JPH0665301B2 - Ｎａｌ（ｎ―アシルノイラミン酸アルドラーゼ）の製造方法 - Google Patents
Ｎａｌ（ｎ―アシルノイラミン酸アルドラーゼ）の製造方法Info
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- JPH0665301B2 JPH0665301B2 JP62042878A JP4287887A JPH0665301B2 JP H0665301 B2 JPH0665301 B2 JP H0665301B2 JP 62042878 A JP62042878 A JP 62042878A JP 4287887 A JP4287887 A JP 4287887A JP H0665301 B2 JPH0665301 B2 JP H0665301B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ（本願明
細書ではＮＡＬと略称する。）をコードする遺伝子を含
む組換え体プラスミドにより形質転換されたプロビデン
シア(Providencia)属に属する微生物を用いてＮＡＬを
製造する方法に関する。
細書ではＮＡＬと略称する。）をコードする遺伝子を含
む組換え体プラスミドにより形質転換されたプロビデン
シア(Providencia)属に属する微生物を用いてＮＡＬを
製造する方法に関する。
ＮＡＬ、すなわち、Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラー
ゼは、国際生化学連合酵素委員会の酵素番号E.C.4.1.3.
3.に分類され、系統名ではＮ−アシルノイラミン酸：ピ
ルビン酸リアーゼと呼称される酵素である。本酵素はシ
アル酸（Ｎ−アシルノイラミン酸）をＮ−アシルマンノ
サミンとピルビン酸に分解する酵素であり、腫瘍の診断
のためのシアル酸含量変化測定に用いられる酵素であ
る。本酵素は、動物組織およびガス壊疽菌(Clostri-diu
m perfringens)コレラ菌(Vibro chlolerae)，大腸菌(Es
cherichia coli)等の微生物に存在することが知られて
いる。また、微生物においては培地中にＮ−アシルノイ
ラミン酸を存在させるとその生産能が飛躍的に上昇する
ことが報告されている（特公昭56-54153号）が、このＮ
−アシルノイラミン酸は非常に高価なものであり、工業
的な規模で用いることは困難であった。本発明者らは先
に、高価なＮ−アシルノイラミン酸を培地に添加するこ
となくＮＡＬを著量産生せしめる方法について鋭意検討
を行ない、Ｎ−アシルノイラミン酸が存在するとＮＡＬ
を産生する微生物の染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で処
理してＤＮＡ断片を得、これを適当なベクターに組み込
んで得られたエシェリヒア属に属する形質転換体の中
に、Ｎ−アシルノイラミン酸を含まない培地で培養して
もＮＡＬを産生するものがあることを見出した(Journal
of Biotcehnology Volume167,page 404(1986))。しか
しながら、プロビデンシア属に属する微生物でＮＡＬ生
産能のあるものは知られていない。
ゼは、国際生化学連合酵素委員会の酵素番号E.C.4.1.3.
3.に分類され、系統名ではＮ−アシルノイラミン酸：ピ
ルビン酸リアーゼと呼称される酵素である。本酵素はシ
アル酸（Ｎ−アシルノイラミン酸）をＮ−アシルマンノ
サミンとピルビン酸に分解する酵素であり、腫瘍の診断
のためのシアル酸含量変化測定に用いられる酵素であ
る。本酵素は、動物組織およびガス壊疽菌(Clostri-diu
m perfringens)コレラ菌(Vibro chlolerae)，大腸菌(Es
cherichia coli)等の微生物に存在することが知られて
いる。また、微生物においては培地中にＮ−アシルノイ
ラミン酸を存在させるとその生産能が飛躍的に上昇する
ことが報告されている（特公昭56-54153号）が、このＮ
−アシルノイラミン酸は非常に高価なものであり、工業
的な規模で用いることは困難であった。本発明者らは先
に、高価なＮ−アシルノイラミン酸を培地に添加するこ
となくＮＡＬを著量産生せしめる方法について鋭意検討
を行ない、Ｎ−アシルノイラミン酸が存在するとＮＡＬ
を産生する微生物の染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で処
理してＤＮＡ断片を得、これを適当なベクターに組み込
んで得られたエシェリヒア属に属する形質転換体の中
に、Ｎ−アシルノイラミン酸を含まない培地で培養して
もＮＡＬを産生するものがあることを見出した(Journal
of Biotcehnology Volume167,page 404(1986))。しか
しながら、プロビデンシア属に属する微生物でＮＡＬ生
産能のあるものは知られていない。
近年、組み換えＤＮＡ技術の進歩によりエシェリヒア属
以外の微生物における遺伝子の組み換えも可能となって
きている。そして、前記ＮＡＬ生産能を有する微生物に
関しても、従来公知のエシェリヒア属に属する微生物以
外のものを遺伝子の組み換えにより開発することができ
れば、微生物によるＮＡＬの生産技術の新規な改善の手
段を提供したものとして十分なメリットがあるものと考
えられる。
以外の微生物における遺伝子の組み換えも可能となって
きている。そして、前記ＮＡＬ生産能を有する微生物に
関しても、従来公知のエシェリヒア属に属する微生物以
外のものを遺伝子の組み換えにより開発することができ
れば、微生物によるＮＡＬの生産技術の新規な改善の手
段を提供したものとして十分なメリットがあるものと考
えられる。
本発明の目的は、かかる、技術の多様化、または、豊富
化の観点から、従来ＮＡＬ生産能のあるものが全く知ら
れていなかったプロビデンシア属に属する微生物を遺伝
子光学的手法で形質転換することにより、ＮＡＬ生産能
のある新規なプロビデンシア属に属する微生物による新
規なＮＡＬの製造方法を提供することにある。
化の観点から、従来ＮＡＬ生産能のあるものが全く知ら
れていなかったプロビデンシア属に属する微生物を遺伝
子光学的手法で形質転換することにより、ＮＡＬ生産能
のある新規なプロビデンシア属に属する微生物による新
規なＮＡＬの製造方法を提供することにある。
本発明は上記目的に基づいて鋭意研究を重ねた結果完成
されたものであって、ＮＡＬをコードする遺伝子ＤＮＡ
を微生物中で複製するベクタープラスミドｐＰＳＴ１０
１に連結した組換え体プラスミドｐＮＬ５Ｐで形質転換
されたプロビデンシア属に属する微生物を培地中で培養
し、培養物中にＮＡを蓄積せしめ、該培養物からＮＡＬ
採取することを特徴とするＮ−アシルノイラミン酸アル
ドラーゼの製造法である。
されたものであって、ＮＡＬをコードする遺伝子ＤＮＡ
を微生物中で複製するベクタープラスミドｐＰＳＴ１０
１に連結した組換え体プラスミドｐＮＬ５Ｐで形質転換
されたプロビデンシア属に属する微生物を培地中で培養
し、培養物中にＮＡを蓄積せしめ、該培養物からＮＡＬ
採取することを特徴とするＮ−アシルノイラミン酸アル
ドラーゼの製造法である。
前記ＮＡＬ遺伝子ＤＮＡとは、ＮＡＬの生産に関与する
ＤＮＡ、すなわち、ＮＡＬをコードする構造遺伝子プロ
モータ、ＳＤ配列および必要によりターミネーターから
なるものである。
ＤＮＡ、すなわち、ＮＡＬをコードする構造遺伝子プロ
モータ、ＳＤ配列および必要によりターミネーターから
なるものである。
そして、本発明において、前記組換え体プラスミドとし
て、ＮＡＬ遺伝子ＤＮＡ以外に、エンドヌクレアーゼPs
t I遺伝子ＤＮＡも共に連結したものを使用するか、ま
たは、宿主のプロビデンシア属に属する微生物としてエ
ンドヌクレアーゼPst I生産能を有するものを選択する
ことにより、前記形質転換されたプロビデンシア属に属
する微生物としてＮＡＬ及びエンドヌクレアーゼPst I
生産能を有する微生物が得られ、該微生物を栄養培地に
培養して、培養物中にＮＡＬ及びエンドヌクレアーゼPs
t Iを同時に蓄積せしめるようにすることができる。
て、ＮＡＬ遺伝子ＤＮＡ以外に、エンドヌクレアーゼPs
t I遺伝子ＤＮＡも共に連結したものを使用するか、ま
たは、宿主のプロビデンシア属に属する微生物としてエ
ンドヌクレアーゼPst I生産能を有するものを選択する
ことにより、前記形質転換されたプロビデンシア属に属
する微生物としてＮＡＬ及びエンドヌクレアーゼPst I
生産能を有する微生物が得られ、該微生物を栄養培地に
培養して、培養物中にＮＡＬ及びエンドヌクレアーゼPs
t Iを同時に蓄積せしめるようにすることができる。
前記エンドヌクレアーゼPst IはＣＴＧＣＡＧの塩基配
列のＤＮＡを認識し、これを切断する酵素であり、遺伝
子工学の研究において頻繁に利用される有用な酵素であ
る。
列のＤＮＡを認識し、これを切断する酵素であり、遺伝
子工学の研究において頻繁に利用される有用な酵素であ
る。
以下本発明を実施のための各ステップにわけて詳細に説
明する。
明する。
(a)組み換え体プラスミド及びその調製 本発明に用いられるＮＡＬ遺伝子ＤＮＡを含む組換え体
プラスミドは、プロビデンシア(Pr-ovidencia)属に属す
る微生物の培養された細胞内での複製能を有するベクタ
ープラスミドにＮＡＬ生産能を有する微生物から調製さ
れたＮＡＬ遺伝子ＤＮＡを組み込んでなるプラスミドで
ある。
プラスミドは、プロビデンシア(Pr-ovidencia)属に属す
る微生物の培養された細胞内での複製能を有するベクタ
ープラスミドにＮＡＬ生産能を有する微生物から調製さ
れたＮＡＬ遺伝子ＤＮＡを組み込んでなるプラスミドで
ある。
前記ベクタープラスミドとしては、例えばProc.Natl.Ac
ad.Sci.,USA,Vol.78.,NO.3,P.1503-1507(1981)記載のpP
ST 101が挙げられる。なお、このpPST 101にはエンドヌ
クレアーゼPst I遺伝子ＤＮＡも含まれており（第１図
参照）、このベクタープラスミドを使用した場合にはエ
ンドヌクレアーゼPst Iの生産性も向上する。なお、前
記Pst I遺伝子ＤＮＡとは、Pst Iのの生産に関与するＤ
ＮＡ、すなわち、Pst Iをコードする構造遺伝子、プロ
モーター、ＳＤ配列および必要によりターミネーターか
らなるものである。
ad.Sci.,USA,Vol.78.,NO.3,P.1503-1507(1981)記載のpP
ST 101が挙げられる。なお、このpPST 101にはエンドヌ
クレアーゼPst I遺伝子ＤＮＡも含まれており（第１図
参照）、このベクタープラスミドを使用した場合にはエ
ンドヌクレアーゼPst Iの生産性も向上する。なお、前
記Pst I遺伝子ＤＮＡとは、Pst Iのの生産に関与するＤ
ＮＡ、すなわち、Pst Iをコードする構造遺伝子、プロ
モーター、ＳＤ配列および必要によりターミネーターか
らなるものである。
さらに、ベクタープラスミドとして前記pPST 101以外
に、pPST 103，pPST 104，pPST 201，pBR322等にあげる
ことができる。
に、pPST 103，pPST 104，pPST 201，pBR322等にあげる
ことができる。
ＮＡＬ遺伝子ＤＮＡとしては、前記の動物組織、ガス壊
疽菌、コレラ菌及び大腸菌から調製することができる
が、大腸菌から調製したものとして、例えばJournal of
Bacteriology,Vol-ume 167,page 404(1986)に記載のプ
ラスミドpNL1（第２図参照）より調製した約1.3kbのEco
RI-EcoRI断片が挙げられる。
疽菌、コレラ菌及び大腸菌から調製することができる
が、大腸菌から調製したものとして、例えばJournal of
Bacteriology,Vol-ume 167,page 404(1986)に記載のプ
ラスミドpNL1（第２図参照）より調製した約1.3kbのEco
RI-EcoRI断片が挙げられる。
また、前記ベクターＤＮＡに前記ＤＮＡ断片を組み込む
方法は、既知のいずれの方法も適用できる。
方法は、既知のいずれの方法も適用できる。
ベクタープラスミドとして、pPST 101を用い、これにＮ
ＡＬ遺伝子ＤＮＡとして、pNL1より調製した約1.3kbのE
coRI-EcoRI断片を組み込むことにより新規なプラスミド
pNL5Pが得られる。pNL5Pの調製工程及その制限酵素地図
を第３図に示す。
ＡＬ遺伝子ＤＮＡとして、pNL1より調製した約1.3kbのE
coRI-EcoRI断片を組み込むことにより新規なプラスミド
pNL5Pが得られる。pNL5Pの調製工程及その制限酵素地図
を第３図に示す。
(b)形質転換微生物の調製 このようにして得られたＮＡＬ遺伝子ＤＮＡを含むベク
ターを既知の形質転換法によりプロビデンシア属に属す
る微生物に導入することにより、所望の遺伝形質とベク
ターＤＮＡの形質を併せもつ形質転換株が得られる。
ターを既知の形質転換法によりプロビデンシア属に属す
る微生物に導入することにより、所望の遺伝形質とベク
ターＤＮＡの形質を併せもつ形質転換株が得られる。
形質転換法としてはJournal of Bacteriology,Volume11
9,page1072に記載のカルシウムイオン処理方が挙げられ
る。
9,page1072に記載のカルシウムイオン処理方が挙げられ
る。
前記プロビデンシア属に属する微生物としては、プロビ
デンシア・スチュアーティー(Pro-videncia stuarti
i)，プロビデンシア・アルカリファシエンス(Providenc
ia Alcalifaciens)，プロビデンシア・レットゲリ(Prov
idencia rett-geri)等があげられる。そして、この内、
Pst I生産能を有するプロビデンシア属に属する微生物
としては、前記プロビデンシア・スチュアーティー(Nuc
leic Acids Research Volume3,page343(1976))が挙げら
れる。かくして得られた微生物の例としては、例えばプ
ロビデンシア・スチュアーティー(Providencia stuarti
i) pNL 5P（微工研菌寄第9077号）がある。
デンシア・スチュアーティー(Pro-videncia stuarti
i)，プロビデンシア・アルカリファシエンス(Providenc
ia Alcalifaciens)，プロビデンシア・レットゲリ(Prov
idencia rett-geri)等があげられる。そして、この内、
Pst I生産能を有するプロビデンシア属に属する微生物
としては、前記プロビデンシア・スチュアーティー(Nuc
leic Acids Research Volume3,page343(1976))が挙げら
れる。かくして得られた微生物の例としては、例えばプ
ロビデンシア・スチュアーティー(Providencia stuarti
i) pNL 5P（微工研菌寄第9077号）がある。
(c)ＮＡＬの生産 工程(b)で得られた形質転換株を培養するには、ＮＡＬ
の生産に適した培地であって且つ宿主微生物の生育に適
した培地を用い得るが、培地中でＮＡＬの生産と同時に
Pst Iの生産をも行わせる場合には、前記培地はPst Iの
生産にも適したものを用いる。
の生産に適した培地であって且つ宿主微生物の生育に適
した培地を用い得るが、培地中でＮＡＬの生産と同時に
Pst Iの生産をも行わせる場合には、前記培地はPst Iの
生産にも適したものを用いる。
そして、本発明方法では、通常エシェリヒア・コリの生
育培地として用いられるＬＢ培地（トリプトン、酵母セ
キス、食塩）ＢＰＢ培地（Difco；ポリペプトン、酵母
エキス、リン酸カリウ）、栄養・寒天培地(Difco 000
1)、トリプトン・食塩培地等を基本培地として調製した
ものを用いればよい。
育培地として用いられるＬＢ培地（トリプトン、酵母セ
キス、食塩）ＢＰＢ培地（Difco；ポリペプトン、酵母
エキス、リン酸カリウ）、栄養・寒天培地(Difco 000
1)、トリプトン・食塩培地等を基本培地として調製した
ものを用いればよい。
その他、必要に応じて炭素原、窒素原の他にアミノ酸、
ビタミン等の栄養素を添加してもよい。
ビタミン等の栄養素を添加してもよい。
培養方法は、pH、温度、酸素供給量等の条件として通常
のエシェリヒア属の微生物の生育に適した条件を採り得
るが、前記微生物を培地に接種した後、前記微生物が生
育してその菌体量が最大に達したとき、即ち対数増殖後
期まで生育させるのが好ましい。培養温度は通常30〜37
℃、pH条件は、pH５〜８の範囲、特に中性付近が適当で
ある。
のエシェリヒア属の微生物の生育に適した条件を採り得
るが、前記微生物を培地に接種した後、前記微生物が生
育してその菌体量が最大に達したとき、即ち対数増殖後
期まで生育させるのが好ましい。培養温度は通常30〜37
℃、pH条件は、pH５〜８の範囲、特に中性付近が適当で
ある。
得られた菌体を集菌後、遠心分離、超音波破砕工程等に
より抽出し、次いで硫安分画、凍結乾燥等、通常この種
の高分子生理活性物質の分離精製方法にしたがって処理
することによりＮＡＬ、あるいは、これと共にエンドヌ
クレアーゼPst Iを得ることができる。
より抽出し、次いで硫安分画、凍結乾燥等、通常この種
の高分子生理活性物質の分離精製方法にしたがって処理
することによりＮＡＬ、あるいは、これと共にエンドヌ
クレアーゼPst Iを得ることができる。
以下、本発明を実施例により、更に詳しく説明するが、
本発明は何らこれらに限定されるものではない。
本発明は何らこれらに限定されるものではない。
実施例 (1)ベクタープラスミドpPST 101の精製 別紙第１図の通り調製されたベクタープラスミドpPST 1
01のＤＮＡを保有するプロビデンシア・スチュアーティ
ーをアイオワ大学のR.Y.ワルダー博士から得た。このプ
ロビデンシア・スチュアーティーを以下の通り精製して
ベクタープラスミドpPST 101を得た。すなわちpPST 101
のＤＮＡをプラスミドとして保有するプロビデンシア・
スチュアーティーをＬＢ培地〔純粋１あたりトリプト
ン(Difco)10ｇ、酵母エキス５ｇ、NaCl10ｇをpH7.0に調
製したもの〕１に接種し、30℃で振盪培養を行なっ
た。18時間後に菌体を集める。次に集めた菌体を５mg／
mlのリゾチーム（太陽化学（株）製）、50mMグルコー
ス、10mMＥＤＴＡを含む25mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)2
0mlに懸濁し、室温で５分間静置する。次に１％ＳＤＳ
を含む0.2N NaOH溶液40mlを加え、氷上で10分間静置す
る。更に３Ｍの酢酸ナトリウム溶液(pH4.8)を30ml加
え、氷上で10分間静置後、20,000rpm 20分間の遠心分離
を行なう。上清にイソプロパノールを加え、室温で15分
間放置する。12,000rpm 30分間の遠心分離を行ない、得
られた沈殿物について、70％エタノール洗浄後、16mlの
1mMＥＤＴＡ含む10mMトリス塩酸緩衝液に溶解させる。
次に、16ｇの塩化セシウム0.8mlのエチジウムブロマイ
ド溶液と混合し、38,000rpm 40時間の遠心分離を行なっ
た。プラスミドＤＮＡ層を注射器でぬきとり、ｎ−ブタ
ノール抽出によってエチジウムブロマイドを除去し、1m
MＥＤＴＡを含む10mMトリス塩緩衝液(pH8.0)に透析する
ことにより約700μｇのpPST101ＤＮＡを取得した。
01のＤＮＡを保有するプロビデンシア・スチュアーティ
ーをアイオワ大学のR.Y.ワルダー博士から得た。このプ
ロビデンシア・スチュアーティーを以下の通り精製して
ベクタープラスミドpPST 101を得た。すなわちpPST 101
のＤＮＡをプラスミドとして保有するプロビデンシア・
スチュアーティーをＬＢ培地〔純粋１あたりトリプト
ン(Difco)10ｇ、酵母エキス５ｇ、NaCl10ｇをpH7.0に調
製したもの〕１に接種し、30℃で振盪培養を行なっ
た。18時間後に菌体を集める。次に集めた菌体を５mg／
mlのリゾチーム（太陽化学（株）製）、50mMグルコー
ス、10mMＥＤＴＡを含む25mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)2
0mlに懸濁し、室温で５分間静置する。次に１％ＳＤＳ
を含む0.2N NaOH溶液40mlを加え、氷上で10分間静置す
る。更に３Ｍの酢酸ナトリウム溶液(pH4.8)を30ml加
え、氷上で10分間静置後、20,000rpm 20分間の遠心分離
を行なう。上清にイソプロパノールを加え、室温で15分
間放置する。12,000rpm 30分間の遠心分離を行ない、得
られた沈殿物について、70％エタノール洗浄後、16mlの
1mMＥＤＴＡ含む10mMトリス塩酸緩衝液に溶解させる。
次に、16ｇの塩化セシウム0.8mlのエチジウムブロマイ
ド溶液と混合し、38,000rpm 40時間の遠心分離を行なっ
た。プラスミドＤＮＡ層を注射器でぬきとり、ｎ−ブタ
ノール抽出によってエチジウムブロマイドを除去し、1m
MＥＤＴＡを含む10mMトリス塩緩衝液(pH8.0)に透析する
ことにより約700μｇのpPST101ＤＮＡを取得した。
(2)ＮＡＬ遺伝子ＤＮＡの調製（第３図参照） まず特願昭60-139807号（特開昭62-277号）に記載のプ
ラスミドpNL1（第２図参照）を保有するEscherichia co
li HB101を１のＬＢ培地に接種し、上記(1)と同様の
方法により最終1,000μｇのpNL1を取得した。次に得ら
れたpNL1の10μｇについて、50Ｕのエンドヌクレアーゼ
EcoRIを加え、37℃，１時間の反応を行なうことによ
り、これを完全に切断した。更に150Ｖ，１時間の１％
アガロース電気泳動を行ない、１μｇ／mlのエチジウム
ブロマイド溶液にて染色後1.3kbのEcoRI-EcoRI断片を含
むゲルを切り出し、核酸回収器（和科盛製）にてゲルよ
り回収した。ｎ−ブタノール抽出によってエチジウムブ
ロマイドを除去し、１mMＥＤＴＡを含む10mMトリス塩酸
緩衝液にて透析することにより、ＮＡＬ遺伝子ＤＮＡが
約１μｇのＤＮＡ断片として得られた。
ラスミドpNL1（第２図参照）を保有するEscherichia co
li HB101を１のＬＢ培地に接種し、上記(1)と同様の
方法により最終1,000μｇのpNL1を取得した。次に得ら
れたpNL1の10μｇについて、50Ｕのエンドヌクレアーゼ
EcoRIを加え、37℃，１時間の反応を行なうことによ
り、これを完全に切断した。更に150Ｖ，１時間の１％
アガロース電気泳動を行ない、１μｇ／mlのエチジウム
ブロマイド溶液にて染色後1.3kbのEcoRI-EcoRI断片を含
むゲルを切り出し、核酸回収器（和科盛製）にてゲルよ
り回収した。ｎ−ブタノール抽出によってエチジウムブ
ロマイドを除去し、１mMＥＤＴＡを含む10mMトリス塩酸
緩衝液にて透析することにより、ＮＡＬ遺伝子ＤＮＡが
約１μｇのＤＮＡ断片として得られた。
(3)ＮＡＬ遺伝子ＤＮＡのベクタープラスミドpPST 101
への挿入（第３図参照） 上記(1)で得られたベクタープラスミドpPST 101 10μｇ
について50ＵのエンドヌクレアーゼEcoRIを加え、37
℃，１時間の反応を行なうことによりこれを完全に切断
後、１Ｕのアルカリフォスファターゼを加え、37℃，１
時間の反応を行ない５′末端のリン酸を除去した。次に
上記(2)で得られたＤＮＡ断片0.5μｇとpPST 101のＤＮ
Ａ断片１μｇを混合し、１mMＡＴＰ及び５mMジチオスレ
イトールの存在下に、５ＵのＴ４ファージ由来のＤＮＡ
リガーゼを用いて15℃16時間のＤＮＡ鎖の連結反応を行
って、ＮＡＬ遺伝子ＤＮＡを含んだ組換え体プラスミド
pNL 5Pを得た。
への挿入（第３図参照） 上記(1)で得られたベクタープラスミドpPST 101 10μｇ
について50ＵのエンドヌクレアーゼEcoRIを加え、37
℃，１時間の反応を行なうことによりこれを完全に切断
後、１Ｕのアルカリフォスファターゼを加え、37℃，１
時間の反応を行ない５′末端のリン酸を除去した。次に
上記(2)で得られたＤＮＡ断片0.5μｇとpPST 101のＤＮ
Ａ断片１μｇを混合し、１mMＡＴＰ及び５mMジチオスレ
イトールの存在下に、５ＵのＴ４ファージ由来のＤＮＡ
リガーゼを用いて15℃16時間のＤＮＡ鎖の連結反応を行
って、ＮＡＬ遺伝子ＤＮＡを含んだ組換え体プラスミド
pNL 5Pを得た。
(4)ＮＡＬ遺伝子ＤＮＡを含む組換え体プラスミドpNL 5
Pによる形質転換 エンドヌクレアーゼPst I生産能を有するプロビデンシ
ア・スチュアーティー164（コールドスプリングハーバ
ー研究所のR.J.ロバーツ博士から入手した）を前記ＬＢ
培地10mlに接種し、30℃で振盪培養を行ない対数増殖期
まで成育させた後に集菌した。これを氷冷下、最終濃度
0.03ＭCaCl2の溶液に懸濁させてコンピテントな細胞と
した。この細胞懸濁液に(3)で得た組換え体プラスミドp
NL 5Pの溶解液を加えて、氷冷下で60分反応させ、42
℃，１〜２分間ヒートショックを与えて、前記組換え体
プラスミドpNL 5Pを細胞内に取りこませた。次いでこの
細胞懸濁液を別途前記ＬＢ培地に接種し、37℃，３〜５
時間振盪培養して形質転換反応を行なった後、アンピシ
リン耐性を有し、且つＮＡＬ生産能を有する株、プロビ
デンシア・スチュアーティー(pNL 5P)（微工研菌寄第90
77号）を分離した。
Pによる形質転換 エンドヌクレアーゼPst I生産能を有するプロビデンシ
ア・スチュアーティー164（コールドスプリングハーバ
ー研究所のR.J.ロバーツ博士から入手した）を前記ＬＢ
培地10mlに接種し、30℃で振盪培養を行ない対数増殖期
まで成育させた後に集菌した。これを氷冷下、最終濃度
0.03ＭCaCl2の溶液に懸濁させてコンピテントな細胞と
した。この細胞懸濁液に(3)で得た組換え体プラスミドp
NL 5Pの溶解液を加えて、氷冷下で60分反応させ、42
℃，１〜２分間ヒートショックを与えて、前記組換え体
プラスミドpNL 5Pを細胞内に取りこませた。次いでこの
細胞懸濁液を別途前記ＬＢ培地に接種し、37℃，３〜５
時間振盪培養して形質転換反応を行なった後、アンピシ
リン耐性を有し、且つＮＡＬ生産能を有する株、プロビ
デンシア・スチュアーティー(pNL 5P)（微工研菌寄第90
77号）を分離した。
(5)プロビデンシア・スチュアーティー(pNL 5P)による
ＮＡＬ及びエンドヌクレアーゼPst Iの生産 (4)で得られた形質転換株、プロビデンシア・スチュア
ーティーpNL 5P)（微工研菌寄第9077号）を前記ＬＢ培
地100mlを含む500ml容のフラスコで30℃にて16時間振盪
培養を行なった。これを遠心分離にて集菌、洗浄後、pH
7.5に調製した0.1Ｍリン酸緩衝液20mlに懸濁し、０℃で
10分間の超音波破砕し、酵素抽出液を得た。次いで、こ
こに得られた抽出液を硫安で塩析し、30〜80％飽和区分
（飽和度はOsborne法で表示）を凍結乾燥して粗粉末50m
gを得た。ここに得られた粗粉末１mgあたりのＮＡＬ活
性は0.1単位、エンドヌクレアーゼPst I活性は400単位
であった。上記において比較のため、前記ＬＢ培地にて
宿主微生物であるプロビデンシア・スチュアーティーを
同様に培養し、上記と同様に処理した結果、得られたＮ
ＡＬの粗粉末は50mgで、粉末１mgあたりのＮＡＬ活性は
0.003単位、エンドヌレアーゼPst I活性は40単位であっ
た。このことからＮＡＬ遺伝子ＤＮＡ及びエンドヌクレ
アーゼPst I遺伝子ＤＮＡを含む前記組み換え体プラス
ミドで形質転換されたプロビデンシア・スチュアーティ
ー(pNL 5P)はシアル酸を含まない栄養培地において、宿
主微生物であるプロビデンシア・スチュアーティーの約
30倍のＮＡＬ生産能及び約10倍のエンドヌクレアーゼPs
t I生産能を有することがわかる。なお、ＮＡＬの活性
の測定は、pH7.5の100mMリン酸緩衝液中で24mMのＮ−ア
シルノイラミン酸を含む混合液を調製し、その混合液に
適当量の粗酵素抽出液を加えて最終液量を0.3mlとし、3
7℃で反応を行ない生成するピルビン酸をＤＮＰ法〔日
本分析化学会、分析化学ライブラリー、３、182、(197
0)〕で定量することによって行なった。酵素活性におけ
る１単位は反応温度37℃において１分間に１μモルのピ
ルビン酸を生成する活性をいう。また、エンドヌクレア
ーゼPst Iの活性の測定は、１μｇのλ−ＤＮＡを20mM
トリス塩酸緩衝液、10mM塩化マグネシウム溶液、50mM硫
酸アンモニウム、７mM２−メルカプトエタノールからな
る反応液45μｌに溶解し、その混合液に５μｌの酵素液
を加えて、37℃で１時間の反応を行なった後、アガロー
ス電気泳動を行なうことにより測定する。酵素活性にお
ける１単位は、37℃pH7.5において１時間に１μｇのλ
−ＤＮＡを完全に分解する酵素活性をいう。
ＮＡＬ及びエンドヌクレアーゼPst Iの生産 (4)で得られた形質転換株、プロビデンシア・スチュア
ーティーpNL 5P)（微工研菌寄第9077号）を前記ＬＢ培
地100mlを含む500ml容のフラスコで30℃にて16時間振盪
培養を行なった。これを遠心分離にて集菌、洗浄後、pH
7.5に調製した0.1Ｍリン酸緩衝液20mlに懸濁し、０℃で
10分間の超音波破砕し、酵素抽出液を得た。次いで、こ
こに得られた抽出液を硫安で塩析し、30〜80％飽和区分
（飽和度はOsborne法で表示）を凍結乾燥して粗粉末50m
gを得た。ここに得られた粗粉末１mgあたりのＮＡＬ活
性は0.1単位、エンドヌクレアーゼPst I活性は400単位
であった。上記において比較のため、前記ＬＢ培地にて
宿主微生物であるプロビデンシア・スチュアーティーを
同様に培養し、上記と同様に処理した結果、得られたＮ
ＡＬの粗粉末は50mgで、粉末１mgあたりのＮＡＬ活性は
0.003単位、エンドヌレアーゼPst I活性は40単位であっ
た。このことからＮＡＬ遺伝子ＤＮＡ及びエンドヌクレ
アーゼPst I遺伝子ＤＮＡを含む前記組み換え体プラス
ミドで形質転換されたプロビデンシア・スチュアーティ
ー(pNL 5P)はシアル酸を含まない栄養培地において、宿
主微生物であるプロビデンシア・スチュアーティーの約
30倍のＮＡＬ生産能及び約10倍のエンドヌクレアーゼPs
t I生産能を有することがわかる。なお、ＮＡＬの活性
の測定は、pH7.5の100mMリン酸緩衝液中で24mMのＮ−ア
シルノイラミン酸を含む混合液を調製し、その混合液に
適当量の粗酵素抽出液を加えて最終液量を0.3mlとし、3
7℃で反応を行ない生成するピルビン酸をＤＮＰ法〔日
本分析化学会、分析化学ライブラリー、３、182、(197
0)〕で定量することによって行なった。酵素活性におけ
る１単位は反応温度37℃において１分間に１μモルのピ
ルビン酸を生成する活性をいう。また、エンドヌクレア
ーゼPst Iの活性の測定は、１μｇのλ−ＤＮＡを20mM
トリス塩酸緩衝液、10mM塩化マグネシウム溶液、50mM硫
酸アンモニウム、７mM２−メルカプトエタノールからな
る反応液45μｌに溶解し、その混合液に５μｌの酵素液
を加えて、37℃で１時間の反応を行なった後、アガロー
ス電気泳動を行なうことにより測定する。酵素活性にお
ける１単位は、37℃pH7.5において１時間に１μｇのλ
−ＤＮＡを完全に分解する酵素活性をいう。
本発明によれば、新規なＮＡＬ生産能のあるプロビデン
シア属に属する微生物が得られ、かつ、それの培養によ
りＮＡＬの工業的生産が可能となる。
シア属に属する微生物が得られ、かつ、それの培養によ
りＮＡＬの工業的生産が可能となる。
第１図はpPST 101の調製法及び制限酵素地図を示す図、
第２図はpNL1の調製法及び制限酵素地図を示す図、及
び、第３図はpNL 5Pの調製工程及び制限酵素地図を示す
図である。
第２図はpNL1の調製法及び制限酵素地図を示す図、及
び、第３図はpNL 5Pの調製工程及び制限酵素地図を示す
図である。
Claims (1)
- 【請求項１】Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼをコ
ードする遺伝子ＤＮＡを微生物中で複製するベクタープ
ラスミドｐＰＳＴ１０１に連結した組換え体プラスミド
ｐＮＬ５Ｐで形質転換されたプロビデンシア属に属する
微生物を培地中で培養し、培養物中にＮ−アシルノイラ
ミン酸アルドラーゼを蓄積せしめ、該培養物からＮ−ア
シルノイラミン酸アルドラーゼを採取することを特徴と
するＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62042878A JPH0665301B2 (ja) | 1987-02-27 | 1987-02-27 | Ｎａｌ（ｎ―アシルノイラミン酸アルドラーゼ）の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62042878A JPH0665301B2 (ja) | 1987-02-27 | 1987-02-27 | Ｎａｌ（ｎ―アシルノイラミン酸アルドラーゼ）の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63209589A JPS63209589A (ja) | 1988-08-31 |
| JPH0665301B2 true JPH0665301B2 (ja) | 1994-08-24 |
Family
ID=12648298
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62042878A Expired - Lifetime JPH0665301B2 (ja) | 1987-02-27 | 1987-02-27 | Ｎａｌ（ｎ―アシルノイラミン酸アルドラーゼ）の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0665301B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2754689B2 (ja) * | 1989-03-28 | 1998-05-20 | 東レ株式会社 | トリプトファナーゼ生産能を有する形質転換体およびｌ―トリプトファンの製造法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6181786A (ja) * | 1984-08-30 | 1986-04-25 | Marukin Shoyu Kk | Ｎ―アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミド及び形質転換微生物 |
| JPS62277A (ja) * | 1985-06-26 | 1987-01-06 | Rikagaku Kenkyusho | 新規プラスミド及びそれにより形質転換された新規微生物及びそれを用いた有用生理活性物質の製造法 |
-
1987
- 1987-02-27 JP JP62042878A patent/JPH0665301B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6181786A (ja) * | 1984-08-30 | 1986-04-25 | Marukin Shoyu Kk | Ｎ―アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミド及び形質転換微生物 |
| JPS62277A (ja) * | 1985-06-26 | 1987-01-06 | Rikagaku Kenkyusho | 新規プラスミド及びそれにより形質転換された新規微生物及びそれを用いた有用生理活性物質の製造法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63209589A (ja) | 1988-08-31 |
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