RU1838410C

RU1838410C - Способ получени альфа-амилазы

Info

Publication number: RU1838410C
Application number: SU823451221A
Authority: RU
Inventors: Энтойн Кольсон Чарльз; Эмил Корнелис Пирр; Симон Дигнефф Колетт; Г.П.Валон Рауль; Валон Коррине
Original assignee: СПС Интернэшнл Инк
Priority date: 1980-02-15
Filing date: 1982-06-11
Publication date: 1993-08-30
Also published as: GB2069503A; US4469791A; FI810425L; EP0034470A2; ES8202362A1; YU44739B; DD158917A5; HU195533B; IL61982A0; IE810297L; DE3177286D1; YU37781A; KE3310A; DK62881A; ES499391A0; GR73678B; DK162776B; CA1183090A; EP0034470B1; FI70424B

Description

Изобретение относитс к области технической генетики, а именно к способу получени альфа-амилазы.

Целью изобретени вл етс повышение эффективности способа получени альфа-амилазы .

. П р и м е,р 1. Клонирование гена альфа- амилазы.

Примен ют следующие материалы: ограничивающа эндонулеаза Hindlll; лигаза ДНКТ4; фаг/л мбда NM 590. ДНК фага получают экстракцивй фенолом из высокочистых частиц фага; плазмида pBR322. ДНК плЭзмиды очищают из клеток E.coli, лизиро- ванных лизоцимом, в хлорид цези -бромид этиди градиентах плотности; микроорга- .нидм-хоз ин: E.coli; микроорганизм-донор штамм Bacillus megaterium со следующими микробиологическими признаками:

морфологи : палочки (0,5-0,7 х 2,0-5,0 мкм), подвижные, грамположительные, споры терминальные и субтерминальные;

питательный бульон: хороший рост;

питательный бульон: хороший рост, колонии плотные посредине и более расплывчатые вокруг;

молоко: пептонизаци без изменени рН;

желатин: не сжижает;

восстановление нитратов: отрицательна реакци ;

каталазна реакци : отрицательна ;

оксидазна реакций: отрицательна ;

цитоэромоксидазна реакци : отрицательна ;

продуцирование индола: отрицательна ;

образование сероводорода: отрицательна ;

потребление углеводов: потребл ет арабинозу, ксил.озу, галактозу, глюкозу, левулезу , мальтозу, рафинозу, сахарозу, крахмал и кислоты, полученные из них, нарамнозу, маннозу, мелибиозу, инулин и салицин не потребл ет;

потребление многоатомных спиртов: потребл етсорбитол и маннитол, не потребл ет аденитол, дульцитол и ионозитол;

ел

с

., .1

00 СА) 00

4

СА)

декарбоксилазна реакци на лизии: отрицательна ;

уреолиз: слабый;

сопротивл емость действию т желых металлов: растет непосредственно на 500 м.д.

бульон хлорид натри : рост при концентрации хлорида натри 3,5%;

оптимальна температура роста: 30- 37°С;

максимальна температура роста: 40- 50°С;

минимальна температура роста: 5- 20°С;

потребность в кислороде: аэробный микроорганизм.

Микроорганизм сдан на хранением Национальную коллекцию промышленных бактерий 12 феврал 1980 г под номером NCIB № 11568.

Ниже приводитс описание применени способа его получени .

А. Рекомбинаци in vitro между ДНК л мбда и B.megaterium.

Около 7 мкг ДЕК B.megaterium расщепл ют 10 ед. Hindlll при температуре 37°С в течение 1 ч в объеме 25 мкл буферного раствора Трис при ,5. Около 2 мкг л мбда М 590 расщепл ют аналогичным образом тем же ферментом. Реакции останавливают путем нагрева в течение 10 мин при температуре 75°С.

С целью определени эффективности расщеплени образцы обеих реакционных смесей подвергают электрофорезу в геле агарозы в течение 20 ч при напр жении 20 В. После окрашивани гел этидийброми- дом должны получить две полосы ДНК л мбда , полученные в результате расщеплени отдельного участка Hindlll на ДНК л мбда, и очень большое количество почти перекрещивающихс полос бактериальной ДНК, расщепленной на большое количество участков .

Расщепление ДНК смешивают и инкубируют в течение 5 ч при температуре 10°С 0,15 единиц ДНК лигазы Т4, чтобы могли, происходить произвольна повторна рена- тураци и ковэлентное окружение фрагментов ДНК.

По окончании инкубации ДНК смешивают с препаратом, инкапсидированным in vitro, состо щим из смеси двух комплементарно-дефективных лизатов фага (л мбда Dam и л мбда Ват), индуцированных из неподавл ющих штаммов.

Дл оценки эффективности этого рпосо- ба выполн ют два контрольных опыта.

1. Образец смеси был сведен в E.coli. В результате должно быть получено 3-10

п тен на 1 мкг введенной ДНК л мбда, что указывает на большую эффективность обработки лигазой.

2. Полученные таким образом плтнэ были исследованы визуально. Если из них 70% были прозрачные, а не мутные, то это указывает на присутствие фрагмента ДНК. B.megaterium, который стыкует и, следовательно , инактивирует л мбда ген CI, отвечающий за помутнение п тна.

В. Отделение деривата фага л мбда, несущего B.megateterium амилазу.

Остаток инкапсидационной смеси примен ют дл заражени E.coli в количестве

5 приблизительно 103 жизнеспособных частиц на посев. После роста зараженных E.coli и образовани п тен посевы сортируют на присутствие п тен разложени крахмала. Это делают путем кратковременного дейст0 ви на посевы парами иода. При этом п тно, образованное таким фагом, будет окружено прозрачной зоной, образующейс в результате диффузии и действи амилазы из лизо- ванных клеток. Фаг, содержащий это п тно,

5 немедленно отбирают дл субкультивировани (длительное действие паров иода убило бы фаг). Потомство этого п тна размножилось в чистоте (продуциру амилазу) и обоз1 начено как л мбда NM 590 Amy. Фаг л мбда

0 мм 590 Amyl сдан на хранение в Национальную коллекцию промышленных бактерий 12 феврал 1980 г; под номером NCIB № 11569.

С,.Повторное клонирование гена амила5 зы в плазмиду pBR 322.

1 мкг ДНК из л мбда NM 590 Amy и 0,3 мкг плазмиды PBR 322 расщепл ют, смешивают и обрабатывают лигазой, как описано в части А. Этот препарат, примен ют дл

0 трансформации (по обычной методике) штамма НВ 101. Отбор производ т по сопротивл емости ампициллину (ар) - свойству, которое сообщаетс клеткам в присутствии этой плазмиды. Обычно эта

5 плазмида сообщает также сопротивл емость к тетрациклину (ТС). Однако введение посторонней ДНК в эту плазмиду расщепл ют tet ген, таким образом, содержание чув- ствительныхк тетрациклину

0 трансформированных клонов отражает содержание содержащих плазмиды клонированных-ДНК- . В данном случае 16% клонов содержали новую плазмиду, котора придавала амилазе активность к E.coli. В соответ5 ствии с одновременной международной номенклатурой плазмид новые плазмиды, описываемые в насто щем описании, называютс (рСР), а конкретна плазмида согласно насто щему примеру обозначена (РСР1).

Это показывает, что повторное «локирование гена тем же самым ферментом (в данном случае Hlndlll) вл етс очень эф- фективным.слособом (16% вместо lilO5).

Плазмидосодержащий микроорганизм обозначен E.coli CL 7001 (рСР 1) и сдан на хранение в Национальную коллекцию промышленных бактерий (NCIB) 12 феврал 1980г. K3KNCIB Ns 11570.

Амплификаци и продуцирование фермента .

Продуцирование фермента в содержащих плазмиду (рСР 1) клетках улучшают двум следующими способами.

1Л Насыщенные культуры.

Культуры инкубируют в течение ночи при температуре 37°С на вращающемс вибраторе в п тилитровых колбах Эрлен- мейера, содержащих 1 л культуральной среды (LB; дрожжевой экстракт-триптон),

2, Хлорамфеникольна амплификаци .

Культуры инкубируют при температуре 37°С на вращающемс вибраторе в п тилитровых колбах Эрленмейера, содержащих 1 л культуральной среды (LB), до достижени плотности 0,8 (650 нм), после чего добавл ют 150 мкг/мл хлорамфеникола. Это предотвращает дальнейшую .репликацию хромосомной ДНК, но не репликацию содержащей ген амилазы плазмиды (рСР 1). После амплификации (до 3000 копий) плазмиды по сравнению с хромосомной ДНК хлорамфеникол был удален, чтобы мог продолжатьс синтез протеина, а именно, после амплификации клетки отдел ют от среды методом центрифугировани , промывают дл удалени хлорамфеникола и повторно культивируют дл продуцировани амилазы.

D. выделение фермента.

Клетки культивируют в течение ночи, после чего их суспендируют в 25%-ном растворе сахарозы в 0,5 объема культуры и подвергают вибрации в течение 10 мин при температуре 24°С, в результате такой обработки происходит плазмолиз клеток. Затем добавл ют ЭДТК к 1 мМ конечного раствора (чтобы стенки клеток стали проницаемыми) и материал подвергают вибрации в течение еще 10 мин при температуре 24°С. Суспензию центрифугируют и клетки быстро по- „вторно суспендируют в холодной (приблизительно 0°С) воде и подвергают вибрации при этой же температуре еще 10 мин. Суспензию снова центрифугируют и из всплывшего сло выдел ют фермент.

Дл сравнени культивируют микроорганизм-донор (Bacillus megaterium) и определ ют ферментативную активность. Количество фермента на 1 мл культуральной

среды определ ют по методу ДНС, причем одну ферментную единицу определ ют как количество фермента, продуцирующее 1 мг восстановленного сахара (с применением 5 мальтозы в качестве эталона дл сравнени ) в 1 мин в течение 10 мин инкубационного времени. Субстрат был очень чистой амилазой .

Микроорганизм-донор продуцировал 0 66,0 ферментных единиц на литр культуры, Насыщенные культуры E.coliCL7001 (pCP1) продуцировали 116,6 единиц/л культуры, тогда как после культивировани (амплификации ) в течение 5 ч с хлорамфениколом и с 5 последующим культивированием в течение 15ч без хлорамфеникола бактерии E.coli CL 7001 (рСР 1) продуцировали 84,5 единиц/л. Это показывает, что метод насыщенных культур обеспечивает достаточное повыше- 0 ние продуцировани фермента.

Фермент, продуцированный бактери ми E.coli CL7001 (рСР1), идентифицированный как альфа-амилаза, имеет следующие свойства. Он расщепл ет и амилазу и ами- 5 лопектин на глюкозу, мальтозу и мальтотри- озу, главным образом мальтозу, и он расщепл ет циклодекстрин и мальтотриозу на глюкозу и мальтозу. Он расщепл ет пул- лулан на панозу и/или изо-панозу. 0 Пример 2. Клонирование теплостойкого гена альфа-амилазы.

Микроорганизмом-донором был исходный штамм Bacillus, выделенный из компоста и идентифицированный как Bacillus 5 coagulans. Он продуцирует теплостойкую альфа-амилазу и отличаетс следующими микробиологическими признаками:

морфологи : палочки (0,6-1 х 2,5-5,0 мкм), подвижные, грамположительные и 0 грамотрицательные, споры центральные или терминальные, не деформированные;

питательный бульн: хороший рост;

питательный скошенный агар: хороший рост, нитевидные, раскидистые, кремово- 5 белые;

потребление органических кислот: лимонной - положительна реакци , малоновой - отрицательна ;

желатин; ожижение;

0 продуцирование ацетилметилкарбино- ла (ацетаина): положительна ;

гидролиз о-нитрофенилагалактозида: положительна ;

восстановление нитратов: положитель- 5 на , может получать газ;

каталазна реакци : положительна ;

продуцирование индола: отрицательна ;

декарбоксилазна реакци : на лизин - отрицательна ,1 орнитин - отрицательна , аргинин - отрицательна ; .

образование сероводорода: отрицательна ;

потребление углеводородов: потребл ет;

пуллуман потребл ет на минимальной среде;

потребление многоатомных спиртов: потребл ет глицерин, сорбитол, маннитол, инозитол, не потребл ет адонитол, дульци- тол;

уреолиз: отрицательна ; потребление лецитина: отрицательна ; оптимальна температура роста: 50°С; максимальна температура роста: 55- 60°С:

минимальна температура роста: 15- 25°С;

потребность в кислороде: аэробный и анаэробный.

Штамм сдан на хранение о NCIB 12 феврал 1980 г как NCIB № 11571.

ДНК экстрагировали и подвергали действию E.coli Rl; Hindlll; PStl; Sail; BamHI и Bglll. Только Bgl и мог .произвести много фрагментов в широком диапазоне молекул рных весов. Однако, можно было, получить фрагменты с . E.coll RI при концентрации хлорида натри менее 50 мМ. Поэтому примен ют E.coli RI дл получени фрагментов дл клонировани в E.coli RI переносчика л мбда ДНК (л мбда NM 781). А. Ограничение ДНК B.coagulans и ДНК л мбда NM 781.

1,25 г ДНК л мбда NM 781 разрезают одной единицей E.coli RI в 25 мкл следующего буферного раствора: 10 мМ Трис-НС (,5), 10 мМ 2-серкаптоэтанола. 10 мМ сульфата магни и 100 мМ хлорида натри . 1 мкг ДНК B.coagulans разрезают,тем же ферментом в аналогичном буферном растворе за тем исключением, что концентрацию хлорида натри понижают до 50 мМ. Инкубацию продолжают 2 ч при температуре 37°С, и реакцию останавливают нагреванием при температуре 75°С в течение 10 мин. Полноту ограничени контролируют методом электрофореза в 1%-ных агароз- ных гел х.

В. Св зывание и выделение рекомби- натных фагов. .

Ограниченные ДНК смешивают и св зывают с применением двух единиц Т4 ДНК лигазы в смеси, содержащей 50 мМ Трис- НС (), 10 мМ сульфата магни , 10 мМ 2-меркаптоэтанола и 0,1 мМ АТФ. Реакцию продолжают 10-15ч при температуре 10°С. После св зывани аликвотные части 0,2 мкг ДНК смешивают с АТФ дл получени конечной концентрации 10 М. Эти аликвотные части подвергают инкапсидации In vitro и примен ют дл инфицировани штамма НВ 101 Ее.coll. Было получено около 1,6 х 10 ПОЕ (п тнообразующих единиц) на 1 мкг

л мбда ДНК. Некоторые из этих фагов про вл ют амилазную активность (обнаружение амилазной активности на чашках Петри и выделение и очистку фаза - см. пример 1). Наблюдалось довольно большое содер0 жание продуцирующих амилазу фагов (1 в 400). Один был отобран и обозначен как л мбда NM 781 альфа Amyl. О и. сдан на хранение в Национальную коллекцию промышленных бактерий 12 феврал 1980 г. под

5 номером NCIB № 11572.

С. Повторное клонирование гена амилазы из л мбда NM781 альфа Amyl в плазмиду PBR322.

1 мкг ДНК л мбда NM 781 альфа Amyl и

0 такое же количество ДЕК из плазмиды pBR 322 разрезают E.coli R1 при обычных услови х . Св зывание и трансформацию выполн ют по методике, описанной в примере 1. Колонии Е. coll НВ 101. содержащие реком5 бинантную плазмиду, обнаруживают по амилазной активности. Одна така колони отобрана и обозначена Е. coli CL 7002 (рСр2). Она сдана на хранение в Национальную коллекцию .промышленных бактерий .12

0 феврал 1980 г. под номером NCIB 11573.

Амплификаци гена. Амплификаци кодирующего амилазу гена л мбда NM 781 альфа Amyl и продуци5 рование амилазы осуществл ют следующим образом. Бактерию-хоз ина (E.coli НВ 101) культивируют в LB среде с 2 мМ хлорида . магни при температура 37°С до достижени оптической 0,3 (650 им). Затем добавл 0 ют л мба NM 781 альфа Amyl, при этом количество фагов было рассчитано так, чтобы множественность заражени составл ла приблизительно 1-2, т.е. один или два фага на одну бактериальную клетку. Затем про5 должают культивирование при энергичном перемешивании при температуре 37°С до понижени оптической плотности. Когда оптическа плотность понижаегс ниже 0,5, культуру собирают и помещают на лед. Куль- 0 туру центрифугируют и всплывший слой испытывают на амилазную активность.

Амплификацию и продуцирование фермента E.coli 7002 (рСр 2) осуществл ют по методам насыщенной культуры и амплифи5 кации хлорамфениколом, как описано в примере 1.

Амилазную активность определ ют по методу ДНС и в лизате фага, и в культурах E.coli, содержащих рекомбинантные плаз .МИДЫ.

В случае применени фага (л мбда NM 781 альфа Amyl) весь фермент выдел етс вследствие лизиса клеток и, следовательно, находитс в культуральной среде. В случае применени плазмиды больша часть фермента (96%) находитс в клетке.

D, Повторное клонирование в дериват фага л мбда, способный к лизогенизации E.coll

Примен ют бактериофаг л мбда Т4 lig CL 857 warn bam sam (л мбда NM 989).

Этот фаг содержит ген ДНК лигазы бактериофага Т4 и способен к лизису E.coti. Кроме того, он содержит теплочувствитель- ный ген иммунитета и две амбер-мутации в гене Е и гене S соответственно. Мутаци гена не дает бактерии лизоватьс под-действием инфекции этим фагом. Целью суб- клонировани была замена гена ДНК лигазы геном, кодирующим амилазу.

ДНК фага и плазмиды (рСР 2) были разрезаны Е. coli Ri и фрагменты были св заны. ДНК фага, полученна в результате лигации, была затем упакована in vitro и п тна иссле- .довали визуально путем посева на штамм E.coii Sup E. Sup F. П тна, показывающие амилазную активность, собирают и фаг очищают по вышеописанной методике.

Затем этот фаг примен ют дл лизоге- Низации штамма Е.соП CL 600 (CL 1205) по обычной методике. Лизогенные колонии провер ют визуально на крахмалсодержа- щей среде с применением метода окрашивани иодом. Полученный при этом штамм обозначен Е.coli CL 7003 (л мбда альфа Amyl) и сдан на хранение в Национальную коллекцию промышленных бактерий 6 марта 1980 года под номером MCIB № 11586.

Амплификацию гена осуществл ют следующим образом. Лизоген выращивают при температуре 32°С в среде LB до плотности 0,8 при 650 нм, затем его центрифугируют и клетки суспендируют в свежей среде LB, предварительно нагретой до температуры 45°С. Потом культуру инкубируют в вод ной бане притемпературе45°С в течение 15 мин с целью индуцировани литического цикла (так как ген иммунитета вл етс теплочув- ствительН Ым).

Затем продолжают инкубацию при. энергетичном перемешивании при температуре 37°С в течение 3 ч, после чего определ ют амилазную активность во всплывшем слое и в клетках.

Выделение и характеристика амилазы, полученной из л мбда NM 781 альфа Amyl, E.coii CL7002 (рСР 2) и E/coli CL 7003 (л мбда альфа Amyl).

Как в примере 10 примен ют метод осмотического удара дл выделени фермента . Кроме того, так как фермент согласно этому примеру вл етс термостабильным. он мог быть далее очищен путем добавлени к водному 10 мМ раствору , подо- 5 грева раствора до 80°С и выдержки в течение 10 мин. в результате такой обработки все протеины E.coii осаждаютс и можно получить альфа-амилазу в исключительно чистой форме, фактически никакие другие

ферменты не присутствуют.

Была определена специфичность альфа-амилазы , она активна к амилазе и крахмалу , продуктами гидролиза вл ютс глюкоза, мальтоза и мальтотриоза со следа5 ми компонентов с большим молекул рным весом. Этот фермент не активен к циклодек- , стрину. Была также исследована теплостойкость фермента и оказалось, что она очень высока. Оптимальна температура активно0 сти с 0,5% амилозы находитс в интервале 80-90°С. С 8%-ным растворимым крахмалом оптимальна температура составл ет около 100°С;

Пример 3. Субклонирование плазми5 Д.ы рСР 2 в плазмиду рС 194 и экспресси новой плазмиды в Bacillus subtiiis.

Насто щий пример иллюстрирует методику , по которой рекомбинантной ДНК, пол- ученна в соответствии с насто щим

0 изобретением, может быть экспрессирова- на в бактерии-хоз ине, отличной от E.coii, a именно в штамме Bacillus subtiiis.

Плазмида рСР 2 (из примера 2) содержит фрагмент размерами 3,31 килобаз из

5 донора. B.coagulans, кроме того, плазмида характеризуетс тем, что сообщает сопротивл емость к ампициллину и тетрациклину и содержит два участка ограничени дл каждого из R.coli RI и Hindlll. Плазмиду рСР

0 2 расщепл ют на 4 фрагмента E/coli RI и Hindlll, обрабатывают лигазой и примен ют дл трансформации НВ 101, как в предыду- щих примерах.

Полученные новые плазмиды, обозна5 ченные как р СР 2,3, имеют фрагмент 2,64 килобаз ДНК B.coagulans, причем указанный фрагмент содержит ген, кодирующий альфа-амилазу. Плазмида рСР 2,3 имеет один участок дл каждого E.coii RI и Hindlll

0 и придают им ампициллиновую и тетрацик- линовую сопротивл емость.

Дл следующей стадии выбирают плазмиду рС 194, котора известна своей способностью к репликации себ в Bacillus

5 subtiiis. Плазмида рС 194 придает хлорам- феникольную сопротивл емость и имеет один участок Hindlll.

рСР 2,3 и рС 194 были обработаны Hindlil смешаны и легированы дл образовани новой плазмиды, обозначенной рСН

1, содержащей кодирующий альфа-амилазу теп и имеющей хлорамфеникольную и а 1пициллиновую сопротивл емость, хот уровень хлорамфеииколыюй сопротивл емости E.coll был низок. Как и прежде, препарат был применен дл трансформации E.coll НВ 101.

Штамм мутанта B.subtills, обозначенный В 1133, не про вл ющий альфа-амилаз- ной активности, был затем обработан в соответствии с методом дл образовани протопластов. Затем протопласты трансформируют рСН 1 по методике трансформации D среде полизтиленгликол Чана и Когана.

После этого протопласты инкубируют в богатой среде в течение 1,5 ч, чтобы плазми- да в бактерии экспрессировала сопротивл емость к хлорамфениколу.

Затем протопласты сеют на регенера- ционную среду, к которой добавл ют хло- рамфеникол в количестве 20 мкг/мл. После инкубации в течение двух суток при температуре 37°С по вл ютс колонии трансфор0

мированных клеток, это колонии, про вл ющие альфа-амилаЗиую активность, которые могут быть обнаружены окрашиванием парами иода. Один клон, обозначенный B.subtills CL8001 (рСН 1), сдан на хранение 13 нвар 1981 г. под номером NCB № 116929. Исходный штамм QB 1133 тоже сдан на хранение 13 нвар 1981 г. под номером NCIB № 11628.

B.subtills CL8001 (рСН 1) стабилен только в присутствии хлорамфеникола. Он может быть применен дл продуцировани альфа-амилазы путем культивировани в среде, содержащей хлторамфеникол (20 5 мкг/мл). Альфа-амилаза может быть легко выделена из культуральной жидкости.

После культивировани в течение ночи в присутствии хлорамфеникола количество продуцированной альфа-амилазы было следующим:

Всплывший слой КлеткиИтого

(ед/л)(ед/л) (ед/л) 136 14 150

0