JPH0697995B2 - 形質転換微生物 - Google Patents
形質転換微生物Info
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- JPH0697995B2 JPH0697995B2 JP26305685A JP26305685A JPH0697995B2 JP H0697995 B2 JPH0697995 B2 JP H0697995B2 JP 26305685 A JP26305685 A JP 26305685A JP 26305685 A JP26305685 A JP 26305685A JP H0697995 B2 JPH0697995 B2 JP H0697995B2
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- Japan
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- strain
- acylneuraminic
- enzyme
- medium
- acid aldolase
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、エシエリヒア属に属し、Ｎ−アシルノイラミ
ン酸アルドラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドを導入
して形質転換された新規な微生物に関する。
ン酸アルドラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミドを導入
して形質転換された新規な微生物に関する。
従来の技術 Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ（Ｎ−acylneuram
inate aldolase）は、別名シアル酸アルドラーゼとも呼
ばれ、国際生化学連合酵素委員会の酵素番号E.C.4.1.3.
3.に分類され、系統名ではＮ−アシルノイラミン酸：ピ
ルビン酸リアーゼ（Ｎ−acylneuraminate:pyruvate lya
se）と呼ばれている酵素である。本酵素は下記の反応式
に示す如く、シアル酸（Ｎ−アシルノイラミン酸）の分
解及び合成反応を触媒する酵素である。
inate aldolase）は、別名シアル酸アルドラーゼとも呼
ばれ、国際生化学連合酵素委員会の酵素番号E.C.4.1.3.
3.に分類され、系統名ではＮ−アシルノイラミン酸：ピ
ルビン酸リアーゼ（Ｎ−acylneuraminate:pyruvate lya
se）と呼ばれている酵素である。本酵素は下記の反応式
に示す如く、シアル酸（Ｎ−アシルノイラミン酸）の分
解及び合成反応を触媒する酵素である。
シアル酸Ｎ−アシルマンノサミン＋ピルビン酸 本発明者らは、先にエシエリヒア属、その他の数種の属
に属する公知菌を、シアル酸の存在下に培養する時に
は、上記Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼが、工業
的規模で容易に製造できることを見い出し、該酵素の製
造技術を確立した（特公昭56−54153号、特許第1111346
号）。
に属する公知菌を、シアル酸の存在下に培養する時に
は、上記Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼが、工業
的規模で容易に製造できることを見い出し、該酵素の製
造技術を確立した（特公昭56−54153号、特許第1111346
号）。
しかるに上記確立された方法では、培地へのシアル酸の
添加が必須であり、このシアル酸自体その調製に繁雑な
操作等を要し且つ高価なものである不利があつた。しか
もこのシアル酸添加を行なわない限り、Ｎ−アシルノイ
ラミン酸アルドラーゼは生産されないかあるいは極微量
生産されるのみで、到底工業的実施はできないものであ
つた。即ち上記方法に利用される微生物は、それ自体シ
アル酸の不存在下ではＮ−アシルノイラミン酸生産能を
実質的に発現できないものであつた。
添加が必須であり、このシアル酸自体その調製に繁雑な
操作等を要し且つ高価なものである不利があつた。しか
もこのシアル酸添加を行なわない限り、Ｎ−アシルノイ
ラミン酸アルドラーゼは生産されないかあるいは極微量
生産されるのみで、到底工業的実施はできないものであ
つた。即ち上記方法に利用される微生物は、それ自体シ
アル酸の不存在下ではＮ−アシルノイラミン酸生産能を
実質的に発現できないものであつた。
本発明者らは、上記方法の最大の欠点とするシアル酸利
用を必須とする点を解消し、該シアル酸を利用せずとも
工業的規模で大量のＮ−アシルノイラミン酸アルドラー
ゼを製造できる技術を開発するべく鋭意研究を重ねた結
果、上記方法に利用される微生物のうちエシエリヒア属
に属するものを変異処理して得られる変異株が、シアル
酸、その類縁体等の誘導物質の無添加培地でも著量の目
的酵素を生産するという事実を見い出し、この知見に基
づく発明を完成した（特開昭60−184384号公報）。
用を必須とする点を解消し、該シアル酸を利用せずとも
工業的規模で大量のＮ−アシルノイラミン酸アルドラー
ゼを製造できる技術を開発するべく鋭意研究を重ねた結
果、上記方法に利用される微生物のうちエシエリヒア属
に属するものを変異処理して得られる変異株が、シアル
酸、その類縁体等の誘導物質の無添加培地でも著量の目
的酵素を生産するという事実を見い出し、この知見に基
づく発明を完成した（特開昭60−184384号公報）。
引続く研究において、本発明者らはまた、前記確立され
た方法に利用される微生物のうちエシエリヒア属に属す
るものからＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子
を含む染色体DNA断片を抽出し、これをエシエリヒア・
コリー系ベクターに組込んで組換えプラスミドを作成す
ることに成功すると共に、該プラスミドで形質転換させ
たエシエリヒア属に属するＮ−アシルノイラミン酸アル
ドラーゼ生産菌又は該酵素の欠損株が、上記変異株と同
様にシアル酸等の誘導物質の無添加培地で、目的とする
酵素を著量生産できるという事実をも発見し、この知見
に係る発明をも完成した（特願昭59−181250号）。
た方法に利用される微生物のうちエシエリヒア属に属す
るものからＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子
を含む染色体DNA断片を抽出し、これをエシエリヒア・
コリー系ベクターに組込んで組換えプラスミドを作成す
ることに成功すると共に、該プラスミドで形質転換させ
たエシエリヒア属に属するＮ−アシルノイラミン酸アル
ドラーゼ生産菌又は該酵素の欠損株が、上記変異株と同
様にシアル酸等の誘導物質の無添加培地で、目的とする
酵素を著量生産できるという事実をも発見し、この知見
に係る発明をも完成した（特願昭59−181250号）。
発明が解決しようとする問題点 本発明の目的は、上記従来技術は勿論のこと、本発明者
らが新たに開発した技術に見られる目的酵素の生産性を
も凌ぐ非常に優れた酵素生産能を有する、より改良され
た形質転換微生物及び該微生物による目的酵素の製造技
術を確立することにある。
らが新たに開発した技術に見られる目的酵素の生産性を
も凌ぐ非常に優れた酵素生産能を有する、より改良され
た形質転換微生物及び該微生物による目的酵素の製造技
術を確立することにある。
問題点を解決するための手段 本発明によれば、誘導物質の不存在下にＮ−アシルノイ
ラミン酸アルドラーゼ生産能を発現するように変異され
たエシェリヒア・コリーの変異株に、エシェリヒア属に
属するＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ生産菌由来
のＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子を含む染
色体DNA断片を組込んだ組換えプラスミドが導入されて
いることを特徴とする形質転換微生物が提供される。
ラミン酸アルドラーゼ生産能を発現するように変異され
たエシェリヒア・コリーの変異株に、エシェリヒア属に
属するＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ生産菌由来
のＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子を含む染
色体DNA断片を組込んだ組換えプラスミドが導入されて
いることを特徴とする形質転換微生物が提供される。
本発明は、本発明者らが先に開発した上記変異株を宿主
として、これに先に開発した特定のプラスミドを導入し
て形質転換させる時には、該形質転換株が、実に驚くべ
きことに、宿主とする変異株及び先の形質転換株のいず
れからも全く予期できない非常に優れた目的酵素生産能
を発現するという事実、即ち本発明に係わる形質転換株
は、その目的酵素生産能が、飛躍的に向上されたものと
なるという事実の発見に基づいて完成されたものであ
る。従つて本発明の形質転換変異株を利用する方法によ
れば、通常の微生物の培養用培地を用いて従来不可能で
あつた非常に著量の目的酵素を容易に工業的規模で製造
採取することができる。
として、これに先に開発した特定のプラスミドを導入し
て形質転換させる時には、該形質転換株が、実に驚くべ
きことに、宿主とする変異株及び先の形質転換株のいず
れからも全く予期できない非常に優れた目的酵素生産能
を発現するという事実、即ち本発明に係わる形質転換株
は、その目的酵素生産能が、飛躍的に向上されたものと
なるという事実の発見に基づいて完成されたものであ
る。従つて本発明の形質転換変異株を利用する方法によ
れば、通常の微生物の培養用培地を用いて従来不可能で
あつた非常に著量の目的酵素を容易に工業的規模で製造
採取することができる。
以下、本発明に係わる形質転換株の製造法につき詳述す
る。
る。
本発明においては、宿主としてエシエリヒア属に属する
変異株を用いることが重要である。該変異株について
は、先の特開昭60−184384号に詳述されている通り、公
知の各種エシエリヒア属微生物に、公知の各種変異処理
手段を適用することにより得られる。本発明に特に好適
に用いられる上記変異株の一例としては、エシエリヒア
コリー（E.coli）IFO3301を親株とし、これをニトロ
ソグアニジンを用いて変異処理して得られるエシエリヒ
ア コリー M8328（微工研条寄第832号、FERM BP−83
2）を例示できる。
変異株を用いることが重要である。該変異株について
は、先の特開昭60−184384号に詳述されている通り、公
知の各種エシエリヒア属微生物に、公知の各種変異処理
手段を適用することにより得られる。本発明に特に好適
に用いられる上記変異株の一例としては、エシエリヒア
コリー（E.coli）IFO3301を親株とし、これをニトロ
ソグアニジンを用いて変異処理して得られるエシエリヒ
ア コリー M8328（微工研条寄第832号、FERM BP−83
2）を例示できる。
本発明の形質転換微生物は、上記変異株を初めとして、
シアル酸添加培地でＮ−アシルノイラミン酸アルドラー
ゼ生産能を有する各種微生物を同様に変異処理して得ら
れる変異株に、Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺
伝子を含む特定のプラスミドを導入することにより得ら
れる。
シアル酸添加培地でＮ−アシルノイラミン酸アルドラー
ゼ生産能を有する各種微生物を同様に変異処理して得ら
れる変異株に、Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺
伝子を含む特定のプラスミドを導入することにより得ら
れる。
上記プラスミドは、エシエリヒア属に属するＮ−アシル
ノイラミン酸アルドラーゼ生産菌由来のＮ−アシルノイ
ラミン酸アルドラーゼ遺伝子を含む染色体DNA断片を、
エシエリヒア・コリー系ベクターに組込むことにより製
造される。ここで染色体DNA供与菌として用いられるエ
シエリヒア属細菌は、例えばエシエリヒア・コリー（E.
coli）のようなＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ高
生産性のものであるのが好ましいが、Ｎ−アシルノイラ
ミン酸アルドラーゼ産性能を有する限り特に制限はな
く、公知の各種細菌をいずれも使用可能である。
ノイラミン酸アルドラーゼ生産菌由来のＮ−アシルノイ
ラミン酸アルドラーゼ遺伝子を含む染色体DNA断片を、
エシエリヒア・コリー系ベクターに組込むことにより製
造される。ここで染色体DNA供与菌として用いられるエ
シエリヒア属細菌は、例えばエシエリヒア・コリー（E.
coli）のようなＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ高
生産性のものであるのが好ましいが、Ｎ−アシルノイラ
ミン酸アルドラーゼ産性能を有する限り特に制限はな
く、公知の各種細菌をいずれも使用可能である。
上記Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ生産菌からの
染色体DNAの調製は、通常の方法、例えばフエノールを
用いる方法〔Saito−Miura法、Biochim.Biophys.Acta.,
72,619（1963）〕等により行なわれる。
染色体DNAの調製は、通常の方法、例えばフエノールを
用いる方法〔Saito−Miura法、Biochim.Biophys.Acta.,
72,619（1963）〕等により行なわれる。
調製された染色体DNAは、次いでベクターと連結するた
めに切断される。この染色体DNAの切断は、通常の制限
エンドヌクレアーゼを用いる方法により行なわれるが、
特にこの方法に限定されず、Ｎ−アシルノイラミン酸ア
ルドラーゼ遺伝子を切断しない限り、例えば物理的に剪
断力を加えて切断する方法等によることもできる。制限
エンドヌクレアーゼを用いて染色体DNAを切断する方法
の実施に当り、完全切断を起こす反応条件を採用する場
合には、目的とするＮ−アシルノイラミン酸アルドラー
ゼ遺伝子に切断部位を持たない各種の制限エンドヌクレ
アーゼを用いることができ、また部分的にしか切断を起
こさない反応条件を採用する場合には、全ての種類の制
限エンドヌクレアーゼを用いることができる。特にベク
ターとの連結の容易さから該制限エンドヌクレアーゼと
しては、用いられるベクターに唯一の切断部位を有する
ものが好ましい。
めに切断される。この染色体DNAの切断は、通常の制限
エンドヌクレアーゼを用いる方法により行なわれるが、
特にこの方法に限定されず、Ｎ−アシルノイラミン酸ア
ルドラーゼ遺伝子を切断しない限り、例えば物理的に剪
断力を加えて切断する方法等によることもできる。制限
エンドヌクレアーゼを用いて染色体DNAを切断する方法
の実施に当り、完全切断を起こす反応条件を採用する場
合には、目的とするＮ−アシルノイラミン酸アルドラー
ゼ遺伝子に切断部位を持たない各種の制限エンドヌクレ
アーゼを用いることができ、また部分的にしか切断を起
こさない反応条件を採用する場合には、全ての種類の制
限エンドヌクレアーゼを用いることができる。特にベク
ターとの連結の容易さから該制限エンドヌクレアーゼと
しては、用いられるベクターに唯一の切断部位を有する
ものが好ましい。
かくして切断された染色体DNA断片を挿入結合されるベ
クターDNAとしては、通常用いられる各種のものをいず
れも利用することができ、特にエシエリヒア・コリー系
ベクターが好適である。上記ベクターの例としては、例
えばColE1の系統、pSC101の系統、pBR322の系統、pACYC
177の系統、pCR1の系統、R6Kの系統、ラムダフアージの
系統等を例示できる。
クターDNAとしては、通常用いられる各種のものをいず
れも利用することができ、特にエシエリヒア・コリー系
ベクターが好適である。上記ベクターの例としては、例
えばColE1の系統、pSC101の系統、pBR322の系統、pACYC
177の系統、pCR1の系統、R6Kの系統、ラムダフアージの
系統等を例示できる。
上記染色体DNAとベクターDNAとの結合は、一般的に行な
われている方法、例えば供与染色体とベクターとを同一
の制限エンドヌクレアーゼで切断し、しかる後に之等を
DNAリガーゼを用いて結合させる方法により行なわれる
が、この方法に限定されることなく、他の如何なる方法
によつてもよい。
われている方法、例えば供与染色体とベクターとを同一
の制限エンドヌクレアーゼで切断し、しかる後に之等を
DNAリガーゼを用いて結合させる方法により行なわれる
が、この方法に限定されることなく、他の如何なる方法
によつてもよい。
かくして得られる組換えプラスミド（供与染色体DNA断
片とベクターとの結合体）は、次に宿主（組換えプラス
ミド受容菌）である前記エシエリヒア属に属する変異株
に導入される。該宿主菌に上記プラスミドを導入して形
質転換を行なわせる方法は、代表的には例えばコンピテ
ント細胞を用いる形質転換法〔Mol.Gen.Genet.,167,251
（1979）〕等に従うことができる。本発明では特にこの
方法に限定されることなく他の公知の各種の方法をいず
れも採用することができる。
片とベクターとの結合体）は、次に宿主（組換えプラス
ミド受容菌）である前記エシエリヒア属に属する変異株
に導入される。該宿主菌に上記プラスミドを導入して形
質転換を行なわせる方法は、代表的には例えばコンピテ
ント細胞を用いる形質転換法〔Mol.Gen.Genet.,167,251
（1979）〕等に従うことができる。本発明では特にこの
方法に限定されることなく他の公知の各種の方法をいず
れも採用することができる。
上記方法により得られる形質転換株から目的とするＮ−
アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子を含む供与染色
体DNA断片を保有し、該酵素をシアル酸等の誘導物質の
不存在下に著量生産する能力を有する目的の微生物の選
択分離は、何ら特殊な方法によらずとも、通常の方法に
より、例えば所望の染色体上の遺伝形質もしくはベクタ
ーの持つ形質又はこれらの両者を合せ持つ菌のクローン
を選択的に生育させ得る培地を利用する方法により実施
できる。
アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子を含む供与染色
体DNA断片を保有し、該酵素をシアル酸等の誘導物質の
不存在下に著量生産する能力を有する目的の微生物の選
択分離は、何ら特殊な方法によらずとも、通常の方法に
より、例えば所望の染色体上の遺伝形質もしくはベクタ
ーの持つ形質又はこれらの両者を合せ持つ菌のクローン
を選択的に生育させ得る培地を利用する方法により実施
できる。
かくしてシアル酸無添加培地で著量のＮ−アシルノイラ
ミン酸アルドラーゼを生産する能力を有する目的の形質
転換株を取得できる。
ミン酸アルドラーゼを生産する能力を有する目的の形質
転換株を取得できる。
本発明は、上記のごとくして得られる形質転換株を培養
してＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼを採取する方
法をも提供するものである。
してＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼを採取する方
法をも提供するものである。
上記形質転換株の培養のための培地としては炭素源、窒
素源、無機化合物その他の栄養素を含み、細菌の培養に
一般に用いられている合成培地、半合成培地或いは天然
培地のいずれをも使用することができる。上記各培地に
利用される炭素源としては、例えばブドウ糖、果糖、転
化糖、澱粉糖化液、ソルビトール、グリセロール等の糖
質液、ピルビン酸、リンゴ酸、コハク酸等の有機酸類等
を例示できる。窒素源としては、例えば硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アン
モニウム、水酸化アンモニウム、酒石酸アンモニウム、
酢酸アンモニウム、尿素等を例示できる。炭素源として
も窒素源としても利用できるものとしては、例えばペプ
トン、肉エキス、コーンステイープリカー等を例示でき
る。無機化合物としては、例えばリン酸−カリウム、リ
ン酸二カリウム、リン酸−ナトリウム、リン酸二ナトリ
ウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化カリ
ウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、塩化第一鉄、硫酸
第二鉄、塩化第二鉄、硫酸マンガン、塩化マンガン等を
例示できる。その他の栄養素としては、例えば酵母エキ
ス、ビタミン等を例示できる。
素源、無機化合物その他の栄養素を含み、細菌の培養に
一般に用いられている合成培地、半合成培地或いは天然
培地のいずれをも使用することができる。上記各培地に
利用される炭素源としては、例えばブドウ糖、果糖、転
化糖、澱粉糖化液、ソルビトール、グリセロール等の糖
質液、ピルビン酸、リンゴ酸、コハク酸等の有機酸類等
を例示できる。窒素源としては、例えば硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アン
モニウム、水酸化アンモニウム、酒石酸アンモニウム、
酢酸アンモニウム、尿素等を例示できる。炭素源として
も窒素源としても利用できるものとしては、例えばペプ
トン、肉エキス、コーンステイープリカー等を例示でき
る。無機化合物としては、例えばリン酸−カリウム、リ
ン酸二カリウム、リン酸−ナトリウム、リン酸二ナトリ
ウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化カリ
ウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、塩化第一鉄、硫酸
第二鉄、塩化第二鉄、硫酸マンガン、塩化マンガン等を
例示できる。その他の栄養素としては、例えば酵母エキ
ス、ビタミン等を例示できる。
培養は、液体培地又は固体培地のいずれでも行なうこと
ができるが、通常液体培地の方が有利であつて、特に振
盪培養又は通気攪拌培養を行なうのが量産上有利であ
る。培養温度は20〜45℃、好ましくは28〜37℃とするの
が好適である。培養中は適当な中和剤を用いてpHを６〜
９に調整するのが好ましい。上記培養を通常10〜50時間
行なうことにより、目的とするＮ−アシルノイラミン酸
アルドラーゼの活性は最高に達する。本酵素は一般に菌
体内酵素であるので、培養物からの本酵素の採取、精製
は菌体内酵素を採取精製する通常の方法に従うことがで
きる。特に好ましいひとつの代表例としては、例えば、
上記培養液から遠心分離等の方法で菌体を集め、得られ
た菌体を超音波処理、ガラスビーズを用いる磨砕処理、
或いはフレンチプレス処理等によつて破砕し、酵素を抽
出する方法を例示できる。また上記で得られる抽出液は
これを硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフイー、ゲ
ル過法等の常法により処理することができ、かくして
精製されたＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼを取得
することができる。
ができるが、通常液体培地の方が有利であつて、特に振
盪培養又は通気攪拌培養を行なうのが量産上有利であ
る。培養温度は20〜45℃、好ましくは28〜37℃とするの
が好適である。培養中は適当な中和剤を用いてpHを６〜
９に調整するのが好ましい。上記培養を通常10〜50時間
行なうことにより、目的とするＮ−アシルノイラミン酸
アルドラーゼの活性は最高に達する。本酵素は一般に菌
体内酵素であるので、培養物からの本酵素の採取、精製
は菌体内酵素を採取精製する通常の方法に従うことがで
きる。特に好ましいひとつの代表例としては、例えば、
上記培養液から遠心分離等の方法で菌体を集め、得られ
た菌体を超音波処理、ガラスビーズを用いる磨砕処理、
或いはフレンチプレス処理等によつて破砕し、酵素を抽
出する方法を例示できる。また上記で得られる抽出液は
これを硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフイー、ゲ
ル過法等の常法により処理することができ、かくして
精製されたＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼを取得
することができる。
実 施 例 以下、実施例を挙げ本発明を更に詳しく説明する。尚、
Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの活性は、バーネ
ツトらの方法〔J.E.G.Barnett,D.L.Corina,and G.Rasoo
l,Biochemical Journal,125,275（1971）〕に従い測定
したものであり、該酵素活性の１単位とは、反応温度37
℃において１分間に１マイクロモルのＮ−アセチルノイ
ラミン酸を分解する活性をいう。
Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの活性は、バーネ
ツトらの方法〔J.E.G.Barnett,D.L.Corina,and G.Rasoo
l,Biochemical Journal,125,275（1971）〕に従い測定
したものであり、該酵素活性の１単位とは、反応温度37
℃において１分間に１マイクロモルのＮ−アセチルノイ
ラミン酸を分解する活性をいう。
実施例１ （１） Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ生産株E.
coli K12C600株からの染色体DNAの調製 下記組成のＬ培地１中でエシエリヒア・コリ−（E.co
li）K12C600株を37℃で約３時間振盪培養し、対数増殖
期の菌体を集めた。
coli K12C600株からの染色体DNAの調製 下記組成のＬ培地１中でエシエリヒア・コリ−（E.co
li）K12C600株を37℃で約３時間振盪培養し、対数増殖
期の菌体を集めた。
〈Ｌ培地組成〉 ペプトン 1g/dl 酵母エキス 0.5g/dl グルコース 0.1g/dl NaCl 0.5g/dl pH 7.2に調製 上記菌体につきフエノール法によるDNA抽出操作を行な
つて、最終3.8mgの染色体DNAを抽出精製した。
つて、最終3.8mgの染色体DNAを抽出精製した。
（２） ベクターDNAの調製と制限酵素による切断 ベクターとしてのプラスミドpBR322のDNAを以下の通り
調製した。即ち、まずpBR322をプラスミドとして保有す
るエシエリヒア・コリーK12株の一種を下記組成のGPM培
地に接種し、37℃で対数増殖期まで培養した後、最終濃
度100μg/mlのクロラムフエニコールを添加し、更に一
夜培養した。
調製した。即ち、まずpBR322をプラスミドとして保有す
るエシエリヒア・コリーK12株の一種を下記組成のGPM培
地に接種し、37℃で対数増殖期まで培養した後、最終濃
度100μg/mlのクロラムフエニコールを添加し、更に一
夜培養した。
〈GPM組成〉 グルコース 10g ペプトン 10g NH4Cl 1g Na2HPO4・12H2O 15.2g KH2PO4 3g NaCl 3g Na2SO4 0.115g MgCl2・6H2O 0.083g 酵母エキス 1g 脱塩水 全体を１とする量 上記操作により、細胞内にプラスミドDNAを多量に生産
させた。クロラムフエニコール添加の16時間目に菌体を
集め、リゾチーム・SDS処理して溶菌させ、30000×ｇ、
１時間の超遠心により上清を得た。これよりプラスミド
DNAを濃縮し、セシウムクロライド−エチジウムブロマ
イド平衡密度勾配遠心法によつて最終700μｇのpBR322
のプラスミドDNAを分画採取した。
させた。クロラムフエニコール添加の16時間目に菌体を
集め、リゾチーム・SDS処理して溶菌させ、30000×ｇ、
１時間の超遠心により上清を得た。これよりプラスミド
DNAを濃縮し、セシウムクロライド−エチジウムブロマ
イド平衡密度勾配遠心法によつて最終700μｇのpBR322
のプラスミドDNAを分画採取した。
（３） 染色体DNA断片のベクターへの導入 上記（１）で得た染色体DNA10μｇを取り、制限エンド
ヌクレアーゼHind IIIを37℃で30分間、60分間又は120
分間それぞれ反応させ、DNAの部分的切断を行なつた
後、65℃で10分間熱処理して反応を停止させた。
ヌクレアーゼHind IIIを37℃で30分間、60分間又は120
分間それぞれ反応させ、DNAの部分的切断を行なつた
後、65℃で10分間熱処理して反応を停止させた。
他方ベクターpBR322につき、制限エンドヌクレアーゼHi
nd IIIを用いて完全に切断後、アルカリフオスフアター
ゼで処理してpBR322のDNA断片を調製した。
nd IIIを用いて完全に切断後、アルカリフオスフアター
ゼで処理してpBR322のDNA断片を調製した。
上記染色体DNA断片とpBR322のDNA断片５μｇとを混合
し、ATP及びジチオスレイトールの存在下に、T4フアー
ジ由来のDNAリガーゼを用いて、10℃で16時間を要してD
NA鎖の連結反応を行なつた。65℃で10分間の熱処理後、
反応液に２倍容のエタノールを加えて連結反応終了後の
DNAを沈澱させ、採取した。
し、ATP及びジチオスレイトールの存在下に、T4フアー
ジ由来のDNAリガーゼを用いて、10℃で16時間を要してD
NA鎖の連結反応を行なつた。65℃で10分間の熱処理後、
反応液に２倍容のエタノールを加えて連結反応終了後の
DNAを沈澱させ、採取した。
（４） 組換えプラスミドDNAによる形質転換エシエリ
ヒア・コリーK12C600株から、ニトロソグアニジン変異
処理によつて誘導したＮ−アシルノイラミン酸アルドラ
ーゼ欠損株を、Ｌ倍地10mlにて対数増殖中期まで生育さ
せた後、塩化カルシウム50mMを含むトリス緩衝液（50m
M、pH7.0）で２回洗浄することにより、コンピテントな
（DNA取り込み能を有する）細胞を調製した。このコン
ピテント細胞懸濁液0.4mlに上記（３）で得たDNA溶液0.
1mlを加えて、０℃で30分間保持した後、直ちに42℃、
２分間の熱パルスを与え、DNAを細胞内に取込ませた。
ヒア・コリーK12C600株から、ニトロソグアニジン変異
処理によつて誘導したＮ−アシルノイラミン酸アルドラ
ーゼ欠損株を、Ｌ倍地10mlにて対数増殖中期まで生育さ
せた後、塩化カルシウム50mMを含むトリス緩衝液（50m
M、pH7.0）で２回洗浄することにより、コンピテントな
（DNA取り込み能を有する）細胞を調製した。このコン
ピテント細胞懸濁液0.4mlに上記（３）で得たDNA溶液0.
1mlを加えて、０℃で30分間保持した後、直ちに42℃、
２分間の熱パルスを与え、DNAを細胞内に取込ませた。
次にこの細胞懸濁液をＬ培地に接種し、37℃で２時間静
置培養を行なつて形質転換反応を完了させた後、集菌
し、洗浄し、再懸濁液を最小培地プレートに塗沫し、37
℃で２日間培養した。
置培養を行なつて形質転換反応を完了させた後、集菌
し、洗浄し、再懸濁液を最小培地プレートに塗沫し、37
℃で２日間培養した。
尚、上記最小培地プレートは、シアル酸の2g、（NH4）2
SO4の1g、K2HPO4の7g、K2PO4の2g、MgSO4・7H2Oの0.1
g、ロイシンの20mg、スレオニンの20mg及びチアミンの1
mgを１の純水に溶解し、pHを7.0に調整したものに寒
天20gを加えて殺菌した固形培地にアンピシリンを10μg
/mlとなるように加えることにより調製した。
SO4の1g、K2HPO4の7g、K2PO4の2g、MgSO4・7H2Oの0.1
g、ロイシンの20mg、スレオニンの20mg及びチアミンの1
mgを１の純水に溶解し、pHを7.0に調整したものに寒
天20gを加えて殺菌した固形培地にアンピシリンを10μg
/mlとなるように加えることにより調製した。
上記により生じたコロニーを釣菌し、アンピシリン（A
p）耐性と菌体内のＮ−アシルノイラミン酸アルドラー
ゼ活性とを検討し、形質転換株RC−H1/pMK2（約14.2k
b）を取得した。
p）耐性と菌体内のＮ−アシルノイラミン酸アルドラー
ゼ活性とを検討し、形質転換株RC−H1/pMK2（約14.2k
b）を取得した。
（５） Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの遺伝情
報を担うプラスミドのセルフクローニング 上記（４）で得た形質転換株をＬ培地100ml中で培養
し、上記（２）と同様にしてクロラムフエニコール処理
を行なつた。菌体を集菌、洗浄後、ビルンボイム及びド
リー（Birnboim and Doly）の方法〔Nucleic Acids Res
earch,７,1513〜1523（1979）〕により、Ｎ−アシルノ
イラミン酸アルドラーゼの遺伝情報を担うpBR322プラス
ミド（以下「pMK2」と称する）を含む液を調製した。
報を担うプラスミドのセルフクローニング 上記（４）で得た形質転換株をＬ培地100ml中で培養
し、上記（２）と同様にしてクロラムフエニコール処理
を行なつた。菌体を集菌、洗浄後、ビルンボイム及びド
リー（Birnboim and Doly）の方法〔Nucleic Acids Res
earch,７,1513〜1523（1979）〕により、Ｎ−アシルノ
イラミン酸アルドラーゼの遺伝情報を担うpBR322プラス
ミド（以下「pMK2」と称する）を含む液を調製した。
この溶液をアガロースゲル電気泳動（アガロース0.7
％、90V）にかけ、pMK2のバンドを紫外線照射下で切り
出し、これを透析チューブに入れ、再度電気泳動を行な
い、ゲルよりDNAを抽出した。エチジウムブロマイドの
除去を行なつた後、２培容のエタノールを加えて沈澱さ
せ、得られたpMK2の90μｇを5mMトリス塩酸緩衝液（pH
7.5）に溶解した。
％、90V）にかけ、pMK2のバンドを紫外線照射下で切り
出し、これを透析チューブに入れ、再度電気泳動を行な
い、ゲルよりDNAを抽出した。エチジウムブロマイドの
除去を行なつた後、２培容のエタノールを加えて沈澱さ
せ、得られたpMK2の90μｇを5mMトリス塩酸緩衝液（pH
7.5）に溶解した。
次いで上記（４）と同様にして、エシエリヒア・コリー
K12C600株にDNA取り込み能を持たせた後、上記pMK2を取
り込ませた。かくして得られる菌株をアンピシリン10μ
g/mlを含む最小培地プレートに培養し、生じてくるコロ
ニーを分離し、アンピシリン耐性と菌体内のＮ−アシル
ノイラミン酸アルドラーゼ活性を検討して、形質転換株
RC−K12C600/pMK2を取得した。
K12C600株にDNA取り込み能を持たせた後、上記pMK2を取
り込ませた。かくして得られる菌株をアンピシリン10μ
g/mlを含む最小培地プレートに培養し、生じてくるコロ
ニーを分離し、アンピシリン耐性と菌体内のＮ−アシル
ノイラミン酸アルドラーゼ活性を検討して、形質転換株
RC−K12C600/pMK2を取得した。
（６） Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子の
サブクローニング 上記（５）で得た形質転換株から、該（５）と同様の方
法によりプラスミドpMK2の10μｇを取り、これに２種の
制限エンドヌクレアーゼvEcoRI及びHind IIIを同時に作
用させて37℃で１時間部分的に切断反応を行なつた後、
65℃で10分間熱処理して反応を停止させた。
サブクローニング 上記（５）で得た形質転換株から、該（５）と同様の方
法によりプラスミドpMK2の10μｇを取り、これに２種の
制限エンドヌクレアーゼvEcoRI及びHind IIIを同時に作
用させて37℃で１時間部分的に切断反応を行なつた後、
65℃で10分間熱処理して反応を停止させた。
他方ベクターpBR322につき、制限エンドヌクレアーゼEc
oRI及びHind IIIを同時に用いて完全に切断後、アルカ
リフオスフアターゼで処理してpBR322のDNA断片を調製
した。
oRI及びHind IIIを同時に用いて完全に切断後、アルカ
リフオスフアターゼで処理してpBR322のDNA断片を調製
した。
上記pMK2のDNA断片とpBR322のDNA断片５μｇとを混合
し、ATP及びジチオスレイトールの存在下に、T4フアー
ジ由来のDNAリガーゼを用いて、10℃で16時間を要してD
NA鎖の連結反応を行なつて組換えプラスミドを調製し
た。
し、ATP及びジチオスレイトールの存在下に、T4フアー
ジ由来のDNAリガーゼを用いて、10℃で16時間を要してD
NA鎖の連結反応を行なつて組換えプラスミドを調製し
た。
次いで上記（４）と同様にしてエシエリヒア・コリーK1
2C600株にDNA取り込み能を持たせた後、上記で調製した
組換えプラスミドを取り込ませた。
2C600株にDNA取り込み能を持たせた後、上記で調製した
組換えプラスミドを取り込ませた。
かくして得られる菌体をアンピシリン10μg/mlを含む最
小培地プレートに培養し、生じてくるコロニーを分離
し、アンピシリン耐性及び菌体内のＮ−アシルノイラミ
ン酸アルドラーゼ活性を検討して、形質転換株RC−K12C
600/pMK6を得た。
小培地プレートに培養し、生じてくるコロニーを分離
し、アンピシリン耐性及び菌体内のＮ−アシルノイラミ
ン酸アルドラーゼ活性を検討して、形質転換株RC−K12C
600/pMK6を得た。
この形質転換株は、Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラー
ゼ遺伝子を含む染色体DNA断片を組込んだ組換えブラス
ミドを保有するものであり、該プラスミドを以下「pMK
6」と称する。
ゼ遺伝子を含む染色体DNA断片を組込んだ組換えブラス
ミドを保有するものであり、該プラスミドを以下「pMK
6」と称する。
pMK6の制限酵素切断地図は第１図に示す通りである。こ
れはpBR322に由来しPstI、PvuII、SalI及びBamHIで各々
切断される切断部位を有するDNA断片と、Ｎ−アシルノ
イラミン酸アルドラーゼ生産菌由来の染色体DNA断片と
が、EcoRI及びHindIIIの切断部位で連結されてなり、約
5.5kbの大きさを有するものである。
れはpBR322に由来しPstI、PvuII、SalI及びBamHIで各々
切断される切断部位を有するDNA断片と、Ｎ−アシルノ
イラミン酸アルドラーゼ生産菌由来の染色体DNA断片と
が、EcoRI及びHindIIIの切断部位で連結されてなり、約
5.5kbの大きさを有するものである。
また上記プラスミドpMK6を保有するエシエリヒア・コリ
ーK12C600株は、工業技術院微生物工業技術研究所にエ
シエリヒア・コリーK12C600/pMK6なる名称にて寄託され
ており、その寄託番号は微工研条寄第833号である。
ーK12C600株は、工業技術院微生物工業技術研究所にエ
シエリヒア・コリーK12C600/pMK6なる名称にて寄託され
ており、その寄託番号は微工研条寄第833号である。
（７） 本発明形質転換株の調製 上記（６）で得た形質転換株から上記（５）と同様にし
てpMK6を取り出し、これを、上記（４）と同様にして、
エシエリヒア・コリーM8328株に取込ませた。
てpMK6を取り出し、これを、上記（４）と同様にして、
エシエリヒア・コリーM8328株に取込ませた。
即ち、エシエリヒア・コリーM8328株を、Ｌ培地で対数
増殖中期まで生育させた後、塩化カルシウム50mMを含む
トリス緩衝液（50mM、PH7.0）で２回洗浄することによ
り、コンピテントな（DNA取り込み能を有する）細胞を
調製した。このコンピテント細胞懸濁液に上記で得たpM
K6の１μｇを加えて、０℃で30分間保持した後、直ちに
42℃、２分間の熱パルスを与え、DNAを細胞内に取込ま
せた。
増殖中期まで生育させた後、塩化カルシウム50mMを含む
トリス緩衝液（50mM、PH7.0）で２回洗浄することによ
り、コンピテントな（DNA取り込み能を有する）細胞を
調製した。このコンピテント細胞懸濁液に上記で得たpM
K6の１μｇを加えて、０℃で30分間保持した後、直ちに
42℃、２分間の熱パルスを与え、DNAを細胞内に取込ま
せた。
次にこの細胞懸濁液をＬ培地に接種し、37℃で２時間静
置培養を行なつて形質転換反応を完了させた後、集菌
し、洗浄し、再懸濁液をアンピシリン40μg/mlを含むＬ
培地プレートに塗沫し、37℃で１日間培養した。
置培養を行なつて形質転換反応を完了させた後、集菌
し、洗浄し、再懸濁液をアンピシリン40μg/mlを含むＬ
培地プレートに塗沫し、37℃で１日間培養した。
上記により生じたコロニーを釣菌し、アンピシリン（A
p）耐性と菌体内のＮ−アシルノイラミン酸アルドラー
ゼ活性とを検討し、形質転換株E.coliM8328/pMK6を取得
した。
p）耐性と菌体内のＮ−アシルノイラミン酸アルドラー
ゼ活性とを検討し、形質転換株E.coliM8328/pMK6を取得
した。
上記形質転換株は、工業技術院微生物工業技術研究所
に、エシエリヒア・コリーM8328/pMK6なる名称にて寄託
されており、その寄託番号は微工研菌寄第8519号（FERM
P−8519）である。
に、エシエリヒア・コリーM8328/pMK6なる名称にて寄託
されており、その寄託番号は微工研菌寄第8519号（FERM
P−8519）である。
（８） 本発明形質転換株によるＮ−アシルノイアミン
酸アルドラーゼの生産 上記（７）で得た本発明形質転換株につき、Ｎ−アシル
ノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子を含む染色体DNA供与
菌であるエシエリヒア・コリーK12C600株及びこれにpMK
6を導入して形質転換させた形質転換株エシエリヒア・
コリーK12C600/pMK6並びに本発明形質転換株の親株（変
異株）であるエシエリヒア・コリーM8328株及び該M8328
株の親株であるエシエリヒア・コリーIFO3301株の各々
と対比して、それらのシアル酸無添加培地（酵母エキス
培地）におけるＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ生
産性を検討した。
酸アルドラーゼの生産 上記（７）で得た本発明形質転換株につき、Ｎ−アシル
ノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子を含む染色体DNA供与
菌であるエシエリヒア・コリーK12C600株及びこれにpMK
6を導入して形質転換させた形質転換株エシエリヒア・
コリーK12C600/pMK6並びに本発明形質転換株の親株（変
異株）であるエシエリヒア・コリーM8328株及び該M8328
株の親株であるエシエリヒア・コリーIFO3301株の各々
と対比して、それらのシアル酸無添加培地（酵母エキス
培地）におけるＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ生
産性を検討した。
各微生物の培養培地としては、以下の組成の培地を利用
した。
した。
〈酵母エキス培地組成〉 酵母エキス 20g コハク酸 10g 純粋 全体を１とする量（pH6.0） 上記各培地に各微生物を接種し、30℃で24時間振盪培養
を行なつた。その後、培養液から遠心分離法により菌体
を集め、25mMリン酸緩衝液（pH7.5）100mlに懸濁させて
超音波処理を行ない細胞を破砕し、菌体内の酵素を抽出
し、遠心分離により沈渣と上澄とを分離した後、抽出液
（上澄）として粗酵素液を得た。
を行なつた。その後、培養液から遠心分離法により菌体
を集め、25mMリン酸緩衝液（pH7.5）100mlに懸濁させて
超音波処理を行ない細胞を破砕し、菌体内の酵素を抽出
し、遠心分離により沈渣と上澄とを分離した後、抽出液
（上澄）として粗酵素液を得た。
得られた酵素液の活性を測定した結果を下記第１表に示
す。
す。
上記第１表より、本発明の形質転換株の利用によれば、
シアル酸無添加培地において著量のＮ−アシルノイラミ
ン酸アルドラーゼを取得できることが明らかである。ま
たこの本発明形質転換株に見られる目的酵素生産能は、
Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子を含む染色
体DNA供与菌にpMK6を導入して形質転換させた形質転換
株エシエリヒア・コリーK12C600/pMK6及び本発明形質転
換株の親株であるエシエリヒア・コリーM8328株の各々
における同酵素の生産能からは、全く予期できない非常
に顕著なものであることが判る。
シアル酸無添加培地において著量のＮ−アシルノイラミ
ン酸アルドラーゼを取得できることが明らかである。ま
たこの本発明形質転換株に見られる目的酵素生産能は、
Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子を含む染色
体DNA供与菌にpMK6を導入して形質転換させた形質転換
株エシエリヒア・コリーK12C600/pMK6及び本発明形質転
換株の親株であるエシエリヒア・コリーM8328株の各々
における同酵素の生産能からは、全く予期できない非常
に顕著なものであることが判る。
なお、上記粗酵素液は、これを常法に従い硫安で塩析
し、遠心分離し、透析後、凍結乾燥することにより粗酵
素粉末とすることができる。また該酵素粉末は、これを
イオン交換クロマトグラフイ、ゲル過等の手段により
精製して更に純化された酵素標品とすることができる。
し、遠心分離し、透析後、凍結乾燥することにより粗酵
素粉末とすることができる。また該酵素粉末は、これを
イオン交換クロマトグラフイ、ゲル過等の手段により
精製して更に純化された酵素標品とすることができる。
【図面の簡単な説明】 第１図は、本発明に利用する組換えプラスミドpMK6の制
限酵素切断地図を示す。
限酵素切断地図を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (1)
- 【請求項１】誘導物質の不存在下にＮ−アシルノイラミ
ン酸アルドラーゼ生産能を発現するように変異されたエ
シェリヒア・コリーの変異株に、エシェリヒア属に属す
るＮ−アシルノイラミン酸アルドラーゼ生産菌由来のＮ
−アシルノイラミン酸アルドラーゼ遺伝子を含む染色体
DNA断片を組込んだ組換えプラスミドが導入されている
ことを特徴とする形質転換微生物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26305685A JPH0697995B2 (ja) | 1985-11-21 | 1985-11-21 | 形質転換微生物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26305685A JPH0697995B2 (ja) | 1985-11-21 | 1985-11-21 | 形質転換微生物 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19575893A Division JPH0757189B2 (ja) | 1993-08-06 | 1993-08-06 | Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62122584A JPS62122584A (ja) | 1987-06-03 |
| JPH0697995B2 true JPH0697995B2 (ja) | 1994-12-07 |
Family
ID=17384244
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26305685A Expired - Lifetime JPH0697995B2 (ja) | 1985-11-21 | 1985-11-21 | 形質転換微生物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0697995B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10378034B2 (en) | 2014-05-27 | 2019-08-13 | Universitetet I Tromsø—Norges Arktiske Universitet | Use of a N-acetylneuraminate lyase derived from the bacterium Aliivibrio salmonicida in the production of neuraminic acid and derivatives thereof |
-
1985
- 1985-11-21 JP JP26305685A patent/JPH0697995B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62122584A (ja) | 1987-06-03 |
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