JPS61280275A - 耐熱性α−アミラ−ゼの製造法 - Google Patents
耐熱性α−アミラ−ゼの製造法Info
- Publication number
- JPS61280275A JPS61280275A JP12153785A JP12153785A JPS61280275A JP S61280275 A JPS61280275 A JP S61280275A JP 12153785 A JP12153785 A JP 12153785A JP 12153785 A JP12153785 A JP 12153785A JP S61280275 A JPS61280275 A JP S61280275A
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- Japan
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- amylase
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- bacillus subtilis
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- cultured
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、耐熱性α−アミラーゼを製造する方法に関す
るものである。
るものである。
更に詳細には、バチラス・ステアロサーモフィラスの生
産する耐熱性α−アミラーゼをバチルス・ズブチリスに
よって生産せしめる方法に関するものである。
産する耐熱性α−アミラーゼをバチルス・ズブチリスに
よって生産せしめる方法に関するものである。
一般に、バチルス・ズブチリスは物質の菌体外生産性に
すぐれ、遺伝子操作関連菌として古くから使用され、ｉ
た。２を伝子操作菌として実験室での使用がいち早く認
可されたところから、多くの研究がなされ各種有用物質
の生産が試みられてきた。
すぐれ、遺伝子操作関連菌として古くから使用され、ｉ
た。２を伝子操作菌として実験室での使用がいち早く認
可されたところから、多くの研究がなされ各種有用物質
の生産が試みられてきた。
不発明者らは、先に、パテラス・ステアロサーモフィラ
スの耐熱性α−アミラーゼ構造遺伝子をエシェリヒア・
コリ菌体内でクローン化することに成功し、この変異株
を培養したところ、多量の耐熱性α−アミラーゼを生産
させることができた。
スの耐熱性α−アミラーゼ構造遺伝子をエシェリヒア・
コリ菌体内でクローン化することに成功し、この変異株
を培養したところ、多量の耐熱性α−アミラーゼを生産
させることができた。
（特願昭５９−１４８６３４ ）
本発明者らは、耐熱性α−アミラーゼをバチルス・ズブ
チリスに生産させれば生産性が高められるとの発想のも
とに鋭意研究したところ１本発明において、エシェリヒ
ア・コリでクローン化したバチラス・ステアロサーモフ
ィラスの耐熱性α−アミラーゼ構造遺伝子をバチルス・
ズブチリスに移し、耐熱性α−アミラーゼを生産させる
ことに成功したのである。
チリスに生産させれば生産性が高められるとの発想のも
とに鋭意研究したところ１本発明において、エシェリヒ
ア・コリでクローン化したバチラス・ステアロサーモフ
ィラスの耐熱性α−アミラーゼ構造遺伝子をバチルス・
ズブチリスに移し、耐熱性α−アミラーゼを生産させる
ことに成功したのである。
（耐熱性α−アミラーゼ生産性エシェリヒア・コリの創
製） 本発明に用いる耐熱性α−アミラーゼ構造遺伝子がクロ
ーン化されたエシェリヒア・コリは次のようにして創製
することができるが、創製された変異株は、エシェリヒ
ア・コリＣ６００−ｐＴＵＥ１０７の名称でＦＥＢＭ
Ｐ−７６７０として微工研に薔託されている。
製） 本発明に用いる耐熱性α−アミラーゼ構造遺伝子がクロ
ーン化されたエシェリヒア・コリは次のようにして創製
することができるが、創製された変異株は、エシェリヒ
ア・コリＣ６００−ｐＴＵＥ１０７の名称でＦＥＢＭ
Ｐ−７６７０として微工研に薔託されている。
バチラス・ステアロサーモクイ２ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ） Ａ＜５５
１ 、 ＩＡＭ １１００３゜ＡＴＣＣ７９５４は耐熱
性α−アミラーゼを菌体外に分泌する中等度好熱細菌と
して知られている。
ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ） Ａ＜５５
１ 、 ＩＡＭ １１００３゜ＡＴＣＣ７９５４は耐熱
性α−アミラーゼを菌体外に分泌する中等度好熱細菌と
して知られている。
本菌体の培養菌体から染色体ＤＮＡを分離し、これを制
限酵素Ｓａｕ ５ Ａで部分分解し１分解物をショ糖密
度勾配超遠心法によシ約２ｋｂ以上の染色体断片を分離
する。
限酵素Ｓａｕ ５ Ａで部分分解し１分解物をショ糖密
度勾配超遠心法によシ約２ｋｂ以上の染色体断片を分離
する。
別に、市販のプラスミドｐＢＲ３２２（宝酒造社製品）
（第１図）を制限酵素ＢａｍＨＩで切断し。
（第１図）を制限酵素ＢａｍＨＩで切断し。
これに先の染色体断片を混合し、更にＴ４ ＤＮＡリ
ガーゼを添加して、連結処理し、処理液はエシェリヒア
・コ！ＪＣ６００の培養菌体懸濁液に添加され、形質転
換処理〔レーダー ・パーグ・エム及びニス・エヌ・コ
ーエン（Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ、 Ｂ、 Ｍ−ｔａｎｄ
Ｓ、 Ｎ、 Ｃｏｈｅｎ ） （１９７４）：）ヤーナ
ル・バクテリオロジ−（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ）
１１９．１０７２−１０７４）される。
ガーゼを添加して、連結処理し、処理液はエシェリヒア
・コ！ＪＣ６００の培養菌体懸濁液に添加され、形質転
換処理〔レーダー ・パーグ・エム及びニス・エヌ・コ
ーエン（Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ、 Ｂ、 Ｍ−ｔａｎｄ
Ｓ、 Ｎ、 Ｃｏｈｅｎ ） （１９７４）：）ヤーナ
ル・バクテリオロジ−（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ）
１１９．１０７２−１０７４）される。
形質転換株はアンピシリン耐性で、かつ、α−アミラー
ゼを生産する一株を分離し、この菌株を培養し、培養菌
体からプラスミドｐＴＵＥ１０７を得る。プラスミドｐ
ＴＵＢ １０７のフィジカルマツプ（制限酵素切断地図
）はｆＩ、２図に示さｎるが。
ゼを生産する一株を分離し、この菌株を培養し、培養菌
体からプラスミドｐＴＵＥ１０７を得る。プラスミドｐ
ＴＵＢ １０７のフィジカルマツプ（制限酵素切断地図
）はｆＩ、２図に示さｎるが。
白ぬきの部分はベクターｐＢ几６２２由来で、黒点の部
分は染色体断片部分であり、このクローン化された断片
の大きさは約７．６ｋｂである。
分は染色体断片部分であり、このクローン化された断片
の大きさは約７．６ｋｂである。
ここに得られる形質転換体は耐熱性α−アミラーゼを耐
体外によく分泌するすぐれた変異大Ｐｌｈ繭であり、そ
の培養菌体から多盆のプラスミドｐＴＵｇ１０７ｔ−取
得することができる。
体外によく分泌するすぐれた変異大Ｐｌｈ繭であり、そ
の培養菌体から多盆のプラスミドｐＴＵｇ１０７ｔ−取
得することができる。
（耐熱性α−アミ２−ゼ生産性バチルス・ズブチリスの
創製） エシェリヒア・コリＣ６００−ｐＴＵｇ １０７゜ＦＥ
ＲＭ ｐ−７６７０の培養函体からプラスミドｐＴＵＢ
１０７を分離し、８ａｕ３Ａで部分分解する。
創製） エシェリヒア・コリＣ６００−ｐＴＵｇ １０７゜ＦＥ
ＲＭ ｐ−７６７０の培養函体からプラスミドｐＴＵＢ
１０７を分離し、８ａｕ３Ａで部分分解する。
一方、公知の枯草菌ベクターｐＵＢ１１０（ジャーナル
・オプ・バクテリオロジイＶｏ１１５６、Ｎｏ。
・オプ・バクテリオロジイＶｏ１１５６、Ｎｏ。
１ ３２７−５５７頁）をＢａｍＨＩで切れ目を入れ。
再結合を防止するためにＢＡ Ｐａ５ｅ （バクチリア
ルアルカリホスファターゼ）で処理し、これとプラスミ
ドｐＴＵＦｉ １０７の８ａｕ ３ Ａによる部分分解
物とを゛ＤＮＡリガーゼで連結処理し、この処理液をバ
チルス・ズブチリス２０７−２５株（ジャーナル・オブ
・バクテリオロジイＭｏｌ １５６． Ｎｏ、 １６
２７−３５７頁）の培養菌体懸濁液に添加し。
ルアルカリホスファターゼ）で処理し、これとプラスミ
ドｐＴＵＦｉ １０７の８ａｕ ３ Ａによる部分分解
物とを゛ＤＮＡリガーゼで連結処理し、この処理液をバ
チルス・ズブチリス２０７−２５株（ジャーナル・オブ
・バクテリオロジイＭｏｌ １５６． Ｎｏ、 １６
２７−３５７頁）の培養菌体懸濁液に添加し。
形質転換処理される。
形質転換株はカナマイシン耐性で、かつ、α−アミラー
ゼを生殖する菌株、バチルス・ズブチリスｐＴＵＢ６０
７を分離し、この菌株を培養し、培養菌体からプラスミ
ドｐＴＵＢ ６０７ （第６図）を得る。
ゼを生殖する菌株、バチルス・ズブチリスｐＴＵＢ６０
７を分離し、この菌株を培養し、培養菌体からプラスミ
ドｐＴＵＢ ６０７ （第６図）を得る。
このプラスミドｐＴＵＢ６０７をＨｍｆ Ｉで切断する
ことによって、バチラス・ステアロナーモフイラスＡ６
３１由来のα−アミラーゼ遺伝子、即ちα−アミラーゼ
遺伝子のプロモーターを含まない断片を得る。次いでＢ
ａ１３１で両末端部よシけずシ、この断片にＨｉｎｄ
Ｉ ！Ｊンカーを結合した後、枯草菌分泌ベクターｐＴ
ＵＢ ２８５（ジーン斌跣（Ａ１東１９すをＨｉｎｄｕ
で切断することによりβ−ラクタマーゼ部分を切シ出し
た残りのベクタ一部分、即ちｐＴＵＢ２８５のプロモー
ター、ＳＤ配列、シグナル領域の下流に相当する部分に
ＤＮＡ！Ｊガーゼによって結合、挿入する。
ことによって、バチラス・ステアロナーモフイラスＡ６
３１由来のα−アミラーゼ遺伝子、即ちα−アミラーゼ
遺伝子のプロモーターを含まない断片を得る。次いでＢ
ａ１３１で両末端部よシけずシ、この断片にＨｉｎｄ
Ｉ ！Ｊンカーを結合した後、枯草菌分泌ベクターｐＴ
ＵＢ ２８５（ジーン斌跣（Ａ１東１９すをＨｉｎｄｕ
で切断することによりβ−ラクタマーゼ部分を切シ出し
た残りのベクタ一部分、即ちｐＴＵＢ２８５のプロモー
ター、ＳＤ配列、シグナル領域の下流に相当する部分に
ＤＮＡ！Ｊガーゼによって結合、挿入する。
得られる組換えプラスミドをバチルス・ズブチリス２０
７−２５株にプロドブ２スト形質転換法によって導入す
る。
７−２５株にプロドブ２スト形質転換法によって導入す
る。
形質転換株はカナマイクン耐性で、かつ、α−アミラー
ゼを生産する菌株を分離し、この一株を培養し、培養菌
体からプラスミドｐＴＵＢ６１０（第４図）を得る。
ゼを生産する菌株を分離し、この一株を培養し、培養菌
体からプラスミドｐＴＵＢ６１０（第４図）を得る。
このプラスミドｐＴＵＢ ６１０を再びバチルス・ズブ
チリス２０７−２５株にプロトプラスト形質転換株で導
入する。
チリス２０７−２５株にプロトプラスト形質転換株で導
入する。
形質転換株はカナマイシンＩｎで、がっ、α−アミラー
ゼを生産する菌株、バチルス・ズブチリスｐＴＵＢ ６
１０を分離する。
ゼを生産する菌株、バチルス・ズブチリスｐＴＵＢ ６
１０を分離する。
バチルス・ズブチリスｐＴＵＢ ６１０を３７℃で４８
時間培養し、その上清のα−アミラーゼの熱安定性を測
定した結果、エシェリヒア・コリＣ６００−ｐＴＵＥ
１０７、ＦＥ几Ｍ Ｐ−７６７０の生産したα−アミラ
ーゼと同様の耐熱性を有していた。
時間培養し、その上清のα−アミラーゼの熱安定性を測
定した結果、エシェリヒア・コリＣ６００−ｐＴＵＥ
１０７、ＦＥ几Ｍ Ｐ−７６７０の生産したα−アミラ
ーゼと同様の耐熱性を有していた。
また、バチルス・ズブチリスｐＴＵＢ ６１．０のＬＧ
−プロス（カナマイシン５０μ！！／Ｍｌ含有）での２
４時間培養後の上清のα−アミラーゼ活性は６０Ｕ／ｄ
に過ぎなかったが、バチルス・ズブチリスｐＴＵＢ６０
７の同じ培養の上清のα−アミラーゼ活性の２〜３倍で
あった。
−プロス（カナマイシン５０μ！！／Ｍｌ含有）での２
４時間培養後の上清のα−アミラーゼ活性は６０Ｕ／ｄ
に過ぎなかったが、バチルス・ズブチリスｐＴＵＢ６０
７の同じ培養の上清のα−アミラーゼ活性の２〜３倍で
あった。
本発明においては、耐熱性α−アミラーセ生産性バチル
ス・ズブチリスが液体培養される。培地トシては、バチ
ルス・ズブチリスの培養に用いられるものであればいず
れでもよいが、炭素源としては澱粉、液化澱粉、グルコ
ース、グリセリン。
ス・ズブチリスが液体培養される。培地トシては、バチ
ルス・ズブチリスの培養に用いられるものであればいず
れでもよいが、炭素源としては澱粉、液化澱粉、グルコ
ース、グリセリン。
糖蜜、溌糖蜜などがあシ、窒素源としては各種蛋白分解
物、大豆粉、肉エキス、にプトン、尿素。
物、大豆粉、肉エキス、にプトン、尿素。
硝ｆｔ塩、アンモニウム塩、ａｍエキス、コーンステイ
ープリカーなどがあり、その他ビオチンなどの栄養素や
微量金属などが適宜使用される。
ープリカーなどがあり、その他ビオチンなどの栄養素や
微量金属などが適宜使用される。
培養は６７〜４５℃で通気撹拌によって行われる。２０
〜６０時間の培養によって培地中の耐熱性α−アミラー
ゼは最大蓄積ｔｔ−示すので、培養を止め、培養液を遠
心分離して菌体を除去する。
〜６０時間の培養によって培地中の耐熱性α−アミラー
ゼは最大蓄積ｔｔ−示すので、培養を止め、培養液を遠
心分離して菌体を除去する。
得られた培ｌＩＰ液は、塩析、透析、イオン交換樹脂処
理、クロマトグラフ処理、アフイニティクロマトグラフ
処理等一般的酵素精製法によシ耐熱性α−アミラーゼを
単離することができる。
理、クロマトグラフ処理、アフイニティクロマトグラフ
処理等一般的酵素精製法によシ耐熱性α−アミラーゼを
単離することができる。
本発明によって得られる耐熱性α−アミラーゼはバチラ
ス・ステアロサーモフィラスの生産する耐熱性α゛−ア
ミラーゼ同じであり、澱粉の高温液化に用いるのに適し
ている。
ス・ステアロサーモフィラスの生産する耐熱性α゛−ア
ミラーゼ同じであり、澱粉の高温液化に用いるのに適し
ている。
次ｅζ本発明の実施例及び製造例を示す。
創製例１．変異太＃＃ｉの創製
バチラス・ステアロサーモフィラスＡ６３１゜ＩＡＭ
１１００３ 、 ＡＴＣＣ７９５４をＬＧ培地（バクト
ドリブトン１０１．酵母エキス５Ｊｉｒ、 ＮａＣＡ’
５ｇグルコース２ｇを水１１の水に溶解し−７，５に
、、ｉ４督〕で６０℃で−＆、冶盪し、遠心分離にて集
画。
１１００３ 、 ＡＴＣＣ７９５４をＬＧ培地（バクト
ドリブトン１０１．酵母エキス５Ｊｉｒ、 ＮａＣＡ’
５ｇグルコース２ｇを水１１の水に溶解し−７，５に
、、ｉ４督〕で６０℃で−＆、冶盪し、遠心分離にて集
画。
況伊し、得られた菌体からサイト−、ミヮラの方法（（
１９６４）バイオヒム・パイオフィス・アクタ（Ｂｉｏ
ｃｈｆｍ、 Ｂｉｏｐｙｓ、 Ａｃｔａ ）、 ７２
ｐ ６１９−６２９〕によって染色体ＤＮＡを分離し、
これをトリス塩酸・ｇ Ｄ Ｔ Ａｒｉ衝液に？？！解
し１皿ｊ限酵素８ａｕ ５ Ａ （宝酒造社製品＞ｔ？
添加し、６７℃で分解し１分解物をショ糖ｖＭ度勾配超
遠心法で約２ｋｂ以上の染色体断片を分離、取得した。
１９６４）バイオヒム・パイオフィス・アクタ（Ｂｉｏ
ｃｈｆｍ、 Ｂｉｏｐｙｓ、 Ａｃｔａ ）、 ７２
ｐ ６１９−６２９〕によって染色体ＤＮＡを分離し、
これをトリス塩酸・ｇ Ｄ Ｔ Ａｒｉ衝液に？？！解
し１皿ｊ限酵素８ａｕ ５ Ａ （宝酒造社製品＞ｔ？
添加し、６７℃で分解し１分解物をショ糖ｖＭ度勾配超
遠心法で約２ｋｂ以上の染色体断片を分離、取得した。
ｒ５販のプラスミドｐＢＲ５２２（宝酒造社製品）の概
略開裂地図は第１図に示されたが、このプラスミドｐＢ
ＦＬ３２２は４．４ｋｂで、アンピシリン何丁性（Ａｍ
ｐｒ）とテトラサイクリン針柱（Ｔｃ’ ）を有し、制
限＠ ＸＢａｍ ＨＩによって１ケ所切断されるもので
ある。
略開裂地図は第１図に示されたが、このプラスミドｐＢ
ＦＬ３２２は４．４ｋｂで、アンピシリン何丁性（Ａｍ
ｐｒ）とテトラサイクリン針柱（Ｔｃ’ ）を有し、制
限＠ ＸＢａｍ ＨＩによって１ケ所切断されるもので
ある。
Ｂａｍ ＨＩで１ケ所切断したｐＢ）Ｌ ５２２と前記
のバチラス・ステアロサーモフィラス人６６１から得た
約２ｋｂ以上の染色体断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを添カロして連結処理した。〔クイズ・ビー、サブロ
ン・ニー・シー、ライブ、ファサード、ジー・シー・リ
チャードソン・シー・シー（Ｗｅｉｓｓ＊肌＊ ８ａｂ
ｌｏｎ＋ Ａ、 Ｊ、、 Ｌｉｖｅ、 Ｔ、 Ｒ，。
のバチラス・ステアロサーモフィラス人６６１から得た
約２ｋｂ以上の染色体断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを添カロして連結処理した。〔クイズ・ビー、サブロ
ン・ニー・シー、ライブ、ファサード、ジー・シー・リ
チャードソン・シー・シー（Ｗｅｉｓｓ＊肌＊ ８ａｂ
ｌｏｎ＋ Ａ、 Ｊ、、 Ｌｉｖｅ、 Ｔ、 Ｒ，。
Ｆａｒｅｅｄ、 ｏ、 ｃ、 Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、
ｃ、 ｃ、 ） （１９６８）ジャーナル・オプ・バ
イオロジカル・ケミストリー （Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈ
ｅｍ ） ２４６．４５４３−４５５５）処理液は、エ
シェリヒア・コリＣ６００の菌体ｍ濁液に添加され、カ
ルシウム・低温処理法（レーダーバーク、イー・エム及
ヒエス・エヌ・コーエン（Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ、 Ｅ、
Ｍ−＋ ａｎｄ Ｓ、 Ｎ、 Ｃｏｈｅｎ ） （１
９７４）ジャーナル・バクテリオロジー（Ｊ、 Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ ）１１９．１０７２−１０７４）によシ
当該プラスミドは導入された。
ｃ、 ｃ、 ） （１９６８）ジャーナル・オプ・バ
イオロジカル・ケミストリー （Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈ
ｅｍ ） ２４６．４５４３−４５５５）処理液は、エ
シェリヒア・コリＣ６００の菌体ｍ濁液に添加され、カ
ルシウム・低温処理法（レーダーバーク、イー・エム及
ヒエス・エヌ・コーエン（Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ、 Ｅ、
Ｍ−＋ ａｎｄ Ｓ、 Ｎ、 Ｃｏｈｅｎ ） （１
９７４）ジャーナル・バクテリオロジー（Ｊ、 Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ ）１１９．１０７２−１０７４）によシ
当該プラスミドは導入された。
得られた形質転換処理菌体を選択培地である可溶性澱粉
１％、アンピシリン５０μ＆／ＩＩＬ１． 寒天１．
５％を含むＬ培地（バクトドリプトン１０ｇ。
１％、アンピシリン５０μ＆／ＩＩＬ１． 寒天１．
５％を含むＬ培地（バクトドリプトン１０ｇ。
酵母エキス５ｇ、ＮａＣ１Ｓ ｊｉを１）の水に溶解し
ｐＨ７，５に調整）に添加して、６７℃で培養し、出現
したアンピシリン耐性株にヨウ素液を噴霧して、ヨウ素
反応を起さなかった菌株をα−アミラーゼ分泌株として
分離することができた。
ｐＨ７，５に調整）に添加して、６７℃で培養し、出現
したアンピシリン耐性株にヨウ素液を噴霧して、ヨウ素
反応を起さなかった菌株をα−アミラーゼ分泌株として
分離することができた。
得られたα−アミラーゼ生産菌株を単離し、これをアン
ピシリン１００μ＆／ＩＬＩを含むＬ培地で６７℃で一
夜ｍ誉し、培養欣を遠心分離して集凶し。
ピシリン１００μ＆／ＩＬＩを含むＬ培地で６７℃で一
夜ｍ誉し、培養欣を遠心分離して集凶し。
洗浄後１分離菌体からアルカリ抽出法〔ビルンボイム・
エッチ・シー及びジエイ・ドーリイ（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ
＋ Ｈ，Ｃ，ａｎｄ Ｊ、 Ｄｏｌｙ ） （１９７９
）ヌクレイツク・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ Ｒｅｓ、 ） ７ 、１５１６）によってプ
ラスミドを分離し、探索し、紺規なプラスミドを得た。
エッチ・シー及びジエイ・ドーリイ（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ
＋ Ｈ，Ｃ，ａｎｄ Ｊ、 Ｄｏｌｙ ） （１９７９
）ヌクレイツク・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ Ｒｅｓ、 ） ７ 、１５１６）によってプ
ラスミドを分離し、探索し、紺規なプラスミドを得た。
このプラスミドをプラスミドｐＴＵＥ １０７と名ずけ
た。
た。
プラスミドｐＴＵｇ １０７は１２．Ｏｋｂの大きさで
、そのフィジカルマツプ（制限酵素切断地図）は第２図
に示される。ここで白ぬきの部分はベクターｐＢＲ３２
２由来で、黒点の部分は染色体断片部分であシ、各略記
号はすべて制限＃素である。
、そのフィジカルマツプ（制限酵素切断地図）は第２図
に示される。ここで白ぬきの部分はベクターｐＢＲ３２
２由来で、黒点の部分は染色体断片部分であシ、各略記
号はすべて制限＃素である。
このプラスミドｐ’ｒＵＦｆ １０７をｊ！Ｐでラベル
し、バチラス・ステアロサーモフィラスＡ６６１株染色
体ＤＮＡ、エシェリヒア・コリＣ６００株染色体ＤＮ人
およびα−アミラーゼ高生産株バチラス・ズブチリス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ） Ｎ Ａ ６
４染色体ＤＮＡのそれぞれのＢｃｏ ＲＩ分解とサザン
ハイプリタイゼーション〔サザン・ニー・エム（５ｏｕ
ｔｈｅｒｎ、 Ｅ、 Ｍ。）（１９７５）ジャーナル・
オプ・モレキュラー・バイオロジイ（Ｊ、 Ｍｏｌ。
し、バチラス・ステアロサーモフィラスＡ６６１株染色
体ＤＮＡ、エシェリヒア・コリＣ６００株染色体ＤＮ人
およびα−アミラーゼ高生産株バチラス・ズブチリス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ） Ｎ Ａ ６
４染色体ＤＮＡのそれぞれのＢｃｏ ＲＩ分解とサザン
ハイプリタイゼーション〔サザン・ニー・エム（５ｏｕ
ｔｈｅｒｎ、 Ｅ、 Ｍ。）（１９７５）ジャーナル・
オプ・モレキュラー・バイオロジイ（Ｊ、 Ｍｏｌ。
Ｂｉｏｌ、 ）ｔ ９８．５０３−５１７ 、）を行っ
たところ、エシェリヒア・コリ、バチラス・ズブチリス
染色体ＤＮＡとは全くハイプリダイスしなかったがバチ
ラス・ステアロサーモフィラスＡ６６１株の染色体ＤＮ
Ａとは６ケ所で特異的にハイブリダイズしておシ、クロ
ーン化した遺伝子はバチラス・ステアロサーモフィラス
Ａ６３１由来であることが確かめられた。
たところ、エシェリヒア・コリ、バチラス・ズブチリス
染色体ＤＮＡとは全くハイプリダイスしなかったがバチ
ラス・ステアロサーモフィラスＡ６６１株の染色体ＤＮ
Ａとは６ケ所で特異的にハイブリダイズしておシ、クロ
ーン化した遺伝子はバチラス・ステアロサーモフィラス
Ａ６３１由来であることが確かめられた。
更に得られたプラスミドｐ’ｒｔｒｇ １０７をエシェ
リヒア・コリＣ６００の菌体懸濁液に添加しカルシウム
低温処理法によシ菌体内に導入した。
リヒア・コリＣ６００の菌体懸濁液に添加しカルシウム
低温処理法によシ菌体内に導入した。
ここに得られた形質転換体を上述の選別培地に添加し、
６７℃で培養し、生育した菌株からα−アミラーゼカ価
の高い菌株を選別し、エシェリヒア・コリＣ６００−ｐ
ＴＵＥ１０７．ＦＩ３几Ｍ Ｐ−７６７０を得た。
６７℃で培養し、生育した菌株からα−アミラーゼカ価
の高い菌株を選別し、エシェリヒア・コリＣ６００−ｐ
ＴＵＥ１０７．ＦＩ３几Ｍ Ｐ−７６７０を得た。
Ｊｌｊｊ製例２．耐熱性α−アミラーゼを生産するバチ
ルス・ズブチリスの創製 創製例１で得たエシェリヒア・コリＣ６００−ｐＴＵＥ
１０７ 、 ＦＩＲＭ Ｐ−７６７０をＬ培地（バク
トドリブトン１０ｉ／ｌ、酵母工牛ス５ｆｌ／ＩＮａＣ
ｊ！ ５１１ ／ ｌ、アンピシリン１００ ｐｇ／
ｍ、ｐａ７〜７．５ ）で３７℃で、１夜培養し、集匿
し、洗浄し、得られた固体からアルカリ抽出法によって
プラスミドｐＴＵＥ １０７を取得し、５ａｕ５ｋによ
って第２図の部分分解物を取得した。
ルス・ズブチリスの創製 創製例１で得たエシェリヒア・コリＣ６００−ｐＴＵＥ
１０７ 、 ＦＩＲＭ Ｐ−７６７０をＬ培地（バク
トドリブトン１０ｉ／ｌ、酵母工牛ス５ｆｌ／ＩＮａＣ
ｊ！ ５１１ ／ ｌ、アンピシリン１００ ｐｇ／
ｍ、ｐａ７〜７．５ ）で３７℃で、１夜培養し、集匿
し、洗浄し、得られた固体からアルカリ抽出法によって
プラスミドｐＴＵＥ １０７を取得し、５ａｕ５ｋによ
って第２図の部分分解物を取得した。
別に、プラスミドｐＵＢ１１０をＩ３ａｍＨＩで切れ目
を入れ、同じプラスミドでの再結合を防止するためにＢ
ＡＰａｓｅで処理した。
を入れ、同じプラスミドでの再結合を防止するためにＢ
ＡＰａｓｅで処理した。
ＢａｍＨＩで１ケ所切断したｐＵＢｌｌｏと前記のプラ
スミドｐ’ｒｔｒｇ １０７から得たＳａｕ ５ Ａ部
分分解物を混合し、ＴＡＤＮ人リガーゼを添加して述結
処理した。
スミドｐ’ｒｔｒｇ １０７から得たＳａｕ ５ Ａ部
分分解物を混合し、ＴＡＤＮ人リガーゼを添加して述結
処理した。
処理液はバチルス・ズブチリス２０７−２５株培養菌体
のプロトプラスト懸濁液に添加し、プロトプラスト形質
転換法によりｍ体内に導入した。
のプロトプラスト懸濁液に添加し、プロトプラスト形質
転換法によりｍ体内に導入した。
プラスミド導入菌体は、８ＭＭＰ培地〔ベナセイ肉汁の
４倍稀釈液と８ＭＭ緩衝液（０，５モルシュークロース
、０．０２Ｍマレイン酸、０．０２ＭＭｇＣ７，、…６
．５）の２倍稀釈液を等量混合〕で遠心洗浄後再度ＳＭ
ＭＰ培地に静かに懸濁し、静かに混合しながら３０℃で
１．５〜ｚＯ時間培養した。
４倍稀釈液と８ＭＭ緩衝液（０，５モルシュークロース
、０．０２Ｍマレイン酸、０．０２ＭＭｇＣ７，、…６
．５）の２倍稀釈液を等量混合〕で遠心洗浄後再度ＳＭ
ＭＰ培地に静かに懸濁し、静かに混合しながら３０℃で
１．５〜ｚＯ時間培養した。
その後、カナマイシン１５０μｍ７／ｍｌ含む再生培地
（５％寒天溶液 ２００＋１１１．ＩＭコハク酸ナナト
リウム溶液５００ｄ５％カザミノ酸溶液１００ゴ。
（５％寒天溶液 ２００＋１１１．ＩＭコハク酸ナナト
リウム溶液５００ｄ５％カザミノ酸溶液１００ゴ。
２０チグルコース溶液２５２１１／、１．５ ％ ！Ｊ
ン酸−カリウム、３．５％リン酸二カリウムを含む溶液
１０゜ｄ、１０％酵母ニー１１− ス溶液５０ ｍ／、
１ Ｍ ＭｇＣ１ｔ溶液２０＋ｄ、２％牛血虜アルブ
ミン溶液２０ｄ。
ン酸−カリウム、３．５％リン酸二カリウムを含む溶液
１０゜ｄ、１０％酵母ニー１１− ス溶液５０ ｍ／、
１ Ｍ ＭｇＣ１ｔ溶液２０＋ｄ、２％牛血虜アルブ
ミン溶液２０ｄ。
カナマイシン１５０１１１ｐ）にプレートし、カナマイ
シン耐性株を分離した。さらにこのカナマイシン耐性株
を可溶性澱粉１チ含有のＬＧ培地にプレートしα−アミ
２−ゼ産生株を選択した。この困をバチラス・ズブチリ
スｐＴＵＢ ６０７とした。
シン耐性株を分離した。さらにこのカナマイシン耐性株
を可溶性澱粉１チ含有のＬＧ培地にプレートしα−アミ
２−ゼ産生株を選択した。この困をバチラス・ズブチリ
スｐＴＵＢ ６０７とした。
形質転換株はカナマイシン耐桂で、かつ、α−アミラー
・ゼを生産する菌株、バチルス・ズブチリスｐＴＵＢ６
０７を分離し、この菌株を培養し、培養菌体からプラス
ミドｐＴＵＢ６０７（第３図）を得る。
・ゼを生産する菌株、バチルス・ズブチリスｐＴＵＢ６
０７を分離し、この菌株を培養し、培養菌体からプラス
ミドｐＴＵＢ６０７（第３図）を得る。
このプラスミドｐＴＵＢ６０７をＨｍｆｉで切断するこ
とによって、バチラス・ステアロサーモフィラスＡ ６
３１’由来のα−アミラーゼ遺伝子、即ちα−アミラー
ゼ遺伝子のプロモーターを含まない断片を得る。次いで
Ｂａｔ ３１で両末端部よりけすることによりβ−ラク
タマーゼ部分を切り出した残りのベクタ一部分、即ちｐ
ＴＵＢ２８５のプロモーター、ＳＤ配列、シグナル領域
の下流に相当する部分にＤ Ｎ Ａ ＩＪガーゼによっ
て結合、挿入する。
とによって、バチラス・ステアロサーモフィラスＡ ６
３１’由来のα−アミラーゼ遺伝子、即ちα−アミラー
ゼ遺伝子のプロモーターを含まない断片を得る。次いで
Ｂａｔ ３１で両末端部よりけすることによりβ−ラク
タマーゼ部分を切り出した残りのベクタ一部分、即ちｐ
ＴＵＢ２８５のプロモーター、ＳＤ配列、シグナル領域
の下流に相当する部分にＤ Ｎ Ａ ＩＪガーゼによっ
て結合、挿入する。
得られる組換えプラスミドをバチルス・ズブチリス２０
７−２５株にプロトプラスト形質転換法によって導入す
る。
７−２５株にプロトプラスト形質転換法によって導入す
る。
形質転換株はカナマイシン耐性で、かつ、α−アミラー
ゼを生産する菌株を分離し、この菌株を培養し、培養菌
体からプラスミドｐＴＵＢ６１０（第４図）を得る。
ゼを生産する菌株を分離し、この菌株を培養し、培養菌
体からプラスミドｐＴＵＢ６１０（第４図）を得る。
このプラスミドｐＴＵＢ６１０を再びバチルス・ズブチ
リス２０７−２５株にプロト７ラスト形質転換法で導入
する。
リス２０７−２５株にプロト７ラスト形質転換法で導入
する。
形質転換株はカナマイシン耐性で、かつ、α−アミラー
ゼを生産する菌株、バチルス・ズブチリスｐＴＵＢ＜５
１０を分離する。
ゼを生産する菌株、バチルス・ズブチリスｐＴＵＢ＜５
１０を分離する。
実施例
ＬＧ＠地の組成 バクトドリプトン １０ｉ／１酵母
エヤス ５９／１３ ＮａＣ１５１１／ｉ グルコース ２７７／１ カナマイシン １０μ＆／Ｍｌ ｌＪｔｌ ７〜７．５バチルス・
ズブチリスｐＴＵＢ ６１０を上記培地１００μを入れ
た５ＯＯ＝坂ロフラスコに接極し。
エヤス ５９／１３ ＮａＣ１５１１／ｉ グルコース ２７７／１ カナマイシン １０μ＆／Ｍｌ ｌＪｔｌ ７〜７．５バチルス・
ズブチリスｐＴＵＢ ６１０を上記培地１００μを入れ
た５ＯＯ＝坂ロフラスコに接極し。
３７℃で一夜振盪培養し、種培養液を得た。
前記と同じ組成の培地２０１を入れたジャーファーメン
タ−に也培養液２０ ｏＩＬｉを暉カロし、６７℃で４
８時間通気戊拌培賃した。
タ−に也培養液２０ ｏＩＬｉを暉カロし、６７℃で４
８時間通気戊拌培賃した。
得られた培養液を遠心分離することによシ菌体を除き培
養Ｆ液１９Ｊを得た。
養Ｆ液１９Ｊを得た。
この培養Ｐ液１９ＡＫ懺安１２にｇ添加することによシ
塩析し沈澱とした。さらに、この沈設物を遠心分離する
ことにより集め約１ノの水に溶解し不溶物を除きアノモ
ニア水で−ＺＯとした後珪線土を加えて濾過した。この
Ｆ液を透析チューブに入れ１．０ｘ１０−ｔモルのトリ
ス・塩酸緩衝液（陣７５）に対し常温で透析した。
塩析し沈澱とした。さらに、この沈設物を遠心分離する
ことにより集め約１ノの水に溶解し不溶物を除きアノモ
ニア水で−ＺＯとした後珪線土を加えて濾過した。この
Ｆ液を透析チューブに入れ１．０ｘ１０−ｔモルのトリ
ス・塩酸緩衝液（陣７５）に対し常温で透析した。
さらに透析内液全０．１モル塩化カリウムを含む１．０
ｘ１０”−２モルのトリス・塩酸緩衝１（ｐＨ７，５）
で平衡化したＤＥＡＲ−セファロースに接触させ透析内
液に含まれる酵素蛋白質を吸著させた。そして、同一緩
衝液で一回洗浄後０．１〜０．５モル間の濃度勾配を直
線になるように設定した塩化カリウムを含む１．０Ｘ１
０−２モルのトリス・塩酸緩衝液（≠７．５ ）をＤｇ
ＡＥ−セファロースに流し吸層した酵素蛋白質を溶出し
た。
ｘ１０”−２モルのトリス・塩酸緩衝１（ｐＨ７，５）
で平衡化したＤＥＡＲ−セファロースに接触させ透析内
液に含まれる酵素蛋白質を吸著させた。そして、同一緩
衝液で一回洗浄後０．１〜０．５モル間の濃度勾配を直
線になるように設定した塩化カリウムを含む１．０Ｘ１
０−２モルのトリス・塩酸緩衝液（≠７．５ ）をＤｇ
ＡＥ−セファロースに流し吸層した酵素蛋白質を溶出し
た。
この溶出液からα−アミラーゼ活性のある画分を集め凍
結乾燥することによシ約９．Ｉの耐熱性α−アミラーゼ
徂酵素標品を得た。
結乾燥することによシ約９．Ｉの耐熱性α−アミラーゼ
徂酵素標品を得た。
第１図はプラスミドｐＢａ ３２２の制限酵素切断地図
を示し、第２図はプラスミドｐＴＵＢ １０７の制限酵
素切断地図を示し、第３図はプラスミドｐＴＵＢ６０７
の制限酵素切断地図を示し、第４図はプラスミドｐＴＵ
Ｂ ６１０の制限酵素切断地図を示す。
を示し、第２図はプラスミドｐＴＵＢ １０７の制限酵
素切断地図を示し、第３図はプラスミドｐＴＵＢ６０７
の制限酵素切断地図を示し、第４図はプラスミドｐＴＵ
Ｂ ６１０の制限酵素切断地図を示す。
Claims (1)
- 耐熱性α−アミラーゼを生産するバチルス・ズブチリス
を培養し、培養物から耐熱性α−アミラーゼを採取する
ことを特徴とする耐熱性α−アミラーゼの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12153785A JPS61280275A (ja) | 1985-06-06 | 1985-06-06 | 耐熱性α−アミラ−ゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12153785A JPS61280275A (ja) | 1985-06-06 | 1985-06-06 | 耐熱性α−アミラ−ゼの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61280275A true JPS61280275A (ja) | 1986-12-10 |
Family
ID=14813697
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12153785A Pending JPS61280275A (ja) | 1985-06-06 | 1985-06-06 | 耐熱性α−アミラ−ゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61280275A (ja) |
-
1985
- 1985-06-06 JP JP12153785A patent/JPS61280275A/ja active Pending
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