JPH01218589A - 耐熱性β−アミラーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規な耐熱性β−アミラーゼ遺伝子に関する。

〔従来の技術〕

β−アミラーゼはデンプンに作用してその非還元末端か
らマルトース単位にα−１，４−グルコシド結合を切断
し、β−マルトースを生成する酵素である。これまで、
耐熱性のβ−アミラーゼを生成する微生物は、はとんど
知られておらず、工業的には約６０℃で使用可能な大豆
由来のβ−アミラーゼが主に使われてきた。

一方クロストリジウム　サーモサルフロゲネス（Ｃｌｏ
ｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｒ］ｏｓｕｌｆｕｒｏｇｅｎ
ｅｓ）は高いデンプン分解能を有する好熱性絶対嫌気性
菌で、菌体外に耐熱性β−アミラーゼを大量に分泌する
〔特表昭６２−５００４２２号〕０本菌が分泌するβ−
アミラーゼは、至適温度が７５℃で、８０℃においても
熱に対して安定である。至適ｐＨは５、５−６．０であ
るが、ｐＨ３，５−６，５のｐＨ領域でも安定である。

また、ＰＣＭＢ、ヨード酢酸、Ｃｕ”″、Ｈｇ　ｇ　＊
などのＳＨ試薬により酵素活性が低下するＳＨ酵素であ
る。これらの性質は大豆のβ−アミラーゼと比較して特
に耐熱性の点ではるかに優れたものであり、本耐熱性β
−アミラーゼは工業的に有用な酵素となりうろことが期
待でき・る。

〔発明が解決しようとする課題〕

そこで本発明の目的は、上記クロストリジウムサーモサ
ルフロゲネスから得られる耐熱性β−アミラーゼを大量
生産する上で不可欠な、該耐熱性β−アミラーゼをコー
ドする遺伝子を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、第１図に示す塩基配列の６５４番目のＡＧＣ
から始まり２２１１２１１番目Ａで柊る１５５７ｂｐの
塩基配列がコードするアミノ酸配列と７０％以上の相同
性を有するアミノ酸配列に対応する塩基配列を含む耐熱
性β−アミラーゼ遺伝子に関する。

以下本発明の耐熱性β−アミラーゼ遺伝子について説明
する。

本発明の耐熱性β−アミラーゼ遺伝子は、第１図に示す
塩基配列の６５４番目のＡＧＣから始まり２２１１２１
１番目Ａで柊る１５５７ｂｐの塩基配列（以下塩基配列
Ａという）がコードするアミノ酸配列に対応する塩基配
列（即ち相同性１００％の塩基配列）、及び上記塩基配
列Ａがコードするアミノ酸配列と７０％以上の相同性を
有するアミノ酸配列に対応する塩基配列を含むものであ
る。

塩基配列Ａがコードするアミノ酸配列と７０％以上の相
同性を有するアミノ酸配列に対応する塩基配列を用いれ
ば塩基配列Ａを用いて得られる耐熱性β−アミラーゼと
同一の活性を有するアミノ酸配列を得ることができる。

このことは、澱粉科学第３３巻、第２号、１１２〜１１
８頁（１９８６）における「α−アミラーゼ間の類似性
」に関する記載からも明らかである。

以下第１図に示す本発明の遺伝子の調製法について説明
する。

（１）使用菌株、プラスミド及びファージ供試菌株は、
クロストリジウム　サーモサルフロゲネス（Ｃｌｏｓｔ
ｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｒ＋ｓｏｓｕｌｆｕｒｏｇｅｎｅ
ｓ）ＡＴＣＣ３３７３３、バチルス　スブチリス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＩＡ２８９（ａｍｙ
Ｅ　５ａｃＡ３２１　ａｒｏ１９０６　ｍｅｔＢ５）　
、ニジエリシア、コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｓｈｉａ　　ｃ
ｏｌｉ）　ＪＭ１０３　　［５ｕｐＥｔｈｉ　Δ（ｌａ
ｃ−ｐｒｏＡＢ）（Ｆ’　　ｔａｎＤ３６　ｐｒｏＡＢ
　１ａｃｌＱＺΔＭ１５　］　、ＭＶ１１８４　［ａｒ
ａΔ（ｌａｃ−ｐｒｏ）　５ＬｒＡ　ｔｈｉ（φ８０Δ
１ａｃｌＺΔＭ１５）Δ　（ｓｒｌ−ｒｅｃＡ）３０６
：：ＴｎｌＯ（ｔｅｔｒ）Ｆ’：ｔｒａＤ３６　ｐｒｏ
ＡＢ　　１ａｃｌＱＺΔＭ１５］を使用した。Ｅ、コリ
（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　ＪＭ１０３及びＭＶ１１８４は、
プラスミドｐＵｃ１１８．１ｆ９　　（八Ｉ）、　３．
３ｋｂ）あるいはＭ１３　ｍｐ１８、ｍｐ１９の宿主と
して用いた。Ｍ１３ＫＯ７は、ｐＵｃ１１８、ｐＵｃ１
１９より１本ｆＪｉ、Ｄ　Ｎ　Ａを調製する場合にヘル
パーファージとして使用した。Ｂ、スブチリス（Ｂ、　
５ｕｂｔｉｌｉｓ）のクローニングプラスミドベクター
としてはｐＨＷｌ−Ｂ（Ｃｍ’、　Ｅｏｌ’　４．４ｋ
ｂ）を使用した。

（２）培地組成及び培養条件 Ｃ，サーモサルフロゲネスは、１．０％デンプンを加え
たＴＹＥ培地（表１）中で６０℃にて嫌気条件下で静置
培養した。Ｂ、スブチリス（Ｂ。

５ｕｂｔｉ　１ｉｓ）　ｌＡ２８９は、抗生物質培地３
　（Ｄｉｒｃｏ）中で３７℃にて振とう培養した。　Ｅ
、　ｃｏｌｉは、Ｌ培地（５ｇトリプトン、１０ｇイー
ストエクストラクト、５ｇＮａＣｊ！、　ＨｔＯＩＬ　
−ｐＨ７，６）、２ＸＹＴ培地（１６ｇ）リブトン、１
０ｇイーストエクストラクト、５ｇＮａＣｊｌ、几■８
０）中で３７℃にて振とう培養した。必要に応じてアン
ピシリン（Ａｐ）、エリスロマイシン（Ｅ曽）をそれぞ
れ５０ｇｇ／ｍ。

１０ｇｇ／−となるように培地に加えた。

表Ｉ　　ＴＹＥ培地の培地成分組成 トリプトン　　　　　　　　　　　　１０　　ｇイース
トエキストラクト　　　　　３ｇＮＨ４１１１ｇ ＭｇＣｌ　！・６）１ｔ０　　　　　　　　　　０．２
ｇＫＨｚＰＯａ　　　　　　　　　　　　　　０．３ｇ
ＮａｚＰＯ＊　”　７Ｈｚ０　　　　　　　　　　２　
　ｇ無機物溶液”　　　　　　　　　　　１０　１１ｇ
２．５Ｘ　Ｆｅ５Ｏｅ　　　　　　　　　　　　Ｏ，３
１１！０．２χ　レサズリン　　　　　　　　　１　ｄ
ビタミン溶液０′″（無菌濾過）　　　　　５　　ｍ１
２．５χＮａｚＳ　　　　　　　　　　　　２０　　ｄ
ｉＨｇＯＩ　　Ｉｌ ＊無機物溶液 ニトリロトリ酢酸　　　　　　　　１．２８■（ＫＯＨ
でｐＨ６，５にした） ＦｅＳＯａ　・ＩＨｔＯ１０＊ ＭｕＣ１ｔ　・４Ｈｚ０　　　　　　　　　　１０　　
ＩＩｔＣｏＣｔ’　ｚ　’　６１ｈ０　　　　　　　　
　　１６　　■ＣａＣｌ　！　’　２ＨｚＯ１０Ｎ ＺｎＣＪ！、　　　　　　　　　　　　　　１０　　ｖ
ａｔＣｕＣｉ　　　　　　　　　　　　　　　２　　ｖ
ｇＨ，ＢＯ，′１　　■ ＮａＭｏＯ４・２Ｈｔ０　　　　　　　　　　　１　１
１ｇ酢酸ニッケル　　　　　　　　　　２．６■＊＊ビ
タミン溶液 ビオチン　　　　　　　　　　　　　０．１　ｗｇ葉酸
　　　　　　０．１■ ピリドキシン・ＩＣＩＩＯ，５■ リボフラビン　　　　　　　　　　０．２５■チアミン
　　　　　　　　　　　　　０．２５■ニコチン酸　　
　　　　　　　　　０．２５■パントテン酸　　　　　
　　　　　０．２５■Ｖ−Ｂｔｔ　　　　　　　　　　
　　　　　５μｇｐ−アミノ安息香酸　　　　　　　　
０．２５■チオクト酸　　　　　　　　　　　　０．２
５■Ｈｇｏ　　　　　　　　　　　　　　　　５０　　
Ｉｆ（３）　Ｄ　Ｎ　Ａの調製 Ｃ，サーモサルフロゲネスの染色体ＤＮＡは、斉胚、三
浦らのＴｒｉｓ−ＳＯ５方法（Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ。

Ａｃｔａ、　？２．６１９（１９６３））にしたがって
！ｌｌ＆Ｉした。

プラスミドＤＮＡは、Ｅ、コリー（Ｅ、　ｃｏｌｉ）か
らはＢｉｒｎｂｏｉｍ−Ｄｏｌｙ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　
ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、、　ＩＬ１５１３（１９７９））
により、Ｂ、スブチリス（Ｂ、　５ｕｂｔｉ１ｉｓ）か
らは日中らの方法（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　韮１
４８７（１９７７）　）によりそれぞれ調製した。

塩基配列決定用の１本鎖プラスミドＤＮＡの調製は、Ｊ
、　Ｍｅｓｓｉｎｇらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ
ｙａ＋ｏ１．。

１０１、２０（１９８３）　）によりヘルパーファージ
Ｍ１３ＫＯ７を用いて行った。また１本鎖ファージＤＮ
Ａの調製は、常法により行った。

（４）　Ｃ、サーモサルフロゲネスの耐熱性β−アミラ
ーゼ遺伝子のクローニング Ｃ，サーモサルフロゲネスの染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓ
ａｕ　３Ａｌで部分分解してアガロースゲル電気泳動に
より分画し、３ｋｂ−９ｋｂの断片を電気溶出しアガロ
ースゲルから回収してフェノール−クロロホルム処理を
行い精製した。このようにして得られたＤＮＡ断片約０
．３μｇをＢａｍ旧で完全に分解した後バクテリア　ア
ルカリ　ホスファターゼ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｌｋ
ａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）処理を行ったプ
ラスミドｐｔｔ賀１．８約０．１μｇとをＴ４　ＤＮＡ
リガーゼにより連結した。このリゲーション溶液を用い
てコーエン（Ｃｏｈｅｎ）らのプロトプラスト形質転換
法（Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　　１６８．１
１１（１９７９））に従ってＢ、スブチリスｌＡ２８９
を形質転換した。耐熱性β−アミラーゼ生成株は、Ｅｍ
を１０μｇ／　、デンプンを０．３％加えたＭ３プレー
ト上で１日増殖させて６５℃で３時間インキュベートし
た後で、１０ｍＭ　１ｘ−Ｋ１７ｇ液で染色してコロニ
ーの周りにハローを形成する株とした（第２図）。

（５）β−アミラーゼ活性測定法 粗酵素液の調製は、培養上清を８０％硫安で飽和させて
得られた沈澱を５０＋ＩＩＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６，０）
約５　ｓｉｔに溶かし、２Ｌの５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ６，０）で２４時間透析し、透析後の溶液を酵素原液
とした。

β−アミラーゼ活性は、０．５％デンプン−５０ｒａＭ
酢酸緩衝液に酵素液を加えて６５℃で３０分間反応させ
て生成したマルトース量を村尾らのＤＮＳ法ＣＡｇｒｉ
ｃ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　４３．７１９（１９
７９）　）により還元糖量に換算して５３０ｎｍの吸光
度で測定した。またデンプン分解物は、ペーパークロマ
トグラフィ〜（展開溶媒；７０％ｎ−プロパツール）で
糖を硝酸銀−水酸化ナトリウム法で発色させて検出した
。５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中のバンドは、活性
染色法により検出した。

（６）サザンハイブリダイゼイション プローブとするＤＮＡ断片約２μｇをｚ”ｐ−ｄＣＴＰ
存在下でＥ、コリＤ　Ｎ　Ａポリメラーゼ■を使って二
７クトランスレーシゴン法によってラベルし高圧放射能
のＤＮＡプローブを作成した。

ハイブリダイズさせるＣ、サーモサルフロゲネスの染色
体ＤＮＡは、ＥｃｏＲｌ、　ＥｃｏＲＩ＋Ｂｇｌ１１．
ＥｃｏＲＩ＋ＢａｍＨ１，Ｒａｍ旧で分解して０．７％
アガロースゲル電気泳動を行った後ゲル中のＤＮＡを変
性させて、バイオダインＡメンプランに移行させ固定化
した。

このメンプランとあらかじめ作成したプローブとをハイ
ブリダイズさせてオートラジオグラフをとった。

（７）　Ｄ　Ｎ　Ａ塩基配列解析 Ｃ，サーモサルフロゲネスの耐熱性β−アミラーゼ遺伝
子をクローン化しているプラスミドｐＮＫ１の約３．６
ｋｂのＤＮＡ断片を肘ＩＩで２つの約１．８ｋｂの断片
に分けてｐＵｃｌｌＢとｐＵｃ１１９にサブクローニン
グした。５°から３゛方向の塩基配列の決定は、次のよ
うに行った。この様にして作製したプラスミドの挿入断
片をエクソヌクレアーゼ■で分解してマングビーン（Ｍ
ｕｎｇ　Ｂｅａｎ）ヌクレアーゼ、クレノーフラッグメ
ントで末端をプラントエンドにしリゲーションして、Ｅ
、コリを形質転換した。得られた形質転換株からプラス
ミドを調製して適当な制限酵素で切断し、アガロースゲ
ルにて電気泳動し、挿入ＤＮＡ断片のサイズを調べて約
１５０−２００ｂｐごとにプリージョンのかかったクロ
ーンを選択し、そのクローンから１本１１　Ｄ　Ｎ　Ａ
を調製し、シーフェンスした。

３゛から５゛方向の塩基配列は先に得られたシーフェン
スから調べた制限酵素サイトを利用して適当なサイズの
断片を調製し、ｐｌＪｃ１１８、ｐＵｃ１１９、Ｍ１３
ｓｐ１８．１９にクローニングしてシーフェンスを調べ
た。

塩基配列の決定はサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）らのジデオ
キシ法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、
　ＵＳＡ、　１４＋　５４６３（１９７７）　）にした
がってα”Ｐ−ｄＣＴＰを用いて行った。

＋８）　Ｃ、サーモサルフロゲネスの耐熱性β−アミラ
ーゼ遺伝子の枯草菌へのクローニング 第１図に示したようなりローニング方法でＣ。

サーモサルフロゲネスのＤＮＡライブラリーをＢ。

スプチリスｌＡ２８９で作製し、Ｅａ＋’を示す約６０
００株の形質転換株を得た。これらの中からアミラーゼ
陽性株の検索を行ったところ、３株のアミラーゼ陽性株
が得られた。この３株のアミラーゼ陽性株は、Ｍ３−２
ｍプレート上で安定にプラスミドを保持していた。

この３株のアミラーゼ陽性株の培養上清から調製した粗
酵素液を用いて、可溶性デンプンを６５℃で１時間分解
させて生成したデンプン分解物をペーパークロマトグラ
フィーで調べたところ、マルトースのみが生成されてい
ることがわかった。

また、Ｃ，サーモサルフロゲネスとこの３株のアミラー
ゼ陽性株の培養上清から調製した粗酵素液を５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動にかけて活性染色を行っ
たところ、同じ泳動距離のところに活性バンドが検出さ
れた。これらの結果よりこの３株のアミラーゼ陽性株は
、Ｃ，サーモサルフロゲネスの耐熱性β−アミラーゼと
同じ分子量を持つ耐熱性β−アミラーゼを菌体外に分泌
しておりＣ，サーモサルフロゲネスの耐熱性β−アミラ
ーゼ遺伝子が完全にクローニングされていることが推定
された。

この３株の耐熱性β−アミラーゼ生生成炉保持するプラ
スミドｐＮＫ１、ｐＮＫ２、ｐＮＫ３の制限酵素地図を
作製した（第３図）、この３つのプラスミドにはそれぞ
れ約３．６ｋｂ、約４．　Ｏｋｂ、約４．７ｋｂのＤＮ
Ａ断片がプラスミドｐＨＷ１−Ｈに挿入されていたが、
制限酵素地図を比較した結果、約３．５ｋｂのＤＮＡ断
片が共通して存在していることがわかった。挿入ＤＮＡ
断片の方向がｐＮＫｌとｐＮＫ２、ｐＮＫ３とでは異な
っており、これが耐熱性β−アミラーゼの活性発現量の
違いの原因となっていると考えられる。また、この３つ
のプラスミドから作製したいくつかの欠失プラスミドの
解析より、耐熱性β、−アミラーゼ遺伝子は約２．２ｋ
ｂのＨｉｎｃｌｌ−ＥｃｏＲＩ断片上にコードされてい
ることが推定された（第４図）。

（９）　Ｃ、サーモサルフロゲネスの耐熱性β−アミラ
ーゼ遺伝子の全ＤＮＡ塩基配列の決定 ３株の耐熱性β−アミラーゼ生生成炉うち最も　−耐熱
性β−アミラーゼ活性が強い株が保持するプラスミドｐ
ＮＫ１の約３．６ｋｂの挿入ＤＮＡ断片について全塩基
配列の決定を行った。その結果この挿入ＤＮＡ断片は、
３６４２ｂｐから構成されていた。

この３６４２ｂｐの断片について転写解読枠（ＯＲＰ）
の検索を行った結果、５°から３°方向に５５８番目の
ＡＴＧから始まり２２１１番目のＴＡＡで終る１６５３
ｂｐのＯＲＦと２３４４番目のＡＴＧから始まり３２７
７番目のＴＡＧで柊る９３３ｂｐのＯＲＦの２つが見い
だされた。この２つのＯＲＦのうち欠失プラスミドの解
析の結果を考え合わせて１６５３ｂｐのＯＲＦが耐熱性
β−アミラーゼ遺伝子をコードしていると考えられた。

この１６５３ｂｐのＯＲＦは５５１個のアミノ酸からな
る分子量６０５４６のタンパク質をコードしていた（第
１図）。

Ｃ］サーモサルフロゲネスの耐熱性β−アミラーゼの分
子量は約５６０００で菌体外に分泌されていること、こ
のタンパク質のＮ末端付近のアミノ酸配列が疏水性のア
ミノ酸から構成されていることより約３０個のアミノ酸
残基から成るシグナルペプチドが存在していると考走ら
れた。事実、分泌されたβ−アミラーゼのＮ末端アミノ
酸配列（１３アミノ酸）の決定により、６５４番目のＡ
ＧＣから５１９個のアミノ酸からなる酵素タンパク質を
コードしていることが判明した。このタンパク質は、バ
イトロバシーを調べた結果から全体的に親水性である。

システィンが非常に多く５１９のアミノ酸のうち７個存
在しており、このことがＣ。

サーモサルフロゲネスのβ−アミラーゼに耐熱性を与え
ている理由の１つであろうと考えられる。

このＯＲＦのＧ−１−Ｃ含量は、３５．４％でＣ，サー
モサルフロゲネスのＧ＋Ｃ含量の３２．６％と非常に近
い値を示している。この１６５３ｂｐのＯＲＦの１２ｂ
ｐ上流にはＧＧＧＡＧＧＧというＳＤ配列と考えられる
塩基配列が存在しており、またさらにその上流にはい（
つかのブロモクー領域（ＴＴＧＡＣＡ−−一約１７ｂｐ
−−ＴＡＴＡＡＴ）と類偵したと考えられる塩基配列が
存在していた。

また終止コドンＴＡＡのａｔｂｐ下流の２２４５番から
２２７０番のところにインパーティフドリピートが存在
しており、ΔＧ　＝　−１９，５Ｋｃａｌ／ｍｏｌのエ
ネルギーを有する安定なパリンドローム構造を形成する
のでターミネータとして十分働くことが予想された。

ラジオアイソトープでラベルしたＮ末端を含む２９６番
から６０５番までの３０９ｂｐの断片とＣ末端を含む２
１４８番から２２６４番までの１１７ｂＰの断片をプロ
ーブとして、バイオダインＡメンプラン上に固定化した
ＥｃｏＲｌ、　ＥｃｏＲＩ÷Ｂｇｌ　ＩＩ、　ＥｃｏＲ
Ｉ＋Ｂａａ＋Ｈ１，ＢａｍＨＩで分解したＣ、サーモサ
ルフロゲネスの染色体ＤＮ六とをハイブリダイズさせた
結果、この２つのプローブとハイブリダイズするＤＮＡ
バンドは同一の位置に現れたのでＣ，サーモサルフロゲ
ネスの耐熱性β−アミラーゼ遺伝子は完全な形でクロー
ニングされている。ことが示された。

〔実施例〕

Ｃ，サーモサルフロゲネスの耐熱性β−アミラーゼ遺伝
子をクローン化しているプラスミドｐＮＫ１を用いてコ
ーエン（Ｃｏｈｅｎ）　　らのプロトプラスト形質転換
法（Ｍｏ１．Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、、　１６８　１１
Ｈ１９７９））に従ってＢ、スプチリスｌＡ２８９を形
質転換した。

得られた形質転換株を０．５１１の抗生物質培地３（Ｄ
ｉｒｃｏ）中で３７℃にて４８時間振とう培養した。

培養上清を８０％硫安で飽和させて得られた沈澱を５０
ｗ＋Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６，０）約５ｄに溶かし、２Ｌ
の５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６，０）で２４時間透析し
、透析後の溶液を酵素原液とした。酵素原液のβ−アミ
ラーゼ活性を０．５％デンプン−５０ｍＭ酢酸緩衝液に
酵素液を加えて６５℃で３０分間反応させて生成したマ
ルトース量を村尾らのＤＮＳ法により５３０ｎｍの吸光
度で測定し還元糖量に換算した。その結果、１５■の耐
熱性β−アミラーゼが得られた。

次にＣ，サーモサルフロゲネスのβ−アミラーゼとクロ
ーニングされたβ−アミラーゼの至適温度とを比較した
。

Ｃ，サーモサルフロゲネスのβ−アミラーゼとクローニ
ングされたβ−アミラーゼの至ｉ！￥１温度を比較した
結果、第５図に表されているように両者とも７５℃まで
に相対活性が温度の上昇とともに増加したが、７５℃を
越えると急激に相対活性が低下し、至適温度は両者とも
７５℃を示していた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の塩基配列Ａ及びその前後の塩基配列並
びに塩基配列Ａに対応するアミノ酸配列を示す、第２図
は、Ｃ，サーモサルフロゲネスの耐熱性β−アミラーゼ
遺伝子のショットガンクローニング方法の手順図である
。第３図はｐＮＫｌ、ｐＮＫ２及びｐＮＫ３の制限酵素
地図である。第４図は耐熱性β−アミラーゼ遺伝子のサ
ブクローニングを示す。第５図は酵素活性に及ぼす温度
の影害を示す。 第２図 ↓ Ｅｒｒ（て加るＢ、スブチリスクローンの選択↓ アミラーセ゛クローンの選択 本　　　十　÷　１　÷　＋　＋ 寡 ｌｌ ＼ 、Ω −と

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の塩基配列がコードするアミノ酸配列と７０
   ％以上の相同性を有するアミノ酸配列に対応する塩基配
   列を含む耐熱性β−アミラーゼ遺伝子。 【遺伝子配列があります】
2. （２）請求項（２）記載の塩基配列がコードするアミノ
   酸配列と１００％の相同性を有するアミノ酸配列に対応
   する塩基配列を含む耐熱性β−アミラーゼ遺伝子。