JPS59196092A - 組換えプラスミドによる耐熱性α−アミラ−ゼの新規製造法 - Google Patents
組換えプラスミドによる耐熱性α−アミラ−ゼの新規製造法Info
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- JPS59196092A JPS59196092A JP58071500A JP7150083A JPS59196092A JP S59196092 A JPS59196092 A JP S59196092A JP 58071500 A JP58071500 A JP 58071500A JP 7150083 A JP7150083 A JP 7150083A JP S59196092 A JPS59196092 A JP S59196092A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
- C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は遺伝子操作技術によって調製された新規な組換
えプラスミド及びその用途に関し、更に詳しくは、バシ
ラス属に属し、耐熱性α−アミラーゼを生産する好熱性
細菌の染色体ＤＮＡに由来するものであって、制限酵素
Ｈｉｎｄｌ処理によシ調製されるＤＮＡ断片を有し、か
つ、好熱性細菌を宿主として複製維持できる組換えプラ
スミド及び該グラスミドによる形質転換体たる微生物並
びに該微生物による１１１熱性α−アミラーゼの製造法
に関する。
えプラスミド及びその用途に関し、更に詳しくは、バシ
ラス属に属し、耐熱性α−アミラーゼを生産する好熱性
細菌の染色体ＤＮＡに由来するものであって、制限酵素
Ｈｉｎｄｌ処理によシ調製されるＤＮＡ断片を有し、か
つ、好熱性細菌を宿主として複製維持できる組換えプラ
スミド及び該グラスミドによる形質転換体たる微生物並
びに該微生物による１１１熱性α−アミラーゼの製造法
に関する。
本明細書にいう「好熱性細菌」なる語句は、５５℃以上
の温度で生育・増殖の可能な細菌を意味する。かかる好
熱性細菌は、一般に、取扱い上の安全性、高増殖速度、
耐熱性酵素等の生産および培養時の冷却コストの低減な
どの見地から工業的利用に関し数多くの利点を有してい
る。そのだめ一層の利用を可能とする適当な宿主菌とベ
クター・プラスミドとの組合せに関する開発が待たれて
いた。
の温度で生育・増殖の可能な細菌を意味する。かかる好
熱性細菌は、一般に、取扱い上の安全性、高増殖速度、
耐熱性酵素等の生産および培養時の冷却コストの低減な
どの見地から工業的利用に関し数多くの利点を有してい
る。そのだめ一層の利用を可能とする適当な宿主菌とベ
クター・プラスミドとの組合せに関する開発が待たれて
いた。
本発明者らは先に、かかる技術的諌題を解決すべく、ダ
ラム陽性またはグラム染色性不定の好熱性細菌へ移入可
能であシ、かつ、その中で複製可能なベクター・プラス
ミドを提供した（例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ、 １４９ Ａ３ ｒ
ｐ、ｓ ２４〜８３０ （１９８２）、特開昭５７−１
４６７９９号公報参照）。
ラム陽性またはグラム染色性不定の好熱性細菌へ移入可
能であシ、かつ、その中で複製可能なベクター・プラス
ミドを提供した（例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ、 １４９ Ａ３ ｒ
ｐ、ｓ ２４〜８３０ （１９８２）、特開昭５７−１
４６７９９号公報参照）。
本発明は、これらのベクター・プラスミドの調製法を応
用することによシ、更に具体的有用性の高い組換えプラ
スミドを提供することを目的に研究を積み重ねた結果、
バシラス属に属する耐熱性細菌の染色体ＤＮＡをそれ自
体公知の制限酵素で処理することによって得られる耐熱
性α−アミラーゼ遺伝子を、上記文献記載の方法によシ
調製される好熱性細菌を宿主として複製維持できるベク
ター・グラスミドに組換えることに成功し完成した。
用することによシ、更に具体的有用性の高い組換えプラ
スミドを提供することを目的に研究を積み重ねた結果、
バシラス属に属する耐熱性細菌の染色体ＤＮＡをそれ自
体公知の制限酵素で処理することによって得られる耐熱
性α−アミラーゼ遺伝子を、上記文献記載の方法によシ
調製される好熱性細菌を宿主として複製維持できるベク
ター・グラスミドに組換えることに成功し完成した。
本発明によれば、耐熱性α−アミラーゼ遺伝子の調製方
法は、種々の公知制限酵素を用いて実施することができ
るが、α−アミラーゼ生産性を発現せしめるには、Ｈｉ
ｎｄｌｌｌを用いて処理したものが分子量の大きさ、生
成タン・やり質の細胞外への分泌に必要なキャリヤータ
ンＡ’り質に相当する遺伝情報（シグナル配列）等を有
効に保持させ得る点で好漬である。従って、該遺伝子の
ベクター・プラスミドとしては、好熱性細菌を宿主とし
て複製維持できるプラスミドであって、制限酵素Ｈｉｎ
ｄｌ［に対する切断箇所を有するものであれば、その起
源や分子量の大きさを問わず使用できる。これらのベク
ター・シラスミドの具体的なものとしては、パシラス属
に属する好熱性細菌で安定に複製増殖する、前記文献（
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ＋
Ｖｏｌ。
法は、種々の公知制限酵素を用いて実施することができ
るが、α−アミラーゼ生産性を発現せしめるには、Ｈｉ
ｎｄｌｌｌを用いて処理したものが分子量の大きさ、生
成タン・やり質の細胞外への分泌に必要なキャリヤータ
ンＡ’り質に相当する遺伝情報（シグナル配列）等を有
効に保持させ得る点で好漬である。従って、該遺伝子の
ベクター・プラスミドとしては、好熱性細菌を宿主とし
て複製維持できるプラスミドであって、制限酵素Ｈｉｎ
ｄｌ［に対する切断箇所を有するものであれば、その起
源や分子量の大きさを問わず使用できる。これらのベク
ター・シラスミドの具体的なものとしては、パシラス属
に属する好熱性細菌で安定に複製増殖する、前記文献（
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ＋
Ｖｏｌ。
１４９ｐ、８２４〜８３０）に記載のプラスミドｐＴＢ
１９及びｐＴＢ２０から選ばれるプラスミド並びにそれ
らからの派生シラスミド例えば、ｐＴＢ５１ 、 ｐＴ
Ｂ５２ 。
１９及びｐＴＢ２０から選ばれるプラスミド並びにそれ
らからの派生シラスミド例えば、ｐＴＢ５１ 、 ｐＴ
Ｂ５２ 。
ｐＴＢ５３又はｐＴＢ９０等を好適なものとして挙げる
ことができる。就中、ｐＴＢ５３及びｐＴＢ９０は、選
択マーカーとして、カナマイシン耐性（Ｋｒｎｒ）及び
テトラサイクリン耐性（ＴＣｒ）を保持し７た−１ま、
上記遺伝子を組み込むことができ、かつ、パシラス属に
属する宿主菌中で、コピー数約１〜９個／染色体を示す
ことから特に本発明のベクター・プラスミドとして好適
である。なお、これらのベクター・シラスミドは工業技
術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第５８９５号に
て寄託されたｐＴＢ１９（Ｋｍｒ＋ Ｔｃ ｒ）保持菌
株よシ得られるｐＴＢ１９ （Ｋｍｒ＋ Ｔｃｒ）を前
記文献の記載方法に準じて容易に調製することができる
。
ことができる。就中、ｐＴＢ５３及びｐＴＢ９０は、選
択マーカーとして、カナマイシン耐性（Ｋｒｎｒ）及び
テトラサイクリン耐性（ＴＣｒ）を保持し７た−１ま、
上記遺伝子を組み込むことができ、かつ、パシラス属に
属する宿主菌中で、コピー数約１〜９個／染色体を示す
ことから特に本発明のベクター・プラスミドとして好適
である。なお、これらのベクター・シラスミドは工業技
術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第５８９５号に
て寄託されたｐＴＢ１９（Ｋｍｒ＋ Ｔｃ ｒ）保持菌
株よシ得られるｐＴＢ１９ （Ｋｍｒ＋ Ｔｃｒ）を前
記文献の記載方法に準じて容易に調製することができる
。
以上の方法によシ得られる耐熱性α−アミラーゼ遺伝子
とベクター・プラスミドとの組換えは、それ自体公知あ
制限酵素並びに結合酵素（リガーゼ）を用いるショット
ガン法によシ行なうことができる。
とベクター・プラスミドとの組換えは、それ自体公知あ
制限酵素並びに結合酵素（リガーゼ）を用いるショット
ガン法によシ行なうことができる。
かくして得られる本発明の組換えプラスミドは、バシラ
ス属に属し、耐熱性α−アミラーゼを生産する好熱性細
菌の染色体ＤＮＡに由来するもので為って、制限酵素Ｈ
ｉｎｄｌによシ調製されるＤＮＡ断片を有し、かつ、好
熱性細菌を宿主として複製維持できる岨換えプラスミド
全てが包含される。よシ具体的には、制限酵素Ｂｉｎｄ
ＩＩ処理により調製されるＤＮＡ断片が分子量約４．
’８Ｍｄで各種の制限酵素に対する切断箇所及び切断に
よシ生じたＤＮＡ’ｌ祈片の分子量（Ｍｄ ）がそれぞ
れ （ａ） Ｂａｍ Ｈｌで２ケ所、ＤＮＡ断片の分子量は
、２．１及び２．７ （ｂ） Ｅｃｏ ＲＩで３ケ所、ＤＮＡ断片の分子量は
０．４゜０．８，１．３及び、２．３ （ｃ） Ｐｓｔ Ｉで２ケ所、ＤＮＡ断片の分子量が０
．８゜０８及び３．２ で示される組換えプラスミドを拳げることができる。さ
らに具体的には、該ＤＮＡ断片を上記ｐＴＢ５３及びｐ
ＴＢ９０に組魯込み、本発明者らによってそれぞれｐＡ
Ｔ５及びｐＡＴ９と命名された組換えプラスミドを遺伝
子工学的手法にょシ有用物質の生産を目的とするだめの
所望の性質（コピー数、薬剤ＩｌＩｊＪ性のＪＩｌｆ類
、各種制限酵素の切断箇所苓）を有することから好適な
ものとして皐げることができる。
ス属に属し、耐熱性α−アミラーゼを生産する好熱性細
菌の染色体ＤＮＡに由来するもので為って、制限酵素Ｈ
ｉｎｄｌによシ調製されるＤＮＡ断片を有し、かつ、好
熱性細菌を宿主として複製維持できる岨換えプラスミド
全てが包含される。よシ具体的には、制限酵素Ｂｉｎｄ
ＩＩ処理により調製されるＤＮＡ断片が分子量約４．
’８Ｍｄで各種の制限酵素に対する切断箇所及び切断に
よシ生じたＤＮＡ’ｌ祈片の分子量（Ｍｄ ）がそれぞ
れ （ａ） Ｂａｍ Ｈｌで２ケ所、ＤＮＡ断片の分子量は
、２．１及び２．７ （ｂ） Ｅｃｏ ＲＩで３ケ所、ＤＮＡ断片の分子量は
０．４゜０．８，１．３及び、２．３ （ｃ） Ｐｓｔ Ｉで２ケ所、ＤＮＡ断片の分子量が０
．８゜０８及び３．２ で示される組換えプラスミドを拳げることができる。さ
らに具体的には、該ＤＮＡ断片を上記ｐＴＢ５３及びｐ
ＴＢ９０に組魯込み、本発明者らによってそれぞれｐＡ
Ｔ５及びｐＡＴ９と命名された組換えプラスミドを遺伝
子工学的手法にょシ有用物質の生産を目的とするだめの
所望の性質（コピー数、薬剤ＩｌＩｊＪ性のＪＩｌｆ類
、各種制限酵素の切断箇所苓）を有することから好適な
ものとして皐げることができる。
これらのグラスミドの制限酵素地図は添付の第１図及び
第２図に示す通シである。
第２図に示す通シである。
本図から明らかなようにこれらの組換えプラスミドは、
後述するごとくそれ自体が耐熱性α−アミラーゼの製造
において重要であるばかシでなく、前述したごとく生成
タンノ９．ｌ質の細胞外への分泌に必要なキャリヤータ
ンｉ４り質に相当する遺伝情報を担い、かつ、外来ＤＮ
Ａのクローニング部位として使用可能なりａｍＨＩ ｒ
Ｐｓｔ ｌ又はＥｃｏＲ■による切断箇所を有するこ
とがら、α−アミラーゼ産生以外の組換えプラスミド用
ベクター・グラスミドとしても有用である。
後述するごとくそれ自体が耐熱性α−アミラーゼの製造
において重要であるばかシでなく、前述したごとく生成
タンノ９．ｌ質の細胞外への分泌に必要なキャリヤータ
ンｉ４り質に相当する遺伝情報を担い、かつ、外来ＤＮ
Ａのクローニング部位として使用可能なりａｍＨＩ ｒ
Ｐｓｔ ｌ又はＥｃｏＲ■による切断箇所を有するこ
とがら、α−アミラーゼ産生以外の組換えプラスミド用
ベクター・グラスミドとしても有用である。
さ−らに、本発明により提供される第２の発明は、パシ
ラス属に属する好熱性細菌を宿主として前述の組換えシ
ラスミドで形質転換せしめた新規微生物であシ、該微生
物は耐熱性α−アミラーゼ生産に有用である。
ラス属に属する好熱性細菌を宿主として前述の組換えシ
ラスミドで形質転換せしめた新規微生物であシ、該微生
物は耐熱性α−アミラーゼ生産に有用である。
かかる微生物の具体的なものとしては、パシング・ステ
アロサーモフィラスＡＮ １７４ （ｐＡＴ ９）ＤＢ
ｉＤりｇ年ケ月２２日付で工業技術院微生物工業技術
研究所に微工研菌Ｗ第 ７（ＩｌＩ−７号として寄託さ
れた菌株を挙げることができる。
アロサーモフィラスＡＮ １７４ （ｐＡＴ ９）ＤＢ
ｉＤりｇ年ケ月２２日付で工業技術院微生物工業技術
研究所に微工研菌Ｗ第 ７（ＩｌＩ−７号として寄託さ
れた菌株を挙げることができる。
親
この菌株の菌学的性状は、ＡＮ１７４菌株のＩｌ菌株で
ある、パシング・ステアロサーモフィラスＡＴＣＣ１２
９８０と耐熱性α−アミラーゼの生産性において箕なる
のみで、その他はほぼ同様の性状を示す。
ある、パシング・ステアロサーモフィラスＡＴＣＣ１２
９８０と耐熱性α−アミラーゼの生産性において箕なる
のみで、その他はほぼ同様の性状を示す。
゛まだ、第３の本発明は、上記Ｉ！ｉ沫を用いた耐熱性
α−アミラーゼの製造法を提供するものである。
α−アミラーゼの製造法を提供するものである。
この発明の方法に従って１・耐熱性のα−アミラーゼを
生産せしめるには、パシラス属に属する細菌が生ａし得
る栄養培地、例えば、炭素源として澱粉、可溶性ｉ殿粉
、デキストリン、酸処理？殿粉などの炭水化物を４〜１
０％、窒素源として、大豆粕、大豆粕抽出物、乾燥酵母
、ミルタカゼイン、ペプトン、肉エキス、コーン・ステ
イープリカー、ヘフチド含有・物、アミノ酸類を単独な
いし適量混合添加する。その他必要によシ、少−計の無
・誠塩づシｆ：適当に添加した培地に上記菌株を接不亜
し、ｐＨ５，５〜７．３にて、４０〜７０℃（就中５５
〜６０℃）で２４〜７２時間Ｉｍ気攪拌培養するととり
こよって耐熱性α−アミラーゼを生成蓄積せしめること
が出来る。
生産せしめるには、パシラス属に属する細菌が生ａし得
る栄養培地、例えば、炭素源として澱粉、可溶性ｉ殿粉
、デキストリン、酸処理？殿粉などの炭水化物を４〜１
０％、窒素源として、大豆粕、大豆粕抽出物、乾燥酵母
、ミルタカゼイン、ペプトン、肉エキス、コーン・ステ
イープリカー、ヘフチド含有・物、アミノ酸類を単独な
いし適量混合添加する。その他必要によシ、少−計の無
・誠塩づシｆ：適当に添加した培地に上記菌株を接不亜
し、ｐＨ５，５〜７．３にて、４０〜７０℃（就中５５
〜６０℃）で２４〜７２時間Ｉｍ気攪拌培養するととり
こよって耐熱性α−アミラーゼを生成蓄積せしめること
が出来る。
培猪物からα−アミラーゼを回収、取得するには、従来
各棟の培養物からその含有α−ア：ミ゛ラーゼを回収、
取得するだめに知られた常法を適宜使用することができ
る。例えば、培養ろ液を減圧濃縮する方法、硫安、硫酸
ソーダ、食塩等での塩析、メタノール、アセトンのよう
な溶媒による分画沈殿法を単独でまたは適宜組み合せて
実施することができる。
各棟の培養物からその含有α−ア：ミ゛ラーゼを回収、
取得するだめに知られた常法を適宜使用することができ
る。例えば、培養ろ液を減圧濃縮する方法、硫安、硫酸
ソーダ、食塩等での塩析、メタノール、アセトンのよう
な溶媒による分画沈殿法を単独でまたは適宜組み合せて
実施することができる。
本発明の方法によれば、耐熱性α−アミラーゼ遺伝子を
クローン化し、該遺伝子が増幅された微生物を用いるの
で従来の技術に比し、耐熱性α−アミラーゼの生産性を
顕著に向上せしめ得ることと、好熱性細菌を宿主とした
ことから、発酵法による製造に際して培養槽の冷却を必
要としない点等で工業的に有為な製造法といえる。
クローン化し、該遺伝子が増幅された微生物を用いるの
で従来の技術に比し、耐熱性α−アミラーゼの生産性を
顕著に向上せしめ得ることと、好熱性細菌を宿主とした
ことから、発酵法による製造に際して培養槽の冷却を必
要としない点等で工業的に有為な製造法といえる。
以下に、本発明を実施例により更に詳細に説明する。
実施例
（１） α−アミラーゼ非生産株の分離使用菌株は好
熱性細菌、パシング・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ａｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
） ＣＵ ２１（本菌株の性質については１、Ｉｍａｎ
ａｋａ ｅｔ ａｌ、 ：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏ１ｏｇ７．Ｖｏｌ、１４９１ Ａ３ ｐ、
８２５ ＋１９８２に記載されている。）を使用した
。この菌株を５ ｍｌのし培地（トリープトン１０ ｇ
／ｌ、酵母エキス５ｆｌ／Ｌ、 ＮａＣ１５９／ １Ｘ
ｐｌ−１７，３）に１白金耳植菌し、５５℃で１６時間
培養した。
熱性細菌、パシング・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ａｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
） ＣＵ ２１（本菌株の性質については１、Ｉｍａｎ
ａｋａ ｅｔ ａｌ、 ：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏ１ｏｇ７．Ｖｏｌ、１４９１ Ａ３ ｐ、
８２５ ＋１９８２に記載されている。）を使用した
。この菌株を５ ｍｌのし培地（トリープトン１０ ｇ
／ｌ、酵母エキス５ｆｌ／Ｌ、 ＮａＣ１５９／ １Ｘ
ｐｌ−１７，３）に１白金耳植菌し、５５℃で１６時間
培養した。
この培養液Ｑ、 ５ ｒｎｌを５０ ｍｌのＬＧ培地（
Ｌ培地にグルコース２．５ｇ／を添加したもの）を含む
３００ｍ１容量フラスコに加え、５５℃で約３時間培養
した。０Ｄ６６ｏが約０．４となった時点で遠心集菌し
、これを再び４８℃で５ ｍｌのＬ培地に１゛静濁させ
た。
Ｌ培地にグルコース２．５ｇ／を添加したもの）を含む
３００ｍ１容量フラスコに加え、５５℃で約３時間培養
した。０Ｄ６６ｏが約０．４となった時点で遠心集菌し
、これを再び４８℃で５ ｍｌのＬ培地に１゛静濁させ
た。
これにＮ−メチル−に−二トローＮ−二トロソグアニジ
ン溶液（Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−二トロングア
ニジンを１ ｍｙ／ｍｌになる様にトリス−マレイン酸
緩衝液に溶解したもの）全終濃度が１０１’ｉ ／ｍ、
ｌになるように添加し、５５℃で１５分間攪拌し、更に
１５ｍ／のＬ培地（４８℃）を加えた後遠心柔菌した。
ン溶液（Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−二トロングア
ニジンを１ ｍｙ／ｍｌになる様にトリス−マレイン酸
緩衝液に溶解したもの）全終濃度が１０１’ｉ ／ｍ、
ｌになるように添加し、５５℃で１５分間攪拌し、更に
１５ｍ／のＬ培地（４８℃）を加えた後遠心柔菌した。
この菌体を約２０ｍｇのＬ培地で洗浄後、２０〜５ Ｑ
ｒｒｔｌのＬ培地に再懸濁し、５５℃で３時間振とう
培養した。これを希釈してＬ寒天培地に広げ、５５℃で
１夜保存した。生じたコロニーをＢＹＳ Ｑ天培地（バ
クトベゾトン１０１１７’ｔ。
ｒｒｔｌのＬ培地に再懸濁し、５５℃で３時間振とう
培養した。これを希釈してＬ寒天培地に広げ、５５℃で
１夜保存した。生じたコロニーをＢＹＳ Ｑ天培地（バ
クトベゾトン１０１１７’ｔ。
肉エキス５ｇ／ｌ、酵母エキス２ｇ／ｌ、可溶性デンプ
ン２９／ｌ、、 ＮａＣｔ２ ｇ／ ｔ 、寒天１５９
／ｌ、 ｐ）１７．３ ）に移し５５℃で１夜保存した
。これにヨウ素済液（ｏ、 ’０１’ Ｍ Ｉ、、−Ｋ
Ｉ浴溶液を流入させ、ノ・ローを形成しないコロニーを
選択した。このような変異処理を２回して得たα−アミ
ラーゼ非生産株の１つをＡＮ １７４株と命名した。
ン２９／ｌ、、 ＮａＣｔ２ ｇ／ ｔ 、寒天１５９
／ｌ、 ｐ）１７．３ ）に移し５５℃で１夜保存した
。これにヨウ素済液（ｏ、 ’０１’ Ｍ Ｉ、、−Ｋ
Ｉ浴溶液を流入させ、ノ・ローを形成しないコロニーを
選択した。このような変異処理を２回して得たα−アミ
ラーゼ非生産株の１つをＡＮ １７４株と命名した。
バシラス・ステアロサーモフィラスＣＵ２１株を、１０
０ｕｌＬ培地を含む５００耐容量フラスコ中で１夜５５
℃で培養した。遠心集閘後約２０ｒｎｌのＴＥ暖衝液（
１０ｍＭ トリス、１ ｍＭ ＥＤＴＡ ＸＰＨ８，５
）で洗浄し、次いで５ ｍｌの１５％シ！糖−５０ ｍ
Ｍ ）リス（ｐＨ８，５） −５０ｍＭＥＩ）ＴＡ −
Ｉ Ｔｎ９ ／ｖｄｌ リゾチームに懸濁し、水中で
３０分間静置した。これに４３ ｍｌの、２％ザルコシ
ルー５ ｒｒＭ ）リスＣ’ｐ）Ｉ ８．５ 、） −
’ ５０ｍＭＥＤＴＡを添加し、室温で約１５分ＩＪ１
放置して完全に溶菌させた。次に５０４容量フラスコに
ＣｓＣ１を１１．０．９入れ、更に前記溶菌液１２．（
ＭＬ／！を加えた。
０ｕｌＬ培地を含む５００耐容量フラスコ中で１夜５５
℃で培養した。遠心集閘後約２０ｒｎｌのＴＥ暖衝液（
１０ｍＭ トリス、１ ｍＭ ＥＤＴＡ ＸＰＨ８，５
）で洗浄し、次いで５ ｍｌの１５％シ！糖−５０ ｍ
Ｍ ）リス（ｐＨ８，５） −５０ｍＭＥＩ）ＴＡ −
Ｉ Ｔｎ９ ／ｖｄｌ リゾチームに懸濁し、水中で
３０分間静置した。これに４３ ｍｌの、２％ザルコシ
ルー５ ｒｒＭ ）リスＣ’ｐ）Ｉ ８．５ 、） −
’ ５０ｍＭＥＤＴＡを添加し、室温で約１５分ＩＪ１
放置して完全に溶菌させた。次に５０４容量フラスコに
ＣｓＣ１を１１．０．９入れ、更に前記溶菌液１２．（
ＭＬ／！を加えた。
その後１０ ｍ９７ｍ１のエチジウムブロマイド液Ｑ、
５ ｍｌを加えた。この液を２本の遠心管に分注し、
ＲＰ６．５Ｔローター（日立製作所製）で超遠心場で分
１：１ｆ＋ Ｌだ。超遠心終了後、ＤＮＡ区分を注射針
で抜き取り、ｎ−ブタノールで３回抽出を繰シ返してエ
チジウムブロマイドを除去した。このＤＮＡ試料を１０
ｍＭ ）リス（ＰＩ（７，５） −０，１ｍＭＥＤＴ
Ａ中で透析し４℃で保存した。
５ ｍｌを加えた。この液を２本の遠心管に分注し、
ＲＰ６．５Ｔローター（日立製作所製）で超遠心場で分
１：１ｆ＋ Ｌだ。超遠心終了後、ＤＮＡ区分を注射針
で抜き取り、ｎ−ブタノールで３回抽出を繰シ返してエ
チジウムブロマイドを除去した。このＤＮＡ試料を１０
ｍＭ ）リス（ＰＩ（７，５） −０，１ｍＭＥＤＴ
Ａ中で透析し４℃で保存した。
好熱性細菌を宿主として、複製維持できるベクター・プ
ラスミドＩ）ＴＢ９０ （カナマイシン耐性、テトラサ
イクリン耐性） （Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ＋Ｖｏ１．１４９ 、Ａ３ 、 ｐ、８
２４．１９８２年に記載されている）を常法によ、！１
ｌｌＡ製した。このｐＴＢ９０及び別途調製したＣＵ２
１株染色体ＤＮＡを、制限酵素Ｈｉ ｎｄ ｌｌでそれ
ぞれ切断した。反応条件は次の通シであつだ。
ラスミドＩ）ＴＢ９０ （カナマイシン耐性、テトラサ
イクリン耐性） （Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ＋Ｖｏ１．１４９ 、Ａ３ 、 ｐ、８
２４．１９８２年に記載されている）を常法によ、！１
ｌｌＡ製した。このｐＴＢ９０及び別途調製したＣＵ２
１株染色体ＤＮＡを、制限酵素Ｈｉ ｎｄ ｌｌでそれ
ぞれ切断した。反応条件は次の通シであつだ。
Ｈｉｎｄｌ緩衝液（１０ｍＭ ）リス（ｐＨ７，４）
−１０ｍＭＭｇＣＡ −５０ｍＭ ＮａＣｔ−１ｍＭ
ジチオスレイトール）の１０倍濃縮液を使用する。（，
１０ＸＨｉｎｄ ｌ緩衝液）で３７℃で１〜１．５時間
反応させた。
−１０ｍＭＭｇＣＡ −５０ｍＭ ＮａＣｔ−１ｍＭ
ジチオスレイトール）の１０倍濃縮液を使用する。（，
１０ＸＨｉｎｄ ｌ緩衝液）で３７℃で１〜１．５時間
反応させた。
２種類のＤＮＡを混合し、５Ｍ酢酸カリウムをカロえ、
その後エタノールを０．４５ｍＡ！加えて遠心して上澄
を捨てた。沈澱をエタノールで洗って脱水、脱塩し、デ
シケータ−で乾燥した。乾燥物に２×リガーゼ緩衝液（
１３２ｍＭ ）リス（ｐＨ７，６）−１３、２ｒｎＮＬ
ＭｇＣｔｚ） １００ ｌｉｔ １１００ ｒｎＭｉ
ジチオスレイトール２０μＬ 、 ５ ｍＭＡＴＰ ２
０μｔ１水６０μｔをカロえて混合した後、ＤＮＡリガ
ーゼ１μｔを加え、８℃で１６時間保った。これに等量
の２ Ｘ ８ＭＭ緩衝液（０，３３Ｍショ糖、０．０２
Ｍマレイン酸、０，０２ＭＭｇＣｔ２、ＰＨ６，５の２
倍濃箱１液）を加えて、次の形質転換に用いた。
その後エタノールを０．４５ｍＡ！加えて遠心して上澄
を捨てた。沈澱をエタノールで洗って脱水、脱塩し、デ
シケータ−で乾燥した。乾燥物に２×リガーゼ緩衝液（
１３２ｍＭ ）リス（ｐＨ７，６）−１３、２ｒｎＮＬ
ＭｇＣｔｚ） １００ ｌｉｔ １１００ ｒｎＭｉ
ジチオスレイトール２０μＬ 、 ５ ｍＭＡＴＰ ２
０μｔ１水６０μｔをカロえて混合した後、ＤＮＡリガ
ーゼ１μｔを加え、８℃で１６時間保った。これに等量
の２ Ｘ ８ＭＭ緩衝液（０，３３Ｍショ糖、０．０２
Ｍマレイン酸、０，０２ＭＭｇＣｔ２、ＰＨ６，５の２
倍濃箱１液）を加えて、次の形質転換に用いた。
バシラス・ステアロサーモフィラスＡＮ １７４（α−
アミラーゼ非生産株）をＬ培地で１夜５５℃で培養した
。この０．５ ｎＬｌを５ Ｑ ｍ、ｌのＬＧＳ培地（
０，１５Ｍのショ糖を添加したＬＧ培地）を含む３ｏｏ
ｒｎｌ容量のフラスコに移し、５５℃で４時間振盪培養
した。０Ｄ６６ｏが約０，４の時に遠心集菌し、２罰の
ＳＰｉ個−ＬＧ培地（ｓｍｒの組成とＬＧの組成を等量
混合しだ液に溶かしたもの）に懸濁した。リゾチーム（
５０ｔｔｊ；／／ｍｉ ＳＭＭ −Ｉ、 Ｇ ）を終濃
度１ ｔｔｇ／ｖ、ｌになるように加え、４８℃で２０
分間振とうした後遠心分離した。得られた７０ロトグラ
ストを２ ｒｕｇのＳＭＭ −Ｌ Ｇ液にｊ′ｍｌ濁し
た。
アミラーゼ非生産株）をＬ培地で１夜５５℃で培養した
。この０．５ ｎＬｌを５ Ｑ ｍ、ｌのＬＧＳ培地（
０，１５Ｍのショ糖を添加したＬＧ培地）を含む３ｏｏ
ｒｎｌ容量のフラスコに移し、５５℃で４時間振盪培養
した。０Ｄ６６ｏが約０，４の時に遠心集菌し、２罰の
ＳＰｉ個−ＬＧ培地（ｓｍｒの組成とＬＧの組成を等量
混合しだ液に溶かしたもの）に懸濁した。リゾチーム（
５０ｔｔｊ；／／ｍｉ ＳＭＭ −Ｉ、 Ｇ ）を終濃
度１ ｔｔｇ／ｖ、ｌになるように加え、４８℃で２０
分間振とうした後遠心分離した。得られた７０ロトグラ
ストを２ ｒｕｇのＳＭＭ −Ｌ Ｇ液にｊ′ｍｌ濁し
た。
前記（３） ＣＩ ＤＮＡ溶液３００μ７と０．５７ｎ
ｌのノロドプラスト懸濁液を混合し、更に１．５ ｍｌ
のポリエチレングリコール（４０％溶液を８ＭＭ緩衝液
に溶解）を加え、４８℃で２分間処理した。次に５−の
ＳＭＭ −’Ｉ； Ｇ液を加えて一ポリエチレングリコ
ールを希釈して遠心分離した。得られたベレｙ ） 鉤
、０１チの牛血清アルブミンを含むｌ ｍｌのＳＭＭ
−Ｌ ａ液に懸濁し、４８℃で１．５時間おだやかに振
盪した。
ｌのノロドプラスト懸濁液を混合し、更に１．５ ｍｌ
のポリエチレングリコール（４０％溶液を８ＭＭ緩衝液
に溶解）を加え、４８℃で２分間処理した。次に５−の
ＳＭＭ −’Ｉ； Ｇ液を加えて一ポリエチレングリコ
ールを希釈して遠心分離した。得られたベレｙ ） 鉤
、０１チの牛血清アルブミンを含むｌ ｍｌのＳＭＭ
−Ｌ ａ液に懸濁し、４８℃で１．５時間おだやかに振
盪した。
プロトシラスト液０．１ ｍｌをカナマイシン（２５μ
ｇ／ｍｌ ’）を含むＲＧＴＡ （１ｒｎｌ ）と共に
、カナマイシン（２５μｇ／ｍ、ｌ ）を含むＲ，ＧＡ
プレートに重層した。
ｇ／ｍｌ ’）を含むＲＧＴＡ （１ｒｎｌ ）と共に
、カナマイシン（２５μｇ／ｍ、ｌ ）を含むＲ，ＧＡ
プレートに重層した。
このプレートを３〜５日間４８℃に保ち、出現したコロ
ニーをＢＹＳ寒天寒天上地上し、５５℃で１日間保った
。ハローを形成するコロニーを取得した。これの保持す
る組換えプラスミドをｐＡＴ９と命名した。
ニーをＢＹＳ寒天寒天上地上し、５５℃で１日間保った
。ハローを形成するコロニーを取得した。これの保持す
る組換えプラスミドをｐＡＴ９と命名した。
なお、前記ＲＧＴＡ 、 ＲＧＡの組成は次のものであ
る。
る。
ＲＧＡ ： ２．８６チ（チは重量／容量チを示す）の
寒天、１．４３％トＩＪゾトン、ｏ、ｔ１ｉ酵母エキス
、および０．７１％ＮａＣ２を含む溶液７００ｍｌ、２
００ｍ１の１Ｍショ糖からなる溶液、５０１ｎｌのＫＨ
２ＰＯ４（３％）十に２ＨＰＯ４（７％）、２０Ｔｎｌ
のグルコース（ｚ５％）、１０ｍ１の１％カザミノ酸液
、１０ｍ１の２ Ｍ ＭｇＣｌ２．１０ｍ１の牛血清ア
ルブミン（２％）、ＲＧＴＡ ：前記ＲＧＡにおける寒
天を０．８５７％としたもの。
寒天、１．４３％トＩＪゾトン、ｏ、ｔ１ｉ酵母エキス
、および０．７１％ＮａＣ２を含む溶液７００ｍｌ、２
００ｍ１の１Ｍショ糖からなる溶液、５０１ｎｌのＫＨ
２ＰＯ４（３％）十に２ＨＰＯ４（７％）、２０Ｔｎｌ
のグルコース（ｚ５％）、１０ｍ１の１％カザミノ酸液
、１０ｍ１の２ Ｍ ＭｇＣｌ２．１０ｍ１の牛血清ア
ルブミン（２％）、ＲＧＴＡ ：前記ＲＧＡにおける寒
天を０．８５７％としたもの。
（６） 耐熱性α−アミラーゼの調製組換えグラスミ
ドｐＡＴ９を保持するバシラス・ステアロサーモフィラ
スＡＮ １７４（ｐＡＴ９）をＬ培地で５５℃２４時間
培養した。培養液を遠心分離して上澄をとシ、これを４
０ｍ１４リン酸緩衝液（ｐＨ６，０）−１ｍＭ ＣａＣ
ｌ２に対して透析し、粗酵素液としだ。
ドｐＡＴ９を保持するバシラス・ステアロサーモフィラ
スＡＮ １７４（ｐＡＴ９）をＬ培地で５５℃２４時間
培養した。培養液を遠心分離して上澄をとシ、これを４
０ｍ１４リン酸緩衝液（ｐＨ６，０）−１ｍＭ ＣａＣ
ｌ２に対して透析し、粗酵素液としだ。
α−アミラーゼ活性は、可溶性デンプンを基質元
とし、生じる娯ａ糖量をジニトロサリチル酸で定量する
常法（Ｂｅｒｎｆｅｌｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＦＪ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ。
常法（Ｂｅｒｎｆｅｌｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＦＪ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ。
１、 ｐ、 １４９−１５８ 、１９５５年）によシ測
定した。
定した。
その結果は次の通りであった。
なお、活性の１年位は４０℃３分間の反応（酵素ｉｆ
ｌ ｍｌ ）により１ｍりのマルトースに相当する還元
糖を遊離させる酵素量とした。
ｌ ｍｌ ）により１ｍりのマルトースに相当する還元
糖を遊離させる酵素量とした。
バシラス・ステアロサーモフィラスＣＵ２１
３．９ｐ ＡＮ１７４ 検出
できないなお、本α−アミラーゼは６５℃６０分間の熱
処理でも活性は全く低下せず、耐熱性酵素であることが
確認できた。
３．９ｐ ＡＮ１７４ 検出
できないなお、本α−アミラーゼは６５℃６０分間の熱
処理でも活性は全く低下せず、耐熱性酵素であることが
確認できた。
第１図はベクター・プラスミドｐＴＢ９０及び該プラス
ミドを用いて調製した組換えグラスミドｐＡＴ９の制限
酵素地図を示す（図中の太線で示した４、８ＭｄのＨｉ
ｎｄｌ断片に相当する部分は耐熱性α−アミラーゼ遺子
である）。 第２図はベクター・プラスミドｐＴＢ５３及び該シラス
ミドを用いて調製した組換えプラスミドｐＡＴ５の制限
酵素地図を示す（図中の太線部は第１図と同じ意味を表
わす）。 なお、図中Ｈ： Ｈｉｎｄｌ［、Ｅ：ＥｃｏＲｉ、Ｐ：
Ｐｓｔｌ。 Ｂ ： Ｂｇｌ Ｉｔ及びＢａ ：Ｂａｍ Ｈ■をそれ
ぞれ表わす。 特許出願人 三泉オーシャン株式会社第１図 Ｇ、７ Ｍｄ Ａ７９ １１．５Ｍｄ ｉ Ｇ 、 ＯＭｄ 手 続 補 正 舎（自発） 昭和５９年４月π日 特許庁長官 若 杉 和 夫 殿 １ 事件の表示 昭和５８年特許願第７１５００号 ２ 発明の名称 組換えプラスミドによる耐熱性α−アミラーセの新規製
造法 ３ 補正をする者 事件との関係 特許出願人 明細書の「発明の詳細な説明」の榴Ｕ ５ 補正の内容
ミドを用いて調製した組換えグラスミドｐＡＴ９の制限
酵素地図を示す（図中の太線で示した４、８ＭｄのＨｉ
ｎｄｌ断片に相当する部分は耐熱性α−アミラーゼ遺子
である）。 第２図はベクター・プラスミドｐＴＢ５３及び該シラス
ミドを用いて調製した組換えプラスミドｐＡＴ５の制限
酵素地図を示す（図中の太線部は第１図と同じ意味を表
わす）。 なお、図中Ｈ： Ｈｉｎｄｌ［、Ｅ：ＥｃｏＲｉ、Ｐ：
Ｐｓｔｌ。 Ｂ ： Ｂｇｌ Ｉｔ及びＢａ ：Ｂａｍ Ｈ■をそれ
ぞれ表わす。 特許出願人 三泉オーシャン株式会社第１図 Ｇ、７ Ｍｄ Ａ７９ １１．５Ｍｄ ｉ Ｇ 、 ＯＭｄ 手 続 補 正 舎（自発） 昭和５９年４月π日 特許庁長官 若 杉 和 夫 殿 １ 事件の表示 昭和５８年特許願第７１５００号 ２ 発明の名称 組換えプラスミドによる耐熱性α−アミラーセの新規製
造法 ３ 補正をする者 事件との関係 特許出願人 明細書の「発明の詳細な説明」の榴Ｕ ５ 補正の内容
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、 ハシラス属に属し、耐熱性α−アミラーゼを生
産する好熱性細菌の染色体ＤＮＡに由来するものであっ
て、制限酵素Ｈｉｎｄ ｌ処理によって調製されるＤＮ
Ａ断片を有し、かつ、好熱性細菌を宿主として複製維持
できる組換えプラスミド。 ２、ハシラス属に属し、耐熱性α−アミラーゼを生産す
る好熱性細菌がバシラス・ステアロサー↓ モフィラスまたはパシラス・コアギュムスである特許請
求の範囲第１項記載の組換えプラスミド。 ３、制限酵素Ｈｉｎｄ ｌ処理によ）調製されるＤＮＡ
断片が分子ｉｔ約４； ８ Ｍｄであシ、かつ、下記の
制限酵素に対して下記の切断箇所を示す。 すなわち、 （ａ） Ｂａｍ ＨＩは２ケ所であシ、（ｂ） Ｅｃｏ
ＲＩは３ケ所であシ、（ｃ）°Ｐａｔ Ｉは２ケ所で
ある ことを特徴とする特許請求の範囲第１項又は第２項記載
の組換えプラスミド。 ４、ハシラス属に属し、耐熱性α−アミラーゼを生産す
る好熱性細菌の染色体ＤＮＡに由来するものであって、
制限酵素Ｈｉｎｄ ｌ処理によシ調製されるＤＮＡ断片
を有し、かつ、好熱性細菌を宿主として複製維持できる
組換えシラスミドによる形質転換体たるハシラス属に属
する好熱性微生物。 ５、形質転換体たるハシラス属に属する好熱性微生物が
バシラス・ステアロサーモフィラスハ１７４ （ｐＡＴ
９ ）である特許請求の範囲第４項記載の微生物。 ６、 ハシラス属に属し、耐熱性α−アミラーゼを生産
する好熱性細菌の染色体ＤＮＡに由来するものであって
、制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩ処理により調製されるＤＮ
Ａ断片を有し、かつ、好熱性細菌を宿主として複製維持
できる組換えプラスミドによる形質転換体たるパシルス
属に属する好熱性微生物を栄養培地で培養し、該培養物
から耐熱性α−アミラ−ゼを回収・取得することを特徴
とする耐熱性α−アミラーゼの製造法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58071500A JPS59196092A (ja) | 1983-04-25 | 1983-04-25 | 組換えプラスミドによる耐熱性α−アミラ−ゼの新規製造法 |
| DK205084A DK205084A (da) | 1983-04-25 | 1984-04-24 | Fremgangsmaade til fremstilling af rekombinantplasmider, mikroorganismer transformeret ved hjaelp af disse plasmider samt termostabil alfa-amylase |
| EP84104652A EP0124076A3 (en) | 1983-04-25 | 1984-04-25 | Method for preparation of recombinant plasmids, microorganisms transformed by said plasmids and thermo-stable alpha-amylase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58071500A JPS59196092A (ja) | 1983-04-25 | 1983-04-25 | 組換えプラスミドによる耐熱性α−アミラ−ゼの新規製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59196092A true JPS59196092A (ja) | 1984-11-07 |
Family
ID=13462451
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58071500A Pending JPS59196092A (ja) | 1983-04-25 | 1983-04-25 | 組換えプラスミドによる耐熱性α−アミラ−ゼの新規製造法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0124076A3 (ja) |
| JP (1) | JPS59196092A (ja) |
| DK (1) | DK205084A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62181777A (ja) * | 1985-05-20 | 1987-08-10 | アボット ラボラトリ−ス | 遺伝子工学由来の菌株及び組換えプラスミド |
| JP2010536334A (ja) * | 2007-08-13 | 2010-12-02 | ティーエムオー リニューアブルズ リミティド | エタノール生産用好熱性微生物 |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0616711B2 (ja) * | 1985-09-27 | 1994-03-09 | メルシャン株式会社 | 高温で自律増殖するプラスミド |
| GB0511602D0 (en) | 2005-06-07 | 2005-07-13 | Tmo Biotec Ltd | Microorganisms |
| EA017548B1 (ru) | 2006-09-28 | 2013-01-30 | Тмо Реньюаблз Лимитед | Термофильный микроорганизм, модифицированный для повышенной выработки этанола, и способ получения этанола при его использовании |
| GB0820262D0 (en) | 2008-11-05 | 2008-12-10 | Tmo Renewables Ltd | Microorganisms |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57139097A (en) * | 1981-01-15 | 1982-08-27 | Cpc International Inc | Method of cloning gene coding heat-resistant alpha-amylase to colibacillus and bacillus subtilis |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL61982A (en) * | 1980-02-15 | 1984-01-31 | Cpc International Inc | Genetically engineered microorganisms for massive production of amyloytic enzymes and process for preparing same using the corresponding recombinant dnas containing amylase coding genes |
| FI64813C (fi) * | 1980-12-31 | 1984-01-10 | Ilkka Antero Palva | Foerfarande foer producering av ett utvalt aeggviteaemne och vid foerfarandet anvaenda rekombinantplasmidvektorer |
| CA1206108A (en) * | 1981-03-06 | 1986-06-17 | Shuichi Aiba | Process for transforming microorganism by means of plasmid introduction |
| FR2537602B2 (fr) * | 1982-09-24 | 1986-10-24 | Centre Nat Rech Scient | Nouvel adn recombinant perfectionne utile dans la preparation d'a-amylase par bacillus subtilis |
-
1983
- 1983-04-25 JP JP58071500A patent/JPS59196092A/ja active Pending
-
1984
- 1984-04-24 DK DK205084A patent/DK205084A/da not_active Application Discontinuation
- 1984-04-25 EP EP84104652A patent/EP0124076A3/en not_active Withdrawn
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57139097A (en) * | 1981-01-15 | 1982-08-27 | Cpc International Inc | Method of cloning gene coding heat-resistant alpha-amylase to colibacillus and bacillus subtilis |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62181777A (ja) * | 1985-05-20 | 1987-08-10 | アボット ラボラトリ−ス | 遺伝子工学由来の菌株及び組換えプラスミド |
| JP2010536334A (ja) * | 2007-08-13 | 2010-12-02 | ティーエムオー リニューアブルズ リミティド | エタノール生産用好熱性微生物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK205084D0 (da) | 1984-04-24 |
| EP0124076A3 (en) | 1986-06-04 |
| DK205084A (da) | 1984-10-26 |
| EP0124076A2 (en) | 1984-11-07 |
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