zellen zerstört, aber nicht die Sporen, sind die auf Platten wachsenden Kolonien diejenigen, die von Sporen stammen, welche während der Vermehrung in dem flüssigen Medium gebildet wurden und beim Schichten auf ein Maximalmedium zum Keimen in der Lage sind.
- Zu diesem Zweck wurde der Stamm SMS 275 in einem für die Sporenbildung geeigneten Medium bei 37 ºC während 24 Stunden vermehrt und dann einer Hitzebehandlung auf 80 ºC während etwa 10 Minuten unterworfen. Geeignete Verdünnungen der Kultur wurden auf ein Kanamycin und Chloramphenicol enthaltendes Maximalmedium ausgebreitet und danach die lebensfähigen Zellen (CFU) gezählt.
- Die Prüfung der Daten zeigte, daß die Frequenz, mit welcher der Stamm SMS 275 in den spo&spplus;-Phänotyp zurückfiel, weniger als 1 x 10&supmin;&sup8; war.
- Der Stamm B. subtilis SMS 275 erscheint daher besonders geeignet für den Einsatz als Wirt bei dem Wirt-Vektor-System zur Herstellung von verschiedenen, im Interesse stehenden Produkten.
- Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung besteht z. B. im Transformieren des asporogenen Stammes mit einem replizierbaren Expressionsvektor mit dem Gen für die Kodierung vom interessierenden heterologen Produkt, Vermehrung des transformierten asporogenen Stammes unter geeigneten Bedingungen, Isolierung und Reinigung des erhaltenen Gen-Expression sprod ukts.
- Geeignete Vektoren können aus Plasmiden ausgewählt werden, die in B. subtilis replizieren; sie sind über Laboratorien und Sammlungsstellen verfügbar.
- Die Transformation der B. subtilis SMS 275-Zellen durch diese Vektoren wird unter Anwendung von einer der üblichen Techniken durchgeführt.
- Der asporogene Stamm B. subtilis SMS 275 kann als Wirt für die Expression von Genen von Nutzen sein, die ein prokaryotisches Polypeptid, wie ein Enzym, z. B. alpha-Amylase, β-Amylase, etc., oder ein eukaryotisches Polypeptid, wie z. B. Interieucin, Interferon, menschliches Wachstumshormon oder Vorläufer davon kodieren.
- Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde der Stamm B. subtilis SMS durch das Plasmid pSM 274 transformiert, das die DNA-Sequenz enthält, welche den Vorläufer des menschlichen Wachstumshormons kodiert (vgl. EP-A-0 321 940).
- Der transformierte Stamm wurde dann auf eine optische Dichte von etwa 3 bis 4, gemessen bei einer Wellenlänge von 600 nm in einem Kulturmedium mit einem Gehalt an Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und Mineralsalzen vermehrt.
- Die Stabilität des Plasmids und das Vermögen des Stammes SMS 275 (pSM 274) zur Bildung des Vorläufers von hGH wurden dann untersucht.
- Die Ergebnisse belegten die Stabilität des Plasmids pSM 274, von dem eine große Anzahl von Kopien in den Zellen (Fig. 1A) vorliegt.
- Darüberhinaus zeigte die elekrophoretische Analyse der aus dem Stamm extrahierten, gesamt löslichen Proteine die Anwesenheit eines Strangs, der mit dem Vorläufer des menschlichen Wachstumshormons kouespondiert.
- Die Lebensfähigkeit des Stammes B. subtilis SMS 275 (pSM 274) wurde auch untersucht durch die Bestimmung der Anzahl der wachstumsfähigen Zellen je ml (CFU/ml) in einer während 6 Monaten in Glycerin gehaltenen Kultur.
- Die Ergebnisse ergaben, daß die Lebensfähigkeiten der Zellen unter den Lagerungsbedingungen gut war und der spo&supmin;-Phänotyp stabil blieb.
- Der asporogene Stamm B. subtilis SMS 275 mit dem Gehalt an dem Plasmid pSM 274 wurde bei dem Centraalbureau Voor Schimmelcultures am 5. Oktober 1990 hinterlegt und erhielt dort die Nummer CBS 433.90.
- Das Vergleichsbeispiel 4 beschreibt die Transformation von vom Stamm SMS 275 abweichenden B. subtilis spo&supmin;-Stämmen mit dem Plasmid pSM 274.
- Bei der Prüfung der Stabilität und der Anzahl der Paare vom Plasmid sowie für die Stabilität vom spo&supmin;-Phänotyp ergaben diese Stämme die folgenden Ergebnisse:
- - in dem Stamm SMS 268 mit der spoOF-Mutation war das Plasmid pSM 274 strukturell unstabil,
- - in dem Stamm SMS 270 mit der spoIIA1-Mutation waren weniger Kopien vom Plasmid pSM 274 vorhanden als beim Wildtyp-Stamm SMS 118,
- - in dem Stamm SMS 272 mit der spoIIF96-Mutation war das Plasmid stabil sowie die Anzahl der Kopien vergleichbar mit der bei dem Wildtyp-Stamm SMS 118.
- Aufgrund einer durch mikroskopische Beoabachtung erfolgten Schätzung neigt jedoch dieser Stamm zur Wiederannahme vom positiven Sporenbildungs-Phänotyp mit einer etwas höheren Frequenz.
- Darüberhinaus zeigte der Stamm SMS 272 eine geringere Lebensfähigkeit als der Stamm SMS 275 (pSM 274), sofern er z. B. in Glycerin gehalten wird.
- Nach der Zugabe von Glycerin war die Anzahl der lebensfihigen Zellen/ml der Kultur 3,7 x 10&sup7; CFU/ml; nach 7 Tagen hatte sich dieser Wert auf 73 %, nach 19 Tagen auf 68 % und nach 40 Tagen auf 54 % reduziert.
- Aus diesem Grund ist der Stamm SMS 272 für den Einsatz bei industriellen Fermentationsprozessen nicht geeignet.
- Die Zeichnungen werden in Kürze wie folgt erläutert:
- Fig. 1 (A und B):
- Elektrophoretische Analyse der DNA vom Plasmid pSM 274 auf Agarose-Gel:
- A. 1) pSM 274, Kontrolle, nicht digeriert;
- 2) pSM 274, Kontrolle, mit EcoRI und HindIII digeriert;
- 3) aus dem Stamm SMS 275 (pSM 274) extrahierte Plasmid-DNA, nicht digeriert;
- 4) aus dem Stamm SMS 275 (pSM 274) extrahierte Plasmid-DNA, digeriert mit EcoRI und HindIII;
- 5) Standard-Molekulargewichte.
- B. 1) bis 4) aus 2 Klonen des Stammes spoIID SMS 275 (pSM 274) extrahierte Plasmid-DNA, wobei im Falle von 1) und 3) die DNA nicht digeriert wurde sowie bei 2) und 4) eine Digerierung mit EcoRI ud HindIII erfolgte;
- 5) bis 8) aus 2 Klonen des Stammes spoIIA1 SMS 270 (pSM 274) extrahierte Plasmid-DNA, wobei im Falle von 5) und 7) die DNA nicht digeriert wurde sowie bei 6) und 8) eine Digerierung mit EcoRI und HindIII erfolgte;
- 9) Standard-Molekulargewichte;
- 10) bis 13) Plasmid-DNA, extrahiert aus 2 Klonen des Stammes spoIIF96 SMS 272 (pSM 274), wobei im Falle von 10) und 12) die DNA nicht digeriert wurde, jedoch bei 11) und 13) eine Digerierung mit EcoRI und HindIII erfolgte;
- 14) und 15) Plasmid-DNA, extrahiert aus 1 Klon des Stammes spoOF SMS 228 (pSM 274), wobei bei 14) die DNA nicht digeriert wurde, jedoch bei 15) eine Digerierung mit EcoRI und HindIII erfolgte.
- Fig. 2 (A bis F)
- Elektrophoretische Analyse an 12,5 %-igem Natriumdodecyl-polyacrylamidgel (SDSE-PAGE) von den aus dem Stamm SMS 275 (pSM 274) extrahierten Proteinen
- A) Standard (partiell gereinigter hGH-Vorläufer);
- B) Proteine, die aus einem SMS 275-Stamm extrahiert wurden, der mit dem keine Sequenz für die Kodierung des hGH-Vorläufers enthaltenden Kontrollplasmid pSM 214 transformiert war;
- C) - F) Proteine, die aus 4 Klonen von dem mit dem Plasmid pSM 274 transformierten Stamm SMS 275 extrahiert wurden.
- Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.
- Die Plasmid-DNA pTV5TS mit dem Gehalt an dem Transposon TN 917 (1 ug) wurde zum Transformieren von kompetenten B. subtilis SMS 118-Zellen gemäß der von Contente und Dubman in Mol. Genetics., 167, 251-258 (1979), beschriebenen Methode eingesetzt.
- Die Transformanten wurden selektiert durch Plattieren der Zellen auf 20 ml vom VY- Maximalmedium (Kalbsaufguß) (Kalbfleischkraftbrühe (DIFCO) 25 g/l, Hefeextrakt 5 g/l und Agar (DIFCO) 20 g/l) und Aufgießen von 5 ml Weichagar mit einem Gehalt an 125 ug Erythromycin auf die Platten und Inkubation der Platten bei 37 ºC während weiterer 18 Stunden.
- Die erythromycin-resistenten (Emr) Transformanten, d. h. diejenigen, in denen eine homologe Rekombination im Chromosomenbereich stattgefunden hatte, wurden auf ihre Unfähigkeit zur Bildung von Sporen hin untersucht.
- Zu diesem Zweck wurden die Emr-Kolonien auf Platten aus einem Schaeffer'schen Sporenbildungsmedium übertragen, das die folgende Zusammensetzung hat: Nährlösung (DIFCO) Agar (DIFCO) Züchtung bei 37 ºC.
- Nach einigen Tagen wurde die Bildung von Sporen durch eine Betrachtung unter einem optischen Mikroskop und auch auf Eintreten morphologischer Änderungen hin geprüft.
- Die Kolonien, bei denen sich Sporen bilden, zeigten tatsächlich eine typische Braunfärbung, wohingegen die asporogenen Kolonien klar blieben und zum Lysieren neigten.
- Die wie oben angeführt erhaltenen Resultate ermöglichten die Isolierung von einigen Emr-Transformanten mit dem asporogenen Phänotyp (spo&supmin;).
- Einer von diesen Transformanten mit der Mutation in dem spoII:D-Gen wurde durch die Symbole SMS 275 ausgewiesen.
- Der Stamm SMS 275 wurde weiterhin untersucht auf die Stabilität der Genmarker apr&supmin;, npr&supmin;, leu, pyrD1 und spo&supmin;.
- Insbesondere wurden Untersuchungen vorgenommen, um (i) die niedrige Protease-Aktivität im Nährmedium des Stammes (Hinweis auf Inaktivierung der Serin- Protease (apr)- und neutralen Protease (npr)-Gene), (ii) die Unfähigkeit des Stammes auf Vermehrung im Minimalmedium in Abwesenheit von Leucin und Uracil und (iii) die Unfähigkeit zur Sporenbildung zu prüfen.
- Die Protease-Aktivität wurde ermittelt durch Auftragen des Stammes SMS 275 auf VY-Maximalmedium mit 1 % Casein (Toma et al., J. Bacteriol., 147, 740-743(1986)). Das Nichtvorhandensein des charakteristischen Hydrolyserings um die Kolonien aufgrund der Wirkung der serinischen und neutralen Protease zeigte an, daß die beiden Enzyme nicht abgesondert worden sind.
- Keine der aus dem Stamm SMS 275 isolierten Kolonien hatte Hydrolyse-Ringe.
- Im Hinblick auf die Ernährungserfordernisse für Leucin (leu) und Uracil (pyrD1) wurden indessen die Kontrolluntersuchungen durch Plattieren des Stammes auf Minimalmedium mit der von P. Youngman in "Plasmids: a practical approach", K.G. Hardy, IRL Press, 79-103 (1986), beschriebenen Zusammensetzung ohne Wachstumsfaktoren, in Minimalmedium mit alleinigem Zusatz an leu (50 ug/ml), in Minimalmedium mit alleinigem Zusatz an Uracil (50 ug/ml) und in Minimalmedium mit einem Zusatz an den beiden Produkten durchgeführt.
- Ein Wachsen wurde nur beobachtet bei dem Medium, das beide Ernährungsfaktoren enthält, was die Stabilität der Genmarker leu und pyrD1 belegt.
- Schließlich wurde die Anzahl der gebildeten Sporen in Relation zu der Gesamtanzahl der Zellen ermittelt und gleichzeitig die Stabilität von dem spo&supmin;-Phänotyp in Abwesenheit des durch Erythromycin bewirkten selektiven Drucks geprüft.
- Die Analyse basierte auf der Tatsache, daß Stämme, die keine Sporen zu bilden vermögen, eine geringe Festigkeit zu kurzen Behandlungen bei hohen Temperaturen zeigen.
- Zwei 100 ml-Flaschen, von denen jede 10 ml von dem Schaeffer'schen Sporenbildungsmedium enthielt, wurden mit dem Stamm SMS 275 oder entsprechend mit dem sporenbildenden Stamm SMS 181 (als Kontrolle) inokuliert und zunächst bei 37 ºC während 24 Stunden und danach bei 80 ºC während 10 Minuten inkubiert.
- Aliquote der Kulturen wurden dann verdünnt und 0,1 ml von jeder Verdünnung wurde auf VY-Maximalmedium mit dem Antibiotikumzusatz gebracht. Nach dem Wachsen bei Raumtemperatur wurden die lebensfähigen Zellen (CFU) vor und nach der Behandlung bei 80 ºC gezählt.
- Da die Hitzebehandlung die Zellen, aber nicht die Sporen zerstört, waren die auf den Platten gewachsenen Kolonien solche, die von während der Züchtung im flüssigen Medium bei 37 ºC gebildeten Sporen stammten und zur Keimung beim Auftragen auf das Maximalmedium fähig waren.
- Die Tabelle I zeigt die Resultate von diesem Experiment, ausgedrückt als CFU/ml. TABELLE I Verdünnung
- Die in der Tabelle angeführten Werte sind Mittelwerte aus drei Bestimmungen
- Es bedeuten: t.q. = nicht verdünnte Kultur
- - = vor der Hitzebehandlung
- + = nach der Hitzebehandlung
- Die Auswertung läßt folgendes erkennen:
- (i) die Anzahl der in den Kulturen von den bei 37 ºC vermehrten Stämmen SMS 118 und SMS 275 vorhandenen Zellen betrug 1,9 x 10&sup8; CFU/ml bzw. 1 x 10&sup8; CFU/ml;
- (ii) die Frequenz, mit der der Stamm SMS 275 in den spo&spplus;-Phänotyp zurückkehrte, war niedriger als 1 x 10&sup8; und das Verhältnis zwischen den Prozentanteilen von die Hitzebehandlung überlebendem SMS 275 zu SMS 118 war niedriger als 0,0014 %;
- (iii) die Anzahl der Sporen, die sich nach 24 Stunden bei 37 ºC gebildet hatten und zur Keimbildung im Maximalmedium fähig waren, betrug 1,4 x 10&sup5; für den sporogenen Stamm SMS 118 und 0 für den asporogenen Stamm SMS 275.
- Nachdem die Züchtung in einem flüssigen Medium bei 37 ºC in Abwesenheit von Erythromycin erfolgte, zeigte das völlige Nichtvorhandensein von SMS 275-Kolonien nach der Hitzebehandlung bei 80 ºC, daß die vom Stamm SMS 275 angenommene spo&supmin;-Eigenschaft sehr stabil ist.
- Tatsächlich bewahrten Zellen, die Gelegenheit zum Verlust des Transposons hatten, nichtsdestoweniger den asporogenen Phänotyp.
- Kompetente B. subtilis SMS 275-Zellen wurden durch das Plasmid pSM 274 (10 ng) transformiert und die Transformanten auf Platten von VY-Maximalmedium mit einem Gehalt von 5 ug/ml an Kanamycin und 5 ug/ml an Chloramphenicol bei 37 ºC während 18 Stunden selektiert.
- Ein Aliquot von der Plasmid-DNA, die aus einem der resistenten Klone durch die schnelle Extraktionsmethode (beschrieben in: "Recombinant DNA Techniques: an introduction", hsggb. Rodriguez und Tait, Addison-Wesley Publishing Company, 1983, 164) isoliert worden war, wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII (BRL) gemäß den Lieferinstruktionen digeriert.
- 2 ul der digerierten Plasmid-DNA und 2 ul von der nicht digerierten DNA wurden auf 0,8 % Agarose-Gel ebenso wie das Plasmid pSM 274 (Kontrolle; 2 ul), behandelt mit denselben Enzymen und unbehandelt, sowie einige Standardmolekulargewichte geladen.
- Die in der Fig. 1A wiedergegebenen Resultate zeigen, daß das aus dem B. subtilis SMS 275 isolierte und mit den Restriktionsenzymen digerierte Plasmid 274 die erwartete Migrationsgeschwindigkeit hatte und ein Digestionsmuster zeigte, das in Übereinstimmung mit dem von pSM 274 war.
- In der Tat wurden zwei Stränge entsprechend den beiden Fragmenten mit den Längen von 6700 bp und 800 bp, die mit dem Plasmid-Vektor und dem den Vorläufer für das menschliche Wachstumshormon kodierenden Insert korrespondieren, nach der Entfärbung mit "ethidium"-bromid herausgelöst.
- Die Fähigkeit des Stammes B. subtilis SMS 275 (pSM 274) zur Herstellung vom Vorläufer des hGH wurde durch Vermehrung des Stammes in 10 ml VY-Mediurn bei 37 ºC während 18 Stunden und nachfolgende Analyse der gesamten löslichen Proteine, die aus den durch Elektrophorese an 12,5 % SDS-PAGE lysierten Zellen extrahiert worden waren und Anfärben mit Coomassie Blue geprüft. Die Anwesenheit des mit dem Vorläufer vom menschlichen Wachstumshormon korrespondierenden Strangs in dem proteinhaltigen Extrakt ist der Fig. 2 zu entnehmen.
- Die asporogenen Stämme B. subtilis SMS 268, SMS 270 und SMS 272 mit den spoIIF96-, spoIIA1- bzw. spoOF-Mutationen wurden durch das Plasmid pSM 274 transformiert und dann zur Feststellung der Stabilität vom Plasmid, der Anzahl der vorhandenen Plasmidkopien und der Stabilität vom spo&supmin;-Phänotyp untersucht.
- Aus der Fig. 1B ist ersichtlich, daß in dem Stamm mit der spoOF-Mutation das Plasmid unstabil erscheint, wohingegen in dem Stamm mit der spoIIA1-Mutation eine geringere Anzahl von Plasmidkopien vorhanden ist als beim Stamm SMS 118.
- Der Stamm spoIIF96 andererseits bewahrte das Plasmid in stabilem Zustand bei einer Anzahl von Kopien, welche mit dem Stamm SMS 118 vergleichbar war.
- Bei dem Prüfen der Stabilität von dem spo&supmin;-Phänotyp zeigte jedoch dieser Stamm eine Tendenz zur Wiederannahme des positiven Sporenbildungs-Phänotyps mit einer leicht erhöhten Frequenz, was sich bei einer Abschätzung durch mikroskopische Betrachtung ergab.
- Zur Abklärung der Lebensfähigkeit von dem Stamm SMS 275 wurden 4 Zellbänke in Glycerin hergestellt.
- Bei der praktischen Durchführung wurden zwei 100 ml Vorkulturen vom Stamm SMS 275 (pSM 274) und von dem Stamm SMS 272 (pSM 274) - als Kontrolle - in einem TYM-Medium mit der nachfolgenden Zusammensetzung hergestellt:
- Trypton 13 g/l
- Hefeextrakt 3 g/l
- Maltose 40 g/l
- Kanamycin 5 mg/l
- Chloramphenicol 5 mg/l.
- Die Flaschen wurden gerührt (220 upm) und bei 37 ºC während 24 Stunden inkubiert.
- Zwei 2-Liter-Fermenter, jeder gefüllt mit 1 L vom TYM-Medium, wurden mit jeweils 100 ml von einer der Vorkulturen (optische Anfangsdichte (O.D.) 0,190 bei 660 nm) beimpft.
- Die Fermentation wurde bei 800 upm, pH-Wert 7,0 und Luftumsatz von 0,5 V/V/min. durchgeführt.
- Die Zellen wurden durch Zentrifugieren des Kulturmediums nach der Fermentation während 15 Stunden auf eine O.D. von 3,0 gewonnen.
- 2 ml-Proben wurden dann mit Glycerin bis auf eine Endkonzentration von 15 % versetzt und bei -80 ºC gehalten.
- 6 Monate nach der Herstellung wurde die Anzahl der lebensfähigen Zellen (koloniebildende Einheiten - CFU) in den Proben mit Glycerin bestimmt. Der Test erfolgte durch Verdünnen aliquoter Anteile von den Proben mit Glycerin mittels eines Kulturmediums und unverzügliches Plattieren von 0,1 ml der Verdünnungen auf TBAB- Maximalwuchsmedium (DIFCO) mit Agar, sowie mit und ohne die Antibiotika Kanamycin und Chloramphenicol.
- Im Falle von SMS 275 (pSM 274) war die Anzahl der lebensfähigen Zellen je ml der Probe in Glycerin 2,4 x 10&sup8; CFU/ml; die Analyse wurde durchgeführt sowohl in Anwesenheit wie Abwesenheit der Antibiotika Kanamycin und Chloramphenicol.
- Die Ergebnisse zeigen eine gute Stabilität und Lebensfähigkeit der SMS 275-Zellen bei den angewendeten Testbedingungen.
- Die im Falle von SMS 272 (pSM 274) erhaltenen CFU-Werte zeigten jedoch eine geringe Lebensfähigkeit.
- So wurden nach dem Zusatz von Glycerin 3,7 x 10&sup7; CFU/ml gemessen. Nach 7 Tagen fiel dieser Wert auf 73 %, nach 19 Tagen auf 68 % und nach 40 Tagen auf etwa 54 %.
- Die Kulturen des Stammes SMS 274 (pSM 274), analysiert gemäß den Beispielen 2 und 3, zeigten auch, daß das Plasmid stabil war und die Sequenz von dem Gen, das den Vorläufer des hGH kodiert, intakt blieb.
Claims (8)
1. Asporogener Stamm Bacillus subtilis SMS 275, der durch eine Häufigkeit der
Reversion gegen Sporenbildung von weniger als 10&supmin;&sup8; und die Anwesenheit der
Genmarker leu, pyrD1, apr&supmin; und npr&supmin; und spoII:D gekennzeichnet ist und unter CBS
432.90 hinterlegt wurde.
2. Asporogener Stamm Bacillus subtilis SMS 275 gemäß Anspruch 1, bestimmt zur
Verwendung als Wirt in einem Wirts-Vektor-System für die gentechnologische
Herstellung von heterologen Polypeptiden und Proteinen oder deren Vorläufer.
3. Asporogener Stamm Bacillus subtilis SMS 275 gemäß Anspruch 2, wobei der Vektor
ein Plasmid ist, das zur Expression in Bacillus subtilis ein Gen für das Kodieren
heterologer Polypeptide oder Proteine oder deren Vorläufer aufweist.
4. Asporogener Stamm Bacillus subtilis SMS 275 gemäß Anspruch 3, wobei das
Plasmid das Gen enthält, das einen Vorläufer des menschlichen Wachstumshormons
kodiert.
5. Asporogener Stamm Bacillus subtilis SMS 275 gemäß Anspruch 4, wobei es sich bei
dem Plasmid um pSM274 CBS 75288 handelt.
6. Asporogener Stamm Bacillus subtilis SMS 275 (pSM 274) gemäß Anspruch 5,
hinterlegt unter CBS 433.90.
7. Verfahren zur Herstellung von heterologen Polypeptiden und Proteinen oder deren
Vorläufern, umfassend die Vermehrung vom Stamm Bacillus subtilis SMS 275 gemäß
Anspruch 1, der durch einen Vektor mit einem Gen für die Kodierung von heterologen
Polypetiden oder Proteinen oder deren Vorläufern zur Expression in Bacillus
transformiert ist, in einem geeigneten Kulturmedium mit einem Gehalt an
Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, Mineralsalzen, Leucin und Uracil, und
Gewinnung des Produkts mit der Genexpression.
8. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei es sich bei dem Bacillus substilis-Stamm um
CBS 433.90 handelt.
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