JPH07504166A

JPH07504166A - ストレプトキナーゼ基剤のワクチン

Info

Publication number: JPH07504166A
Application number: JP5512306A
Authority: JP
Inventors: リー，ジェームズ・アンドリュー
Original assignee: ファイザー・インコーポレイテッド
Priority date: 1992-01-17
Filing date: 1993-01-18
Publication date: 1995-05-11
Anticipated expiration: 2016-12-04
Also published as: WO1993014209A1; DE69330246D1; GR3036369T3; ES2158857T3; EP0623170B1; CA2128247A1; AU3360193A; AU673344B2; GB9201013D0; PT623170E; EP0623170A1; US5840315A; JP3234226B2; DK0623170T3; DE69330246T2; CA2128247C; ATE201448T1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】１１、細菌プロテアーゼが、スタフィロコッカス・アウレウスにより産生されるプロテアーゼであるか、または実質的にそれと同じである請求項１ｏ記載のワクチン。

１２　を推動物を免疫学上有効量の請求項１〜１１に記載のいずれか１つのワクチンで予防接種することからなるを推動物における疾患の治療または予防方法。

１３、請求項１２に記載の方法で予防接種されているヒト以外のを推動物。

１４、乳汁中の哺乳動物プラスミノーゲンの活性化能を有するストレプトキナーゼ。

１５、ウシ・プラスミノーゲンを特徴とする請求項１４記載のストレプトキナーゼ。

１６、ストレプトコッカス・ウベリスにより産生されるストレプトキナーゼであるか、または実質的にそれと同じである請求項１４または１５記載のいずれが１つのストレプトキナーゼ。

１７　請求項１４〜１６に記載のいずれか１つのストレプトキナーゼに対して反応性を有する抗体。

１８、配列が天然で見いだされるゲノムの少なくとも大部分がら単離される請求項１４〜１６に記載のいずれか１つのストレプトキナーゼをコードする核酸配列。

１９　請求項１４〜１６に記載のいずれか１つのストレプトキナーゼの抗原部位に対応するペプチド。

２０、請求項１４〜１６に記載のいずれかのストレプトキナーゼに対して特異的な抗体。

２１、適当な宿主細胞にて対応する核酸配列を発現させるか、またはアミノ酸合成またはラージポリペプチドを蛋白質分解することにより、請求項１４〜１６に記載のいずれか１つのストレプトキナーゼを産生ずる方法。

２２、ストレプトキナーゼを乳汁に加えることからなり、該ストレプトキナーゼがプラスミノーゲンをカゼイン分解蛋白質のプラスミンに活性化することを特徴とする、乳汁にて蛋白質分解を生じさせる方法。

１９８４）。プラスミノーゲンのプラスミンへの変換は、血漿および動物組織中ストレプトキナーゼ基剤のワクチン本発明は病原体により引き起こされる疾患に対する予防接種に、さらに詳しくは乳房炎に対する予防接種に関する。

ウシ乳房において臨床性乳房炎を起こすには、分泌物中への除去を回避するに十分な速度にて線内で細菌を増殖させるか、または正常な分泌および／または小管組織を集落形成させなければならない。よりビルレントな菌株の細菌は、多数の多形核白血球が存在するにもかかわらず、食食性殺作用に抵抗する。ある種の細菌は、疾患の病理発生にて役割のある、溶血性および／または細胞溶解性トキシンを産生ずることが知られている。

今日まで、臨床性乳房炎の乳腺を保護するためのワクチンは、（オプソニン抗体の産生によって）より効果的な細菌の責食作用および殺菌作用を促進しようとするものであるか、または（中和抗体の産生によって）毒性産物を失活させようとするものであった。

ストレプトコッカス・ウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｕｂｅｒｉｓ）がウシ乳房炎の一般的病因であり、英国における臨床ケースのうちの約２０％に関与している（ブランレイおよびトッド（ＢｒａｍｌｅｙおよびＤｏｄｄ）　１９８４）。この微生物の泌乳乳腺に感染する能力は、分泌物中にて増殖し、ウシ好中球による禽食作用を回避する能力に依存する（リー（Ｌｅｉｇｈ）ら、１９９０）。

牛乳中にある窒素の大部分は蛋白質の形態にて存在しくアストン（＾５ｔｏｎ）　。

１９７５）、蛋白質分解作用がないときは、乳汁中における細菌増殖は遊離アミノ酸の欠如によって制限される。このことは、乳酸性ストレプトコッカスが、乳汁中における増殖について細胞外カゼイン分解性プロテイナーゼに依存することにより顕著である（ミルスおよびトーマス（ＭｉｌｌｓおよびＴｈｏｌＩａｓ）　１９８１　）。

乳房炎乳汁中における細菌増殖能は、カゼイン分解性酵素であるプラスミンの存在により高められる（マーノヤルおよびブランレイ（ＭａｒｓｈａｌｌおよびＢｒａｍｌｅｙ）に存在することが知られているプラスミノーゲン・アクチベーターを必要とする（コレン（Ｃｏｌｌｅｎ）　１９８０）。ある種のストレプトコッカスは、プラスミノーゲンをプラスミンに活性化するストレプトキナーゼの産生能を有するが、従来より、ウシプラスミノーゲンを活性化するストレプトキナーゼは単離されいていない。

本発明は−の態様において、を推動物における疾患を治療または予防するのに用いるためのワクチンを提供する。そのワクチンは抗原体（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ　ｅｎｔｉｔｙ）と担体とからなり、該ワクチンでを推動物を予防接種した後には、その抗原体は、直接的または間接的に、を推動物における蛋白質を分解させ、該蛋白質分解が病原体の増殖を強化する、病原体に由来の因子を阻害する抗体を生成する免疫応答を生じさせる。

病原体由来の因子を「阻害」する抗体は、を推動物性蛋白質の分解の原因となる、該因子の能力を有用な程度まで減少させるものである。個々の抗体と該因子の分子の間にある所定の相互作用について、その能力をゼロにまで減少させることが好ましい。適当には、該因子が作用する環境中に抗体を分泌させる。かくして、乳房炎に対するワクチンの場合、抗体を乳汁中に分泌させなければならない。

ストレプトコッカスは、ある種のデンタルケアーに関与しており、かくして、デンタルケアーの場合には、抗体を唾液中に分泌させるかまたは口の歯肉および内層に付随する粘膜中に存在させなければならない。

抗原体をワクチンに処方するための適当な担体およびアジュバント等が知られている。

医薬上許容される担体は、例えば、抗原体をを推動物に導入するためのビヒクルとしての使用に適する液体培地である。そのような担体として、例えば、セイライン溶液が挙げられる。抗原体は溶液中にあってもよく、または固体として担体中に懸濁させてもよい。

ワクチン処方はまた、免疫応答を刺激し、それによりワクチンの効果を強化するためのアジュバントからなっていてもよい。本発明において用いるのに都合のよいアジ二バントは、例えば、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムを包含する。

本発明のワクチンは、経口および非経口（例、皮下または筋肉内）注射を包含する、ワクチン投与のいずれか都合のよい方法により投与してもよい。治療はワクチンを一回投与するか、または一定の期間にわたって複数回投与することからなる。

疾患の「治療または予防」とは、現存するまたは将来的に生じる疾患を有用な程度まで改善することを意味するものであり、炎症を有用な程度まで減少させることを包含する。

第二の態様によれば、本発明は、を推動物を前記のワクチンで予防接種することからなる、を推動物における疾患の治療または予防方法を提供する。

本発明に係るワクチンおよび方法は、遊離アミノ酸が生成されないように、宿主における蛋白質の分解の直接的または間接的な原因である病原体由来の因子を阻害することで作用し、それで、病原体は疾患を持続するのに十分迅速に増殖できないと考えられる。

その因子は、直接的または間接的に乳汁中のプラスミノーゲンを活性化し、乳汁蛋白質の蛋白質分解を生じさせる。乳房炎に拮抗する予防接種の場合には、その因子は乳汁中のプラスミノーゲンの活性化能を有する細菌ストレプトキナーゼである。適当には、該因子はストレプトコッカス・ウベリスにより産生されるストレプトキナーゼである。しかし、他のストシブ）・コツカスに由来のストレプトキナーゼもまた、乳汁中のプラスミノーゲンを活性化する。例えば、ストレプトコッカス・ディスガラクチェ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）により産生されるストレプトキナーゼが適当なプラスミノーゲン・アクチベーターである。また、該因子は乳汁蛋白質の加水分解発現能を有する細菌プロテアーゼ、例えばスタフィロコッカス・アウレウス・プロテアーゼ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ｐｒｏｔｅａｓｅ）であってもよく、そのうちの多くのものは報告されている（参考文献参照）。

本発明のワクチンは、前記の病原体因子に関する免疫応答阻害を生じさせるいずれかの物質からなる。該物質は完全な未変性因子である必要はない。抗原性フラグメント、特に、親水性プロットにより親水性であると同定されたものを用いてもよ（、機能的に不活性である、すなわち、宿主の蛋白質の分解を生じさせないが、該因子に対する阻害抗体を産するのに用いることができる因子の修飾形であってもよい。

したがって、本発明の抗原体が、蛋白質、好ましくは細菌プロテアーゼ、さらに好ましくはストレプトキナーゼである場合、該用語は、特に、未変性蛋白質の機能を欠いている該蛋白質またはその変異形と結合する抗体を生成するのに有用な蛋白質のいずれの変異株およびフラグメントをも包含する。そのような変異株およびフラグメントは、通常、少なくとも５個の連続したアミノ酸からなる最低１個の領域を有し、それは該蛋白質のその最も対応する５個またはそれ以上の連続したアミノ酸領域と少なくとも９０％の相同性を有する。

本発明の抗原ポリペプチドは、公知蛋白質修飾法により修飾できることは当業者であれば理解するであろう。これらは、出展明示により本明細書の一部とする、米国特許第４．３０２．３８６号（１９９１年１１月２４日、スティーブンズ（Ｓｔｅｖｅｎｓ）に付与）に開示されている方法を包含する。そのような変法は抗原の免疫原性を強化するか、またはそのような免疫原性について効果を有しないかもしれない。例えば、２ないし３個のアミノ酸残基を変形してもよい。また、本発明の抗原体は、その免疫原性に必須でない、１またはそれ以上のアミノ酸配列を含有してもよい。不必要な配列は当該分野における周知方法により除去できる。

例えば、該配列はトリプシンまたはパパインのような酵素または関連する蛋白質分解酵素を用いる制限された蛋白質分解消化を介して除去できる。

別法として、蛋白質の抗原部分に相当するポリペプチドはその分野における周知方法により化学的に合成できる。これらは、出展明示により本明細書の一部とする、米国特許第４，２９０，９４４号（１９８１年９月２２日付けでゴールドバーブ（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ）に付与）に開示の方法を包含する。

ペプチドは、ルー（Ｌｕ）らにより、（１９８１）ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊ、Ｏｒｇ、Ｃｈｅｍ、）　４６．　３４３３およびその中にある参考文献に開示されている固相ペプチド合成のＦＩＩＯｃ−ポリアミド法により合成できる。一時的なＮ−アミノ基保護は９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆ　ｗｏｅ）基により付与される。この塩基高下安定性保護基の繰返し切断は、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド中２０％ピペリジンを用いてなされる。側鎖官能性はそのブチルエーテル（セリン、トレオニンおよびチロシンの場合）、ブチルエステル（グルタミン酸およびアスパラギン酸の場合）、ブチルオキシカルボニル誘導体（リンノおよびヒスチジンの場合）、トリチル誘導体（システィンの場合）および４−メトキシ−２，３，６−ドリメチルベンゼンスルホニル誘導体（アルギニンの場合）として保護できる。グルタミンまたはアスパラギンがＣ−末端残基である場合、側鎖アミド官能性の保護については、４，４ °−ジメトキシベンズヒドリル基の使用でなされる。固相支持体は、３種のモノマー、ジメチルアクリルアミド（骨格−モノマ−）、ビスアクリロイルエチレンジアミン（架橋剤）およびアクリロイルサルコシンメチルエステル（官能基導入剤）からなるポリジメチルアクリルアミドポリマーを基礎とする。用いるペプチド−樹脂の切断可能な架橋剤は、酸不安定性４−ヒドロキシメチルーフェノキシ酢酸誘導体である。すべてのアミノ酸誘導体は、アスパラギンおよびグルタミンを除いて、その予備形成された対称無水誘導体として加えられ、それらを逆Ｎ、Ｎ−ジシクロへキシル−カルボジイミド／１−ヒドロキシベンゾトリアゾール媒介カップリング操作を用いて加える。すべてのカップリングおよび脱保護反応を、ニンヒドリン、トリニトロベンゼン・スルホン酸またはイソチン試験操作を用いてモニターする。合成完了後、５０％スカベンジャー混合物含有の９５％トリフルオロ酢酸で処理することにより、ペプチドを樹脂支持体より切断し、側鎖保護基を同時に除去する。通常用いるスカベンジャーは、エタンジチオール、フェノール、アニソールおよび水であり、その的確な選択は合成されるペプチドの構成アミノ酸に依存する。トリフルオロ酢酸を真空下での蒸発により除去し、その後、ジエチルエーテルでトリチュレートして粗ペプチドを得る。存在するいずれのスカベンジャーも簡単な抽出操作により除去され、水相を凍結乾燥に付した後、スカベンジャー不含の粗ペプチドを得る。ペプチド合成用試薬は、一般に、英国、ノツチインガムＮＧ７　２０Ｊ１カルバイオケムーノババイオケム（ＵＫ）リミテッド（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅ＋＋−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅ＋ｉ　（ＵＫ）　Ｌｔｄ）より入手可能である。精製は、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび（主に）逆相高性能液体クロマトグラフィーのような技法のいずれか１つまたは組み合わせにより行うことができる。ペプチド分析は、薄層クロマトグラフィー、逆相高性能液体クロマトグラフィー、酸加水分解後のアミノ酸分析、および高速原子衝撃（ＦＡＢ）質量分析法により実施することができる。

か（して、本発明の抗原体が蛋白質である場合、これは一連の修飾ポリペプチド、例えば本発明の範囲内にある起源、構造および免疫原性の共通の要素を有する原蛋白質の合成的に誘導されたポリペプチドまたはフラグメントを包含する。

通常、本発明のワクチンで免疫処置するほうが望ましいが、その因子に対する抗体を宿主に投与して受動免疫性を付与してもよい。

第三の態様によれば、本発明は、乳汁中にて哺乳動物プラスミノーゲン活性化能を有するストレプトキナーゼを提供する。好ましくは、該ストレプトキナーゼは、ストレプトコッカス・ウベリスにより産生されるストレプトキナーゼと同一であるか、または実質的に同一である。

第四の態様は、配列が天然で見いだされるゲノム配列の少なくとも大部分より単離されるストレプトキナーゼをコードする核酸配列を提供するものである。換言すれば、該核酸配列はそれが従来存在している形態で特許請求されるものではない。かくして、本発明の核酸配列は、配列がプラスミドのような細菌ベクター中に、またはバクテリオファージにより匿われていてもよいウィルスベクター中にてクローンされた際の核酸配列を包含する：ただし、そのようなりローンは関連した染色体のＤＮＡライブラリーを構築するクローンとは分離状態にある。

当該分野における周知方法を用いることによりストレプトキナーゼのアミノ酸配列からストレプトキナーゼをコードする核酸配列を得ることが可能である。蛋白質由来のアミノ酸配列鎖を用いることにより、公知方法に従って、蛋白質をコードするｍＲＮＡおよびＤＮＡを雑種形成する特異的ＤＮＡプローブを合成できる。

遺伝子は、通常、その発現を支配するプロモーターおよび／または他の発現調順配列からなり、イントロンを含んでいてもよ（、またはコーディング配列、例えばｃＤＮＡ配列のみからなっていてもよい。

核酸配列は、（ｉ）遺伝子によりコードされる蛋白質に特異的に結合する抗体を製造するのに用いることができる蛋白質またはそのフラグメントを産生するのに使用できるか、または（ｉｌ）遺伝子または前記定義の型（１）の変異に対応するアンチセンス（＆ｎｔｔｓｅｎｓｅ）配列であるいずれの変異も包含する。例えば、最初のコドンと同一のアミノ酸（Ｓ）をコードする異なるコドンを代わりに用いることができる。また、置換コドンは、蛋白質の活性および免疫原性に影響を与えないか、またはその活性または免疫原性を改善する異なるアミノ酸をコードしてもよい。例えば、部位一定方向変異誘発または他の技法を用いて、出展明示により本願明細書の一部とする、ホトスタインおよびジョートル（Ｂｏｔｓｔｅｉｎおよび５ｂｏｒｔｌｅ）、ｒストラティージックス・アンド・アプリケーシジンズ・オブ・イン・ビトｏ−ミュータゲネシス（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｉｎ　Ｖｉｔｒ。

１１ｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）　Ｊ　、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　、２２９　：１９３−１２１０　（１９８５）に記載されているように、置換、挿入、欠失および転移のような単一または複数の変異をクリエートできる。このような修飾遺伝子は、公知技法を本明細書中に含まれる教示に適用することにより得ることができるため、このような修飾遺伝子も特許請求した核酸配列の範囲内にある。

さらには、その遺伝子配列（またはそのフラグメント）を用い、厳重な条件下、それと雑種形成している他のＤＮＡ配列を得ることができる。このようなりＮＡはいずれのゲノムＤＮＡも包含する。したがって、本発明の遺伝子は、本発明の遺伝子と、少なくとも５５％、好ましくは６０％、最も好ましくは７０％の相同性を示すＤＮＡを包含する。ただし、このような相同性ＤＮＡは前記のような病原体因子に関連する阻害免疫応答の原因となる蛋白質をコードするものである。

遺伝子の「変異」は、たとえ２つの遺伝子の間の相同性が全体としてそれほどないとしても、相対的に短い鎖（例、２０〜５０ヌクレオチド）が、本発明の遺伝子の対応する鎖と高度の相同性（少なくとも５０％、好ましくは少なくとも９０または９５％）を有する遺伝子を包含する。これは、蛋白質の一般的構成が異なっている場合であっても、重要な活性または結合部位は分割できるからである。

以後、「遺伝子」なる語はこのようなすべての変異およびフラグメントを包含するのに用いる。

適当な発現配列に含まれる際の、遺伝子またはその変異を用い、本発明に従って用いることができる抗原蛋白質またはそのフラグメントを製造することができる。

第五の態様において、本発明は、適当な宿主細胞中の対応する核酸配列を発現することによる、またはアミノ酸合成による、蛋白質の産生方法を提供する。

したがって、本明細書中の教示を考慮して適宜修飾した公知技法に従つて、本発明の核酸を用いて発現ベクターを構築し、ついでそれを用いて、本発明の抗原性ポリペプチドの発現および生成用の適当な宿生細胞を形質転換させる。このような技法は、１９８４年４月３日付けでルター（Ｒｕｔｔｅｒ）らに付与された米国特許第４．４４０．８５９号、１９８５年７月２３日付けでワイズマン（ｆｅｉｓｓ＋ｍａｎ）に付与された第４．５３０，９０１号、１９８６年４月１５日付けでクロール（Ｃｒｏｗｌ）に付与された第４．５８２．８００号、１９８７年６月３０日付けでマーク（Ｍａｒｋ）らに付与された第４，６７７．０６３号、１９８７年７月７日付けでゲーゼル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）に付与された第４．６７８，７５１号、１９８７年１１月３日付けでイタクラ（Ｉｔａｋｕｒａ）らに付与された第４．７０４．３６２号、１９８７年１２月１日付けでミューレイ（Ｍｕｒｒａｙ）に付与された第４，７１０．４６３号、１９８８年７月１２日付けでトール・ジュニア（Ｔｏｏｌｅ、　Ｊｒ、　）らに付与された第４．７５７．００６号、１９８８年８月２３日付けでゲーゼル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）らに付与された第４，７６６．０７５号および１９８９年３月７日付けでストーカ−（Ｓｔａｌｋｅｒ）に付与された第４．８１０．６４８号に開示されている技法を包含する。これらすべての文献を出展明示により本明細書の一部とする。

本発明の遺伝子は、適当な宿主に導入するために、広範な他のＤＮＡ配列に結合させてもよい。伴ＤＮＡは、宿主の特性、ＤＮＡを宿主に導入する方法、およびエピゾーム維持または組込みが望ましいかどうかに依存する。

一般に、好ましくはｃＤＮＡのような遺伝子を、発現用の適当な配向および的確なリーディングフレームにて、プラスミドのような発現ベクター中に挿入する。

必要ならば、ＤＮＡを、所望の宿主によって認識される適当な転写および翻訳制御調整ヌクレオチド配列に連結させてもよいが、このような調整は、一般に、発現ベクターで利用できる。その場合、ベクターを、標準技法を介して宿主中に導入する。一般に、すべてではないが、宿主は該ベクターによって形質転換される。

したがって、宿主細胞を形質転換するように選択することが必要であろう。−の選択技法として、抗生物質抵抗性のような、形質転換された細胞にて選択可能な特性をコードする、必須の調整エレメントを有する、ＤＮＡ配列を発現ベクター中に組み入れることが挙げられる。また、このような選択可能な特性についての遺伝子は別のベクター上にあってもよ（、それを用いて所望の宿主細胞を共同０賀転換できる。

ついで、本発明の組換え型ＤＮＡにより形質転換された宿主細胞を、ポリペプチドを発現させるに十分な時間かつ本明細書の教示を考慮して当業者に公知の適当な条件下で培養し、そして回収できる。

細菌（例、イー・コリ（Ｅ、Ｃｏ１１）およびパンラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｆｌｉｓ）　）　、酵母（例、サツカロミセス・セレビシェ（ＳａｃｃｈａｒｏＩｌｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　）　、線状真菌（例、アスペルギルス（＾ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）　）　、植物細胞、動物細胞および昆虫細胞を包含する多（の発現系が知られている。

レプリコン、例えば原核レプリコンを含有するそれらのベクターはまた、適当なプロモーター、例えばそれで形質転換される、イー・コリのような細菌宿主細胞中の遺伝子の発現（転写および翻訳）の定方向能を有する原核プロモーターを含有できる。

プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合および転写を生じさせるＤＮＡ配列により形成される発現調整エレメントである。典型的な細菌宿主と適合するプロモーター配列は、典型的には、本発明のＤＮＡセグメント挿入用の都合のよい制限部位を含有するプラスミドベクターにて提供される。

典型的な原核ベクタープラスミドは、バイオラド・ラボラドリース（ＢｉｏｒａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　（米国、カリフォルニア州、リッチモンド）より入手可能なｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９であり、米国、ニューシャーシー州、ビス力タウェイ、ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉｓ）より入手可能なｐＰＬおよびｐＫＫ２２３である。

相補的付着末端を介してＤＮＡをベクターに操作的に連結するための種々の方法が開発されている。例えば、相補的ホモポリマー系をＤＮＡセグメントに加え、ベクターＤＮＡに挿入することができる。ついで、該ベクターおよびＤＮＡセグメントを相補的ホモポリマー末端の間の水素結合により接合させ、組換え型ＤＮＡ分子を形成させる。

１またはそれ以上の制限部位を含有する合成リンカ−は、ＤＮＡセグメントをベクターに接合する別法を提供する。前記のように、エンドヌクレアーゼ制限消化により生成されるＤＮＡセグメントを、バクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼまたはイー・コリＤＮＡポリメラーゼ１１突出する３’、　５’−エキンヌクレオチド分解活性を有する３′−単鎖末端を除去し、重合活性を有するくぼみ３゜−末端を充足する酵素で処理する。

したがって、これらの活性の組み合わせは、鈍端ＤＮＡセグメントを生成する。

ついで、該鈍端セグメントを、バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼのような鈍端ＤＮＡ分子の連結を触媒し得る酵素の存在下、多量のリンカ−分子と一緒にインキュベートする。すなわち、該反応の生成物は、その末端にポリマーリンカ −配列を有するＤＮＡセグメントである。ついで、これらのＤＮＡセグメントを適当な制限酵素で切断し、該ＤＮＡセグメントと適合する末端を生成する、酵素で切断した発現ベクターに連結する。

種々の制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する合成リンカ−はインターナショナル・バイオチクノロシーズ・インコーポレイテッド（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏ　−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ、）　、米国、コロラド州、ニューヘイブンを包含する多くの供給源から入手できる。

本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドベクター構築体で形質転換された宿主細胞に関する。該宿主細胞は、原核または真核性のいずれかとすることができる。細菌細菌は原核宿主細胞であることが好ましく、典型的には、例えば、イー・コリ株ＤＨ５（米国、メリーランド州、ベテスダ、ベテスダ・リサーチ・ラボラドリース（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から入手可能）およびＲＰＩ（米国、メリーランド州、ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（＾５ｅｒｉｃａｎ　ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）　（ＡＴ　ＣＣ）　（Ｎｏ、　ＡＴ　ＣＣ３１３４３）から入手可能）のようなイー・コリ株である。好ましい真核宿主細胞は、酵母および哺乳動物細胞、好ましくはマウス、ラット、サルまたはヒト繊維芽細胞株からのようなを推動物細胞である。好ましい真核宿主細胞は、ＡＴＣＣからＣＣＬ６１として入手可能なチャイニーズ・ハムスター・オバリー（ＣＨＯ）細胞およびＡＴＣＣからＣＲＬ１６５８として入手可能なＮＩＨスイス・マウス・胎内細胞ＮＩＨ／３Ｔ３を包含する。

適当な細胞宿主の本発明のＤＮＡ構築体を用いる形質転換は、典型的には、用いるベクターの型に依存して周知方法により達成される。原核宿主細胞の形質転換に関しては、例えば、コーエン（Ｃｏｈｅｎ）ら、プロシーディンゲス・オブ・ナンｇナル・アカデミ−・オブ・サイエンシス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）　Ｕ　Ｓ　Ａ。

６９：２１１０　（１９７２）；およびサンブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリ−・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）　、コールド・スプリング＋ハーバ −・ラボラトリ−。

コールド・スプリング・ハーバ−、ＮＹ　（１９８９）参照。酵母細胞の形質転換が、ノニルマン（Ｓｈｅｒｍａｎ）ら、メソッド・イン・イースト・ジェネティックス。

ア・ラボラトリー−マニュアル（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、＾ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）　、　コールド・スプリング −ハーバ−、ＮＹ　（１９８６）に記載されている。ベッグス（Ｂｅｇｇｓ）　、不イチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）　、２７５　＋１０４−１０９　（１９７８）の方法もまた有用である。を推動物細胞を、ｒＤＮＡ含有のレトロウィルスベクターで形質転換することに関しては、例えば、ソルゲ（Ｓｏｒｇｅ）ら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（１１ｏ１゜Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）　、４　：　１７３０−３７　（１９８４）；グラハム（Ｇｒａｈａｍ）ら、ウイａｃｔジー（Ｖｉｒｏｌ、　）、５２　：４５６　（１９７３）；およびウィグラー（Ｗｉｇｌｅｒ）ら、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ −・オブ・サイエンシスＵＳＡ、７６：１３７３−７６（１９７９）参照。

形質転換に成功した細胞、すなわち本発明のＤＮＡ構築含有の細胞は、周知方法により同定できる。例えば、本発明の発現構築体を導入した結果得られた細胞を増殖させ、本発明の蛋白質を産生できる。細胞を収穫し、溶解し、そのＤＮＡ含量をサザン（３０ｕｔｈｅｒｎ）により、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｆｏｌ、）　、９８　：　５０３　（１９７５）またはベレント（Ｂｅｒｅｎｔ）らにより、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈ、）　、３　：　２０８　（１９８５）に記載されているような方法を用いてＤＮＡの存在について試験することができる。また、上溝中の蛋白質の存在を、後記の抗体を用いて検出できる。

組換え型ＤＮＡの存在を直接的に検定することに加えて、形質転換の成功は、組換え型ＤＮＡが蛋白質の発現を方向付ける能力を有する場合、周知の免疫学的方法により確認できる。例えば、発現ベクターで形質転換することに成功した細胞は、適当な抗原性を示す蛋白質を産生ずる。形質転換されていると思われる細胞の試料を収穫し、該蛋白質を適当な抗体を用いて検定する。

かくして、形質転換された宿主細胞自体に加えて、本発明はまた、栄養培地中、それらの細胞の培養、好ましくはモノクローナル（クローン的に同一の）培養、またはモノクローナル培養に由来する培養も意図する。さらに、該培養は蛋白質を含有していることが好ましい。

形質転換された宿主細胞を培養するのに有用な栄養培地は当該分野において周知であり、数社より入手可能である。

本発明の第六の態様は、宿主因子に対してワクチンを接種したを推動物を提供することである。乳房炎に対する予防接種の場合、を推動物は、ブタ、ウシ、ヒツジまたはウマのような乳房炎を患う傾向にあることが知られている哺乳動物である。乳房炎は、通常、少なくともストレプトキナーゼが関連しない限りでは、中和免疫応答を生じさせないため、少なくとも、本発明の方法（抗原が細菌性ストレプトキナーゼに関連するものである）により乳房炎に対して予防接種されているこれらの哺乳動物の場合、そのような哺乳動物は、中和抗ストレプトキナーゼ抗体の存在により非予防接種哺乳動物（乳房炎を患っている哺乳動物であっても）と区別できる。

本発明に係る乳房炎に対する予防接種は、乳房炎についての公知療法と組み合わせて用いることができる。

本発明のワクチンおよび方法を特に乳房炎疾患に関して検討しかつ例示する。

ワクチンの抗原体は原因微生物であるストレプトコッカス・ウベリスにより産生されるストレプトキナーゼまたは抗原的に同等なものである。しかし、該発明は一般な原理に関するものであり、その病原体の因子が宿主において蛋白質の分解を引き起こす他の疾患にも適用できる。

栄養要求変異細菌はある種の必須アミノ酸を合成できず、増殖させるためには該微生物用の培地にこれらのアミノ酸を供給しなければならない。乳汁中にあるアミノ酸には３種の形態：遊離アミノ酸、非蛋白質ペプチド（１２％Ｗ／Ｖのトリクロロ酢酸に可溶なものと定義）およびポリペプチドならびに蛋白質がある。

アミノ酸の大部分は、蛋白質の形態にて存在する。細菌は遊離アミノ酸を容易に利用でき、ある場合には、スモールペプチドの形態にてアミノ酸を用いることができる。しかし、高密度の細菌増殖を達成するのに十分なアミノ酸を得るために、または蛋白質の形態でのみ存在する必須アミノ酸を得るために、栄養要求変異細菌は、乳汁蛋白質の蛋白質分解用の系を有していなければならない。

ストレプトコッカス・ウベリスは、化学的に限定した培地における増殖実験により決定されるように、非常に特異的なアミノ酸要求を膏することが判明した。

これらの要求は、牛乳中、遊離形にて存在するアミノ酸では満たされず、また牛乳中の非蛋白性の窒素の形態にて存在するものによっても満たされない（アストン（Ａｓｔｏｎ）　１９７５）。ニス・ウベリスがウシ乳腺にて良好に増殖すること。

乳腺中に注入された約３００コロニー形成単位（ｃ　ｆ　ｕ）が、結果として、１２時間後、乳汁１ｍｌ当たり約１０６〜１０７ｃ　ｆ　ｕを生じさせることが十分に確立されている。

本発明に係る、ここで抗原体が細菌性ストレプトキナーゼに関するものであるワクチンおよび方法は、宿主のプラスミノーゲンが活性化されず、したがって遊離アミノ酸が乳汁中に生成されないように、細菌性ストレプトキナーゼを阻害することで作用し、それによって、細菌の増殖が十分迅速に阻害され、疾患が持続されないと考えられる。

該ワクチンは、ストレプトコッカス・ウベリス・ストレプトキナーゼの実質的に純粋なまたは非純粋な調製物からなる。さらに、失活形態のストレプトキナーゼを含有する調製物からなっていてもよい。

ニス・ウベリス・ストレプトキナーゼ、または他のプラスミノーゲン活性化因子あるいは細菌性プロテアーゼが、乳房炎に対するワクチンとして適当であることが判明し、ワクチンとして用いる場合、種々の異なる経路により投与できる。

乳腺の分泌液中、十分な抗体を産生じ、細菌誘発の蛋白質分解を中和するようにワクチンを投与する。このことは、細菌による感染に対する乳腺の保護を促進する。

ニス・ウベリスにより産生されるストレプトキナーゼは、ウシ、ウマおよびヒツジプラスミノーゲンの活性化能を有する。該ストレプトキナーゼは硫酸アンモニウム沈降法、つづいて分子排除クロマトグラフィーによりニス・ウベリスの培養濾液より製造できる。ニス・ウベリスはプラスミノーゲン活性化活性を有する単一の蛋白質を産生ずる。天然分子の分子量は約５７に、Ｄであり、それに対してＳＤＳ　ＰＡＧＥにより精製された蛋白質の分子量は２９ｋＤである。これは、天然分子が２９ｋＤのサブユニットの二量体からなり、ＳＤＳおよび２−メルカプトエタノールの存在下、電気泳動の間に解離することを示唆している。

天然分子量は、ランスフィールド（Ｌａｎｃｅｆｉｅｌｄ）　Ａ群ストレプトコッカス（４６，７ｋＤ）またはランスフィールド０群ストレプトコッカス（４７，２ｋＤ）由来のストレプトキナーゼについて観察される分子量と異なる。しかし、これらの分子は共に、モノマー構造として存在し、ＳＤＳ　ＰＡＧＥの間に解離していない（ファング（ｌｕａｎｇ）ら、１９８９）。スタフィロキナーゼ、スタフィロコッカス・アウレウス由来のプラスミノーゲン・アクチベーターは、２３ｋＤ　（ジャクソンおよびタング（ＪａｃｋｓｏｎおよびＴａｎｇ）　、１９８２）と１５．３ｋＤ（サコ（Ｓａｋｏ）ら、１９８２）の間のサブユニットの分子量を有し、活性用の二量体構造を必要とすることが示されている（ジャクソンら、１９８１）。この分子がつシプラスミノーゲンを活性化するとは示されておらず、ウシ乳腺に感染するスタフィロコッカス・アウレウス株中に存在するとは考えられない。

ストレプトコッカス・ウベリス・ストレプトキナーゼは、分子上に同様の抗原部位があることを反映して、他のストレプトコッカス由来のストレプトキナーゼが産生ずる抗血清とある種の免疫学的交差反応を示す。

本発明のさらなる態様は、乳汁中にて蛋白質分解を生じさせる方法であって、ストレプトキナーゼを乳汁に添加し、それによってストレプトキナーゼがプラスミノーゲンをカゼイン分解蛋白質プラスミンに活性化することからなる方法を提供する。

スイス型チーズ熟成におけるプラスミンの重要性が説明されている（オルリカイネンおよびキベラ（ＯｌｌｉｋａｉｎｅｎおよびＫｉｖｅｌａ）　１９８９）、スイス型チーズの熟成の間の蛋白質分解の研究において、プラスミンのよるβ− カゼインの加水分プトンの産生はプラスミン活性であることを示しており、プラスミンがスイス型チーズ熟成についての重要な、必須の酵素であると結論付けられる。したがって、最終製品の風味がペプチド、アミノ酸およびそれらの誘導体に依存するチーズ熟成工程にてストレプトキナーゼの潜在的な役割がある。

ストレプトキナーゼの別の使用の可能性は、活性化に対して敏感であるプラスミノーゲンを有する種において、繊維素溶解剤として用いることである。他のストレプトキナーゼが、通常、血栓崩壊障害を患っている患者にて、この処置のために用いられる。

以下の実施例は、添付図面に関して、本発明の好ましい態様を、制限することな（説明する。

第１図はストレプトコッカス・ウベリスの培養濾液からの硫酸アンモニウム沈降蛋白質の溶出特性を示す。

第２図は分子排除クロマトグラフィーによる硫酸アンモニウム沈降蛋白質と高ストレプトキナーゼ活性フラクションの分離を示す。硫酸アンモニウム沈降蛋白質（１）。低純度のフラクション（２）。高純度のフラクション（３）。天然分子量１８０．１１６．８４．５８．４８，５．３６．５および２６．６ｋＤを有する予備染色した分子量標品（ングマ）（４）。

第３図は、ウシ・プラスミノーゲンのある場合、ない場合のストレプトコッカス・ウベリスによる乳汁蛋白質の加水分解を示す。ストレプトコッカス・ウベリス株０１４０Ｊ（ＡおよびＢ）を、ウシ・プラスミノーゲンの存在（Ａ）および不存在（Ｂ）下、脱脂乳含有のアガロースと共に重層させた。

第４図は、ランスフィールド０群ストレプトコッカスからのストレプトキナーゼまたはニス・ウベリス培養濾液を用いてプラスミノーゲンを活性化した後のカゼイン分解活性の検出を示す。ウェルは、ランスフィールド０群ストレプトコッカスからのストレプトキナーゼ（カラム１）、ニス・ウベリス培養濾液（カラム２）またはリン酸緩衝セイライン（カラム３）と、ヒト（Ｈ列）、ウサギ（Ｒ列）、ブタ（Ｐ列）、ウマ（Ｅ列）またはウシ（Ｂ列）プラスミノーゲンの混合物を含有する。ＰＢＳ標識の列は、プラスミノーゲンの代わりにリン酸緩衝セイラインを含有した。

第５図は、ニス・ウベリス培養濾液の存在下、インキュベートした後のウシ・プラスミノーゲンのＳＤＳ　ＰＡＧＥを示す。リン酸緩衝セイライン（Ａ）、リン酸緩衝セイライン（ＰＢＳ）中、１／１０００　（Ｂ）、１／１００　（Ｃ）および１／１０　（Ｄ）に希釈したニス・ウベリス培養濾液２μｍの存在下にあるウシ・プラスミノーゲンの痕跡。矢印はプラスミン関連のポリペプチドの位置を示す。

ＰＢＳ中、１１５に希釈した培養濾液の電気泳動によれば蛋白質バンドは検出されなかった。数は既知分子量の蛋白質の位置を示す。

実施例１：培養濾液からのストレプトキナーゼの精製この研究を通して、ストレプトコッカス・ウベリス株０１４０Ｊを用いた。この株は、英国、リーディング、シンフィールド、ザ・ナショナル・インスティテユート・オブ・ディリー・リサーチ（ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｄａｉｒｙ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）で、当初、ウノ乳房炎のものから単離した。

細菌を、２５％（Ｗ／Ｖ）グリセロール含有のトッド・ヒユーウィツト培地（Ｔｏｄｄ　Ｈｅｖｉｔｔ　ｂｒｏｔｈ）　（ＴＨＢ）中、−２０℃で貯蔵した。培養を、最初、トッド・ヒユーウィツト培地１０ｍ１中、３７℃で１８時間増殖させた。カゼイン氷解物（１％、Ｗ／Ｖ）およびグルコース（１％、Ｗ／Ｖ）含有の化学的限定培地（ライおよびフィールド（ＬｅｉｇｈおよびＦｉｅｌｄ）　１９９１　）にこの培養を接種しく培地５００ｍ１中に１０μ］）、３７℃で１８時間インキュベートした。遠心分離（１０，０００ｇ　；　２０分間）に付し、得られた上清を濾−Ａ（孔径０．４５μｍ）することにより細胞を除去した。ナトリウムアジドを培養濾液に０．０５％（Ｗ／　Ｖ　）の最終濃度まで加えた。

培養濾液からのストレプトキナーゼの精製はまた、固定化モノクローナル抗体を用いる、アフィニティー・クロマトグラフィー系により達成できる（）１−ロウ・イー＆レイン・ディー　（Ｈａｒｌｏｗ、Ｅ、＆Ｌａｎｅ、Ｄ、）　（１９８８）アンチボディーズ。

ア・ラボラトリ−・マニュアル、コールド・スプリング・ノ）−バー（Ｕ　Ｓ　Ａ））。

培養濾液からの硫酸アンモニウム沈降、ゲル濾過およびストレプトキナーゼ活性９棟世ストレプトコッカス・ウベリス株０１４０Ｊを用いた。硫酸アンモニウム飽和溶液を細胞不含培養濾液に３８％（Ｖ／Ｖ）の最終濃度まで加えた。混合物を４℃ で２０時間撹拌し、得られた沈降物を濾過（孔径０．４５μｍ）により収集した。その沈降物を０．０５％（ｗ／ｖ）ナトリウムアジド含有の蒸留水１００ｍ１に再び溶解し、同希釈液２．０リツトルに対して２４時間透析した。その透析物を１０　ｋ、　Ｄ排除リミットを有する膜（米国、マサチューセッツ州、フィルトロン（Ｆｉｌｔｒｏｎ）　）を用いる撹拌圧力セル（米国、マサチューセッツ州、アミコン（Ａ＋＋１ｃｏｎ）　）中、１０倍に濃縮した。

５００ｍ１の概算充填床容量を有する、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ　−７５（スウェーデン、ウプサラ、７７−マ’／ア（Ｐｈａｒａ＋ａｅｉａ）　）含有のカラム（２８ｘｌｏｏｏｍｍ）を、リン酸緩衝セイライン（ＰＢＳ）で４℃で平衡化した。硫酸アンモニウム沈降、再溶解、透析、濃縮した約１０ｍ１の蛋白質溶液を該カラムに加え、蛋白質を０．５〜１．０ｍｌ／分の流速でＰＢＳにて溶出させた。フラクション（１０ｍ、ｌ）を収集し、各５μｌをウシ・プラスミノーゲン活性化活性について検定した。

予備実験は、ストレプトキナーゼ活性体が３３〜３８％飽和濃度で硫酸アンモニウムにより細胞不含培養濾液から沈降することを示した（データは示さない）。

その後は、２，５リツトルの細胞不含培養濾液からストレプトキナーゼを沈降させるのに３８％の飽和濃度を用いた。沈降物を、再び溶解し、透析し、ゲル濾過前に濃縮した。

ストレプトキナーゼ活性体が約５７ｋＤの見かけ上の分子量を有する単活性ピークとしてＧ−７５カラムから溶出した（第１図）。フラクション２１および２２（高純度ストレプトキナーゼ）をプールし、同様にフラクション１９，２０．２３および２４（低純度ストレプトキナーゼ）をプールし、−７０℃で貯蔵した。

見かけ上の活性の喪失はなかった。

ストレプトキナーゼ活性を有するプールしたフラクションの純度を、既述したＳＤＳ　ＰＡＧＥおよび蛋白質染色法を用いて測定した。

再溶解し、透析し、濃縮した硫酸アンモニウム沈降物は、１００〜２９ｋＤの範囲の分子量を有する６種の蛋白質を含有した。低純度フラクションは２９ｋＤ蛋白質および微量の他の蛋白質を含有し、それに対して高純度フラクションは２９ｋＤの分子量を有する単一のバンドのみを含有したく第２図）。

実施例２．アガロース／脱脂乳重層によるプラスミノーゲン活性化の検出ウサギ、ヒト、ヒツジ、ウマおよびウシ由来のプラスミノーゲンをングマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ　ＣｈｅＩｌｉｃａｌ　Ｃｏ、）　（英国、ドーセット州、プール）から入手し、１．０単位／ｍｌの最終濃度に滅菌蒸留水中にて復元した。さらに、ランスフィールド０群ストレプトコッカスからのストレプトキナーゼをシグマ社から入手し、リン酸緩衝セイライン（ｐＨ７，４）中、１ｍｇ／ｍ＋の濃度で復元した。プラスミノーゲンおよびストレプトキナーゼを一７０’ Ｃで貯蔵し、使用前に一度だけ解凍した。

ＴＨＢ中で一夜培養し、トッド・ヒユーウィツト寒天上に画線培養させ、３７℃ で１８時間インキュベートした。単離したコロニーのプレートを、ＮａＣ１（１５０ｍＭ）、トリス／ＭＣＩ　（５０ｍＭ、ｐＨ８，１）　、オキソイド（Ｏｘｏｉｄ）脱脂乳（１％Ｖ　／　Ｖ　）およびウシ・プラスミノーゲン（１０μｇ／ｍ＋）含有の溶解アガロース（１０μｇ／ｍ＋）１０ｍｌと共に重層させ、３７℃でインキュベートした。対照を、プラスミノーゲンを除く以外、前記と同一の重層を用いて試験した。

ニス・ウベリスの５種類の株（０１４０Ｊ、ＥＦ２０，５ＴＩＯ，Ｃ２１６、Ｃ１９７Ｃ）は、すべて、３７℃で４時間以内に、脱脂乳、ウシ・プラスミノーゲン、アガロースの重層中にてカゼイン分解活性帯を生成した（第３図Ａ）。しかし、この活性を示さない数種のニス・ウベリス株がある：これらは、おそらく、ウシ乳腺についてのビルレントの減少を示している。ウシ・プラスミノーゲンの不存在下にある重層において、単離したコロニーの回りに何ら帯は検出できなかった（第３図Ｂ）。

実施例３．プラスミノーゲン活性化およびプラスミンの検出等容量のプラスミノーゲン（種々の哺乳動物種がらの１．０単位／ｍｌ）とニス・ウベリス培養濾液またはランスフィール１６群ストレプトコッカス由来のストレプトキナーゼ（１ μｇ／ｍｌ）を混合し、３７℃で４５分間インキュベートし、ついで、カゼイン分解活性を検出することにより、１０μｌをプラスミンの存在について検定した。活性を、３７℃で２４時間インキュベートした後の（プラスミノーゲン不含の前記重層としての）脱脂乳アガロース中にカットされたウェルからの拡散により検出した（第４図）。

ニス・ウベリス由来の培養濾液はウシおよびウマ・プラスミノーゲンを活性化したが、後者での活性は、ウシ・プラスミノーゲンを用いた場合の２時間と比較して、脱脂乳アガロースで約１８時間インキュベートした後でのみ明らかであった。このことは、ニス・ウベリス・ストレプトキナーゼがこの基質について低活性であるかまたは得られたプラスミン分子がウシ乳汁蛋白質に対して貧活性であるかのいずれかを示唆する。ニス・ウベリス培養濾液はヒト、ウサギまたはブタのプラスミノーゲンを活性化しなかった。対照的に、ランスフィール１６群ストレプトコッカス由来のストレプトキナーゼはヒト・プラスミノーゲンを活性化し、ウマ・プラスミノーゲンに対してわずかな活性を示したが、ウサギ、ウシまたはブタ細胞室からのプラスミノーゲンに対して全く活性を示さなかつた。ニス・ウベリス培養瀘液またはランスフィールド０群ストレプトコッカスからのストレプトキナーゼはいずれも、プラスミノーゲンの不存在下でいずれのカゼイン分解活性も示さなかった。

すなわち、ニス・ウベリス培養濾液中にあるストレプトキナーゼ活性は、ブタ・プラスミノーゲンを活性化すると報告されている（エリスおよびアームストロング（Ｅｌｌｉｓおよび＾ｒ＠ｓｔｒｏｎｇ）　１９７１　）ランスフィールドＥ群ストレプトコッカスから単離されたものとは異なる活性であった。ニス・ウベリス培養濾液はこの分子を活性化しなかった（第４図）。それはまたニス・エクイシミリス（Ｓ、　ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）およびニス・ピオゲネス（Ｓ、　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からの類似活性とも異なった：それらは共にウシ・プラスミノーゲンを活性化しないが、ヒト・プラスミノーゲンを活性化した（カステリノ（Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ）　１９７９．ウルツおよびメルフ（ｆｕｌｆおよびＭｅｒｔｚ）　１９６９　）。それに対してニス・ウベリス由来のストレプトキナーゼはヒト・プラスミノーゲンを活性化しないが、ウシ・プラスミノーゲンを活性化した。これが、ニス・ウベリスにおけるプラスミノーゲン活性化活性の存在についての最初の報告であり、ウシ・プラスミノーゲンを活性化するストレプトキナーゼについての最初の報告である。

ウシ・プラスミノーゲン（０，０Ｏ５単位／容量５μｍ）を、ニス・ウベリス培養濾液２μｌと混合し、３７℃で１時間インキュベートした。試料を等容量の試料−ドデシル硫酸ナトリウム（００１％Ｗ／Ｖ）および２−メルカプトエタノール（０，２％Ｖ　／　Ｖ　）含有の緩衝液と混合し、６５℃で５分間加熱した。

蛋白質を電気泳動により分離しくレンムリ（ＬａｅＩｌｉｌｉ）　１９７０）　、オークレイ（Ｏａｋｌｅｙ）らの染色法により検出した（第５図）。

この研究の間に用いたプラスミノーゲンは混入蛋白質を含有した。供給人はプラスミンの混入が蛋白質全体の５％以下であると主張する（英国、プール、シグマ・ケミカル・コーポレーション（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　）　）。ウシ・プラスミノーゲンは９１．２ｋＤの見かけ上の分子量を有し、これはこの蛋白質のアミノ酸配列に基づく概算分子量と一致する（シャルラ−（Ｓｃｈａｌｌｅｒ）ら、１９８５）。

プラスミノーゲンの活性化は、ニス・ウベリス培養濾液の１／１０希釈により６０分後に達成された（第５図）。これは、結果的に、別の蛋白質（４８，５ｋＤ）と−緒に９１．２ｋＤの蛋白質バンドを喪失させた。４８．５ｋＤの蛋白質の消失が、培養濾液の作用の結果であるかまたは得られたプラスミン活性の結果であるかどうかは明らかでない。これら２種の蛋白質の消失は、５６．２．２８．８および２５．４ｋＤの見かけ上の分子量を有する３種のスモールポリペプチドの形成と一致した。

ウロキナーゼ（ヒト起源のプラスミノーゲン・アクチベーター）によるウシ・プラスミノーゲンの活性化は、分子量５３．７および２５．４ｋＤのわずか２種のポリペプチドの形成をもたらすと予測される（ンヤルラーら、１９８５）。これらの蛋白質は、おそらく、各々、５６．２および２５．４ｋＤの蛋白質に対応している。その推定５３．７ｋＤのポリペプチドは２つの潜在的糖付加部位を有しくンヤルラーら、１９８５）、これで推定値と観測値の間の不一致を説明できる。

これはニス・ウベリス・ストレプトキナーゼがウシ・プラスミノーゲン分子の活性化の間にウロキナーゼと同様の方法にて作用することを示唆する。

全体のプラスミノーゲン活性化を達成するために用いる濃度よりも２倍高い濃度で培養濾液を電気泳動した後には、蛋白質バンドは見られないため、付加的なポリペプチド（２８，８ｋＤ）の存在は、細菌蛋白質の存在により簡単には説明できない。この研究の間でプラスミノーゲン活性化の後に観察される３種のポリペプチドの分子量の累計は、ウシ・プラスミノーゲンのものと明らかに食い違っている。これについての−の説明は、２８．８ｋＤポリペプチドがプラスミノーゲン調製物に混入している４８．５ｋＤ蛋白質の分解生成物であり、活性化の間に減少するというものである。精製したニス・ウベリス・ストレプトキナーゼによる精製したプラスミノーゲンの活性化の生成物の分子量を測定することによりこの不一致は解決されるであろう。

精製したストレプトキナーゼ（１０μｇ）をフロイント不完全アジュバントと混合し、Ｂａ１ｂ／ｃマウスに皮下注射した。この操作を、約２１日間のインターバルの後に繰り返した。特異抗体の生成を、以下のように、第二の注射の１０日後にモニター観察した。第二の注射の約１カ月後で膵臓細胞の融合の４日前に、リン酸緩衝セイライン（ＰＢＳ　；ｐＨ７，２）に懸濁させた精製ストレプトキナーゼ１０μｇを静脈内投与し、抗体産生を増加させた。

ハイブリドーマ細胞の産生および培養膵臓を予防接種したマウスから取り出し、常法に従って融合を行った（ガルフレ（Ｇａｌｆｒｅ）ら、１９７７）、融合細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、０゜１ｍＭハイポキサンチン、０．０１６ｍＭチミジンおよび４０μＭアミノプテリン（英国、プール、シグマ社）含有のＨＡＴ培地（ＲＰＭＩ　１６４０　（英国、ペースリー、ライフ・テクノロジー（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）　、ギブ）　（Ｇｉｂｃｏ）　ＢＲＬ）に再び懸濁させた。ついで、細胞を、２Ｘ１０’個のマウス・マクロファージ含をのＨＡＴ培地（１，ｍｌ）で２４時間前に接種した２４−ウェルの菌株群プレートに２Ｘ１０’細胞／ｍｌの濃度で分配した（１ｍｌ／ウェル）。その上清の試料をストレプトキナーゼ特異抗体の存在について試験した場合、ハイブリドーマコロニーが明らかに可視できるまで、該プレートを、５％ＣＯ宜の存在下、３７℃でインキュベートした。上清がストレプトキナーゼ特異抗体を示したコロニーを増殖させ、前記のように上清を抗−ストレプトキナーゼ活性について試験した。活性を示す培養を制限希釈により２回クローンした。

Ｂａ１ｂ／Ｃマウスを２〜４Ｘ１０１個のクローン化ハイブリドーマ細胞を用いて腹腔内（１，Ｐ、）注射することにより腹水液を調製した。この操作の１週間前に、該マウスを０．５ｍｌの「ブリスタン（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）　Ｊ　（英国、ギリンガム、アルドリッチ・ケミカル・カンパニー（＾１ｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　）の商品名）の１．Ｐ。

注射液を投与した。

ストレプトキナーゼ特異マウス抗体の検出精製、凍結乾燥したストレプトキナーゼを炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，６）に１μｇ／ｍｌの濃度で再び溶解し、１００μｍを、平底の９６−ウェルのマイクロタイタートレイ（米国、バージニア州、フロー・ラブダ（リンプロ）　（Ｆｌｏｗｌａｂｓ　（Ｌｉｎｂｒｏ）　）のウェルに加えた。ストレプトキナーゼを該ウェルに１８時間４℃で結合させた。過剰なＥＬＩＳＡ−緩衝液（ツイーン２０．０．０５にＶ／Ｖ含有の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，２）を用いて洗浄することにより、非結合ストレプトキナーゼを該ウェルから除去した。抗体含有溶液を適当なウェルに加え、結合ストレプトキナーゼと３７℃で１時間反応させた。前記のように、ＥＬＩＳＡ−緩衝液で洗浄することで非結合抗体を除去した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に接合したマウス・イムノグロブリン−特異抗体を添加し、３７℃で１時間インキュベートし、ＥＬＩＳＡ−緩衝液で洗浄して非結合接合体を除去することにより結合抗体を検出した。これはＯ−フェニルアミンジアミン（０，３４ｍｇ／ｍＩ）および過酸化水素（０，０３％、ｖ／ｖ）含有のクエン酸緩衝液（０，０５Ｍクエン酸２４．３ｍｌ、Ｏ，ＩＭ　Ｎａ２８ＰＯ＜２５．７ｍ１）１００μＩを添加することによって結合ＨＲＰを比色定量検出するものである。顕色を約２０分間行わせ、等容量の１Ｍ硫酸を加えることにより停止させた。

色相を４９２ｎｍの波長で分光測光法により測定し、特異抗体の存在を対照ウェル（ストレプトキナーゼを含有しないウェルおよび抗体含有溶液が加えられていなかった他のウェル）における顕色と比較することにより測定した。

ストレプトキナーゼ中和活性の検出モノクローナル抗体（ｍＡｂ）をＰＢＳ　（ｐＨ７，２）に希釈し、各希釈液を等容量のストレプトキナーゼ（０，５μｇ／ｍｌ）と混合した。該混合物を室温で１０分間インキュベートし、その後、各ｍＡｂの希釈液からの２０μｍを、オキソイド脱脂乳（１％、Ｗ／Ｖ）および１０′□ｊ単位／ｍ＋のウシ・プラスミノーゲン（シグマ）含有のアガロースシート中にカットされたウェルに置いた。

ｍＡｂおよびストレプトキナーゼ含有のウェルを、ストレプトキナーゼおよび等容量のＰＢＳを加えた対照ウェル（陽性）と、ｍＡｂだけを加えたウェル（陰性）と比較した。ストレプトキナーゼを中和するｍＡｂの能力を、０．５μｇ／ｍ１の全阻害が達成される最低濃度として表す（第１表）。

第１表：ストレプトキナーゼ特異モノクローナル抗体の中和活性の比較実施例６：ニス・ウベリス・ストレプトキナーゼに対するポリクローナル抗体の精製したストレプトキナーゼ（５０μｇ）をフロイント不完全アジュバントと混合し、二二−ジランド系白ウサギに皮下注射した。最初の注射の５週問および８週間後で、さらに２回、この操作を繰り返した。本実施例において西洋ワサビ・ペルオキシダーゼに接合した抗体がウサギ・イムノグロブリンに対して特異的であるほかは、実施例５にてマウス抗体について記載されているように注射後の種々の時点で特異抗体の産生をモニターした。

ストレプトキナーゼ中和活性の検出固定化蛋白質Ｇ（スウェーデン、ウプサラ、ＭＡＢ　ＴＲＡＰファーマシア）を用いてポリクローナル血清から精製したイムノグロブリンのストレプトキナーゼ活性を中和する能力を、特異モノクローナル抗体について実施例５に記載されているように正確に測定した。

ポリクローナル抗体はニス・ウベリス・ストレプトキナーゼの活性を中和するが、シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　）　（英国、ドーセット州、プール）から入手したニス・エクイシミリス（Ｓ、　ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）の活性を中和しなかった。

参考文献アストン・ジエイ・ダブリス（＾５ｔｏｎ、Ｊ、ｊ）　（１９７５）乳汁中の遊離アミノ酸。気体−液体クロマトグラフィーによる測定および乳房炎感染によるその変化。オーストラリアン・ジャーナル・オブ・ダイアリ−・テクノロジー（ＡｕｓｔｒａｌｉａｎＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｄａｉｒｙ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　３０．５５−５９゜ペンスリマン・ニス、エム・ジエイ・ドグニンーバーグレット、ジエイ・エル・バーダグ−、ワイ・ガウドマ−（Ｂｅｎｓｌｉｆｆｉａｎｅ、　Ｓ、　、　Ｍ、　Ｊ、　Ｄｏｇｎｉｎ−Ｂｅｒｇｅｒｅｔ、　Ｊ、　Ｌ。

Ｂｅｒｄａｇｕｅ、Ｙ、Ｇａｕｄｅｍｅｒ、　（１９９０）モチペリアート種（Ｍｏｔｅｂｅｌｉａｒｄ　ｃｏｗｓ’　）の牛乳におけるプラスミンおよびプラスミノーゲンの季節および泌乳期での変化。ジャーナル・オブ・ダイアリ−・リサーチ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｄａｉｒｙ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　５８．４２３−４３５゜ブランレイ・エイ・ジエイおよびエフ・エッチ・トッド（Ｂｒａｍｌｅｙ、Ａ、　Ｊ、およびＦ、Ｈ，Ｄｏｄｄ、）　（１９７８）科学の発展ついての報文。乳房炎の制御−進行および観察。

ジャーナル・オブ・ダイアリ−・リサーチ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｄａｉｒｙ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　５１．４８１−５１．２゜カステリノ・エフ・ジェイ（Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ、　Ｆ、　Ｊ、　）　（１９７０）独特酵素−蛋白質基買修飾反応：プラスミン・ストレプトキナーゼ相互作用。トレンズーイン・バイオケミカル・サイエンシス（Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｉｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ）　４．１−５゜コレン・ディー（Ｃｏｌｌａｎ、　Ｄ、　）　（１９８０）フィブリン溶解の制御および調整。トロンボシス・アンド−へ（−スタシス（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈａｅａｏｓｔａｓｉｓ）　４３．７７−！ｔ９゜エリス・アール・ピーおよびアームストロング・シー・エッチ（Ｅｌｌｆｓ、　Ｒ，Ｐ、およびＡｒｍｓｔｒｏｎｇ、Ｃ，Ｈ，）　（１９７１）ストレプトコッカス８群による莢膜、ストレプトキナーゼおよびストレプトキナーゼの産生。アメリカン・ジャーナル・オブ・ベタリナリー１リサーチ（Ａ＋＋ｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　３２．３４９−３５６゜ガルフィー・ジー（Ｇａｌｆｒｅ、のら（１９７７）雑種細胞株により産生される主要組織適合抗原に対する抗体。ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）　２６６、５５０−５５２゜ヒル・エイ・ダブリュオヨビライ・ジエイ・エイ（ｌｌｉｌｌ、　Ａ、　？、およびＬｅｉｇｈ、　Ｊ、　Ａ、　）（１９８９）ストレプトコッカス・ウベリスのＤＮＡ指紋法：ウシ乳房炎の疫学についての有用な装置。エビデミオロジー・アンド・インフェクション（Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）　１０３．１６５　１７１゜ファング、マルクおよびフエリッチ（Ｉｌｕａｎｇ、　ＭａｌｋｅおよびＦｅｒｒｉｔｔｉ）　（１９８９）ストレプトコッカスＡ群のストレプトキナーゼ遺伝子：エンエリキア・コリにおけるクローニング、発現、および配列分析。モレキュラー・ミクロバイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｉｌｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）　３２．１９７−２０５゜ジャクソン、エスモンおよびタン（Ｊａｃｓｏｎ、　Ｅｓｍｏｎおよび丁ａｎｇ）　（１９８１）ストレプトキナーゼおよびスタフィロキナーゼ。イン・メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｉｎ　：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　ｏ−ランド（Ｌｏｒａｎｄ）編、　８０．３８７．アカデミツク・プレス、ニューヨーク。

ジャクンンおよびタン（ＪａｃｋｓｏｎおよびＴａｎｇ）　（１９８２）ストレプトキナーゼの完全アミノ酸配列およびそのセリン・プロテアーゼとの相同性。

バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　２１．６６２０−６６２５゜レムリ・ニー・ケイ（Ｌａｅ＋ｎｌｉ、　Ｕ、　Ｋ、　）　（１９７０）バクテリオファージＴ４のヘッド蛋白質の集合の間の構造蛋白質の切断。ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　２７７、６８０−６８５ライ・ジェイ・エイ、フィールド・ティー・アールおよびウィリアム・エム・アール（Ｌｅｉｇｈ、　Ｊ、　Ａ、　、　Ｆｉｅｌｄ、　Ｔ、　Ｒ，およびｆｉｌｌｉａｍｓ、Ｍ、Ｒ，（１９９０）臨床性乳房炎を発現させる異なる能力を有する２種の菌株、宿主防御因子に抵抗する能力の相違。

リサーチ・イン・ベタリナリー・サイエンス（Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｉｎ　ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　５ｃｉｅｎｃｅ）４９、　８５−８７゜ライ・ジェイ・エイ、フィールド・ティー・アール（Ｌｅｉｇｈ、　Ｊ、＾、、　Ｆｉｅｌｄ、Ｔ、Ｒ，）（１，９９１）化学限定培地にて増殖させた、ウシ好中球によるストレプトコッカス・ウベリスの殺菌。パテリナリー・リサーチ・コミュニケーションズ（ＶｅｔｅｒｉｎａｒＶ［１ｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍ＋１ｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）　１５．１−６゜マルタおよびフェレッチ（ＭａｌｋｅおよびＦｅｒｅｔｔｉ）　（１９８４）ストレプトキナーゼ：エンエリキア・コリによるクローニング、発現および分泌。ブロン−ディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンンス（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ）　Ｕ　Ｓ　Ａ、　８１．３５５７−３５６１゜マルク、ロエおよびフェレッチ（Ｍａｌｋｅ、　ＲｏｅおよびＦｅｒｅｔｔｉ）　（１９８７）スト・レブトフノカス遺伝学。

フエレソチおよびカーチスｍ　（ＦｅｒｅｔｔｉおよびＣｕｒｔｉｓＩＩＩ）（編）、アメリカン・ソサイエティー・フォー・ミクロバイオロジー（ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）　、ワシントン− ＤＣ。

ミルス・オー・イーおよびトーマス・ティー・ディー（Ｍｉｌｌｓ、　Ｏ，Ｅ、およびＴｈｏ腫ａｓ。

丁、Ｄ、）　（１９８１）乳汁中の乳性ストレプトコッカス増殖用窒素源。ニューシーラント・ジャーナル・オブ・ダイアリ−・サイエンス・アンド・テクノロジー（ＮｅｗＺｅａｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｄａｉｒｙ　５ｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　１５．４３−５５゜オークレイ・ビー・アール、キルシュ・ディー・アールおよびモリス・アール・エヌ（Ｏａｋｌｅｙ、Ｂ、Ｒ，、Ｋｆｒｓｃｈ、Ｄ、ＲおよびＭｏｒｒｉｓ、Ｒ，Ｎ、）　（１９８０）ポリアクリルアミドゲル中の検出蛋白質用の単純超感度銀染料。アナリティヵル・バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　１０５．　３６１−３６３゜ンヤルラー・ジェイ、モサー・ビー・ジエイ、ダンネガー−ミュラー・ジー・エイ・ケイ、ロッセレット・ニス・ジェイ、カンファー・ニーおよびりカリ・イー・イー（Ｓｃｈａｌｌｅｒ、　Ｊ、　、　Ｍｏ５ｅｒ、　Ｐ、　ｆ、　、　Ｄａｎｎｅｇｇｅｒ−Ｍｕｌｌｅｒ、　Ｇ、　Ａ、　Ｋ、　、　Ｒ盾唐唐■撃■煤A　Ｓ、　Ｊ、　。

Ｋａｍｐｈｅｒ、　Ｕ、およびＲｉｃｋｌｉ、Ｅ、Ｅ、　（１９８５）ウシ・プラスミノーゲンの完全アミノ酸配列。ヒト・プラスミノーゲンとの比較。ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　１４９．２６７−２７８゜ウルツ・アール・ジエイおよびメルフ・イー・ティー（ＷυＩｆ、　１１．１．およびＭｅｒｔ２゜Ｅ、Ｔ、）　（１９６９）プラスミノーゲン■についての研究。ストレプトキナーゼの種特異性。カナディアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（ＣａｎａｄｉａｎＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　４７．９２７−９３１゜マーンヤル・ブイ・エムおよびブランレイ・エイ・ジェイ（Ｍａｒｓｈａｌｌ、　Ｖ、　Ｍ、およびＢｒａｍｌｅｙ、＾、Ｊ、）　（１９８４）乳房炎乳汁中のストレプトコッカス・サーモフィラス増殖の刺激。ジャーナル・オブ・ダイアリ−・リサーチ（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＤａｉｒｙＲｅｓｅａｒｃｈ）　５１．　１７−２２゜アルビドンン・ニス（＾ｒｖｉｄｓｏｎ、ｓ）　（１９７３）スタフィロコッカス・アウレウス■由来の細胞外蛋白質分解酵素についての研究。ＥＤＴＡ−感受性プロテアーゼの単離および特徴化。

バイオシミ力・工・バイオフィジカ・アクタ（Ｅｉｏｃｈｅ＋ａ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ）　３０２　：　１４９−１５７゜アルビドソン・ニス、ホルム・ティー、リントホルム・ビー（＾ｒｖｉｄｓｏｎ、　Ｓ、　。

！ｌｏｌ＋ｎｅ、Ｔ、、　Ｌｉｎｄｈｏｌｍ、Ｂ、）　（１９７２）スタフィロコッカス・アウレウスによる細胞外蛋白質分解酵素の形成。アクタ・バソロジ力・ミクロバイオロジー・工・イムノロシカ・スカンジナビ力（Ａｃｔａ、　Ｐａｔｈ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　５ｃａｎｄ、　）　８０　：　８３５−８４４゜アルビドンン・ニス、ホルム・ティー、リントホルム・ビー（＾ｒｖｉｄｓｏｎ、　Ｓ、　。

）１ｏ１＋ａｅ、Ｔ、、　Ｌｉｎｄｂｏｌ＠、Ｂ、）　（１９７３）スタフィロコッカス・アウレウス、工由来の細胞外蛋白質分解酵素についての研究。１の中性および１のアルカリ性プロテアーゼの精製および特徴化。バイオノミ力・工・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ）　３０１　：　１３５−１４８゜ボープツト・アール、サエブ・ニス・エイ、ドレイボー・ジー・アール（Ｂｅａｕｄｅｔ、Ｒ，５ａｈｅｂ、Ｓ、Ａ、、　Ｄｒａｐｅａｕ、Ｇ、Ｒ，）　（１９７４）スタフィロコッカス・アウレウスの数種の菌株より単離されたプロテアーゼの構造異種性。ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　）　２４９　＋　６４６８ −６４７１゜ビジョルクリンドー、ｌＬイ＆アルビドソン・ニス（Ｂｊｏｒｋｌｉｎｄ、　、Ａ＆Ａｒｖｉｄｓｏｎ　Ｓ、　）　。

（１，９７７）スタフィロコッカス株間の細胞外セリン・プロテアーゼの発生。

アクタ・バソロン力・ミクロバイオロジー・工・イムノロシカ・スカンンナビカ（Ａｃｔａ、Ｐａｔｈ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　５ｃａｎｄ、　）カルモナ・シー＆グレイ・ジー・エル（Ｃａｒｍｏｎａ、Ｃ＆Ｇｒａｙ、Ｇ、１．、　（１９８７）スタフィロコッカス・アウレウス株ｖ８のセリン・プロテアーゼ遺伝子のヌクレオチド配列。ヌクレイツク・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄ、　Ｒｅｓ、　）　１５　：　６７５７゜ドレイポー・ジー・アール（Ｄｒａｐｅａｕ、Ｇ、Ｒ，）　（１９７８）スタフィロコッカス・プロテアーゼの主構造。カナディアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）　５６　：　５３４−５４４゜ドレイポー・ジー・アール、ポイリー・ワイ＆フーマルド（Ｄｒａｐｅａｕ、　Ｇ、　Ｒ，。

Ｂｏｉｌｙ、　Ｙ、　＆ｌＩｏｕｍａｒｄ、　Ｊ、　）　（１９７２）スタフィロコッカス・アウレウスの細胞外プロテアーゼの精製および特性。ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｒｉａｌ、　Ｃｈｅｔ　）　２４７　：　６７０−６７２６゜ポテンバ・ジエイ、ダビン・エイ、コルサス・ジー及トラビス・ジェイ（Ｐｏｔｅｍｐａ、Ｊ、、　Ｄｕｂｉｎ、＾、、　Ｋｏｒｚｕｓ、Ｇ＆Ｔｒａｖｉｓ、Ｊ、）　（１９８８）スタフィロコッカス・アウレウス由来の７ステイン・ブロティナーゼによるエラスチンの崩壊。ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ＋＊、　）　２６３　：　２６６４−２６６７゜リーデン・エイージー、リーデン・エル＆フィリプソン・エル（Ｒｙｄｅｎ、　Ａ−Ｃ，。

Ｒｙｄｅｎ、Ｌ、　（１９７４）優先的にグルタモイル−ペプチド結合を切断するスタフィロコッカス・プロテアーゼの４１Ｍおよび特性。ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）　４４　：　１０５−１１４゜サエブ・ニス・エイ（Ｓａｈｅｂ、Ｓ、Ａ、）　（１９７６）　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｅｔ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎｄ’　ｕｎｅ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｉｒｅ　ｄｅ　５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　１ｎｈｉｂｅ■@ｐａｒ１’　ＥＤＴＡ、バイオケミ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ）　、　５８　：　７９３− ８０４゜Ｒ・　・　・Ｐ　・　・　・ＰＢＳ　・　・　・ＡＢＣＤ一−噛一　−山−−一一一°゛゛゛　−棹トト、国際膿審輔牛、　Ａ＋１１＋＋ｍＮ＋　ＰＣＴ／ＧＢ　９３１００１１０フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　９１５２　９１５２−４ＢＣ１２Ｐ　２１１０８　９１６１−４Ｂ／／　Ｃ１２Ｎ　１５１０２（Ｃ１２Ｎ　９１５２Ｃ１２Ｒ１：４６）（Ｃｌ３Ｆ　２１１０８Ｃ１２Ｒ１：９１）Ｉ

Claims

【特許請求の範囲】

１．脊椎動物の疾患を治療または予防するのに用いるためのワクチンであって、該ワクチンが抗原体および担体からなり、脊椎動物を該ワクチンで予防接種した場合、該抗原体が、脊椎動物における蛋白質の分解を直接的または間接的に生じさせ、その分解が病原体の増殖を向上させる病原体由来の因子を阻害する抗体を付与する免疫応答を引き起こすように適合することを特徴とするワクチン。
２．疾患が乳房炎である請求項１記載のワクチン。
３．疾患における因子が、直接的または間接的に乳汁中のプラスミノーゲンを活性化し、乳汁蛋白質の蛋白質分解を生じさせる請求項１または２記載のワクチン。
４．因子がストレプトキナーゼである請求項１〜３記載のいずれか１つのワクチン。
５．ストレプトキナーゼが、ストレプトコツカス・ウベリスにより産生されるストレプトキナーゼであるか、または実質的にそれと同じである請求項４記載のワクチン。
６．疾患における因子が乳汁蛋白質の蛋白質分解能を有する細菌プロテアーゼである請求項１または２記載のワクチン。
７．細菌プロテアーゼがスタフィロコッカス・アウレウスにより産生されるプロテアーゼであるか、またはそれと実質的に同じである請求項６記載のワクチン。
８．脊椎動物の疾患を治療または予防するのに用いるためのワクチンであって、該ワクチンが抗原体および担体からなり、該抗原体がストレプトキナーゼまたはその抗原フラグメントからなることを特徴とするワクチン。
９．ストレプトキナーゼが、ストレプトコッカス・ウベリスにより産生されるストレプトキナーゼであるか、または実質的にそれと同じである請求項８記載のワクチン。
１０．抗原体が細菌プロテアーゼまたはその抗原フラグメントからなる請求項１、２、６または７記載のいずれか１つのワクチン。
１１．細菌プロテアーゼが、スタフィロコッカス・アウレウスにより産生されるプロテアーゼであるか、または実質的にそれと同じである請求項１０記載のワクチン。
１２．脊椎動物を免疫学上有効量の請求項１〜１１に記載のいずれか１つのワクチンで予防接種することからなる脊椎動物における疾患の治療または予防方法。
１３．請求項１２に記載の方法で予防接種されているヒト以外の脊椎動物。
１４．乳汁中の哺乳動物プラスミノーゲンの活性化能を有するストレプトキナーゼ。
１５．ウシ・プラスミノーゲンを活性化する請求項１４記載のストレプトキナーゼ。
１６．ストレプトコッカス・ウベリスにより産生されるストレブトキナーゼであるか、または実質的にそれと同じである請求項１４または１５記載のいずれか１つのストレプトキナーゼ。
１７．請求項１４〜１６に記載のいずれか１つのストレプトキナーゼに対して反応性を有する抗体。
１８．配列が天然で見いだされるゲノムの少なくとも大部分から単離される請求項１４〜１６に記載のいずれか１つのストレブトキナーゼをコードする核酸配列。
１９．請求項１４〜１６に記載のいずれか１つのストレプトキナーゼの抗原部位に対応するペプチド。
２０．請求項１４〜１６に記載のいずれかのストレプトキナーゼに対して特異的な抗体。
２１．適当な宿主細胞にて対応する核酸配列を発現させるか、またはアミノ酸合成またはラージポリペプチドを蛋白質分解することにより、請求項１４〜１６に記載のいずれか１つのストレブトキナーゼを産生する方法。
２２．ストレプトキナーゼを乳汁に加えることからなり、該ストレブトキナーゼがプラスミノーゲンをカゼイン分解蛋白質のプラスミンに活性化することを特徴とする、乳汁にて蛋白質分解を生じさせる方法。