JPS61177982A - 新規微生物及びそれを用いるｌ−トリプトフアンの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明はアルカリゲネス属に属する新規微生物及び該微
生物を用いるＬ−）！Ｊブトファンの製法に関する。

〔従来技術〕

Ｌ−トリプトファンの製法としてはアルカリゲネス　フ
ェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ
　）をインドールとＬ−セリン（又はピルビン酸とアン
モニア）に作用させて酵素的に製造する方法（特公昭５
３−１８３６号、特公昭５７−１４６５８２号）が知ら
れている。一方、遺伝子組換え方法によって得られる新
規微生物のうちアルカリゲネス属微生物を宿主とするも
のについては全く知られていない。

〔解決すべき技術的課題〕

上記Ｌ−トリプトファンの製造に用いられるアルカリゲ
ネス　フェカリスにはそのＬ−トリプトファナーゼ活性
が工業的に充分満足し得るほどに°高いとは云えないと
いう問題があった。

〔本発明の構成及び効果〕

本発明者らはアルカリゲネス属に属する微生物の有する
トリプトファナーゼ活性を司る染色体フラグメントを切
り出し、これをプラスミドに組み込んだのち、アルカリ
ゲネス属微生物に移入する、所謂セルフクローニングに
より親株に比して極めて高いトリプト７１ナーゼ活性を
有する微生物を調製することに成功すると共に、かくし
て得られる微生物を用いればＬ−）リプトス１ンを極め
て効率よく製造し得ることを見い出し前記課題を解決し
たものである。

本発明はアルカリゲネス属に属する微生物から採取した
トリプトフアナーゼの遺伝情報を担うデオキシリポ核酸
をプラスミドに組み込んだハイブリッドプラスミドをア
ルカリゲネス属に属する微生物に含有せしめた微生物お
よび該微生物の培養。

液、該培養液から採取した菌体もしくは該菌体の処理物
をインドールとＬ−セリン（又はピルビン酸とアンモニ
ア）に作用させることを特徴とするＬ−トリプトファン
の製法である。

〔本発明微生物の調製〕

（染色体ＤＮＡおよびその調製） 本発明においてトリプトファナーゼの遺伝情報を担うデ
オキシリボ核酸（以下、染色体ＤＮＡと称する）の供給
源となる微生物としてはアルカリゲネス属に属しトリプ
トファナーゼ活性を有するものであれば、いかなる微生
物でもよ（１例えばアルカリゲネス・フェカリスＯＵ’
ｌ’８０２５を用いることができる。

これらの微生物から染色体ＤＮＡを採取する方法として
は例えば微生物の菌体をリゾチーム処理、界面活性剤（
ＳＤＳ、サルコシル（Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナト
リウム）等〕で処理したのち除蛋白しついでエタノール
沈殿せしめる常法〔Ｊ、　Ｍｏｌ、　Ｂｉｏｌ、　＊　
３　ｅ　２０８　（１９６１）　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、
　Ｂｉｏｐｈｙａ。

Ａｃｔａ、　＠ユ、　６１９　（１９６３）　）により
容易に実施できる。

（ベクタープラスミドＤＮＡＩよびその調製）上記の如
くして得られる染色体ＤＮＡを組み込むベクタープラス
ミドとしてはアルカリゲネス属に属する微生物中におい
て複製可能なプラスミドであれば特に限定されないが９
例えばｐＫ’ｌ’２３１　（Ｇｅｎｅ、　１６．２３７
　（１９８１）　）　　もしくはｐＢＲ３２２（Ｇｏｎ
ｅ、　２．９５（１９７７））、　ｐＢＲ３２５（Ｇｏ
ｎｅ。

４、１２１　（１９７８）　）等を用いることができる
。これらのプラスミドは一部アルカリゲネス属微生物に
移入したのち、常法により抽出したものを用いればより
好ましい結果が得られる。

（ハイブリッドプラスミドの調製） 上記で得られた染色体ＤＮＡとベクタープラスミドＤＮ
Ａからハイブリッドプラスミドを調製するには制限エン
ドヌクレアーゼ（例えハＨｉｎｄ　Ｉ　。

ＥｃｏＲＩ　、　Ｓａｃ　１等）を用いて染色体ＤＮＡ
とプラスミドのＤＮＡ鎖を切断したのち、リガーゼ（例
えばＴ４ＤＮＡ！Ｊガーゼ、大腸菌リガーゼ等）で処理
するか、或いはその切断末端によってはターミナルトラ
ンスフェラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ等で処理したのち
りガーゼを作用させてＤＮＡ鎖ができる。

かくして得られたハイブリッドプラスミドはそのまま形
質転換に用いることもでき、又ハイブリッドプラスミド
を各種の変異を有する変異株：こ移入して目的とするハ
イブリッドプラスミドを保持する菌株を予め選択したの
ち該菌株からハイブリッドプラスミドを常法により抽出
しこれを宿主微生物に移入することもでき、かかる方法
によるときは形質転換株の選択が容易であり好ましい。

かかる目的に用いる変異株としては例えばアルカリゲネ
ス属、ニジエリシア属に属する微生物であってトリプト
ン１ナーゼ欠損性微生物であるか、アンピシリン感受性
、カナマイシン感受性等の変異の一部又は全部を有する
変異株があげられる。

（宿主微生物） ハイブリッドプラスミドを含有せしめる宿主としてはア
ルカリゲネス属に属し形質転換可能な微生物であればよ
く９例えば前記染色体ＤＮＡの供給源として用いた微生
物を好適に用いることができる。

（ハイブリッドプラスミドによる形質転換）形質転換方
法は低温下で塩化カルシウム含有溶液で宿主微生物細胞
を処理して菌膜の透過性を増大させ、ハイブリッドＤＮ
Ａを宿主微生物中に取り込ませる方法（ＪｏＭｏｌ、　
Ｂｉｏｌ、　を皿、　１５９　（１９７０）　、　Ｊ、
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　、　１１９．１０７２　（１９
７４）　）等を採用できる。

かくして得られた形質転換株のうち、トリプトファナー
ゼの遺伝情報を担うハイブリッドプラスミドが移入され
た菌株の選択は培地に添加したトリプトフアンからイン
ドールを生成しつる菌株を釣菌１分離することにより実
施できる。

具体的には目的とする形質転換株の選択はカナマイシン
を約１０〜２００μり／ｄを含むＬ−ブロス寒天培地に
生育する転換株のうちジメチルアミノベンズアルデヒド
試薬によってインドールの生成９発色が高濃度に認めら
れた株、すなわち、インドールを高濃度に生成する株を
選択することによって実施することができる。

かくすることにより本発明に係る微生物、即ち、アルカ
リゲネス属に属する微生物から採取したイ１（ トリプトファナーゼの遺肴情報を担うデオキシリポ核酸
をプラスミドに組み込んだハイブリッドプラスミドを含
有せしめたアルカリゲネス属に属する微生物を得ること
ができる。

かかる微生物としては後記実施例の方法により得られる
アルカリゲネス　フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅ−ｎｅ
ｇ　ｆａｅｃａｌｉｓ　）　Ｋ　Ｎ　１０１　ｍアルカ
リゲネス　フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａ
ｅｃａｌｉｇ　）　Ｋ　Ｎ　１０２があげられ、これら
の微生物は親株に比して約３〜５倍の高いトリプトファ
ナーゼ活性を有する。又、これらの微生物の菌学的性質
はカナマイシン含有培地で生育する点を除けば親株たる
アルカリゲｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
ｇｙ）、　Ｖｏｌ　１　、９ｔｈ　Ｈｄ、　（１９８４
）〕と同一の性質を有する。

〔Ｌ−トリプトファンの製法〕

本発明方法によれば上記で得られた微生物を培養し、そ
の培養液、該培養液から採取される菌体用させることに
よりＬ−）リプトラ１ンを製することができる。

（微生物の培養） 上記の微生物を培養するに際しては炭素源、窒素源、有
機栄養源、無機塩類などを含む通常の栄養培地が使用で
きる。尚、微生物のトリプトファナーゼ活性は培地中に
Ｌ−）リプトファンを約０゜１〜１に、とりわけ約０．
２〜０．５％添加することにより増大するので好ましい
。

培養は常法により行なうことができ１例えば培地のｐＨ
を４〜８に調整し、微生物を培地に接種したのち約２０
〜４０℃で好気的に培養すればよい。

菌体の処理物としては例えば洗ｆＰｍ体、乾燥菌体、菌
体磨砕物、菌体の自己消化物、１１体の超音波処理物、
菌体抽出物又はこれらをゲル抱括法や吸着法等のそれ自
体公知の固定化方法により固定化したものがあげられる
。固定化したものの具体例としては菌体等を例えばポリ
アクリルアミドゲル、含硫多糖類ゲル（カラギーナン、
ファーセレラン等）、コラーゲンゲル、アルギン酸ゲル
、ポリビニルアルコールゲル、寒天ゲルで固定化したも
のがあげられ、ポリアクリルアミドゲルによる場合は例
えば特公昭５３−１８３１号記載の方法により、又、含
硫多糖類による場合は例えば特開昭５３−６４８３号記
載の方法により固定化することができる。コラーゲンゲ
ル、アルギン酸ゲル、ポリビニルアルコ−ゲル、寒天ゲ
ル等による場合も１例えば特開昭５１−１４４７８０号
、特開昭４９−３０５８２号、特開昭４９−８０２８５
号、特開昭５１−１３３４８４号記載の方法に従って固
定化することができる。

（酵素反応） 基質たるＬ−セリンとインドール、或いはインドール、
ピルビン酸及びアンモニアは種々の形で反応系に供給す
ることができ９例えばＬ−セリンは必ずしも高純度のも
のでなくともよく、１例をあげるならばグリシンからセ
リントランスヒドロキシメチラーゼによって生成させた
Ｌ−セリン酵素反応液であってもよい。又、ピルビン酸
はアンモニウム塩、ナトリウム塩などの形でそれぞれ用
いることができる。

反応系に供給する基質濃度はＬ−セリンとインドール、
或いはインドール、ピルビン酸及びアンモニアのいずれ
を用いる場合であっても濃度が約１０〜１００１−であ
ればよい。゛ 酵素反応は約５〜５０℃の広い温度範囲で実施すること
ができるが微生物の酵素の安定性を考慮して約２０〜４
５℃で実施するのが好ましい。又、酵素反応に際してそ
のｐＨは７〜１１となるのが好ましい。

尚、上記酵素反応に際し酵素源として培養液又は微生物
菌体を用いる場合には反応液中に界面活性剤（例えば、
ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル等）を予
め添加してお（のが好ましく、その濃度は基質としてＬ
−セリンを用いる場合には約０．０１〜１％、ピルビン
酸を用いる場合には約１〜２０％が適当である。

反応は微生物菌体を用いる場合にはバッチ法で実施する
のが好ましく、培養後集菌した微生物菌体を前記した如
き基質溶液にけん濁しかくはんすることによってＬ−ト
リプトファンが生成する。

又、固定化微生物を用いる場合の反応は固定化微生物が
水に不溶性であるため、バッチ法によるのみならず、カ
ラム法によって連続的に実施することもできる。例えば
固定化微生物をカラムに充填し、このカラムに基質溶液
を適当な速度で流下すれば、Ｌ−トリプトファンのみを
含む流出液が得られる。またバッチ法による場合は基質
溶液に固定化微生物をけん濁させ、かくはんすることに
よってＬ−）！ｊブトファンが生成する。この場合には
反応終了液から固定化微生物を口過或いは遠心分離する
ことにより収得すれば再びこれを反覆使用することがで
きる。

かくして反応液中に生成蓄積したＬ−トリプトファンの
分離精製は１通常のイオン交換樹脂法やその他の公知方
法を組合せて容易に行なうことができる。

以上の如き本発明は従来Ｌ−）リプトファンの製造に用
いられたアルカリゲネス属微生物に比較して格段に高い
トリプトファナーゼ活性を有する微生物を用いるため極
めて高収率かつ短時間で基質（Ｌ−セリンとインドール
、或いはインドールとピルビン酸とア、ンモニア）から
Ｌ−トリプトファンを製造し得るというすぐれた特徴を
有するものである。

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。尚、
実施例中トリプトファナーゼ生成量の測定は下記の如く
して行なった。

培養液より菌体を集め冷水に懸濁したものを酵素液の適
量にＩＭリン酸緩衡液（ｐＨ９，０）０．０５ｄ、１ｍ
Ｍピリドキサールリン酸０．０５ｍ、０゜５％ｏｐ−１
０にツコーケミカルズ社製界面活性剤ホリオキシエチレ
ンアルキルフェニルエーテル）　０．０５ｄ、　２０　
ｍＭＬ　−トリプトファン０．２−を加えて全量を０．
５　ｗＩｔとし３７℃で１ｏ分間酵素反応させ、１０分
後２反応液にジメチルアミノベンズアルデヒド試薬を３
−添加して反応を停止させると同時に発色させ、比色法
により生成したインドール量を測定した。この条件下で
１分間に１μｍｏｌｅのインドールを生成する酵素量を
１単位とした。

実施例１ （１）染色体ＤＮＡの調製 アルカリゲネス・フェカリス０ＵＴ８０２５を１１のＬ
−ブロス（ペプトン１％、酵母エキス０゜５％、塩化ナ
トリウム０．５％、ｐＨ７，２）に接種し、３０℃で６
時間長とう培養し対数増殖期の菌体を遠心分離により集
めた。この菌体をリゾチーム処理、ザルコシル処理して
溶菌し、フェノール処理して染色体Ｄ−ＮＡを抽出精製
することにより染色体Ｄ　Ｎ　Ａ　４．４キを得た。

（２）プラスミドＤＮＡの調製 ニジエリシア・コリに−１２０６０，Ｏｒ−ｍ−株（Ａ
ＴＯＣ３３５２５）に１）ＢＲ３２５を含有させた菌株
を１ｔのＬ−ブロスに接種し３７℃で７時間長とう培養
した後、菌体を遠心分離して集菌した。ついで該菌体を
リゾチーム処理、ＳＤＳ処理によす溶菌させ、最終ＩＭ
になるように塩化ナトリウムを加えた後Ｚｏｏ、０ＯＯ
ＸＰ、３０分間の遠心分離を行なった。上清を採取し、
フェノール−クロロホルム処理した後、エタノールを加
えＤＮＡを遠心分離により集めた。沈殿したＤＮＡを１
０ｍＭ）リス塩酸−１ｍＭｇＤＴＡ　（ｐＨ７，５）に
溶解し、塩化セシウム−エチジウムブロマイド平衡密度
勾配遠心法によりプラスミドＤＮＡを分離精製した。か
くして２．ＯｖのｐＢＲ３２５プラスミドＤＮＡを得た
。

（３）ハイブリッドプラスミドの調製 上記（１）で得た染色体ＤＮＡ５０μＦ　、　（２１で
得たプラスミドＤＮＡ５μ２の各々に制限エンドヌクレ
アーゼＥ、。Ｒ１を通常の条件で作用させＤＮＡ鎖を完
全に切断した。６５℃１０分間の熱処理後１両反応液を
混合しＴ４７アージ由来のＤＮＡリガーゼを通常の条件
下で作用させてＤＮＡ鎖を連結させた。

（４）ハイブリットプラスミドによる形質転換とトリプ
トファナーゼ遺伝子のスクリーニング（ａ）エシニリシ
アーコリに一１２０６０Ｏｒ−ｍ−をＮ−メ５−ルＮ′
−二トローＮ−二トロサクアニジンで変異誘導処理し、
Ｌ−）ＩＪブトファンを０．２％含むＬ−グロス寒天培
地（ペプトン１′Ｘ、酵母エキス０．５％、塩化ナトリ
ウム０．５％、寒天１．５％、ｐＨ７，２）に塗布した
。３７℃で１日間培養しり（７）チ、　生じたコロニー
を濾紙番こレプリカし、濾紙片にジメチルアミノベンズ
アルデヒド試薬を噴霧し着色が認められない株（即ち、
インドールの生成が認められない株）を選択することに
よりトリプトファナーゼ活性を欠損したＴＮＩＯＩ株を
得た。

得られたＴＮＩＯＩをＬ−ブロス３０−に接種し、３７
℃で振とう培養し、その対数増殖の中期まで生育せしめ
た菌体を集菌した。ついで氷冷した０、　１　Ｍ塩化マ
グネシウム溶液１５−にけん濁したのち集菌し、水冷し
た０、　１　Ｍ塩化カルシウム溶液１５−にけん濁した
。０℃で３０分間放置したのち集菌し、水冷した０、１
Ｍ塩化カルシウム溶液３ｄにけん濁した。この細胞けん
濁液に（３）で得たＤＮＡ溶液を加えて６０分間水冷し
たのち、３７℃で３分間熱処理することによってＤＮＡ
を細胞内に取り込ませた。ついでこのけん濁液にＬ−ブ
ロス３０−を加え３７℃で２時間振とう培養した後、該
培養液を０．５−ずつＬ−トリプトファン０゜２％を含
むＬ−ブロス寒天培地（カナマイシン２００μり／−含
有）に塗布し３７℃で２日間培養した。

生じたコロニーを濾紙にレプリカし、濾紙片にジメチル
アミノベンズアルデヒド試薬を噴霧し。

発色反応によりインドールの生成が認められた株をハイ
ブリッドプラスミドＤＮＡによる形質転換株として得た
。かくして得られた形質転換株を上記（１）と同様にし
て処理することによりトリプトフアナーゼの遺伝情報を
担うデオキシリボ核酸を組み込んだハイブリッドプラス
ミドＤＮＡｐＫＮ２０１０．８岬を得た。

（１））このＤＮＡ１μ２とプラスミドｐＫＴ２３１１
μ２に各々制限エンドヌクレアーゼＢｃｏ　ＲＩを通常
の条件で作用させて両プラスミドＤＮＡ鎖を切断した。

６５℃１０分間熱処理後９両反応液を混合しＴ　４　Ｄ
　Ｎ　Ａ　＋７ガーゼを通常の条件下で作用さ込ませ、
カナマイシン２００μ’Ｐ／ＷＩｔを含むＬ−ブロス寒
天培地を用いて生育する菌株を採取し、高トリプトファ
ナーゼ活性を有する微生物を選択することよりトリプト
ファナーゼ遺伝子を有するハイブリッドプラスミド（ｐ
ＫＮ２０１）を含み高トリプトファナーゼ活性を有する
形質転換株アルカリゲネス・７エカリスＫＮＩＯＩを得
た。

上記で得られたアルカリゲネス・フェカリスＫＮ１０１
と原株アルカリゲネス・フェカリス０ＵＴ８０２５のト
リプトン１ナーゼ活性を測定した。その結果は下記第１
表に示す通りである。

第　　１　　表 上記第１表から本発明の微生物アルカリゲネス・フェカ
リスＫＮＩＯＩ株は原株たるアルカリゲネス・フェカリ
ス０ＵＴ８０２５株に比べ約３．４倍のトリプトファナ
ーゼ活性を有することが明らかである。

実施例２ （１）プラスミドＤＮＡの調製 実施例１−＋２）においてプラスミドＩ）　ＢＨ３２２
を含有させたニジエリシア・コリに一１２０６０Ｏｒ”
”ｍ−株を用い、以下同様にして処理することによりプ
ラスミドＤＮＡｐＢＲ３２２０，８曙を得た。このｐＢ
Ｒ３２２１哩とプラスミドｐＫＴ２３１１μ２に各々制
限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩを通常の条件で作用させ
て両プラスミドＤＮＡ鎖を切断した。６５℃１０分間の
熱処理後９両反応液を混合し、　Ｔ　４１７ガーゼを通
常の条件下で作用させてＤＮＡ鎖を連結させた。実施例
１−＋４１と同様にエシェリッシア・コリに一１２０６
０Ｏｒ−ｍ−株をこのＤＮＡ溶液で形質転換し、カナマ
イシン２００μＰ／−を含むＬ−ブロス寒天培地を用い
て生育する菌株のうち、カナマイシン耐性、アンピシリ
ン感受性の株をｐＢＲ３２２にカナマイシン耐性遺伝子
を導入したプラスミドによる形質転換株として得た。か
くして得られた形質転換株を又 Ｌ−プロ４１４Ｆで培養したのち実施例１−＋２）と同
様にしてカナマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドＤ
ＮＡ　　ｐＢＲＫｌを０．６町採取した。

（２）ハイブリッドプラスミドの調製 上記（１）で得たｐＢＲ４１１μ２とｐＫＮ２０１１μ
２に各々制限エンドヌクレアーゼＲｃｏＲＩを通常の条
件で作用させて両プラスミド鎖を切断した。６５℃１０
分間の熱処理後０両反応液を混合しＴ４ＤＮＡ！Ｊガー
ゼを通常の条件下で作用させてＤＮＡ鎖を連結させた。

（３）ハイブリッドプラスミドによる形質転換。

実施例１−（４１と同様にしてアルカリゲネス・フェカ
リスＯＵ’Ｉ’８０２５を（２）で得たＤＮＡ溶液で形
質転換し、カナマイシン２００μ２／−を含むＬ−ブロ
ス寒天培地を用いて生育する菌株を採取し高トリプトフ
ァナーゼ活性を有する微生物を選択することによりトリ
プトフアナーゼの遺伝子を有するハイブリッドプラスミ
ド（ｐｘＮ２０２）を含み高トリプトファナーゼ活性を
有する形質転換株アルカリゲネス・フェカリスＫＮ１０
２を得た上記で得られたアルカリゲネス・フェカリスＫ
Ｎ１０２と原株アルカリゲネス・フェカリス０ＵＴ８０
２５のトリプトファナーゼ活性を測定した。その結果は
下記第２表に示す通りである。

第　　２　　表 （培地：実施例１で用いたものと同一）上記第２表から
本発明の微生物アルカリゲネス・フェカリスＫＮ１０２
は原株たるアルカリゲネス０ＵＴ８０２５に比べ約４４
倍のトリプトファナーゼ活性を有することが明らかであ
る。

実施例３ 実施例１で示した培地にアルカリゲネス・フェカリスＫ
ＮＩＯＩを植菌し３０℃で１９時間培養した。かくして
得られた培養液１０−を遠心分離して集め、該菌体を酵
素源とした。この酵素源にＬ−セリン６００岬、インド
ール６００■、１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ９，０）１＋ｄ
、１０ｍＭピリドキサールリン酸０．５　ｍｇを添加し
、水を加えて最終１０−とし、１００−容エルレンマイ
ヤーフラスコで３７℃、３日間、１３０ｃｐｍで振とう
反応を行なった。その結果９反応液中に９７５１ｒ１９
のＬ−トリプトファンが蓄積した（対インドール収率９
３．２％）。生成したＬ−）リプトファンの結晶をろ取
し、ろ液はアンバーライトＩＲ−１２０（Ｈ”〕型カラ
ムで処理してＬ−トリプトフアンを回収した。ろ取した
Ｌ−）リプトファンを回収した。

ろ取した結晶と樹脂処理して回収した結晶を合わせて活
性炭処理することにより、Ｌ−１−リプトファンの結晶
８４０町を得た（収率８６％）。結晶について光学活性
を測定した所〔α）　、　＝−３４゜５　（Ｃ＝１　、
　ａｇｏ）であった。

実施例４ 実施例３と同様の酵素源にピルビン酸３００ｆｎｆ、重
炭酸アンモニウム８００ｑ、インドール２００４．１０
ｍＭピリドキサールリン酸０．５１１１ｔ、エチレンジ
アミンテトラ酢酸四ナトリウム３０＋ｙ。

亜硫酸ソーダ１０ｍｙ、界面活性剤ＮＰ−２０にッコー
ケミカルズ社製）５００ｇＪを添加し水を加えて最終１
０ｄ（ｐＨＩＯ）とし、３日間、３７℃ｅ８０ｃｐｍで
振とう反応を行なった。その結果９反応液中に２３０町
のＬ　−トＩＪブトファンが蓄積した。

実施例５ 実施例１で示した培地２００−にアルカリゲネス・フェ
カリスＫＮＩＯＩを植菌し、３０℃１４０　ｃｐｍで１
９時間振とう培養した。かくして得られた培養液１０−
にＬ−セリン２００ｙｙ、インドール２０１）ｙ、　１
０　ｍＭピリドキサールリン酸０．５−を添加し、苛性
カリでｐＨ１０とした後。

３日間、３７℃、８０ｃｐｍで振とう反応を行なった。

その結果１反応液中に３１０１９のＬ−）リプトラ１ン
が蓄積した。

実施例６ 実施例３で示した培地２００−にアルカリゲネス・フェ
カリスＫＮＩＯＩを接種し、３０℃、１４０ｃｐｍで１
９時間振とう培養した。かくして得られた培養液１０ｄ
分の菌体を酵素源とし、これを特公昭５９−４８０９２
号記載の方法によって得られた酵素反応終了液〔サルシ
ナ・アル♂ダ０５２４１７の菌体をグリシンおよびピリ
ドキサールリン酸を含有する溶液に加えて酵素反応させ
た溶液：Ｌ−セリン１５０ｍｐ、グリシン１５０ｑを含
有する〕１０ｗＩｔ６ｃ懸濁し、インドール１５０ッ、
１０ｍＭピリドキサールリン酸０．５−添加し、苛性カ
リでｐＨ９として３日間、３７℃、８０ｃｐｍ振とう下
に酵素反応を行なった。その結果、反応液中に２０５ｑ
のＬ−ト！Ｊブトファンが蓄積した。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）アルカリゲネス属に属する微生物から採取したト
   リプトファナーゼの遺伝情報を担うデオキシリボ核酸を
   プラスミドに組み込んだハイブリッドプラスミドをアル
   カリゲネス属微生物に含有せしめた微生物。
2. （２）アルカリゲネス属に属する微生物から採取したト
   リプトファナーゼの遺伝情報を担うデオキシリボ核酸を
   プラスミドに組み込んだハイブリッドプラスミドを含有
   せしめたアルカリゲネス属に属する微生物の培養液、該
   培養液から採取した菌体もしくは該菌体の処理物をＬ−
   セリンとインドール、或いはインドール、ピルビン酸と
   アンモニアに作用させることを特徴とするＬ−トリプト
   ファンの製法。