DE3177286T2

DE3177286T2 - Genetisch modifizierte mikroorganismen fuer die massenherstellung amylolytischer enzyme und verfahren zu deren herstellung.

Info

Publication number: DE3177286T2
Application number: DE8181300578T
Authority: DE
Inventors: Charles Antoine Colson; Pierre Emile Cornelis; Colette Simone Digneffe; Corrine Walon; Raoul G P Walon
Original assignee: Unilever Bestfoods North America
Current assignee: Unilever Bestfoods North America
Priority date: 1980-02-15
Filing date: 1981-02-12
Publication date: 1992-12-10
Anticipated expiration: 2001-02-13
Also published as: US4469791A; YU86783A; KE3310A; IL61982A; DK162776B; FI810425L; EP0034470A3; ES8202362A1; IE50919B1; DD207553A5; YU37781A; DE3177286D1; IL61982A0; FI70424B; GB2069503A; DK62881A; ES499391A0; EP0034470B1; GR73678B; RU1838410C

Description

Die Erfindung liegt im Bereich der Gentechnik und betrifft genauer die Herstellung von rekombinanter DNA (Deoxyribonukleinsäure), die ein Amylase kodierendes Gen als einziges Fremdgen, das exprimiert werden soll, enthält und die Verwendung desselben, um Mikroorganismen zu erzeugen für die Massenherstellung von amylolytischen Enzymen.
Obwohl der Ausdruck "Gentechnik" ständig verwendet wird, um eine große Anzahl von Verfahren zur künstlichen Modifikation der genetischen Information eines Organismus zu beschreiben, wird er in der gesamten Beschreibung und den Ansprüchen nur verwendet in Bezug auf das in vitro-Verfahren zur Bildung von rekombinanter DNA aus einem Donor-Mikroorganismus und einem geeigneten Vektor, der auf Basis der gewünschten genetischen Information ausgewählt wird und das Einführen der ausgewählten DNA in einen geeigneten Mikroorganismus (Wirtsorganismus), wobei die gewünschte (fremde) genetische Information Teil des genetischen Komplements des Wirtes wird. Der Ausdruck "gentechnisch veränderter Mikroorganismus", wie er in der gesamten Beschreibung und den Ansprüchen verwendet wird, bezeichnet einen Mikroorganismus, der mit dieser Technik erzeugt wurde.
Die Ausdrücke "Amylase" und "amylolytisches Enzym" sind Synonyme und beziehen sich, so wie sie in der gesamten Beschreibung und den Ansprüchen verwendet werden, auf solche Enzyme, die die Hydrolyse von Stärke, wie z. B. α-Amylase, β-Amylase, Isoamylase (einschließlich den α-1,6-Glucosidasen wie Pullulanase), Glucoamylase etc. katalysieren können.
Es wurde natürlich in Bezug auf die Gentechnik in den letzten Jahren viel geschrieben (zwei der vielen ausgezeichneten Reviews sind "DNA cloning and the Analysis of Plasmid Structure and Function" von K.N. Timmis, S.N. Cohen und S.C. Cabello, Proc. Molec. subcell Biol. 6, 1978, Seiten 1 bis 58 und "Lamboid Phages that Simplify the Recovery of in vitro Recombinants" von Noreen E. Murray, W.J. Brammar und K. Murray, Molec. gen. Genet. 150, 1977, Seiten 53 bis 56), die viele Berichte einschließen, die neue, gentechnisch veränderter Mikroorganismen mit wertvollen Eigenschaften beschreiben. Die japanische Patentveröffentlichung Nr. SHO 52-76480 (veröffentlicht am 27. Juni 1977, eingereicht am 19. Dezember 1975 als SHO 50-150641) von Bunzi Maruo, Yuko Yoneda und Gakuzo Tamura offenbart die Herstellung von Amylase in großem Ausmaß produzierenden Stämmen von Mikroorganismen durch in vivo Verfahren der Mutagenese, Transduktion und Transformation, um mehrere genetische Merkmale, die für die Amylase-Produktion günstig sind, in einem Bacillus-Mikroorganismus anzuhäufen. Diese Verfahren, die nicht die hier definierte Gentechnik umfassen, sind begrenzt auf einen einzigen oder wenige nah verwandte (im genetischen Sinn) Mikroorganismen. Auch sind diese Stämme der Gen-Amplifikation (z. B. durch Phage oder Plasmid), die in der vorliegenden Erfindung für höhere Enzymproduktion verwendet wird, nicht zugänglich. In einem kürzlich erschienen Artikel von Yuko Yoneda, Scott Graham und Frank E. Young mit dem Titel "Cloning of a Foreign Gene Coding for Alpha- amylase in Bacillus subtilis", Biochemical and Biophysical Research Communications 91, Nr. 4, Seiten 1556 bis 1564 (28. Dezember 1979) beschreiben die Autoren das Klonieren eines α-Amylase kodierenden Gens in Bacillus subtilis, indem gespaltene DNA von Bacillus amyloliquefaciens mit der DNA des temperenten Phagen phi 3T verbunden wird und anschließend Amylase-defiziente Zellen von Bacillus subtilis transformiert werden. Die Autoren zeigen nicht irgendeinen Hinweis auf die Amplifikation des Gens und eine sich anschließende Massenproduktion des Amylase-Enzyms, was der Hauptzweck der vorliegenden Erfindung ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden gentechnisch veränderte Mikroorganismen erzeugt, die unter geeigneten Züchtungsbedingungen wesentlich größere Mengen amylolytischer Enzyme erzeugen können, als durch die Donor-Mikroorganismen erzeugt werden können. In einer bevorzugten Ausführungsform haben die so hergestellten Amylasen eine oder mehrere Eigenschaften, die sie besonders nützlich für die industrielle, enzymatische Stärkehydrolyse machen (z. B. bei der enzymatischen Verflüssigung und/oder Saccharifizierung von Stärke zur Herstellung von Haftmitteln, Schlichten, Maltodextrinen, Stärkesirupen verschiedener Zusammensetzung, Maltose, Dextrose etc.), z. B. Widerstandsfähigkeit gegenüber hohen Temperaturen, Widerstandsfähigkeit gegenüber der Vergiftung mit Schwermetallen etc.
Die Erfindung wird ausgeführt, indem zuerst die DNA eines Bakterien-Mikroorganismus (Donor-Mikroorganismus) extrahiert wird, der mindestens ein amylolytisches Enzym erzeugen kann, die DNA plus, als Vektor, die DNA eines Derivats des Phagen Lambda gespalten wird (mit einem geeigneten Restriktionsenzym) und die entstehenden Fragmente vereinigt und ligiert werden unter Bildung rekombinanter DNA, von der ein Teil ein Amylase-kodierendes Gen enthält. Die rekombinante DNA wird dann biologisch aktiv durch Insertion in geeignete Wirtszellen (d. h. E. coli) durch in vitro Einkapselung bzw. -Verpackung oder Transfektion.
Die entstehenden Klone werden dann gescreent auf die Gegenwart eines Amylase-kodierenden Gens und ein oder mehrere positive Klone werden ausgewählt und vervielfältigt, wodurch neue, gentechnisch veränderte bakterielle Mikroorganismen geliefert werden, die unter geeigneten Züchtungsbedingungen wesentlich größere Mengen Amylase produzieren können, als die Donor-Mikroorganismen produzieren können. Gegebenenfalls wird die DNA des neuen Phagen extrahiert, gespalten und subkloniert in einen zweiten Vektor, der entweder ein Plasmid oder ein anderer Phage sein kann und die neuen Klone werden gescreent und ausgewählt auf Basis der Gegenwart eines Amylase-kodierenden Gens. Aufeinanderfolgende "Sub-Sub-Klonierungen" können auch durchgeführt werden.
Zusätzlich zur Erzeugung neuer, gentechnisch veränderter Mikroorganismen, die "Überproduzierer" von Amylase sind, hat die Erfindung den weiteren Vorteil, daß sie zum Transfer hauptsächlich des Gens für die Produktion eines einzigen amylolytischen Enzyms führt, wodurch großteils die Reinigung minimiert wird, die notwendig ist bei Kulturen von nicht gentechnisch veränderten Mikroorganismen.
Wenn einmal der gentechnisch veränderte Mikroorganismus, der die gewünschte rekombinante DNA enthält, erzeugt worden ist, wird der Mikroorganismus auf solche Weise gezüchtet, daß die rekombinante DNA amplifiziert wird und dadurch Amylase in wesentlich größeren Mengen geliefert wird, als vom Donor-Mikroorganismus geliefert werden kann.
Wenn der Vektor ein Derivat des Phagen Lambda ist, wobei in diesem Fall der Wirts-Mikroorganismus notwendigerweise E. coli ist, kann die Amplikation und Enzymproduktion wie folgt erreicht werden. Wenn der Phage lytisch ist, wird der Wirtsorganismus, d. h. E. coli, zuerst gezüchtet, um die Zellen zu der geeigneten Dichte zu vervielfältigen, die dann mit einer geeigneten Menge des Bakteriophagen infiziert werden und das System wird gezüchtet, bis die Zellwände zerstört sind und die Amylase in das Kulturmedium entweicht.
Wenn das Vektor-Wirtssystem ein geeigneter Lambda-lysogener E. coli ist, wird der infizierte Wirtsorganismus zuerst bei 32ºC gezüchtet, um die Bakterienzellen zu einer geeigneten Dichte zu vervielfältigen, und danach wird die Temperatur auf 42ºC erhöht und eine bestimmte Zeit auf dieser Temperatur gehalten, um den lytischen Zyklus zu induzieren und dann auf 37ºC gebracht und dort gehalten, um die Amplikation der fremden, residenten DNA zu verursachen, was große Mengen an Amylaseproduktion nach sich zieht. Die Zellwände können gegebenenfalls zerstört werden, abhängig von den Bedingungen, wobei dann die Amylase in das Kulturmedium entweicht.
Wenn der Vektor ein Multicopy-Plasmid ist, wie pBR 322 oder pACYC 184, wird die Amplifikation der Fremd-DNA per se erreicht. Alternativ wird zuerst der gentechnisch veränderte Mikroorganismus, der die Plasmid-DNA enthält, gezüchtet, um die Bakterienzellen zu der gewünschten Dichte zu vervielfältigen, und danach wird Chloramphenicol zugegeben; da das Antibiotikum die Proteinsynthese hemmt, verhindert es eine weitere Zellvermehrung und Amylaseproduktion, läßt aber die Vermehrung (Amplifikation) der Plasmid-DNA in den Zellen zu. Schließlich werden die Zellen von dem Kulturmedium abgetrennt und gewaschen, um das Chloramphenicol zu entfernen. Für die Amylaseproduktion werden die Zellen dann wieder gezüchtet, natürlich in Abwesenheit von Chloramphenicol, zur Produktion von großen Mengen an Amylase.
Es ist natürlich wesentlich, bei jeder gentechnologischen Arbeit, solche Klone, die die gewünschte genetische Information enthalten, "markieren" zu können und dadurch auswählen zu können. Bei Durchführung der vorliegenden Erfindung kann dies leicht erreicht werden, indem auf ein Medium plattiert wird, das Stärke enthält, wenn α-Amylase-, β-Amylase- oder Glucoamylase-Aktivität gesucht wird. Das Kulturmedium wird dann mit Jod gefärbt, Klone, die Amylase- Aktivität aufweisen, sind auf einem Stärke enthaltenden Medium von einem weißen Bereich umgeben. Ein spezifisches, bevorzugtes Färbeverfahren wird später beschrieben. Wenn Pullulanase-Aktivität gesucht wird, werden die Klone auf ein BBL-Trypticase-Medium, das Pullulan enthält, plattiert. Diese Technik wird später genauer beschrieben.
Es soll nun die Erfindung genauer beschrieben werden einschließlich der spezifischen Materialien und Techniken, die dabei angewendet wurden. Es ist zu bemerken, daß viele der angewendeten Techniken Standardtechniken sind und dem Praktiker auf diesem Gebiet wohlbekannt sind; nichtsdestotrotz werden einige davon aus Gründen der Klarheit im Detail beschrieben.

Donor-Mikroorganismus

Der Donor-Mikroorganismus sollte ein bakterieller Mikroorganismus sein, der ein Amylase kodierendes Gen als einziges Fremdgen enthält, das exprimiert werden soll. Er kann somit mindestens eine Amylase (einschließlich natürlich der gewünschten Amylase) produzieren und produziert vorteilhafterweise eine Amylase mit den Eigenschaften, die für die industrielle Hydrolyse von Stärke wünschenswert sind, z. B. Widerstandsfähigkeit gegenüber hohen Temperaturen oder einer Vergiftung durch Metall. Wahrscheinlich könnte der Donor auch ein eukaryontischer Amylase produzierender Mikroorganismus sein (z. B. ein Pilz oder eine Hefe); wegen der relativen Einfachheit beim Arbeiten mit einer prokaryontischen Quelle für DNA, verglichen mit Eukaryonten, wurde die Arbeit hier mit Bakterien durchgeführt und die Erfindung ist deshalb auf die Verwendung eines bakteriellen Donors beschränkt. Wie in den Beispielen zu sehen ist, wurden erfolgreich Stämme von Bacillus mecaterium, Bacillus coagulans, Bacillus cereus und Klebsiella pneumoniae angewendet, um gentechnisch veränderte Mikroorganismen zu erzeugen, die große Mengen an α-Amylase, hitzeresistenter α-Amylase, β-Amylase bzw. Pullulanase erzeugen können.

Ligierung und Restriktionsenzyme

Bei unserer Arbeit haben wir beständig als Ligierungsenzym T4-DNA-Ligase verwendet, aber es ist selbstverständlich, daß jedes DNA-ligierende Enzym angewendet werden kann. Die spezifischen, bei unserer Arbeit angewendeten Restriktionsenzyme sind in den Beispielen angeführt. Die Selektion eines geeigneten Restriktionsenzyms kann natürlich durch den erfahrenen Praktiker unter Anwendung wohlbekannter Techniken erfolgen. Unser Verfahren zur Auswahl eines Restriktionsenzyms für die weitere Untersuchung war es, die aus dem Donor-Mikroorganismus extrahierte DNA (die Donor- DNA) mit verschiedenen Restriktionsenzymen zu spalten und das eine (oder mehr als eines) am meisten geeignete, für die weitere Untersuchung auszuwählen auf Basis der Fähigkeit des Enzyms, die DNA in zahlreiche Fragmente einer Größe im Bereich zwischen 2 und 15 Kilobasen zu schneiden.

Vektoren

Es gibt mehrere Gründe, warum Derivate des Phagen Lambda besonders wirkungsvoll für das Klonieren der aus dem Donor extrahierten DNA sind. (1) Deletionsmutanten des Phagen Lambda erlauben die Insertion von Fremd-DNA-Fragmenten verschiedener Größen (abhängig natürlich vom spezifischen Lambda-Derivat) und erlauben weiterhin eine einfache Identifizierung solcher Klone, die Fremd-DNA enthalten. (2) Verschiedene Derivate des Phagen Lambda wurden entwickelt, die die Verwendung mehrerer Restriktionsenzyme zulassen, was die Chance der Realisierung einer erfolgreichen Klonierung erhöht. (3) Sehr gute Amplikationen von Fremdgenen sind möglich unter Verwendung geeigneter Derivate des Phagen Lambda. (4) Nach Ligierung kann die Gewinnung der rekombinanten Klone leicht durch Transvektion oder in vitro Verpackung erfolgen. Wegen seiner Vielseitigkeit, die kein anderer derzeit existierender Vektor liefern kann, werden bei Durchführung der Erfindung Derivate des Phagen Lambda und E. coli als Wirt, für die erste Klonierung der aus dem Donor extrahierten DNA angewendet.
Andere Vorteile der Verwendung eines Phagen statt eines Plasmids für die erste Klonierung sind die folgenden: (1) Der Prozentanteil an Rekombinanten mit Fremd-DNA- Insertionen ist höher; (2) die Bakterien werden lysiert, wodurch der Zellinhalt und damit die Amylase in das Medium freigesetzt wird, wodurch die Detektion mit der Jodfärbetechnik erleichtert wird; (3) die Resistenz eines Phagen gegenüber Jod ist höher als die irgendeines lebenden Bakteriums.
Die Selektion eines geeigneten Plasmids als Vektor für eine Subklonierung liegt in der Erfahrung des kompetenten Gentechnikers, wobei natürlich ein Kriterium die Existenz einer einzigen oder einer begrenzten Anzahl von Restriktionsstellen für das angewendete Restriktionsenzym ist.
Die meistens in unserer Arbeit angewendeten Plasmide sind pBR 322 und pACYC 184. Im intakten Zustand trägt Plasmid pBR 322 Resistenz gegenüber Ampicillin und Tetracyclin bei und enthält jeweils eine einzige Restriktionsstelle für die Enzyme Pst I, Eco RI, Hind III, Bam HI und Sal I. Das Schneiden und die Insertion an der Pst I-Stelle zerstört die Resistenz gegenüber Ampicillin, während die Insertion in die Bam HI- bzw. Sal I-Stelle die Resistenz gegenüber Tetracyclin zerstört. Die Insertion in die Hind III-Stelle zerstört manchmal die Resistenz gegenüber Tetracyclin, was darauf hinweist, daß das klonierte Gen keinen eigenen Promotor besitzt.
Im intakten Zustand liefert das Plasmid pACYC 184 eine Resistenz sowohl gegenüber Tetracyclin als auch Chloramphenicol und enthält jeweils eine einzige Restriktionsstelle für die Enzyme Eco RI, Hind III, Bam HI und Sal I. Das Schneiden und die Insertion an der Eco RI-Stelle zerstört die Fähigkeit, die Resistenz gegenüber Chloramphenicol zu liefern, während die Insertion in die drei anderen Stellen für Hind III, Bam HI und Sal I dieselben Wirkungen hat wie bei Plasmid pBR 322, da diese Region beiden Plasmiden gemeinsam ist.
Für die Subklonierung in Bacillus subtilis wurde Plasmid pC 194 als Vektor verwendet. Dieses Plasmid hat eine einzige Hind III-Stelle und liefert die Resistenz gegenüber Chloramphenicol.

Wirtsorganismus

Weil die Derivate des Phagen Lambda nur in E. coli exprimiert werden können, muß dies offensichtlich der Wirt für die rekombinante Phagen-DNA sein, die gemäß der Erfindung hergestellt wird. Wenn die rekombinante DNA in Form eines Plasmids ist, kann andererseits jeder bekannte Mikroorganismus, der solche Plasmid-DNA annehmen und replizieren kann, z. B. ein anderer bakterieller Mikroorganismus oder eine Hefe wie Saccharomyces cerivisiae, angewendet werden.
Aus praktischen Gründen wurden meistens E. coli-Stämme (z. B. HB 101) verwendet, da sie wohlbekannte Stämme für den Genetiker sind und für eine Infektion durch bekannte Phagen und Plasmide empfänglich sind mit der sich daraus ergebenden Fähigkeit der Enzym-Überproduktion.
Wie in Beispiel II A beschrieben, kann ein rekombinantes Plasmid in ein Plasmid wie pC 194, das in B. subtilis repliziert werden kann, subkloniert werden.

Verfahren

Das Verfahren wird beschrieben in Bezug auf ein zweistufiges Klonierungs-Experiment, wobei in der ersten Stufe (shotgun) ein Phage angewendet wird und in der zweiten Stufe ein Plasmid angewendet wird.
Wenn der Donor-Mikroorganismus, die Restriktions- und Ligierungsenzyme und das spezifische Derivat des Phagen Lambda ausgewählt worden sind, wird die DNA extrahiert, geschnitten, gemischt und die vereinigten Stücke ligiert, alles mit üblichen Techniken, die hier nicht beschrieben werden müssen.
Die DNA wird dann biologisch aktiv gemacht in einem E. coli durch Transfektion oder in vitro-Verpackung. Bei der Arbeit mit Lambda-DNA wurden sehr gute Erfolge erzielt unter Verwendung der Verpackungstechnik (B. Hohn und K. Murray, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 3259-3263, 1977). Die Klone, die Fremd-DNA aufgenommen haben, werden dann durch geeignete Methoden identifiziert. Wenn ein Insertionsvektor wie Lambda NM590 oder Lambda NM607 angewendet wird, ergeben solche Klone, die Fremd-DNA enthalten, klare Plaques, während solche, die keine Fremd-DNA enthalten, trübe Plaques ergeben. Wenn ein Substitutionsvektor wie Lambda NM761 oder Lambda NM781 verwendet wird, erfolgt die Identifizierung durch Plattieren auf einem E. coli lac amber Empfänger auf Lactose-Indikatormedium, z. B. McConkey, EMB oder X-Gal.
Viele (mehrere tausend) der Klone, die Fremd-DNA aufgenommen haben, werden dann auf die Medien, die Stärke enthalten, plattiert und gescreent auf Gegenwart eines Amylase kodierenden Gens mit dem vorher erwähnten Jod-Färbeverfahren. Es muß natürlich darauf geachtet werden, daß nicht eine so hohe Konzentration an Jod angewendet wird, daß der Phage getötet wird und dies kann ein Problem sein, wenn Jod in Form einer Lösung zugegeben wird. Die am meisten bevorzugte Anfärbetechnik ist es, die Platten Joddampf über einen kurzen Zeitraum auszusetzen; dieses Verfahren wurde mit gutem Erfolg angewendet.
Ein bevorzugtes Verfahren zum Nachweis von Klonen mit Pullulanase-Aktivität, bei dem nicht das Verfahren der Jod-Anfärbung angewendet wird, wird nun beschrieben. Die Phagen werden auf Petrischalen, die BBL-Trypticase plus Pullulan in einer Konzentration von etwa 0,25 % enthalten, plattiert. Das Pullulan in dem Medium rund um die "positiven" Plaques wird durch die Pullulanase zu Maltotriose hydrolysiert, wobei die Maltotriose von den Bakterien verwendet wird. Daher wachsen solche Bakterien, die sich von Maltotriose ernähren, besser als die anderen auf dem Rasen, was dazu führt, daß die Plaques, die Pullulanase produzieren, von einem durchsichtigen Ring wachsender Bakterien umgeben sind und leicht nachgewiesen werden können. Diese Technik wird im Detail im Beispiel IV beschrieben.
Ein (oder mehrere) positiver Klon wird dann herausgenommen und vermehrt. Dies kann natürlich den "endgültigen" gentechnisch veränderten Mikroorganismus umfassen und er kann verwendet werden, um große Mengen an Amylase zu produzieren durch geeignete Züchtung, wie vorher beschrieben. Alternativ kann der Klon als Quelle für DNA für eine zweite Klonierung in ein Plasmid oder einen anderen, geeigneteren Phagen, verwendet werden. Das Verfahren der Subklonierung in ein Plasmid wird nun beschrieben.
Wiederum unter Verwendung von Standardtechniken wird die DNA der Klone extrahiert und mit einem Restriktionsenzym gespalten, das Plasmid wird ebenso gespalten, die Fragmente werden gemischt und die rekombinierten Fragmente werden ligiert. Bei Verwendung von Plasmid-pBR 322 wird die Identifizierung von Klonen, die DNA aufgenommen haben, die ein Amylase kodierendes Gen enthält, erreicht, indem die DNA biologisch aktiv gemacht wird in einem Wirt wie E. coli durch Transformation, in einem Kulturmedium, das Ampicillin oder Tetracyclin enthält, abhängig von dem verwendeten Restriktionsenzym. Das Kulturmedium wird auch Stärke oder Pullulan enthalten und die Identifizierung der Klone, die das Amylase kodierende Gen enthalten, erfolgt durch eine der vorher beschriebenen Techniken. Positive Klone werden dann gezüchtet und die Plasmid-DNA kann dann mit Hilfe von Chloramphenicol, wie vorher beschrieben, amplifiziert werden.
Die Zeichnungen zeigen Karten des Wildtyps des Bakteriophagen Lambda (Figur 1, a) und alle verwendeten Vektoren und neue, erzeugte, rekombinante Plasmide gemäß den folgenden Beispielen. Genauer zeigt Figur 1 auch eine Karte der Phagen Lambda NM 590 (b) und Lambda NM 781 (c), (N.E. Murray, W.J. Brammar, K. Murray (1977), Molec. gen. Genet. 150, 53-61). Figur 2 enthält Karten der Plasmide pBR 322 (F. Bolivar, R.L. Rodriguez, P.J. Greene, M.C. Betlach, H.L. Heyneker, H.W. Boyer (1977), Gene 2, 95-113) und pAYC 184 (A.C.Y. Chang, S.N. Cohen (1978), J. Bact. 134, 1141-1156). Figur 3 ist eine Karte des neuen Plasmids pCP 1 und Figur 4 ist das neue Plasmid pCP 2. Figur 5 stellt Beispiel II A dar, und zeigt die Plasmide pC 194, pCP 2.3 und das endgültige neue Plasmid pCH 1.
Die Figuren 6 und 7 zeigen die Plasmide pCP 3 bzw. pCP 4. In all den Karten der neuen rekombinanten Plasmide ist die Donor-DNA durch eine dicke Linie angezeigt.
Die Beispiele erläutern die Durchführung der Erfindung. Sie dienen nur der Erläuterung und sollen die Erfindung in keiner Weise beschränken. Die Prozentangaben beziehen sich auf Gewicht, wenn nicht anders angegeben. Alle Versuche wurden durchgeführt gemäß den Containment-Richtlinien der NIH (USA).

Beispiel I

Klonieren eines α-Amylase-Gens
Die folgenden Materialien wurden verwendet:
Restriktions-Endonuklease Hind III,
T4-DNA-Ligase,
Phage Lambda NM 590. Die Phagen-DNA wurde gewonnen durch Phenolextraktion aus hochgereinigten Phagenteilchen.
Plasmid pBR 322. Plasmid-DNA wurde gereinigt aus mit Lysozym lysierten E. coli-Zellen in Cesiumchlorid-Ethidiumbromid-Dichtegradienten.
Wirtsorganismus E. coli HB 101.
Der Donor-Mikroorganismus war ein Stamm von Bacillus megaterium mit den folgenden mikrobiologischen Eigenschaften:
(1) Morphologie: Stäbchen (0,5 bis 0,7 u x 2,0 bis 5,0 u), beweglich, grampositiv, Sporen sind terminal bis subterminal.
(2) Nährlösung: gutes Wachstum.
(3) Nähragar-Brühe: gutes Wachstum; die Kolonien sind dicht in der Mitte und diffuser rundherum.
(4) Milch: Peptonisierung ohne Änderung des pH-Wertes.
(5) Gelatine: keine Verflüssigung.
(6) Reduktion von Nitraten: negativ.
(7) Katalase-Reaktion: negativ.
(8) Oxidasereaktion: negativ.
(9) Cytochrom-Oxidase-Reaktion: negativ.
(10) Indolproduktion: negativ.
(11) Bildung von H&sub2;S: negativ.
(12) Verwertung von Kohlehydraten: verwertet Arabinose, Xylose, Galactose, Glucose, Lävulose, Maltose, Raffinose, Saccharose, Stärke und erzeugt aus ihnen Säure. Rhamnose, Mannose, Melibiose, Inulin und Salicin werden nicht verwertet.
(13) Polyolverwertung: Sorbit und Mannit werden verwertet; Adenit, Dulcit und Inosit nicht.
(14) Decarboxylase-Reaktion auf Lysin: negativ.
(15) Ureolyse: schwach.
(16) Widerstandsfähigkeit gegenüber Schwermetallen: wächst direkt auf 500 ppm Cr&spplus;&spplus;&spplus;.
(17) Natriumchloridbrühe: Wachstum auf einer NaCl-Konzentration von 3,5 %.
(18) Optimale Temperatur für das Wachstum: 30 bis 37ºC,
maximale Temperatur für das Wachstum: 40 bis 50ºC,
minimale Temperatur für das Wachstum: 5 bis 20ºC.
(19) Sauerstoffbedarf: aerob.
Der Mikroorganismus wurde identifiziert als Bacillus megaterium auf Basis der mikrobiologischen Eigenschaften unter Bezugnahme auf Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (8. Ausgabe), R.E. Buchanan und N.E. Gibbons, Co-Editoren; veröffentlicht von Williams and Wilkins Company, Baltimore, Md. Der Mikroorganismus wurde hinterlegt bei der National Collection of Industrial Bacteria (NCIB), Torry Research Station, PO Box Nr. 31, 135 Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, Schottland, am 12. Februar 1980 und erhielt die NCIB Nr. 11568.
Es folgt eine Beschreibung des verwendeten Verfahrens.

A. In vitro Rekombination zwischen der Lambda-DNA und der DNA von B. Megaterium

Etwa 7 ug der B. Megaterium-DNA wurde mit 10 Einheiten Hind III bei 37ºC eine Stunde in einem Volumen von 25 ul Tris-Puffer mit pH 7,5 gespalten. Etwa 2 ug Lambda NM 590 wurde ebenso mit demselben Enzym gespalten. Die Reaktionen wurden beendet durch 10minütiges Erhitzen auf 75ºC.
Zwei Tests wurden durchgeführt, um die Effizienz der Spaltung zu bestimmen:
1. Eine Probe der zwei Reaktionsmischungen wurde in einem Agarosegel 20 Minuten mit 20 Volt elektrophoresiert. Nach Anfärben des Gels mit Ethidiumbromid wurde das erwartete Bandenmuster beobachtet; zwei Banden Lambda-DNA aus der Spaltung der einzigen Hind III-Stelle der Lambda-DNA und eine sehr große Anzahl fast überlappender Banden der Bakterien-DNA, die an einer großen Zahl von Stellen gespalten war.
2. Transfektionstest der Phagen-DNA zeigte, daß die Spaltung zu mehr als 99 % wirksam war, wodurch die biologische Aktivität der Phagen-DNA fast vollständig zerstört wurde.
Die gespaltenen DNA's wurden gemischt und 5 Stunden bei 10ºC mit 0,15 Einheiten T4-DNA-Ligase inkubiert, um ein statistisches Annealing und kovalentes Binden der DNA-Fragmente zuzulassen.
Am Ende der Inkubationszeit wurde die DNA mit einem in vitro-Verpackungspräparat vermischt, das aus einer Mischung zwei komplementärer defizienter Phagen-Lysate bestand (Lambda Dam und Lambda Eam), die aus nicht suppressiven Stämmen stammten. In dieser Mischung kann jedes DNA- Molekül mit cos Enden der Lambda-DNA, das die geeignete Größe hat, in das Phagenprotein eingebaut werden, wodurch in vitro ein biologisch aktives Phagenteilchen rekonstituiert wird, das E. coli infizieren kann und ein Infektionszentrum bilden kann (Plaque).
Um die Effizienz dieses Verfahrens zu testen, wurden zwei Kontrollen durchgeführt:
1. Eine Probe der Mischung wurde auf E. coli plattiert, 3 x 10&sup5; Plaques wurden gefunden pro ug eingesetzter Lambda-DNA. Dies war etwa 100fach mehr als mit dem gespaltenen Präparat gefunden wurde, was auf die gute Effizienz der Ligase- Behandlung deutet.
2. Die so gebildeten Plaques wurden visuell untersucht. 70 % davon waren klar statt trüb, was auf die Gegenwart eines Fragments von B. megaterium- DNA, ein Spleißen und damit ein Inaktivieren des Lambda-Gens C1, das für die Trübung der Plaques verantwortlich ist, deutet.
So konnte bestätigt werden, daß das Präparat eine statistische Probe aller bei B. megaterium möglichen Hind III DNA-Fragmente enthielt, die kompatibel sind mit einer Insertion in den Phagen Lambda NM 590.

B. Isolierung eines Phagen-Lambda-Derivats, das B. megaterium-Amylase trägt.

Der Rest der Verpackungsmischung wurde verwendet, um E. coli zu beimpfen auf einer großen Anzahl von Stärke enthaltenden Platten mit etwa 10³ lebensfähigen Teilchen pro Platte. Nach Wachstum der infizierten E. coli und Bildung der Plaques wurden die Platten gescreent auf die Gegenwart von Stärke abbauenden Plaques. Dies erfolgte, indem die Platten für eine kurze Zeit Joddämpfen ausgesetzt wurden; es wurde erwartet, daß der Plaque, der von solch einem Phagen gebildet wurde, von einem klaren Bereich umgeben wäre, der aus der Diffusion und Wirkung der Amylase der lysierten Zellen resultierte. Ein solcher Plaque wurde gefunden und der Phage, der darin enthalten war, wurde sofort herausgenommen zur Subkultivierung (ein längerer Kontakt mit Joddämpfen würde den Phagen getötet haben). Die Nachkommen dieses Plaques vermehrten sich reinrassig (Amylase produzierend) und werden bezeichnet als "Lambda NM 590 Amy 1". Phage Lambda NM 590 Amy 1 wurde hinterlegt bei der NCIB am 12. Februar 1980 als NCIB Nr. 11569.

C. Wiederholtes Klonieren des Amylase-Gens in Plasmid pBR 322

Dies wurde durchgeführt, sowohl um einen überproduzierenden Stamm zu erhalten, als auch um leicht eine große Menge an DNA mit dem Amylase-Gen herzustellen.
1 ug DNA von Lambda NM 590 Amy 1 und 0,3 ug von Plasmid pBR 322 DNA wurden gespalten, gemischt und mit Ligase behandelt, wie in Teil A. beschrieben. Dieses Präparat wurde verwendet, um (unter Verwendung üblicher Methoden) den Stamm HB 101 zu transformieren. Die Selektion geschah bezüglich der Ampicillin (ap) Resistenz, eine Eigenschaft, die den Zellen durch Gegenwart dieses Plasmids vermittelt wird. Dieses Plasmid vermittelt normalerweise auch die Resistenz gegenüber Tetracyclin (Tc). Jedoch wird bei der Einführung von Fremd-DNA in dieses Plasmid das tet-Gen gespalten, so daß der Anteil an Tetracyclin empfindlichen transformierten Klonen den Anteil der Plasmide, die die klonierte DNA enthalten, widerspiegelt. In diesem Fall enthielten 16 % der Klone ein neues Plasmid, das die Amylase-Aktivität an E. coli weitergab. (Gemäß der derzeitigen internationalen Nomenklatur für Plasmide werden die neuen, hier beschriebenen Plasmide bezeichnet (pCP) und das spezifische Plasmid dieses Beispiels wird bezeichnet als (pCP 1)).
Dies zeigt, daß das nochmalige Klonieren eines Gens mit demselben Enzym (in diesem Fall Hind III) ein sehr effizientes Verfahren ist (16 % statt 1/10&sup5;).
Der Plasmid enthaltende Mikroorganismus wird als E. coli CL 7001 (pCP 1) bezeichnet und wurde hinterlegt bei der NCIB am 12. Februar 1980 als NCIB Nr. 11570.

D. Amplikation und Enzymproduktion

Die Enzymproduktion in den Plasmid (pCP1) enthaltenden Zellen wurde auf zwei Arten verbessert wie folgt:

1. Gesättigte Kulturen

Die Kulturen wurden über Nacht bei 37ºC auf einem Schüttler mit kreisender Bewegung in 5 l unterteilten Erlenmeyer-Kolben, die 1 l Kulturmedium (LB; Hefeextrakt-Trypton) enthielten, inkubiert.

2. Chloramphenicol-Amplikation

Die Kulturen wurden bei 37ºC auf einem Schüttler mit kreisender Bewegung in 5 l Erlenmeyer-Kolben, die 1 l Kulturmedium (LB) enthielten, inkubiert, bis eine Dichte von 0,8 (650 nm) erreicht war, dem Punkt, an dem 150 ug/ml Chloramphenicol zugegeben wurden. Dies verhinderte eine weitere Replikation der Chromosomen-DNA, aber nicht die des Amylase-Gen enthaltenden Plasmids (pCP1). Nach Amplikation (bis zu 3000 Kopien) des Plasmids, verglichen mit der Chromosomen-DNA, wurde Chloramphenicol entfernt, damit die Proteinsynthese wieder beginnen konnte. Insbesondere wurden nach der Amplikation die Zellen von dem Medium abgetrennt durch Zentrifugation, gewaschen, um Chloramphenicol zu entfernen und zur Amylase- Produktion wieder kultiviert.

E. Enzymgewinnung

Es wurde das Verfahren des "osmotischen Schocks" angewendet, um die α-Amylase in sehr reiner Form zu gewinnen. Dieses Verfahren, das von H.C. Neu und L.A. Heppel in J. Biol. Chem. 240, 3685-3692 (1965) berichtet wird, war wie folgt.
Die Zellen wurden zuerst über Nacht gezüchtet und danach in einer 25%igen Saccharose-Lösung in 0,5 Volumina Kultur suspendiert und 10 Minuten bei 24ºC geschüttelt, eine Behandlung, die die Zellen plasmolysiert. Dann wurde EDTA zugegeben auf 1 mM (um die Zellwände permeabel zu machen) und das Material wurde weitere 10 Minuten bei 24ºC geschüttelt. Die Suspension wurde zentrifugiert und die Zellen wurden schnell in kaltem (etwa 0ºC) Wasser resuspendiert und bei dieser Temperatur 10 Minuten geschüttelt. Diese Suspension wurde wieder zentrifugiert und 96% des Enzyms konnten aus dem Überstand gewonnen werden.
Zum Vergleich wurde der Donor-Mikroorganismus (Bacillus megaterium) gezüchtet und die enzymatische Aktivität bestimmt. Die Enzymmenge pro ml Kulturmedium wurde gemessen mit dem DNS-Verfahren, wobei eine enzymatische Einheit definiert ist als die Menge von Enzym, die 1 mg reduzierenden Zucker (unter Verwendung von Maltose als Bezug) pro Minute bei 10 Minuten Inkubationszeit erzeugt. Das Substrat war sehr reine Amylose.
Der Donor-Mikroorganismus produzierte 66,0 enzymatische Einheiten pro Liter Kultur. Mit E. coli CL 7001 (pCP 1) gesättigte Kulturen produzierten 116,6 Einheiten pro Liter Kultur, während nach 5 Stunden Kultivierung mit Chloramphenicol (Amplikation), an die sich 15 Stunden ohne Chloramphenicol anschlossen, E. coli CL 7001 (pCP 1) 84,5 Einheiten pro Liter produzierte. Dies zeigt, daß das Verfahren der gesättigten Kultur ausreichend ist, um eine gute Verbesserung der Enzymproduktion zu liefern.
Das von E. coli CL 7001 (pCP 1) erzeugte Enzym, das als α-Amylase identifiziert wurde, hatte die folgenden Eigenschaften. Es spaltet sowohl Amylose als auch Amylopectin in Glucose, Maltose und Maltotriose, hauptsächlich Maltose und spaltet sowohl Cyclodextrin als auch Maltotriose in Glucose und Maltose. Es spaltet Pullulan in Panose und/oder Isopanose, eine Eigenschaft, ähnlich der eines Enzyms, das kürzlich von Mizucho Shimizu, Mutsuo Kanno, Masaki Tamura und Mikio Suekane "Purification and Some Properties of a Novel Alpha-Amylase Produced by a Strain of Thermoactinomyces vulgaris", Agric. Biol. Chem. 42 (9), 1978, Seiten 1681-1688, beschrieben wurde.
Der hier als Bacillus megaterium bezeichnete Mikroorganismus wurde von uns erst für Bacillus circulans gehalten.

Beispiel II

Klonierung eines hitzebeständigen α-Amylase-Gens

Der Donor-Mikroorganismus war ein Originalstamm Bacillus, der aus Kompost isoliert wurde und als Bacillus coagulans identifiziert wurde. Er produziert eine hitzebeständige α-Amylase und hat die folgenden mikrobiologischen Eigenschaften.
Sporen sind zentral oder terminal, nicht verformend.
(2) Nährbrühe: gutes Wachstum
(3) Nährschrägagar: gutes Wachstum, filamentös, verteilt, cremig weiß.
(4) Verwertung organischer Säuren - Citrat: positiv
- Malonat: negativ
(5) Gelatine: Verflüssigung
(6) Produktion von Acetylmethylcarbinol (Acetain): positiv.
(7) Orthonitrophenyl-Galactosid-Hydrolyse: positiv
(8) Reduktion von Nitraten: positiv, Gas kann erzeugt werden.
(9) Katalasereaktion: positiv
(10) Produktion von Indol: negativ
(11) Decarboxylase-Reaktion auf Lysin: negativ
Ornithin: negativ
Arginin: negativ
(12) Bildung von H&sub2;S: negativ
(13) Verwertung von Kohlehydraten: verwertet Arabinose, Galactose, Glucose, Lävulose, Mannose, Maltose, Saccharose, Stärke, Trehalose und produziert Säure aus ihnen.
(14) Pullulan wird in Minimalmedium verwertet
(15) Verwertung von Polyolen: Glycerin, Sorbit, Mannit, Inosit werden verwertet. Adonit, Dulcit werden nicht verwertet.
(16) Ureolyse: negativ
(17) Lecithin-Verwertung: negativ
(18) Optimale Temperatur für Wachstum: 50ºC Maximale Temperatur für Wachstum: 55 bis 60ºC Minimale Temperatur für Wachstum: 15 bis 25ºC.
(19) Sauerstoffbedarf: aerob und anaerob.
Der Stamm wurde hinterlegt bei der NCIB am 12. Februar 1980 als NCIB Nr. 11571.
Die DNA wurde extrahiert und der Wirkung von Eco RI; Hind III; Pst I; Sal I; Bam HI und Bgl II unterworfen. Nur Bgl II konnte viele Fragmente in einem weiten Bereich von Molekulargewichten erzeugen. Es war jedoch möglich, Fragmente mit Eco RI zu erzeugen, wenn die NaCl-Konzentration auf 50 mM verringert wurde. Es wurde daher beschlossen, Eco RI zu verwenden, um Fragmente für die Klonierung in einem Eco RI Lambda-DNA-Vektor zu erzeugen (Lambda NM781).

A. Restriktion von B. coagulans- und Lambda NM781-DNA

1,25 ug Lambda NM781-DNA wurden mit einer Einheit Eco RI geschnitten in 25 ul des folgenden Puffers: 10 mM Tris HCl (pH 7,5), 10 mM 2-Mercaptoethanol, 10 mM MgSO&sub4; und 100 mM NaCl.
2 ug B. coagulans-DNA wurden mit demselben Enzym im gleichen Puffer geschnitten, mit der Ausnahme, daß die NaCl-Konzentration auf 50 mM abgesenkt wurde. Die Inkubation erfolgte zwei Stunden bei 37ºC und die Reaktion wurde durch 10minütiges Erhitzen auf 75ºC gestoppt. Die Vollständigkeit der Restriktion wurde mit Elektrophorese in 1 % Agarosegel kontrolliert.

B. Ligierung und Gewinnung der rekombinanten Phagen

Die geschnittene DNA wurde vermischt und ligiert unter Verwendung von zwei Einheiten T&sub4; DNA-Ligase in einer Mischung, die 60 mM Tris HCl (pH 8), 10 mM MgSO&sub4;, 10 mM 2-Mercaptoethanol und 0,1 mM ATP enthielt. Die Reaktion erfolgte bei 10ºC 10 bis 15 Stunden lang. Nach der Ligierung wurden Aliquots von 0,2 ug DNA mit ATP gemischt, was eine Endkonzentration von 10&supmin;² M ergab. Diese Aliquots wurden einer in vitro-Verpackung unterzogen und verwendet, um Stamm HB 101 von E. coli zu infizieren. Etwa 1,6 x 10&sup4; PFU (Plaque bildende Einheiten) wurden pro ug Lambda-DNA erhalten. Unter diesen Phagen zeigten einige eine Amylase-Aktivität (zum Nachweis der Amylase-Aktivität auf Petrischalen und zur Gewinnung und Reinigung des Phagen siehe Beispiel I).
Ein ziemlich hoher Anteil von Amylase produzierenden Phagen wurde beobachtet (einer von 400).
Einer wurde ausgewählt und als "Lambda NM781 alpha Amy 1" bezeichnet. Er wurde bei der NCIB am 12. Februar 1980 als NCIB Nr. 11572 hinterlegt.

C. Erneutes Klonieren des Amylase-Gens aus Lambda NM781 alpha Amy 1 in Plasmid pBR 322

1 ug Lambda NM781 alpha Amy 1 DNA und dieselbe Menge DNA aus dem Plasmid pBR 322 wurden mit Eco RI geschnitten unter Verwendung üblicher Bedingungen. Die Ligierung und Transformation erfolgte wie in Beispiel I erklärt. Die Kolonien von E. coli HB 101, die rekombinantes Plasmid enthielten, wurden aufgrund ihrer Amylase-Aktivität nachgewiesen. Eine solche Kolonie wurde ausgewählt und als E. coli CL 7002 (pCP 2) bezeichnet. Sie wurde hinterlegt bei der NCIB am 12. Februar 1980 als NCIB Nr. 11573.

D. Amplikation des Genprodukts

Die Amplikation des Amylase kodierenden Gens von Lambda NM781 alpha Amy 1 und die Amylase-Produktion wurden wie folgt erreicht. Das Wirtsbakterium (E. coli HB 101) wurde in LB-Medium mit 2 mM MgCl&sub2; bei 37ºC gezüchtet, bis eine optische Dichte von 0,3 (bei 650 nm) erreicht war. Lambda NM781 alpha Amy 1 wurde dann zugegeben, wobei die Anzahl der Phagen so berechnet wurde, daß ein Faktor der Infektion von etwa 1 bis 2 erhalten wurde, d. h. ein oder zwei Phagen pro Bakterienzelle. Die Kultur wurde dann fortgesetzt unter heftigem Rühren bei 37ºC und die optische Dichte wurde verfolgt, bis sie anfing abzufallen. Als sie auf unter 0,5 abgefallen war, wurde die Kultur geerntet und auf Eis gegeben. Die Kultur wurde zentrifugiert und der Überstand wurde auf Amylase-Aktivität getestet.
Die Amplikation und Enzymproduktion mit E. coli Cl 7002 (pCP 2) wurde erreicht unter Verwendung sowohl des Verfahrens der gesättigten Kultur als auch mit Chloramphenicol-Amplikation, wie in Beispiel I.
Die Amylase-Aktivität wurde bestimmt unter Verwendung des DNS-Verfahrens sowohl im Phagenlysat als auch in den Kulturen von E. coli, die das rekombinante Plasmid aufwiesen. Tabelle I zeigt die Werte, die für die Amylase-Aktivität im Originalstamm vom B. coagulans erhalten wurden und die Aufteilung zwischen der extrazellulären Aktivität und der zellgebundenen Aktivität. Die Aktivitäten, die mit dem rekombinanten Phagen (Lambda NM781 alpha Amy 1) und die, die mit dem Stamm, der das rekombinante Plasmid E. coli CL 7002 (pCP 2) enthält, erhalten wurden, sind auch angegeben. Eine Verbesserung der Enzymproduktion um etwa das Dreifache wurde erhalten mit dem rekombinanten Phagen und eine weitere Verbesserung wurde mit dem Plasmid beobachtet (etwa 300 fach).
Im Fall des Phagen (Lambda NM781 alpha Amy 1) wird alles Enzym bei Zellyse freigesetzt und ist anschließend im Kulturmedium vorhanden. Im Fall des Plasmids ist der größte Teil des Enzyms zellgebunden (96%).
E. Nochmaliges Klonieren in ein Derivat des Phagen Lambda, der E. coli lysogenisieren kann
TEXT FEHLT
Um die Herstellung eines Vektor-Wirtssystem darzustellen, das Lambda, der lysogen für E. coli ist, enthält, wurde der folgende Versuch durchgeführt.
Bakteriophage Lambda T4 lig. CI 857 Wam Eam Sam (Lambda NM 989) wurde angewendet. Er ist beschrieben in J. Mol. Biol. Vol. 132 (1979), "Molecular Cloning of the DNA Ligase Gene from Bacteriophage T4. I. Characterization of the Recombinants" von G.G. Wilson und Noreen E. Murray (Seiten 471 bis 491) und "II. Amplification and Separation of the Gene Product" von Noreen E. Murray, S.A. Bruce und K. Murray (Seiten 493 bis 505).
Dieser Phage enthält das DNA-Ligase-Gen des Bakteriophagen T4 und kann E. coli lysogenisieren. Er hat außerdem ein hitzeempfindliches Immunitätsgen und zwei Amber-Mutationen im E-Gen bzw. dem S-Gen. Die Mutation des S-Gen führt dazu, daß die Bakterien bei Infektion mit diesem Phagen nicht mehr lysiert werden. Der Zweck des Subklonierens war es, das DNA-Ligase-Gen durch das Amylase kodierende Gen zu ersetzen.
Die DNA des Phagen und des Plasmids (pCP 2) wurde mit Eco RI geschnitten und die Fragmente wurden ligiert. Die Phagen-DNA, die sich durch die Ligierung ergab, wurde dann in vitro verpackt und die Plaques sichtbar gemacht, indem sie auf einem Stamm von E. coli Sup E Sup F plattiert wurden. Die Plaques, die Amylase-Aktivität zeigten, wurden herausgenommen und der Phage wurde gereinigt unter Verwendung der vorher beschriebenen Technik.
Dieser Phage wurde dann verwendet, um einen Stamm von E. coli C 600 (CL 1205) unter Verwendung üblicher Techniken zu lysogenisieren. Die lysogenen Kolonien wurden sichtbar gemacht auf einem Stärke enthaltenden Medium unter Verwendung der Jodfärbung. Dieser Stamm wurde als E. coli CL 7003 (Lambda alpha Amy 1) bezeichnet und bei der NCIB am 06. März 1980 als NCIB Nr. 11586 hinterlegt.
Die Amplikation des Genproduktes wurde auf folgende Weise erreicht. Der lysogene Stamm wurde bei 32ºC in LB-Medium gezüchtet, bis eine Dichte von 0,8 bei 650 nm erreicht war, dann zentrifugiert und die Zellen wurden in frischem LB-Medium, das auf 45ºC vorgewärmt worden war, suspendiert. Die Kultur wurde dann in einem 45ºC warmem Bad 15 Minuten inkubiert, um den lytischen Zyklus zu induzieren (da das Immunitätsgen- Produkt wärmeempfindlich ist).
Die Inkubation wurde dann unter heftigem Schütteln 3 Stunden bei 37ºC fortgesetzt. Die Amylase-Aktivität wurde dann im Überstand und in den Zellen gemessen. Die Werte sind in Tabelle I angegeben.
Dieses spezielle Experiment zeigt eine "Subklonierungs"-Technik von dem Plasmid in einen neuen Lambda-Phagen. Es ist ohne weiteres zu verstehen, daß die DNA von Lambda NM781 alpha Amy 1 ebenso leicht in den Phagen Lambda T4 lig. CI 857 Wam Eam Sam subkloniert hätte werden können. Alternativ könnte die Donor-DNA direkt in den zuletzt erwähnten Phagen kloniert werden, wobei eine Zahl von Variationen des beispielhaft angegebenen Verfahrens möglich ist.
F. Gewinnung und Charakterisierung der Amylase, die von Lambda NM781 alpha Amy 1, E. coli CL 7002 (pCP 2) und E. coli CL 7003 (Lambda alpha Amy 1) hergestellt wird.
Wie in Beispiel I wurde das Verfahren des osmotischen Schocks zur Gewinnung des Enzyms angewendet. Außerdem konnte, da das Enzym dieses Beispiels thermostabil ist, es weiter gereinigt werden, durch Zugabe von einer wäßrigen Lösung von 10 mM Ca&spplus;&spplus; und Erwärmen der Lösung auf 80ºC und 10 Minuten Halten auf dieser Temperatur; diese Behandlung fällt alle E. coli Proteine und erlaubt die Gewinnung der α-Amylase in extrem reiner Form, praktisch ohne daß Zellbruchstücke oder andere Enzyme vorhanden sind.
Die Spezifität der α-Amylase wurde bestimmt: sie ist aktiv bei Amylose und Stärke, die Produkte der Hydrolyse sind Glucose, Maltose und Maltotriose mit Spuren von Komponenten mit höherem Molekulargewicht. Dieses Enzym ist nicht aktiv bei Cyclodextrin. Die Hitzebeständigkeit des Enzyms wurde auch untersucht und erwies sich als sehr hoch. Die optimale Temperatur für die Aktivität bei 0,5 % Amylose liegt zwischen 80 und 90ºC. Mit 8 % löslicher Stärke ist das Optimum bei etwa 100ºC.
Es ist möglich, daß der hier als Bacillus coagulans bezeichnete Mikroorganismus tatsächlich Bacillus licheniformis ist. Tabelle I Amylase-Aktivität in Einheitenx/Liter im Originalstaub von B. coagulans und den rekombinanten Klonen von Beispiel II Überstand Periplasma Zellen insgesamt Verbesserung der Enzymproduktion B. coagulans Lambda NM 781 Alpha Amy 1 E. coli CL 7002 (pCP 2) mit CM Amplifizierung E. coli CL 7002 (pCP 2), Übernachtkultur E. coli CL 7003 (Lambda Alpha Amy 1) x Eine Einheit wird definiert als die Menge an Enzym, die 1 mg Maltose-Äquivalent pro ml pro Minute bei 50ºC unter Verwendung von 0,5 % Amylose als Substrat ergibt. xx Das Verfahren mit osmotischem Schock wurde nicht verwendet, aber es erfolgte eine Lyse, so daß dieser Wert die Summe der Amylase-Aktivität in Periplasma und den Zellen darstellt.

Beispiel II A

Subklonierung von Plasmid pCP 2 in Plasmid pC 194 und Expression des neuen Plasmids in Bacillus subtilis

Dieses Beispiel zeigt eine Technik, mit der gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellte rekombinante DNA in einem anderen Wirtsbakterium als E.coli exprimiert werden kann, nämlich in einem Stamm Bacillus subtilis.
Plasmid pCP 2 von Beispiel II enthält ein 3,31 kb Fragment des B. coagulans-Donors; das Plasmid ist weiter dadurch charakterisiert, daß es die Ampicillin- und die Tetracyclinresistenz vermittelt und es enthält jeweils zwei Restriktionsstellen für Eco RI und Hind III. Plasmid pCP 2 wurde in 4 Fragmente gespalten mit Eco RI und Hind III, mit Ligase behandelt und verwendet, um HB 101 zu transformieren, wie in den vorhergehenden Beispielen.
Neue Plasmide, die als pCP 2.3 bezeichnet wurden, wurden gebildet, die ein 2,69 kb Fragment von B. coagulans-DNA aufwiesen, das Fragment, das das α-Amylase kodierende Gen enthält. pCP 2.3 hat jeweils eine einzige Stelle für Eco RI und Hind III und vermittelt sowohl die Ampicillin- als auch die Tetracyclinresistenz.
Für den nächsten Schritt wurde Plasmid pC 194 ausgewählt, das ein Plasmid ist, von dem bekannt ist, daß es sich selbst in Bacillus subtilis replizieren kann. pC 194 liefert die Chloramphenicol-Resistenz und hat eine einzige Hind III-Stelle.
Sowohl pCP 2.3 als auch pC 194 wurden mit Hind III geöffnet, vermischt und ligiert unter Bildung eines neuen Plasmids, das als pCH 1 bezeichnet wird, das das α-Amylase kodierende Gen enthält und sowohl Chloramphenicol-Resistenz als auch Ampicillin-Resistenz aufweist, obwohl der Grad der Chloramphenicol-Resistenz in E. coli niedrig ist. Wie vorher wurde das Präparat verwendet, um E. coli HB 101 zu transformieren.
Der Mutantenstamm von B. subtilis, der als QB 1133 bezeichnet wurde (erhalten von Dr. Michael Steinmetz, Institut de Recherche en Biologie Moleculaire, Université Paris VII, Tour 43, 2 Place Jussieu, 75221 Paris Cedex 05), ein Stamm, der keine α-Amylase-Aktivität aufweist, wurde dann gemäß der Technik von S. Chang und S. Cohen, Molec. Gen. Genet. 168, 111-115 (1979) behandelt zur Bildung von Protoplasten. Die Protoplasten wurden dann mit pCH 1 transformiert unter Verwendung des durch Polyethylenglykol vermittelten Transformations-Verfahrens von Chang und Cohen (oben).
Die Protoplasten wurden dann in einem Vollmedium 1,5 Stunden inkubiert, damit das Plasmid in den Bakterien die Resistenz gegenüber Chloramphenicol exprimieren konnte.
Die Protoplasten wurden dann auch einem Regenerationsmedium, dem Chloramphenicol in einer Menge von 20 ug/ml zugesetzt worden war, plattiert. Nach zwei Tagen Inkubation bei 37ºC erschienen Kolonien der transformierten Zellen; die Kolonien mit α-Amylase-Aktivität wurden nachgewiesen mit der Joddampf-Anfärbungstechnik. Ein Klon, der als B. subtilis CL8001 (pCH 1) bezeichnet wurde, wurde am 13. Januar 1981 als NCIB Nr. 11629 hinterlegt. Der Originalstamm QB1133 wurde ebenso am 13. Januar 1981 als NCIB Nr. 11628 hinterlegt.
B. subtilis CL 8001 (pCH 1) ist nur in Gegenwart von Chloramphenicol stabil. Er kann verwendet werden, um α-Amylase zu produzieren, indem er in einem Medium, das Chloramphenicol (20 ug/ml) enthält, gezüchtet wird. Die α-Amylase kann leicht aus der Kulturflüssigkeit gewonnen werden.
Nach Übernachtkultur in Gegenwart von Chloramphenicol wurde die Menge von erzeugter α-Amylase wie folgt bestimmt: Überstand ZelleGesamt

Beispiel III

Klonieren einer β-Amylase

Der Donor-Mikroorganismus war ein Stamm von Bacillus cereus, der in dem britischen Patent 1,466,009 der Agency of Industrial Science & Technology (Japan) beschrieben wird. Er wurde hinterlegt bei dem Fermentation Research Institute von Chiba-shi, Japan am 20. Dezember 1973 als FERM - P Nr. 2391 und wurde auch bei der American Type Culture Collection als ATCC Nr. 31102 am 26. Dezember 1974 hinterlegt. Es ist bekannt, daß er sowohl β-Amylase als auch α-1,6-Glucosidase produziert.

A. Klonierung des β-Amylasegens in Lambda NM781

Die für die Restriktion, Ligierung und Gewinnung der rekombinanten Phagen verwendeten Verfahren waren dieselben wie bei Beispiel II. Die DNA (2 ug) von B. cereus wurde unter normalen Bedingungen mit dem Restriktionsenzym Eco RI geschnitten. Die Phagen-Vektor- DNA (1,25 ug von Lambda NM781) wurde auch mit Eco RI geschnitten. Die Ligierung und Verpackung wurde wie vorher beschrieben durchgeführt.
Verschiedene rekombinante Phagen, die α-Amylase-Aktivität aufwiesen, wurden entdeckt (etwa einer von 500). Einer dieser Phagen (bezeichnet als Lambda NM781 beta Amy 1) wurde ausgewählt; er wurde bei NCIB am 12. Februar 1980 als NCIB Nr. 11574 hinterlegt.

B. Wiederholte Klonierung des β-Amylasegens aus Lambda NM781 beta Amy 1 in Plasmid pBR 322

Um die Enzymproduktion zu erhöhen, wurde dieser erste β-Amylase-Klon verwendet als Quelle von β-Amylase kodierender DNA, um diese in das Multicopy Plasmid pBR 322 zu subklonieren.
2 ug Lambda NM781 beta Amy 1 DNA und 1 ug pBR 322 wurden mit Eco RI geschnitten, gemischt und mit T4-Ligase behandelt. Ligierung und Transformation wurden wie vorher beschrieben durchgeführt.
Eine Kolonie von 200 Ampicillin-resistenten Kolonien zeigte eine Stärke abbauende Aktivität. Eine wurde isoliert und als E. coli CL 7004 (pCP 3) bezeichnet; sie wurde am 15. September 1980 als NCIB Nr. 11602 hinterlegt.

C. Erneutes klonieren des β-Amylase-Gens in ein Derivat des Phagen Lambda, der E. coli lysogenisieren kann.

Der angewendete Vektor war der hitzeempfindliche Lambda T4 lig Phage CI 857 Wam Eam Sam (Lambda NM 989), der in Beispiel II beschrieben wurde. Etwa 1 ug der Plasmid pCP 3-DNA und 0,5 ug der Phagen-DNA wurden gespalten, dann wurden die Fragmente miteinander ligiert und die entstehenden DNA-Stücke in vitro verpackt. Die Phagenteilchen, die eine α-Amylase-Aktivität aufwiesen, wurden isoliert und verwendet, um lysogene Kolonien mit demselben Verfahren wie vorher zu erhalten. Der Stamm E. coli C600, der für diesen rekombinanten Phagen lysogen ist, wurde isoliert und als E. coli CL 7005 (Lambda beta Amy 1) bezeichnet, er wurde am 15. September 1980 als NCIB Nr. 11603 hinterlegt.

D. Amplikation des Amylase-Genprodukts

In allen Klonen und Subklonen wurde die Amylase-Aktivität mit dem DNS-Verfahren nachgewiesen. Die β-Amylase-Aktivität wurde mit DC-Chromatogramm bestätigt durch Gegenwart eines einzigen Punktes für Maltose nach Verdau von Amylose.
Die Amplikation des β-Amylasegens in verschiedenen Klonen wurde durchgeführt, wie vorher beschrieben. Tabelle II zeigt die enzymatische Aktivität des Originalstamms, verglichen mit der in den drei Klonen; diese Aktivität wurde entweder aus dem Phagen-Lysat oder mit dem Verfahren des osmotischen Schocks, das im Beispiel II beschrieben ist, gewonnen. Tabelle II Extrazelluläre und zellgebundene β-Amylase-Aktivität in B. dereus und in den rekombinanten Klonen Extrazelluläre Aktivität Einheit/Liter (1) zellgebundene Aktivität Einheit/Liter Gesamt-Aktivität Einheit/Liter B. cereus (2) ATCC 31102 Lambda NM 781 Beta Amy 1 E. coli CL 7004 (pCP 3) (3) E. coli CL 7005 (Lambda Beta Amy 1) (4) nicht bestimmt (1) Zellgebundene Aktivität: Behandlung mit Lysozym und Lyse der Zellen. (2) Die Kultur erfolgte über Nacht bei 30ºC (Hefeextrakt 1 %; Baktotrypton 1 %; NaCl 0,5 %). (3) Übernachtkultur bei 37ºC (selbe Zusammensetzung des Kulturmediums) (4) Kultivierung bei 32ºC T 45ºC T 37ºC, Aktivität gemessen in Überstand und in den Zellen nach Lyse, wie für E. coli Lambda alpha Amy 1 in Beispiel II.

Beispiel IV

Klonieren eines Pullulanase-Gens

Der Donor-Mikroorganismus war Klebsiella pneumoniae, der von H. Bender in Biochem. Z. 334, Seiten 79 bis 95 (1961) beschrieben wird und bei ATCC am 06. Juni 1963 als Nr. 15050 hinterlegt wurde. Er ist auch erwähnt in dem britischen Patent 1,273,789 von A.E. Staley.
2,25 ug Donor-DNA wurden extrahiert und mit Eco RI fragmentiert unter Verwendung von Standard-Bedingungen und 1,25 ug Lambda NM 781-DNA wurde mit demselben Enzym geschnitten unter denselben Bedingungen. Die Inkubation wurde drei Stunden bei 37 ºC durchgeführt und danach wurde die Reaktion durch 10minütiges Erhitzen auf 75ºC gestoppt. Die Vollständigkeit der Restriktion wurde wie in Beispiel II bestimmt.
Die geschnittenen DNA's wurden ligiert, gewonnen und verwendet, um den Stamm HB 101 von E. coli zu infizieren, alles wie in Beispiel II. Etwa 2 x 10&sup5; PFU wurden pro ug Lambda-DNA erhalten.
Nach zwei Tagen Inkubation bei 37ºC auf Platten, die BBL- Trypticase plus 0,25 % Pullulan enthielten, zeigten einige Plaques Pullulanase-Aktivität, d. h. waren von durchsichtigen Ringen umgeben, die charakteristisch sind für "überwachsende" Bakterien. Der Anteil der Pullulanase-produzierenden Phagen war im Bereich von 1/2.500.
Einer wurde ausgewählt und als Lambda NM 781 Pul 1 bezeichnet; er wurde bei der NCIB am 09. April 1980 als NCIB Nr. 11593 hinterlegt.
Die Pullulanase-Aktivität wurde mit dem DNS-Verfahren nachgewiesen und das Produkt der Hydrolyse von Pullulan durch die Phagenlysate wurde durch Dünnschicht-Chromatographie als Maltotriose identifiziert.
Lambda NM 781 Pul 1 enthält ein großes DNA-Fragment (von Klebsiella pneumoniae) von 13,5 Kb; dieses Fragment wurde wiederum mit Eco RI gespalten, was zu zwei Fragmenten mit 6,1 Kb bzw. 7,4 Kb führte. Das Subfragment mit 6,1 Kb wurde dann in Lambda NM 781 rekloniert und es erwies sich, daß es das Pullulanase-Gen enthielt. Dieser neue rekombinante Phage wird als Lambda NM 781 Pul 2 bezeichnet; er wurde am 15. September 1980 als NCIB Nr. 11,604 hinterlegt.
Das 6,1 Kb Subfragment wurde weiter subkloniert in das Multicopy-Plasmid pACYC 184 (ein Derivat von pBR 322 mit dem Tc -Gen des letzteren und einem Cm -Gen mit einer Eco RI- Stelle). Dieser neue Klon wird als E. coli CL 7006 (pCP 4) bezeichnet; er wurde am 15. September 1980 als NCIB Nr. 11605 hinterlegt.
Ein dritter Subklon wurde konstruiert, indem das 6,1 Kb- Fragment in den Phagen Lambda NM 989 insertiert wurde, wie in Beispiel II beschrieben. Dieser Klon wird als E. coli CL 7007 (Lambda Pul 2) bezeichnet; er wurde am 15. September 1980 als NCIB Nr. 11,606 hinterlegt.
Das Ausmaß der Expression und der Amplikation der Pullulanase wurde für alle Klone untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt.
Wie sich aus den Ergebnissen zeigt, wird die Pullulanase- Aktivität durch Maltose induziert, wobei 0,04 % Maltose dem LB-Medium zugegeben worden waren. Weiterhin war eine Triton X 100 Behandlung der Membran-Fraktion notwendig, um die Pullulanase zu gewinnen, was zeigt, daß die Aktivität in den Membranen lokalisiert ist. Tabelle III Expression von Klebsiella-Pullulanase in E. coli Klonen. Die Aktivität ist ausgedrückt als Einheiten Maltose-Äquivalent pro Liter Kultur Überstand Membranen insgesamt Verbesserung der Enzymproduktion Klebsiella pneumonia + Maltose / NM 781 Pul 1 / NM 781 Pul 1 + Maltose / NM 781 Pul 2 / NM 781 Pul 2 + Maltose x E. coli CL 7006 (pCP 4) x E. coli CL 7006 (pCP 4) + Maltose xx E. coli CL 7007 (Lambda Lambda Pul 2) + Maltose nicht nachgewiesen x Übernachkultur xx Züchtung bei 32ºCT45ºCT37ºC, Aktivität gemessen im Überstand und in den Zellen nach Lyse, wie für E. coli Lambda alpha Amy 1 in Beispiel II.

Claims

1. Rekombinante DNA, enthaltend ein Amylase kodierendes Gen als einziges Fremdgen, das exprimiert werden soll, hergestellt mit einem in vitro-Verfahren, bei dem DNA, die aus einem bakteriellen Donor-Mikroorganismus stammt, gespalten wird und die entstehenden DNA-Fragmente mit einem Vektor, der auf dieselbe Weise gespalten wurde, kombiniert wird, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor ein Plasmid oder die DNA eines Derivats des Phagen Lambda umfaßt.

2. Rekombinante DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der bakterielle Donor-Mikroorganismus ein Bacillus- Stamm ist.

3. Rekombinante DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der bakterielle Donor-Mikroorganismus Bacillus megaterium, Bacillus coagulans, Bacillus cereus oder Klebsiella pneumoniae ist.

4. Rekombinante DNA nach Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß der bakterielle Donor-Mikroorganismus Bacillus megaterium NCIB Nr. 11568, Bacillus coagulans NCIB Nr. 11571, Bacillus cereus ATCC Nr. 31102 oder Klebsiella pneumoniae ATCC Nr. 15050 ist.

5. Rekombinante DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor Plasmid pBR 322, pACYC 184 oder pC 194 umfaßt.

6. Rekombinante DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor den Phagen Lambda NM 590, Lambda NM 781 oder Lambda NM 989 umfaßt.

7. Rekombinante DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Phagen Lambda NM 590 Amy 1, NCIB Nr. 11569; Lambda NM 781 alpha Amy 1, NCIB Nr. 11572; Lambda NM 781 beta Amy 1, NCIB Nr. 11574; Lambda NM 781 Pul 1, NCIB Nr. 11593; Lambda NM 781 Pul 2, NCIB Nr. 11604 oder Varianten davon mit im wesentlichen denselben Eigenschaften umfaßt.

8. Gentechnisch veränderter Mikroorganismus enthaltend rekombinante DNA, dadurch gekennzeichnet, daß die rekombinante DNA die rekombinante DNA nach einem vorhergehenden Ansprüche umfaßt und daß der Mikroorganismus ein bekannter Mikroorganismus ist, der diesen Vektor aufnehmen und replizieren kann.

9. Mikroorganismus nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß er unter geeigneten Züchtungsbedingungen Amylase in einer Menge erzeugen kann, die wesentlich größer ist als die, die von dem Original-Donor-Mikroorganismus erzeugt wird.

10. Mikroorganismus nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß er E. coli oder B. subtilis umfaßt.

11. Mikroorganismus nach Anspruch 8, 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß er E. coli CL 7001 (pCP 1), NCIB Nr. 11570; E.coli CL 7002 (pCP 2) NCIB Nr. 11573; E. coli CL 7003 (Lambda alpha Amy 1) NCIB Nr. 11586; E. coli CL 7004 (pCP 3), NCIB Nr. 11602; E. coli CL 7005 (Lambda beta Amy 1), NCIB Nr. 11603; E. coli CL 7006 (pCP 4), NCIB Nr. 11605; E. coli CL 7007 (Lambda Pul 2), NCIB Nr. 11606; B. subtilis CL 8001 (pCH 1), NCIB Nr. 11629 oder Varianten davon mit im wesentlichen denselben Eigenschaften umfaßt.

12. Verfahren zur Herstellung der rekombinanten DNA von Anspruch 1, umfassend das Spalten und Verbinden der DNA eines bakteriellen Donor-Mikroorganismus, der ein Amylase kodierendes Gen als einziges Fremdgen, das exprimiert werden soll, enthält und eines Vektors, Einführung in einen bekannten Wirts-Mikroorganismus, der den Vektor aufnehmen und replizieren kann und Screenen und Auswählen der entstehenden Klone auf Basis der Gegenwart des Amylase kodierenden Gens, dadurch gekennzeichnet, daß der Vektor die DNA eines Derivats des Phagen Lambda umfaßt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, das den weiteren Schritt einschließt, daß die DNA eines ausgewählten Klons extrahiert und gespalten wird, in einen anderen Vektor subkloniert wird und wiederum gescreent und ausgewählt wird auf Basis der Gegenwart eines Amylase kodierenden Gens, wobei der andere Vektor ein Plasmid oder die DNA eines anderen Derivats des Phagen Lambda umfaßt; wobei sich an das Subklonieren gegebenenfalls ein oder mehrere Subklonierungen anschließen.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Screening durchgeführt wird, indem die Klone auf einem Stärke enthaltenden Kulturmedium plattiert werden und das Medium mit Jod angefärbt wird, indem die Platten Joddämpfen ausgesetzt werden.

15. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Amylase kodierende Gen ein Pullulanase kodierendes Gen umfaßt und das Screenen durchgeführt wird, indem die Klone auf einem BBL-Trypticase-Medium, das Pullulan enthält, plattiert werden, wobei positive Klone sichtbar gemacht werden durch durchsichtige Ringe, die sie umgeben.

16. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Donor-Miokroorgansimus Bacillus megaterium, Bacillus coagulans, Bacillus cereus oder Klebsiella pneumoniae umfaßt.

17. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Donor-Mikroorganismus Bacillus megaterium NCIB Nr. 11568, Bacillus coagulans NCIB Nr. 11571, Bacillus cereus ATCC Nr. 31102 oder Klebsiella pneumoniae ATCC Nr. 15050 ist.

18. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Phage, an den die Donor-DNA gebunden wird, Lambda NM 590 oder Lambda NM 781 umfaßt.

19. Verfahren nach Anspruch 13, worin die DNA der ausgewählten Klone mit einem Plasmid verbunden wird, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid pBR 322, pACYC 184 oder pC 194 umfaßt.

20. Verfahren nach Anspruch 13, worin die DNA der ausgewählten Klone mit der DNA eines anderen Derivats des Phagen Lambda verbunden wird, dadurch gekennzeichnet, daß der Phage Lambda NM 989 umfaßt.

21. Verfahren zur Erzeugung von Amylase, umfassend die Züchtung eines gentechnisch veränderten Mikroorganismus von Anspruch 8 unter Amylase produzierenden Bedingungen.

22. Verfahren nach Anspruch 21, worin die rekombinante DNA in Form eines lytischen Phagen vorhanden ist und die Züchtung in einem infizierten Bakterienwirt stattfindet.

23. Verfahren nach Anspruch 21, worin die rekombinante DNA in Form eines Phagen in einem lysogenen E. coli vorhanden ist und die Züchtung durchgeführt wird, indem die Phagenvermehrung durch Hitzebehandlung induziert wird.

24. Verfahren nach Anspruch 21, worin die rekombinante DNA in dem gentechnisch veränderten Mikroorganismus in Form eines Plasmids vorhanden ist und die Züchtung durch Wachstum in der stationären Phase durchgeführt wird.

25. Verfahren nach Anspruch 24, worin das Plasmid ein Derivat von pBR 322 oder pACYC 184 ist und eine Amplifikation durch Züchtung in Gegenwart von Chloramphenicol durchgeführt wird vor dem Wachstum in der stationären Phase.