JP2587764B2 - Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの製造法 - Google Patents
Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの製造法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、エシエリヒア属に属す
るＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ生産菌由来のＮ
−アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子を含む染色体
ＤＮＡ断片を組込んでなる新しい組換えプラスミドを導
入して形質転換した微生物よりＮ−アシルノイラミン酸
アルドラーゼを製造する方法に関する。
るＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ生産菌由来のＮ
−アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子を含む染色体
ＤＮＡ断片を組込んでなる新しい組換えプラスミドを導
入して形質転換した微生物よりＮ−アシルノイラミン酸
アルドラーゼを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ
（Ｎ−acylneuraminate aldolase）は、別名シアル酸ア
ルジラーゼとも呼ばれ、国際生化学連合酵素委員会の酵
素番号Ｅ．Ｃ．４．１．３．３．に分類され、系統名で
はＮ−アシルノイラミン酸：ピリビン酸リアーゼ（Ｎ−
acylneuraminate ：pyruvate lyase）と呼ばれている酵
素である。本酵素は下記の反応式に示す如く、シアル酸
（Ｎ−アシルノイラミン酸）の分解及び合成反応を触媒
する酵素である。
（Ｎ−acylneuraminate aldolase）は、別名シアル酸ア
ルジラーゼとも呼ばれ、国際生化学連合酵素委員会の酵
素番号Ｅ．Ｃ．４．１．３．３．に分類され、系統名で
はＮ−アシルノイラミン酸：ピリビン酸リアーゼ（Ｎ−
acylneuraminate ：pyruvate lyase）と呼ばれている酵
素である。本酵素は下記の反応式に示す如く、シアル酸
（Ｎ−アシルノイラミン酸）の分解及び合成反応を触媒
する酵素である。
【０００３】シアル酸＝Ｎ−アシルマンノサミン＋ピル
ビン酸 本発明者らは、先にエシエリヒア属、その他の数種の属
に属する公知菌を、シアル酸の存在下に培養する時に
は、上記Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼが工業的
規模で容易に製造できることを見出し、該酵素の製造技
術を確立した（特公昭５６−５４１５３号、特許第１１
１１３４６号）。しかるに上記確立された方法では、培
地へのシアル酸の添加が必須であり、このシアル酸自体
その調製に繁雑な操作等を要し且つ高価なものである不
利があった。しかもこのシアル酸添加を行なわない限
り、Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼは生産されな
いかあるいは極微量生産されるのみで、到底工業的実施
はできないものであった。即ち上記方法に利用される微
生物は、それ自体シアル酸の不存在下ではＮ−アシルノ
イラミン酸生産能を実質的に発現できないものであっ
た。
ビン酸 本発明者らは、先にエシエリヒア属、その他の数種の属
に属する公知菌を、シアル酸の存在下に培養する時に
は、上記Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼが工業的
規模で容易に製造できることを見出し、該酵素の製造技
術を確立した（特公昭５６−５４１５３号、特許第１１
１１３４６号）。しかるに上記確立された方法では、培
地へのシアル酸の添加が必須であり、このシアル酸自体
その調製に繁雑な操作等を要し且つ高価なものである不
利があった。しかもこのシアル酸添加を行なわない限
り、Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼは生産されな
いかあるいは極微量生産されるのみで、到底工業的実施
はできないものであった。即ち上記方法に利用される微
生物は、それ自体シアル酸の不存在下ではＮ−アシルノ
イラミン酸生産能を実質的に発現できないものであっ
た。
【０００４】
【発明の目的】本発明者らは、上記方法の最大の欠点と
するシアル酸利用を必須とする点を解消し、該シアル酸
を利用せずとも工業的規模で大量のＮ−アシルノイラミ
ン酸アルドラーゼを製造できる技術を開発するべく鋭意
研究を重ねた。その結果上記確立された方法に利用され
る微生物のうちエシエリヒア属に属するＮ−アシルノイ
ラミン酸アルドラーゼ生産菌からＮ−アシルノイラミン
酸アルドラーゼ遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断片を抽出
し、これをベクターに組み込んで組換えプラスミドを作
成し、該プラスミドの導入により形質転換させた微生物
を得るに成功すると共に、該微生物がシアル酸無添加培
地での培養により、目的とする酵素を著量生産できると
いう事実を発見した。本発明はこの新しい知見に基づい
て完成されたものである。
するシアル酸利用を必須とする点を解消し、該シアル酸
を利用せずとも工業的規模で大量のＮ−アシルノイラミ
ン酸アルドラーゼを製造できる技術を開発するべく鋭意
研究を重ねた。その結果上記確立された方法に利用され
る微生物のうちエシエリヒア属に属するＮ−アシルノイ
ラミン酸アルドラーゼ生産菌からＮ−アシルノイラミン
酸アルドラーゼ遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断片を抽出
し、これをベクターに組み込んで組換えプラスミドを作
成し、該プラスミドの導入により形質転換させた微生物
を得るに成功すると共に、該微生物がシアル酸無添加培
地での培養により、目的とする酵素を著量生産できると
いう事実を発見した。本発明はこの新しい知見に基づい
て完成されたものである。
【０００５】
【発明の構成】即ち本発明は、エシエリヒア属に属する
Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ生産菌由来のＮ−
アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子を含む染色体Ｄ
ＮＡのＨｉｎｄ III−ＥｃｏＲＩ断片であって大きさ約
１．２ｋｂのＤＮＡ断片を組込んでなる組換えプラスミ
ドｐＭＫ６を上記染色体ＤＮＡの供与菌に導入して得ら
れる形質転換株を培養して、培養物からＮ−アシルノイ
ラミン酸アルドラーゼを採取することを特徴とするＮ−
アシルノイラミン酸アルドラーゼの製造法に係わる。
Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ生産菌由来のＮ−
アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子を含む染色体Ｄ
ＮＡのＨｉｎｄ III−ＥｃｏＲＩ断片であって大きさ約
１．２ｋｂのＤＮＡ断片を組込んでなる組換えプラスミ
ドｐＭＫ６を上記染色体ＤＮＡの供与菌に導入して得ら
れる形質転換株を培養して、培養物からＮ−アシルノイ
ラミン酸アルドラーゼを採取することを特徴とするＮ−
アシルノイラミン酸アルドラーゼの製造法に係わる。
【０００６】本発明の上記組換えプラスミド及びこれを
導入した形質転換株の利用によれば、調製が面倒なシア
ル酸、その類縁体等のＮ−アシルノイラミン酸アルドラ
ーゼの誘導物質を培地に添加せずとも、通常の微生物の
培養用培地を用いて工業的規模で大量の目的酵素を容易
に製造採取することができる。
導入した形質転換株の利用によれば、調製が面倒なシア
ル酸、その類縁体等のＮ−アシルノイラミン酸アルドラ
ーゼの誘導物質を培地に添加せずとも、通常の微生物の
培養用培地を用いて工業的規模で大量の目的酵素を容易
に製造採取することができる。
【０００７】以下、上記組換えプラスミド及びこれを導
入した形質転換株の製造法につき詳述する。
入した形質転換株の製造法につき詳述する。
【０００８】本発明に利用するプラスミドは、エシエリ
ヒア属に属するＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ生
産菌由来のＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子
を含む染色体ＤＮＡ断片をベクターに組込むことにより
製造される。ここで染色体ＤＮＡ供与菌として用いるエ
シエリヒア属細菌は、例えばエシエリヒア・コリー
（Ｅ．coli）のようなＮ−アシルノイラミン酸アルドラ
ーゼ高生産性のものであるのが好ましいが、Ｎ−アシル
ノイラミン酸アルドラーゼ産生能を有する限り特に制限
はなく、公知の各種細菌をいずれも使用可能である。
ヒア属に属するＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ生
産菌由来のＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子
を含む染色体ＤＮＡ断片をベクターに組込むことにより
製造される。ここで染色体ＤＮＡ供与菌として用いるエ
シエリヒア属細菌は、例えばエシエリヒア・コリー
（Ｅ．coli）のようなＮ−アシルノイラミン酸アルドラ
ーゼ高生産性のものであるのが好ましいが、Ｎ−アシル
ノイラミン酸アルドラーゼ産生能を有する限り特に制限
はなく、公知の各種細菌をいずれも使用可能である。
【０００９】上記Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ
生産菌からの染色体ＤＮＡの調製は、通常の方法、例え
ばフエノールを用いる方法〔Saito-Miura 法、Biochim.
Biophys. Acta.,７２，６１９（１９６３）〕等により
行なわれる。
生産菌からの染色体ＤＮＡの調製は、通常の方法、例え
ばフエノールを用いる方法〔Saito-Miura 法、Biochim.
Biophys. Acta.,７２，６１９（１９６３）〕等により
行なわれる。
【００１０】調製された染色体ＤＮＡは、次いでベクタ
ーと連結するために切断される。この染色体ＤＮＡの切
断は、通常の制限エンドヌクレアーゼを用いる方法によ
り行なわれるが、特にこの方法に限定されず、Ｎ−アシ
ルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子を切断しない限り例
えば物理的に剪断力を加えて切断する方法によることも
できる。制限エンドヌクレアーゼを用いて染色体ＤＮＡ
を切断する方法の実施に当り、完全切断を起こす反応条
件を採用する場合には、目的とするＮ−アシルノイラミ
ン酸アルドラーゼ遺伝子に切断部位を持たない各種の制
限エンドヌクレアーゼを用いることができ、また部分的
にしか切断を起こさない反応条件を採用する場合には、
全ての種類の制限エンドヌクレアーゼを用いることがで
きる。特にベクターとの連結の容易さから該制限エンド
ヌクレアーゼとしては、用いられるベクターに唯一の切
断部位を有するものが好ましい。
ーと連結するために切断される。この染色体ＤＮＡの切
断は、通常の制限エンドヌクレアーゼを用いる方法によ
り行なわれるが、特にこの方法に限定されず、Ｎ−アシ
ルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子を切断しない限り例
えば物理的に剪断力を加えて切断する方法によることも
できる。制限エンドヌクレアーゼを用いて染色体ＤＮＡ
を切断する方法の実施に当り、完全切断を起こす反応条
件を採用する場合には、目的とするＮ−アシルノイラミ
ン酸アルドラーゼ遺伝子に切断部位を持たない各種の制
限エンドヌクレアーゼを用いることができ、また部分的
にしか切断を起こさない反応条件を採用する場合には、
全ての種類の制限エンドヌクレアーゼを用いることがで
きる。特にベクターとの連結の容易さから該制限エンド
ヌクレアーゼとしては、用いられるベクターに唯一の切
断部位を有するものが好ましい。
【００１１】かくして切断された染色体ＤＮＡ断片を挿
入結合されるベクターＤＮＡとしては、通常用いられる
各種のものをいずれも利用することができ、特にエシエ
リヒア・コリー系ベクターが好適である。上記ベクター
の例としては、例えばCol Ｅ１の系統、ｐＳＣ１０１の
系統、ｐＢＲ３２２の系統、ｐＡＣＹＣ１７７の系統、
ｐＣＲ１の系統、Ｒ６Ｋの系統、ラムダファージの系統
等を例示できる。
入結合されるベクターＤＮＡとしては、通常用いられる
各種のものをいずれも利用することができ、特にエシエ
リヒア・コリー系ベクターが好適である。上記ベクター
の例としては、例えばCol Ｅ１の系統、ｐＳＣ１０１の
系統、ｐＢＲ３２２の系統、ｐＡＣＹＣ１７７の系統、
ｐＣＲ１の系統、Ｒ６Ｋの系統、ラムダファージの系統
等を例示できる。
【００１２】上記染色体ＤＮＡとベクターＤＮＡとの結
合は、一般的に行なわれている方法、例えば供与染色体
とベクターとを同一の制限エンドヌクレアーゼで切断
し、しかる後に之等をＤＮＡリガーゼを用いて結合させ
る方法により行なわれるが、この方法に限定されること
なく、他の如何なる方法によってもよい。かくして目的
とする組換えプラスミド（組換え体ＤＮＡ分子、即ち供
与染色体ＤＮＡ断片とベクターとの結合体）を得る。
合は、一般的に行なわれている方法、例えば供与染色体
とベクターとを同一の制限エンドヌクレアーゼで切断
し、しかる後に之等をＤＮＡリガーゼを用いて結合させ
る方法により行なわれるが、この方法に限定されること
なく、他の如何なる方法によってもよい。かくして目的
とする組換えプラスミド（組換え体ＤＮＡ分子、即ち供
与染色体ＤＮＡ断片とベクターとの結合体）を得る。
【００１３】本発明は、また上記プラスミドを導入して
形質転換させた微生物をも提供するものである。該組換
えプラスミドを導入して形質転換される宿主としての受
容菌としては、エシエリヒア属細菌、特に上記染色体Ｄ
ＮＡ供与菌又はこれより誘導したＮ−アシルノイラミン
酸アルドラーゼ欠損株が使用される。これらの内で特に
Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ欠損株は、目的プ
ラスミドを保有する形質転換株の選択の際に好適であ
る。
形質転換させた微生物をも提供するものである。該組換
えプラスミドを導入して形質転換される宿主としての受
容菌としては、エシエリヒア属細菌、特に上記染色体Ｄ
ＮＡ供与菌又はこれより誘導したＮ−アシルノイラミン
酸アルドラーゼ欠損株が使用される。これらの内で特に
Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ欠損株は、目的プ
ラスミドを保有する形質転換株の選択の際に好適であ
る。
【００１４】宿主菌としてのエシエリヒア属細菌に目的
プラスミドを導入して形質転換を行なわせる方法は、公
知の方法、例えば代表的にはコンピテント細胞を用いる
形質転換法〔Mol. Gen. Genet., １６７，２５１（１９
７９）〕等に従うことができる。本発明では特にこの方
法に限定されることなく他の公知の各種の方法をいずれ
も採用することができる。
プラスミドを導入して形質転換を行なわせる方法は、公
知の方法、例えば代表的にはコンピテント細胞を用いる
形質転換法〔Mol. Gen. Genet., １６７，２５１（１９
７９）〕等に従うことができる。本発明では特にこの方
法に限定されることなく他の公知の各種の方法をいずれ
も採用することができる。
【００１５】上記方法により得られる形質転換株から目
的とするＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子を
含む供与染色体ＤＮＡ断片を保有し、該酵素をシアル酸
等の誘導物質の不存在下に生産する能力を有する微生物
の選択分離は、何ら特殊な方法を採用することなく、所
望の染色体上の遺伝形質もしくはベクターの持つ形質又
はこれらの両者を合せ持つ菌のクローンを選択的に生育
させ得る培地を利用して容易に実施できる。
的とするＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子を
含む供与染色体ＤＮＡ断片を保有し、該酵素をシアル酸
等の誘導物質の不存在下に生産する能力を有する微生物
の選択分離は、何ら特殊な方法を採用することなく、所
望の染色体上の遺伝形質もしくはベクターの持つ形質又
はこれらの両者を合せ持つ菌のクローンを選択的に生育
させ得る培地を利用して容易に実施できる。
【００１６】かくして抗生物質耐性を有し、シアル酸最
小培地に生育し、シアル酸等の誘導物質の無添加培地で
著量のＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ生産能を有
する目的とする形質転換株を取得できる。
小培地に生育し、シアル酸等の誘導物質の無添加培地で
著量のＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ生産能を有
する目的とする形質転換株を取得できる。
【００１７】従来かかる顕著に向上された酵素生産能を
有するエシエリヒア属細菌は全く知られておらず、勿論
公知のエシエリヒア属細菌が遺伝子組換え法によりかか
る酵素生産能を発現させ得るという事実、更にシアル酸
無添加培地で著量のＮ−アシルノイラミン酸アルドラー
ゼ生産能を有する形質転換株を育種するという事実も知
られていない。
有するエシエリヒア属細菌は全く知られておらず、勿論
公知のエシエリヒア属細菌が遺伝子組換え法によりかか
る酵素生産能を発現させ得るという事実、更にシアル酸
無添加培地で著量のＮ−アシルノイラミン酸アルドラー
ゼ生産能を有する形質転換株を育種するという事実も知
られていない。
【００１８】本発明は、上記のごとくして得られる形質
転換株を培養してＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ
を採取する方法を提供するものである。
転換株を培養してＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ
を採取する方法を提供するものである。
【００１９】上記形質転換株の培養のための培地として
は炭素源、窒素源、無機化合物その他の栄養素を含み、
細菌の培養に一般に用いられている合成培地、半合成培
地或いは天然培地のいずれをも使用することができる。
上記各培地に利用される炭素源としては、例えばブドウ
糖、果糖、転化糖、澱粉糖化液、ソルビトール、グリセ
ロール等の糖質液、ピルビン酸、リンゴ酸、コハク酸等
の有機酸類等を例示できる。窒素源としては、例えば硫
酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウ
ム、リン酸アンモニウム、水酸化アンモニウム、酒石酸
アンモニウム、酢酸アンモニウム、尿素等を例示でき
る。炭素源としても窒素源としても利用できるものとし
ては、例えばペプトン、肉エキス、コーンスティープリ
カー等を例示できる。無機化合物としては、例えばリン
酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一ナトリウ
ム、リン酸二ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグ
ネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸第一
鉄、塩化第一鉄、硫酸第二鉄、塩化第二鉄、硫酸マンガ
ン、塩化マンガン等を例示できる。その他の栄養素とし
ては、例えば酵母エキス、ビタミン等を例示できる。
は炭素源、窒素源、無機化合物その他の栄養素を含み、
細菌の培養に一般に用いられている合成培地、半合成培
地或いは天然培地のいずれをも使用することができる。
上記各培地に利用される炭素源としては、例えばブドウ
糖、果糖、転化糖、澱粉糖化液、ソルビトール、グリセ
ロール等の糖質液、ピルビン酸、リンゴ酸、コハク酸等
の有機酸類等を例示できる。窒素源としては、例えば硫
酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウ
ム、リン酸アンモニウム、水酸化アンモニウム、酒石酸
アンモニウム、酢酸アンモニウム、尿素等を例示でき
る。炭素源としても窒素源としても利用できるものとし
ては、例えばペプトン、肉エキス、コーンスティープリ
カー等を例示できる。無機化合物としては、例えばリン
酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一ナトリウ
ム、リン酸二ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグ
ネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸第一
鉄、塩化第一鉄、硫酸第二鉄、塩化第二鉄、硫酸マンガ
ン、塩化マンガン等を例示できる。その他の栄養素とし
ては、例えば酵母エキス、ビタミン等を例示できる。
【００２０】培養は、液体培地又は固体培地のいずれで
も行なうことができるが、通常液体培地の方が有利であ
って、特に振盪培養又は通気撹拌培養を行なうのが量産
上有利である。培養温度は２０〜４５℃、好ましくは２
８〜３７℃とするのが好適である。培養中は適当な中和
剤を用いてｐＨを６〜９に調整するのが好ましい。上記
培養を通常１０〜５０時間行なうことにより、目的とす
るＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの活性は最高に
達する。本酵素は一般に菌体内酵素であるので、培養物
からの本酵素の採取、精製に当っては、上記培養液から
遠心分離等の方法で菌体を集め、得られた菌体を超音波
処理、ガラスビーズを用いる磨砕処理、或いはフレンチ
プレス処理等によって破砕し、酵素を抽出するのが好ま
しい。抽出液はこれを硫安塩析法、イオン交換クロマト
グラフイー、ゲル濾過法等の常法により処理して精製Ｎ
−アシルノイラミン酸アルドラーゼとすることができ
る。
も行なうことができるが、通常液体培地の方が有利であ
って、特に振盪培養又は通気撹拌培養を行なうのが量産
上有利である。培養温度は２０〜４５℃、好ましくは２
８〜３７℃とするのが好適である。培養中は適当な中和
剤を用いてｐＨを６〜９に調整するのが好ましい。上記
培養を通常１０〜５０時間行なうことにより、目的とす
るＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの活性は最高に
達する。本酵素は一般に菌体内酵素であるので、培養物
からの本酵素の採取、精製に当っては、上記培養液から
遠心分離等の方法で菌体を集め、得られた菌体を超音波
処理、ガラスビーズを用いる磨砕処理、或いはフレンチ
プレス処理等によって破砕し、酵素を抽出するのが好ま
しい。抽出液はこれを硫安塩析法、イオン交換クロマト
グラフイー、ゲル濾過法等の常法により処理して精製Ｎ
−アシルノイラミン酸アルドラーゼとすることができ
る。
【００２１】
【実施例】以下、実施例を挙げ本発明を更に詳しく説明
する。
する。
【００２２】実施例１ （１）Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ生産株Ｅ．
coli Ｋ１２Ｃ６００株からの染色体ＤＮＡの調製 下記組成のＬ培地１ｌ中でエシエシヒア・コリー（Ｅ．
coli）Ｋ１２Ｃ６００株を３７℃で約３時間振盪培養
し、対数増殖期の菌体を集めた。
coli Ｋ１２Ｃ６００株からの染色体ＤＮＡの調製 下記組成のＬ培地１ｌ中でエシエシヒア・コリー（Ｅ．
coli）Ｋ１２Ｃ６００株を３７℃で約３時間振盪培養
し、対数増殖期の菌体を集めた。
【００２３】〈Ｌ培地組成〉 ペプトン １ｇ／ｄｌ 酵母エキス ０．５ｇ／ｄｌ グルコース ０．１ｇ／ｄｌ ＮａＣｌ ０．５ｇ／ｄｌ ｐＨ ７．２に調整 上記菌体につきフエノール法によるＤＮＡ抽出操作を行
なって、最終３．８mgの染色体ＤＮＡを抽出精製した。
なって、最終３．８mgの染色体ＤＮＡを抽出精製した。
【００２４】（２）ベクターＤＮＡの調製と制限酵素に
よる切断 ベクターとしてのプラスミドｐＢＲ３２２のＤＮＡを以
下の通り調製した。即ち、まずｐＢＲ３２２をプラスミ
ドとして保有するエシエリヒア・コリーＫ１２株の一種
を下記組成のＧＰＭ培地に接種し、３７℃で対数期中期
まで培養した後、最終濃度１００μｇ／mlのクロラムフ
ェニコールを添加し、更に一夜培養した 。〈ＧＰＭ組成〉 グルコース １０ｇ ペプトン １０ｇ ＮＨ4 Ｃｌ １ｇ Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・１２Ｈ2 Ｏ １５．２ｇ ＫＨ2 ＰＯ4 ３ｇ ＮａＣｌ ３ｇ Ｎａ2 ＳＯ4 ０．１１５ｇ ＭｇＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ ０．０８３ｇ 酵母エキス １ｇ 脱塩水 全体を１ｌとする量 上記操作により、細胞内にプラスミドＤＮＡを多量に生
産させた。クロラムフエニコール添加の１６時間目に菌
体を集め、リゾチーム・ＳＤＳ処理して溶菌させ、３０
０００×ｇ、１時間の超遠心により上清を得た。これよ
りプラスミドＤＮＡを濃縮し、セシウムクロライド−エ
チジウムブロマイド平衡密度勾配遠心法によって最終７
００μｇのｐＢＲ３２２のプラスミドＤＮＡを分画採取
した。
よる切断 ベクターとしてのプラスミドｐＢＲ３２２のＤＮＡを以
下の通り調製した。即ち、まずｐＢＲ３２２をプラスミ
ドとして保有するエシエリヒア・コリーＫ１２株の一種
を下記組成のＧＰＭ培地に接種し、３７℃で対数期中期
まで培養した後、最終濃度１００μｇ／mlのクロラムフ
ェニコールを添加し、更に一夜培養した 。〈ＧＰＭ組成〉 グルコース １０ｇ ペプトン １０ｇ ＮＨ4 Ｃｌ １ｇ Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・１２Ｈ2 Ｏ １５．２ｇ ＫＨ2 ＰＯ4 ３ｇ ＮａＣｌ ３ｇ Ｎａ2 ＳＯ4 ０．１１５ｇ ＭｇＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ ０．０８３ｇ 酵母エキス １ｇ 脱塩水 全体を１ｌとする量 上記操作により、細胞内にプラスミドＤＮＡを多量に生
産させた。クロラムフエニコール添加の１６時間目に菌
体を集め、リゾチーム・ＳＤＳ処理して溶菌させ、３０
０００×ｇ、１時間の超遠心により上清を得た。これよ
りプラスミドＤＮＡを濃縮し、セシウムクロライド−エ
チジウムブロマイド平衡密度勾配遠心法によって最終７
００μｇのｐＢＲ３２２のプラスミドＤＮＡを分画採取
した。
【００２５】（３）染色体ＤＮＡ断片のベクターへの導
入 上記（１）で得た染色体ＤＮＡ１０μｇを取り、制限エ
ンドヌクレアーゼＨｉｎｄ IIIを３７℃で３０分間、６
０分間又は１２０分間それぞれ反応させ、ＤＮＡの部分
的切断を行なった後、６５℃で１０分間熱処理して反応
を停止させた。他方、ベクターｐＢＲ３２２につき制限
エンドヌクレアーゼＨｉｎｄ IIIを用いて完全に切断
後、アルカリフォスフアーゼで処理してｐＢＲ３２２の
ＤＮＡ断片を調製した。
入 上記（１）で得た染色体ＤＮＡ１０μｇを取り、制限エ
ンドヌクレアーゼＨｉｎｄ IIIを３７℃で３０分間、６
０分間又は１２０分間それぞれ反応させ、ＤＮＡの部分
的切断を行なった後、６５℃で１０分間熱処理して反応
を停止させた。他方、ベクターｐＢＲ３２２につき制限
エンドヌクレアーゼＨｉｎｄ IIIを用いて完全に切断
後、アルカリフォスフアーゼで処理してｐＢＲ３２２の
ＤＮＡ断片を調製した。
【００２６】上記染色体ＤＮＡ断片とｐＢＲ３２２のＤ
ＮＡ断片５μｇとを混合し、ＡＴＰ及びジチオスレイト
ールの存在下に、Ｔ4 ファージ由来のＤＮＡリガーゼを
用いて、１０℃で１６時間を要してＤＮＡ鎖の連結反応
を行なった。６５℃で１０分間の熱処理後、反応液に２
倍容のエタノールを加えて連結反応終了後のＤＮＡを沈
殿させ、採取した。
ＮＡ断片５μｇとを混合し、ＡＴＰ及びジチオスレイト
ールの存在下に、Ｔ4 ファージ由来のＤＮＡリガーゼを
用いて、１０℃で１６時間を要してＤＮＡ鎖の連結反応
を行なった。６５℃で１０分間の熱処理後、反応液に２
倍容のエタノールを加えて連結反応終了後のＤＮＡを沈
殿させ、採取した。
【００２７】（４）組換えプラスミドＤＮＡによる形質
転換 エシエリヒア・コリーＫ１２Ｃ６００株から、ニトロソ
グアニジン変異処理によって誘導したＮ−アシルノイラ
ミン酸アルドラーゼ欠損株を、Ｌ培地１０mlにて対数増
殖中期まで生育させた後、塩化カルシウム５０ｍＭを含
むトリス緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）で２回洗浄す
ることにより、コンピテントな（ＤＮＡ取り込み能を有
する）細胞を調製した。このコンピテント細胞懸濁液
０．４mlに上記（３）で得たＤＮＡ溶液０．１mlを加え
て、０℃で３０分間保持した後、直ちに４２℃、２分間
の熱パルスを与え、ＤＮＡを細胞内に取込ませた。
転換 エシエリヒア・コリーＫ１２Ｃ６００株から、ニトロソ
グアニジン変異処理によって誘導したＮ−アシルノイラ
ミン酸アルドラーゼ欠損株を、Ｌ培地１０mlにて対数増
殖中期まで生育させた後、塩化カルシウム５０ｍＭを含
むトリス緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）で２回洗浄す
ることにより、コンピテントな（ＤＮＡ取り込み能を有
する）細胞を調製した。このコンピテント細胞懸濁液
０．４mlに上記（３）で得たＤＮＡ溶液０．１mlを加え
て、０℃で３０分間保持した後、直ちに４２℃、２分間
の熱パルスを与え、ＤＮＡを細胞内に取込ませた。
【００２８】次にこの細胞懸濁液をＬ培地に接種し、３
７℃で２時間静置培養を行なって形質転換反応を完了さ
せた後、集菌し、洗浄し、再懸濁液を最小培地プレート
に塗沫し、３７℃で２日間培養した。
７℃で２時間静置培養を行なって形質転換反応を完了さ
せた後、集菌し、洗浄し、再懸濁液を最小培地プレート
に塗沫し、３７℃で２日間培養した。
【００２９】尚、上記最小培地プレートは、シアル酸の
２ｇ、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 の１ｇ、Ｋ2 ＨＰＯ4 の７
ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 の２ｇ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏの０．
１ｇ、ロイシンの２０mg、スレオニンの２０mg及びチア
ミンの１mgを１ｌの純水に溶解し、ｐＨを７．０に調整
したものに寒天２０ｇを加えて殺菌した固形培地にアン
ピシリンを１０μｇ／mlとなるように加えることにより
調製したものである。
２ｇ、（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 の１ｇ、Ｋ2 ＨＰＯ4 の７
ｇ、ＫＨ2 ＰＯ4 の２ｇ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏの０．
１ｇ、ロイシンの２０mg、スレオニンの２０mg及びチア
ミンの１mgを１ｌの純水に溶解し、ｐＨを７．０に調整
したものに寒天２０ｇを加えて殺菌した固形培地にアン
ピシリンを１０μｇ／mlとなるように加えることにより
調製したものである。
【００３０】上記により生じたコロニーを釣菌し、アン
ピシリン耐性と菌体内のＮ−アシルノイラミン酸アルド
ラーゼ活性とを検討し、形質転換株ＲＣ−Ｈ１／ｐＭＫ
２（約１４．２ｋｂ）を収得した。
ピシリン耐性と菌体内のＮ−アシルノイラミン酸アルド
ラーゼ活性とを検討し、形質転換株ＲＣ−Ｈ１／ｐＭＫ
２（約１４．２ｋｂ）を収得した。
【００３１】（５）Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラー
ゼの遺伝情報を担うプラスミドのセルフクローニング 上記（４）で得た形質転換株をＬ培地１００ml中で培養
し、上記（２）と同様にしてクロラムフェニコール処理
を行なった。菌体を集菌、洗浄後、ビルンボイム及びド
リー（Birnboim and Doly ）の方法（Nucleie Acids Re
search, ７，１５１３〜１５２３（１９７９）〕によ
り、Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの遺伝情報を
担う組換えプラスミド（以下「ｐＭＫ２」と称する）を
含む液を調製した。
ゼの遺伝情報を担うプラスミドのセルフクローニング 上記（４）で得た形質転換株をＬ培地１００ml中で培養
し、上記（２）と同様にしてクロラムフェニコール処理
を行なった。菌体を集菌、洗浄後、ビルンボイム及びド
リー（Birnboim and Doly ）の方法（Nucleie Acids Re
search, ７，１５１３〜１５２３（１９７９）〕によ
り、Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの遺伝情報を
担う組換えプラスミド（以下「ｐＭＫ２」と称する）を
含む液を調製した。
【００３２】この溶液をアガロースゲル電気泳動（アガ
ロース０．７％、９０Ｖ）にかけ、ｐＭＫ２のバンドを
紫外線照射下で切り出し、これを透析チューブに入れ、
再度電気泳動を行ない、ゲルよりＤＮＡを抽出した。エ
チジウムブロマイドの除去を行なった後、２倍容のエタ
ノールを加えて沈殿させ、得られたｐＭＫ２の９０μｇ
を５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した。
ロース０．７％、９０Ｖ）にかけ、ｐＭＫ２のバンドを
紫外線照射下で切り出し、これを透析チューブに入れ、
再度電気泳動を行ない、ゲルよりＤＮＡを抽出した。エ
チジウムブロマイドの除去を行なった後、２倍容のエタ
ノールを加えて沈殿させ、得られたｐＭＫ２の９０μｇ
を５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した。
【００３３】次いで上記（４）と同様にして、エシエリ
ヒア・コリーＫ１２Ｃ６００株にＤＮＡ取り込み能を持
たせた後、上記ｐＭＫ２を取り込ませた。かくして得ら
れる菌株をアンピシリン１０μｇ／mlを含む最小培地プ
レートに培養し、生じてくるコロニーを分離し、アンピ
シリン耐性と菌体内のＮ−アシルノイラミン酸アルドラ
ーゼ活性を検討して、形質転換株ＲＣ−Ｋ１２Ｃ６００
／ｐＭＫ２を収得した。
ヒア・コリーＫ１２Ｃ６００株にＤＮＡ取り込み能を持
たせた後、上記ｐＭＫ２を取り込ませた。かくして得ら
れる菌株をアンピシリン１０μｇ／mlを含む最小培地プ
レートに培養し、生じてくるコロニーを分離し、アンピ
シリン耐性と菌体内のＮ−アシルノイラミン酸アルドラ
ーゼ活性を検討して、形質転換株ＲＣ−Ｋ１２Ｃ６００
／ｐＭＫ２を収得した。
【００３４】（６）Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラー
ゼ遺伝子のサブクローニング 上記（５）で得た形質転換株から、該（５）と同様の方
法によりプラスミドｐＭＫ２の１０μｇを取り、これに
２種の制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ
IIIを同時に作用させて３７℃で１時間部分的に切断反
応を行なった。
ゼ遺伝子のサブクローニング 上記（５）で得た形質転換株から、該（５）と同様の方
法によりプラスミドｐＭＫ２の１０μｇを取り、これに
２種の制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ
IIIを同時に作用させて３７℃で１時間部分的に切断反
応を行なった。
【００３５】予め６５℃で１０時間加熱処理し、制限エ
ンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ IIIを同時に
用いて完全に切断後、アルカリフォスターゼで処理して
ｐＢＲ３２２のＤＮＡ断片を調製した。
ンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ IIIを同時に
用いて完全に切断後、アルカリフォスターゼで処理して
ｐＢＲ３２２のＤＮＡ断片を調製した。
【００３６】上記ｐＭＫ２のＤＮＡ断片とｐＢＲ３２２
のＤＮＡ断片５μｇとを混合し、ＡＴＰ及びジチオスレ
イトールの存在下に、Ｔ4 ファージ由来のＤＮＡリガー
ゼを用いて、１０℃で１６時間を要してＤＮＡ鎖の連結
反応を行なって組換えプラスミドを調製した。
のＤＮＡ断片５μｇとを混合し、ＡＴＰ及びジチオスレ
イトールの存在下に、Ｔ4 ファージ由来のＤＮＡリガー
ゼを用いて、１０℃で１６時間を要してＤＮＡ鎖の連結
反応を行なって組換えプラスミドを調製した。
【００３７】次いで上記（４）と同様にしてエシエリヒ
ア・コリーＫ１２Ｃ６００株にＤＮＡ取り込み能を持た
せた後、上記で調製した組換えプラスミドを取り込ませ
た。
ア・コリーＫ１２Ｃ６００株にＤＮＡ取り込み能を持た
せた後、上記で調製した組換えプラスミドを取り込ませ
た。
【００３８】かくして得られる菌体をアンピシリン１０
μｇ／mlを含む最小培地プレートに培養し、生じてくる
コロニーを分離し、アンピシリン耐性及び菌体内のＮ−
アシルノイラミン酸アルドラーゼ活性を検討して、形質
転換株ＲＣ−Ｋ１２Ｃ６００／ｐＭＫ６を得た。
μｇ／mlを含む最小培地プレートに培養し、生じてくる
コロニーを分離し、アンピシリン耐性及び菌体内のＮ−
アシルノイラミン酸アルドラーゼ活性を検討して、形質
転換株ＲＣ−Ｋ１２Ｃ６００／ｐＭＫ６を得た。
【００３９】この形質転換株は、目的のＮ−アシルノイ
ラミン酸アルドラーゼ遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断片を
組込んだ組換えプラスミドを保有するものであり、該プ
ラスミドを以下「ｐＭＫ６」と称する。
ラミン酸アルドラーゼ遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断片を
組込んだ組換えプラスミドを保有するものであり、該プ
ラスミドを以下「ｐＭＫ６」と称する。
【００４０】ｐＭＫ６の制限酵素切断地図は図１に示す
通りである。これはｐＢＲ３２２に由来しＰｓｔＩ、Ｐ
ｖｕＩＩ、ＳａｌＩ及びＢａｍＨＩで各々切断される切
断部位を有するＤＮＡ断片（Ｈｉｎｄ III−ＥｃｏＲＩ
断片、４３２１ｂｐ）と、Ｎ−アシルノイラミン酸アル
ドラーゼ生産菌由来の染色体ＤＮＡ断片（Ｈｉｎｄ III
−ＥｃｏＲＩ断片、約１．２ｋｂ）とが、ＥｃｏＲＩ及
びＨｉｎｄ IIIの切断部位で連結されてなり、約５．５
ｋｂの大きさを有するものである。
通りである。これはｐＢＲ３２２に由来しＰｓｔＩ、Ｐ
ｖｕＩＩ、ＳａｌＩ及びＢａｍＨＩで各々切断される切
断部位を有するＤＮＡ断片（Ｈｉｎｄ III−ＥｃｏＲＩ
断片、４３２１ｂｐ）と、Ｎ−アシルノイラミン酸アル
ドラーゼ生産菌由来の染色体ＤＮＡ断片（Ｈｉｎｄ III
−ＥｃｏＲＩ断片、約１．２ｋｂ）とが、ＥｃｏＲＩ及
びＨｉｎｄ IIIの切断部位で連結されてなり、約５．５
ｋｂの大きさを有するものである。
【００４１】また上記プラスミドｐＭＫ６を保有する形
質転換株は、工業技術院微生物工業技術研究所にエシエ
リヒア・コリーＫ１２Ｃ６００／ｐＭＫ６なる名称にて
寄託されており、その寄託番号は微工研菌寄第７７９７
号（微工研条寄第８３３号）である。
質転換株は、工業技術院微生物工業技術研究所にエシエ
リヒア・コリーＫ１２Ｃ６００／ｐＭＫ６なる名称にて
寄託されており、その寄託番号は微工研菌寄第７７９７
号（微工研条寄第８３３号）である。
【００４２】（７）形質転換株によるＮ−アシルノイラ
ミン酸アルドラーゼの生産 上記（６）で得た形質転換株につき、ＤＮＡ供与菌であ
るエシエリヒア・コリーＫ１２Ｃ６００株と対比して、
それらのシアル酸添加培地及びシアル酸無添加培地（酵
母エキス培地）の各々におけるＮ−アシルノイラミン酸
アルドラーゼ生産性を検討した。
ミン酸アルドラーゼの生産 上記（６）で得た形質転換株につき、ＤＮＡ供与菌であ
るエシエリヒア・コリーＫ１２Ｃ６００株と対比して、
それらのシアル酸添加培地及びシアル酸無添加培地（酵
母エキス培地）の各々におけるＮ−アシルノイラミン酸
アルドラーゼ生産性を検討した。
【００４３】各微生物の培養培地としては、以下の組成
の培地をそれぞれ利用した。
の培地をそれぞれ利用した。
【００４４】〈シアル酸添加培地組成〉 シアル酸 ５ｇ （ＮＨ4 )2 ＳＯ4 １ｇ Ｋ2 ＨＰＯ4 ７ｇ ＫＨ2 ＰＯ4 ２ｇ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．１ｇ 酵母エキス ０．５ｇ 純水 全体を１ｌとする量（ｐＨ６．０） 〈酵母エキス培地組成〉 酵母エキス ２０ｇ コハク酸 １０ｇ 純水 全体を１ｌとする量（ｐＨ６．０） 上記各培地に各微生物を接種し、３０℃で２４時間振盪
培養を行なった。その後、培養液から遠心分離法により
菌体を集め、２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１０
０mlに懸濁させて超音波処理を行ない細胞を破砕し、菌
体内の酵素を抽出し、遠心分離により沈渣と上澄とを分
離した後、抽出液（上澄）として粗酵素液を得た。
培養を行なった。その後、培養液から遠心分離法により
菌体を集め、２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１０
０mlに懸濁させて超音波処理を行ない細胞を破砕し、菌
体内の酵素を抽出し、遠心分離により沈渣と上澄とを分
離した後、抽出液（上澄）として粗酵素液を得た。
【００４５】得られた酵素液の活性を、バーネットらの
方法〔J.E.G.Barnett,D.L.Corina,and G.Rasool, Bioch
emical Journal, １２５，２７５（１９７１）〕に従い
測定した。
方法〔J.E.G.Barnett,D.L.Corina,and G.Rasool, Bioch
emical Journal, １２５，２７５（１９７１）〕に従い
測定した。
【００４６】Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ活性
は、上記方法により測定されるものであり、その酵素活
性の１単位とは、反応温度３７℃において１分間に１マ
イクロモルのＮ−アセチルノイラミン酸を分解する活性
をいう。
は、上記方法により測定されるものであり、その酵素活
性の１単位とは、反応温度３７℃において１分間に１マ
イクロモルのＮ−アセチルノイラミン酸を分解する活性
をいう。
【００４７】得られた結果を下記表１に示す。
【００４８】
【表１】
【００４９】上記表１より、本発明によれば、シアル酸
無添加培地において著量のＮ−アシルノイラミン酸アル
ドラーゼを収得できることが明らかである。
無添加培地において著量のＮ−アシルノイラミン酸アル
ドラーゼを収得できることが明らかである。
【００５０】なお、上記粗酵素液は、これを常法に従い
硫安で塩析し、遠心分離し、透析後、凍結乾燥すること
により粗酵素粉末とすることができる。また該酵素粉末
は、これをイオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過等の
手段により精製して更に純化された酵素標品とすること
ができる。
硫安で塩析し、遠心分離し、透析後、凍結乾燥すること
により粗酵素粉末とすることができる。また該酵素粉末
は、これをイオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過等の
手段により精製して更に純化された酵素標品とすること
ができる。
【図１】組換えプラスミドｐＭＫ６の制限酵素切断地図
を示す。
を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (1)
- 【請求項１】エシエリヒア属に属するＮ−アシルノイラ
ミン酸アルドラーゼ生産菌由来のＮ−アシルノイラミン
酸アルドラーゼ遺伝子を含む染色体ＤＮＡのＨｉｎｄ I
II−ＥｃｏＲＩ断片であって大きさ約１．２ｋｂのＤＮ
Ａ断片を組込んでなる組換えプラスミドｐＭＫ６を上記
染色体ＤＮＡの供与菌に導入して得られる形質転換株を
培養して、培養物からＮ−アシルノイラミン酸アルドラ
ーゼを採取することを特徴とするＮ−アシルノイラミン
酸アルドラーゼの製造法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59181250A JPS6181786A (ja) | 1984-08-30 | 1984-08-30 | Ｎ―アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミド及び形質転換微生物 |
| DE19853530935 DE3530935A1 (de) | 1984-08-30 | 1985-08-29 | Rekombinantes plasmid, transformante und verfahren zur herstellung von n-acylneuraminat-aldolase |
| JP5018292A JP2587764B2 (ja) | 1984-08-30 | 1993-02-05 | Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59181250A JPS6181786A (ja) | 1984-08-30 | 1984-08-30 | Ｎ―アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミド及び形質転換微生物 |
| JP5018292A JP2587764B2 (ja) | 1984-08-30 | 1993-02-05 | Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの製造法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59181250A Division JPS6181786A (ja) | 1984-08-30 | 1984-08-30 | Ｎ―アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミド及び形質転換微生物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0638751A JPH0638751A (ja) | 1994-02-15 |
| JP2587764B2 true JP2587764B2 (ja) | 1997-03-05 |
Family
ID=26354948
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59181250A Granted JPS6181786A (ja) | 1984-08-30 | 1984-08-30 | Ｎ―アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミド及び形質転換微生物 |
| JP5018292A Expired - Lifetime JP2587764B2 (ja) | 1984-08-30 | 1993-02-05 | Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの製造法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59181250A Granted JPS6181786A (ja) | 1984-08-30 | 1984-08-30 | Ｎ―アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミド及び形質転換微生物 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (2) | JPS6181786A (ja) |
| DE (1) | DE3530935A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62277A (ja) * | 1985-06-26 | 1987-01-06 | Rikagaku Kenkyusho | 新規プラスミド及びそれにより形質転換された新規微生物及びそれを用いた有用生理活性物質の製造法 |
| JPS62278982A (ja) * | 1986-05-27 | 1987-12-03 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | Ｎ−アセチルノイラミン酸リア−ゼの製造法 |
| JPH0755152B2 (ja) * | 1986-06-02 | 1995-06-14 | 日本化薬株式会社 | 組換え遺伝子産物の製法及び培地 |
| JPH0665301B2 (ja) * | 1987-02-27 | 1994-08-24 | 東洋紡績株式会社 | Ｎａｌ（ｎ―アシルノイラミン酸アルドラーゼ）の製造方法 |
| JP4753904B2 (ja) | 2007-03-15 | 2011-08-24 | シャープ株式会社 | 発光装置 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5654153A (en) * | 1979-10-09 | 1981-05-14 | Fujitsu Ltd | Information system of failure congestion |
| JPH062061B2 (ja) * | 1984-06-14 | 1994-01-12 | 協和醗酵工業株式会社 | Ｎ−アセチルノイラミン酸リア−ゼの製法 |
-
1984
- 1984-08-30 JP JP59181250A patent/JPS6181786A/ja active Granted
-
1985
- 1985-08-29 DE DE19853530935 patent/DE3530935A1/de active Granted
-
1993
- 1993-02-05 JP JP5018292A patent/JP2587764B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6181786A (ja) | 1986-04-25 |
| DE3530935C2 (ja) | 1987-06-11 |
| JPH0638751A (ja) | 1994-02-15 |
| JPH0559705B2 (ja) | 1993-08-31 |
| DE3530935A1 (de) | 1986-03-06 |
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