JPS6087784A - ＴｒｐＲ保持菌株の培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はエシェリヒア属に属するトリット７アンリグレ
ツサ一対応遺伝子（Ｔｒ、Ｒ）保持菌株の培養方法に関
し、更に詳しくは、菌体中にトリプトファンシンターゼ
の含有量が高く且つ高収量の菌体を取得することのでき
るエシェリヒア属に属するＴｒア保持菌株の培養方法に
関する。

トリプトファンシンターゼはインドールとＬ又はＤＬ−
セリンとからＬ−トリプトファンを製造する場合の酵素
触媒として有用な物質である。

Ｌ　−トＩＪプトファ／は飼料や食料等への添加物とし
ての用途或いは各種の工秦的用途が考えられるが、現在
までのところ工業的に安価な製造法が開発でれておらず
、これらの用途は制限されているのが実情である。した
がってＬ−）リグトファンの工業的製造法の確立が強く
望まれている。

ところで、Ｌ−トリプトファンの製造法としてこれ迄い
くつかの方法が提案されている。例えば、（１）［賀を
用いブレビバクテリウム・フラパムヲｉ！接発酵して培
養中に産生されるＬ−トリプトファンを精製採取する方
法（特開昭５７−１７４０９６号公報）　Ｓ　Ｌ２１イ
ンドールもしくはアントラニル酸と糖質を含有する培養
液中でバチルス・ズブチリスを培養し、培養液中にＬ−
）リプトファンを生成蓄積でせ、その培養液がらＬ−）
リプトファンを精製採取する方法（％公昭５３−３５１
５２号公報）　：　（３１インドールとセリン或いはイ
ンドールとピルビン酸及びアンモニウムイオンかう、微
生物が生成する酵素、トリットファンシンターゼ又はト
リプトファナーゼを用いて、酵素反応によりＬ−）リプ
トファンを製造する方法（特開昭４７−３９６９３号公
報、特公昭４９−４６９１７号公報）等が提案でれてい
る。

本発明者らはインドールとセリンとから酵素法によるＬ
−）リプトファンの製造に注目し研究を行なってきた。

この酵素法によるＬ−）リプトファンの製造のキーポイ
ントはその触媒作用を担うトリプトファンシンターゼを
如何に安価に大量に生産するかにかかつている。このト
リプトファンシンターゼは微生物によって生産されるも
のであるから、トリシトファンシンターゼを安価に大針
に生産するためには、微生物菌体中のトリプトファンシ
ンターゼの含有量を高めると共ＶＣ培養時における該菌
体が高収量で得られる培養法を開発することが必須であ
る。

微生物菌体中の特定の酵素の含有量を増大させるための
一つの有力方法として、遺伝子組み換え技術を利用した
遺伝子増幅効果が考えられる。しかしながら、トリプト
ファンブロモ−ター及びオペレーター領域を利用する場
合には、上記のような遺伝子増幅効果を有している菌株
においても、主染色体上にあるトリプトファン抑制穢構
であるトリプト７アンリプレツサ一対応遺伝子の作用に
よりトリフ０ト７アングロモーター活性が強く阻害でし
、ソの結果菌株中のトリプトファンシンターゼの含有量
は一定のレベルに抑制されてしまい、菌体中のトリット
ファンシンターゼを著量蓄積きせることは困難である。

また、この抑制機構であるトリプトファンリプレッサー
をコードする遺伝子Ｔｒ７）Ｒが欠失した菌株を用いる
ことも考えられるが、かがるｉ’　、　、Ｒ欠失菌株は
、トリプトファン生合成に関与する遺伝子をもつプラス
ミドで形質転換すると、該菌株中ではグラスミドが極め
て不安定でグラスミド全体の脱落もしくは部分的欠失な
どが起こることが報告ぜれでおり［Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏ
ｆ　ＧｅｎｅｒａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１１８
．２５３〜２６１　（１９８０）参照〕工業的には問題
がある。

一方、トリプトファンリプレッサーの機能を抑制する方
法として、培地にトリプトファン訪導体であるインドー
ルアクリル酸をｌＯμｆ／ｄ以下の濃度で添加し、トリ
プトファンリプレッサーを不活化することによって、菌
株中のトリットファンシンターゼ含有量を高めることが
できることが報告されている（　Ｐｒｏ、　Ｎａｔ、　
Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　。

Ｖｏｗ、　７１．　Ａ、９、ｐｐ３４５５〜３４５９　
（１９７４）参照〕が、培地としては最小栄養培地、す
なわち合成培地を使う必要があると指示でれているため
、単位培養液当りの菌株の収量は低く、！菌体中のトリ
プトファンシンターゼの含有量が高くても、単位培養液
当りのトリプトファンシンターゼの生産量は低く、工業
的に安価に酸素を得る方法としては過てない。

また、真核細胞由来のペプチドをコードする遺伝子、ベ
クター及びプロモーターからなる組換えＤＮＡを含有す
る該ペグチド生産能をもつ微生物を、インドールアクリ
ル酸を添加した培地で培養することにより、該ペプチド
の生産性を高める方法もごく最近提案でれた（特開昭５
８−１４１７９６号公報）が、この方法も有様窒素源の
低い合成培地を使用しており、菌体生産性は低く、工業
的安価な酵素源とはなりえない。

本発明者らは、上記のインドールアクリル酸を添加する
培養法において棲、合成培地の代りに、ポリペブートン
、トリゾトン、ペプトンなどのペプトン類、肉エキス、
酵母エキス、麦芽エキス、コーンステイブリカー、カザ
ミノ酸などの天然成分を含む天然培地の使用可能性を検
討すべく、大腸菌培養用の天然培地として代表的なＬ培
地（トリプト７１０重量部、酵母エキス５Ｎ量部、グル
コースｔｉ量部、ＮａＣｌ３重量部、純水１０００重量
部、ｐｉ１７．２）を用い、上記文献の指示に従いイン
ドールアクリル酸をｌθμ２／献の濃度で添加し、大腸
菌（ｙｚ２ｏｏｔ株、（ＦＥＢＮＰ−７１３９））の培
養を試みたが、上記文献に記Ｕされたような菌体中のト
リプトファンシンターゼ含有量の増大効果は認められな
かった。

そこで、本発明者らはこの天然培地におけるインドール
アクリル酸の添加効果につき、インドールアクリル酸の
添加量及び添加時期の両面から鋭意検討を重ねた結果、
インドールアクリル酸を上記文献に記載されているより
もはるかに多量の少なくとも２５μｆ　／　ｍｓ以上の
最終濃度で添加すると、菌体中のトリプトファンシンタ
ーゼの含有量が増大するにかりでなく、菌体の収量も向
上すること、しかも、この効果はインドールアクリル酸
を培養の初期に添加する場合のみならず、菌体が充分に
増殖するまで、すなわち対数増殖期の末期までの任意の
時点で添加し培養を継続する場合にも得られることを見
い出し、本発明を完成し゛た。

かくして、本発明によれば、工７エリヒア属に属するト
リノトファンリゾレツザ一対応遺伝子（Ｔ　ｒｐＲ）保
持菌株を、有様窒素源を窒素原子重量に換算して少なく
とも０．１重量％含有する栄養培地で培養するに際して
、遅くとも該菌株の対数増殖期の末期までに該培地にイ
ンドールアクリル酸又はその塩を少なくとも２５μｆ　
／　ｒｎｅの最終濃度で添加して培養を行ない菌体中の
トリットファンジンダーゼの含有量が増大した上記菌株
を取得することを特徴とするエシェリヒアＭ　ＶＣＩＡ
するＴｒ、ｐＲ保持菌株の培養方法が提供される。

本発明の方法においては、栄養培地として、合成培地１
小栄養培地）と異なり、有機窒素源を多量に含有する、
いわゆる天然培地を使用する。

すなわち、本発明では有機窒素源を窒素原子重量に換算
して少なくともｏ、　を重量係、好ましくは０．２〜１
．０重量％、をらに好ましくは０．２５〜０．６Ｍ景多
含有する天然培地を使用する。かかる天然培地における
有機窒素源としては、従来からエシェリヒア属に属する
微生物の培養のために使用式れている天然培地において
屋素源として配合でれているものが同様に用いられ、例
えば、ポリペプトン、トリプトン、ペグトンなどのペグ
トン類、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、コーンス
テイープリカー、カザミノ酸等の有機窒素化合物（アミ
ノ酸、ペゾチド、ビタミン、未知生育促進因子など）を
それぞれ単独で又は２種もしくはそれ以上混合して用い
ることができる。本発明の方法に使用する培地には、窒
素源として上記の有機窒素源に加えて、無機窒素源、例
えば、（ＮＩＩ４）２ｓｏ４、ＮＭ４Ｃｌ　、　（Ｎ１
１４）ｔＰＯ４、（Ｎｌ１４）　ＮＯ５等を含ませるこ
とも可能である。

また、本発明の方法に使用する培地は、栄養源として、
上記の窒素源の他に、炭素源、ミネラル分、ビタミン等
を含有することができる。炭素源としては、例えば、グ
ルコース、グリセロース、フラクトース、シュクトース
、廃糖蜜などの種々の炭水化物を利用できる。

以上に述べた如き栄養分を含む培地は最終的にｐｌｉを
一般に５〜９の範囲、好ましくは６〜８の範囲に調整し
た後、菌体の培養に供することができる。

本発明の方法に従い暗、養することのできる微生物は、
微生物菌体内にトリプトファンシンターゼを産出する能
力のある菌株であり、殊に、トリプトファンシンターゼ
生産能４ｃもつエシェリヒア属に属するトリプトファン
リゾレッサ一対応遺伝子（本明細書においてこの遺伝子
を＠　ＴｒｐＲ″と略記する）を保持した菌株である。

上記トリノトファンリゾレッサ一対応遺伝子（’Ｔｒｐ
Ｒ）は、該菌株の主染色体にコードされていてもよく或
いはグラスミド中に存在していてもよく、本発明はその
いずれのタイプの菌株に対しても適用することができる
。

しかして、本発明の方法においては、トリットファンシ
ンターゼ生産能をもつエシェリヒア属に楓するＴｒ、Ｒ
保持菌株はいずれも使用可能であるが、特に、トリシト
ファンプロモーター及びオヘｖ−１−領域とトリプトフ
ァンシンターゼ対応遺伝子をもつグラスミド、より好適
にはトリプトファンオペロンを有するグラスミドで形質
転換することにより、トリプトファンシンターゼの生産
能が増幅でれた大ＪＭｋ菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　
ｃｏｌｉ　）菌株が有利に使用される。そのようなグラ
スミドを含有する大腸菌菌株としては、例えば、本発明
者らが先に創製し提案したトリプトファンシンターゼの
生合成を司る遺伝子を含む両分と　ＩＮ因子プラスミド
の増殖制御分画系を司る遺伝子を含む両分とを有する新
規なプラスミドで形質転換された大腸菌菌株を有効に使
用することができる。

しかして、この新規なプラスミドについてでらに詳しく
説明する。

上記のグラスミドを構成する「トリプトファンシンター
ゼの生合成を司る遺伝子を含む両分」（以下「Ｔ画分」
と略称することがある）とは、インドールとＬ−又はＤ
Ｌ−セリンがらＬ−トリプトファンの生合成を司る遺伝
子ケ含む両分を意味し、しかして、Ｔ画分にはトリプト
ファンオペロン又はトリプトファンオペロンを含むもっ
と大きな遺伝子画分、或いは、トリフ０トフアンオペロ
ン中のトリプトファンシンターゼの生合成を司る遺伝子
であるＴｒｐＡとＴｒ、Ｂにグロモータ及びオペレータ
ーを結合した画分、又は７’、　ｐＡとＴＢにＴ、ｐＣ
，Ｔｔ−、Ｄ及びＴｒｐＥの少ｐ なくともｌ［とプロモーター及びオペレーターを結合ま
た両分（例えば、”　ｒｐＡｚ　Ｔｒ　ｐ　ＢｘＴｒ７
）Ｃ及びＴｒｐＥにプロモーター及びオペレーターが結
合した画分）等が包含てれる。これらの１′画分として
は実用的には大腸菌由来のものが好適に使用ぢれ、中で
も、トリプトファンオペロンそれ自体及びファージφ８
０ｐｔの遺伝子を制限酵素／Ｊ　ａｍ　ＩＩ　Ｉにより
切断して得られる約２２．６ｋｂの分子量を有するトリ
プトファンオペロンを含む両分が有利に使用でれる。

他方、Ｆ因子プラスミドは例えば「蛋白質　核酸　酵素
」第２７巻第１号（１９８２）の９８頁の図１の遺伝子
地図及びＥｃｏＲＩによる物理的地図に示される如き構
造をもつ、分子量が９４．５ｋ　ｂ　（６２Ｘ　Ｉ　Ｏ
’　ｄｏｌｔｏｎ）（Ｄ既知（Ｄｆ７スミドであり、大
腸菌などの腸内細菌中に通常細胞染色体轟り１〜２個の
コピー数で存在し、従って染色体が細胞当り２個あると
すればＦ因子シラスミドとしては２〜４個しか担われて
いない。このグラスミドは細胞分裂時にちょうど倍化し
てそれぞれの娘細胞に正確に伝達でれるような機Ｗｔを
備えている（このように、コピー数を低レベルに保ちつ
つ、正確に宿主の増殖と被−スを合わせて増やす仕組み
をｓｔｒｉｎｇｅｔｎｔな増殖の制御と呼んでいる）。

Ｆ因子プラスミドにおけるこのようなｓｔｒｉｎｇｅｎ
ｔな増殖の制御機能が、ｍ１ｎｉ−Ｆと呼ばれる分子量
が９．　ｌｋ　ｂの自律増殖できる断片に担われている
ことも既に究明でれており、このｍ１ｎｉ−Ｆがｐ゛因
子プラスミドより制限酵素Ｅｃ。

ＲｔＫより切り出し可能であることも知られている。

上記新規なプラスミドはとのｍ１ｎｉ　−Ｐ’に担われ
ている増殖制御分配系を利用するものであり、しかして
［Ｆ因子プラスミドの増殖制御分配系を司る遺伝子を含
む画分」　（以下Ｆ画分と略称することがある）とは、
上述したようなＦ因子プラスミドを娘細胞に正確に伝達
する機構を備えた遺伝子画分を意味し、そのようなＦ画
分の代表例としては約ｇ、　１　ｋ　ｂの分子量含有す
るｍ１ｎｉ−Ｆ画分が誉げられる。

前記新規なプラスミドは、以上に述べた１画分とＦ画分
に加えて、さらに他の遺伝子画分、例えば各種細菌の薬
剤耐性を司る、例えばカナマイシン耐性等の遺伝子画分
、例えばカナマイシン耐性を司る遺伝子画分等を含有し
ていてもよい。

そのようなグラスミドの代表例として、トリプトファン
オペロン画分及びノ？因子プラスミドのｍ１ｎｉ−Ｆ画
分を含有し、分子量が約３１．７　ｋ　ｂであり且つ下
記の制限酵素に対して下記の感受性を示す、すなわち （α）ＥｃｏＲＩに対する認識部位が５ケ所であり、（
ｂ）　ＨａｍｌｌｌＶｃ対する認識部位が２ケｊ９ｉで
あり、（Ｃ）　Ｍ　ｉ　ｎ　ｄ　川に対する認識部位が
３ケ所であることを特徴とするグラスミドｐＭＴＹ−１
が挙げられる。

このプラスミドｐＭＴＹ−１は上記のとおり約３１、７
　ｋ　ｂの分子量を有するが、この分子量はアがロース
・グル電気泳動法により？ｌｌ定したものである。

また、プラスミドｐｋｉＴＹ−１の各柚制限酵素に対す
る感受性は上記（α）〜（Ｃ）に示すとおりであり、よ
り詳細に各制限酵素による分解断片の分子量（ｋｂ）を
示せば次のとおりである。

（（１）　Ｅｃｏ　ＲＩ：ｃ＋、ｔ　、　７．０　、６
．４　、６．１　、３．１（ｂ）　Ｂａｍ１ｊｌ　：　
２２．６　、９．１（Ｃ）　Ｉｊｉｎａ川：１８．０．
１０．８，２．９以ｈｖｃ述べた如【特性をもつプラス
ミドｐＭＴ　Ｙ−１は例えば次のようにして製造するこ
とができる。

まず、トリットファンオペロン画分の調製は、例えば、
染色体遺伝子中にトリットファンオペロンをもつ大腸菌
、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏＬｉＫ−１２
（ＩＦ０３３０１．ＡＴＣＣ１０’１９Ｂ。

ＡＴＣＣｇ２３ｓ６２）などに、ファージ、例えば７ア
ーヅφ８０　（ＡＴＣＣ１１４５６α−Ｂｌ）などを感
染させ、溶原化及び＠発現象を利用して、ファー−、ｌ
ＤＮＡ中にトリプトファンオペロンを取り込んだファー
ジを大証に調製し〔Ｒ。

Ｍ　、　Ｄｅｎｎｅｙ、　Ｃ，Ｙａｎｏｆｓｋｙ　：　
Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　、。

ｉｔｓ、５０５　（１９７４）参照〕、それから常って
ファーゾＤＮ／１を抽出し、制限酵凛、例えばＨＧｍ　
ＨＩ　、　Ｅ　ｃ　ｏＲＩ等を用いてトリプトファンオ
ペロンを含む遺伝子画分を切り出すことにより行なうこ
とができる。

他方、ｔｎｉｎｉＦ画分の調製は、例えば、１・“因子
シラスミドを保有する微生物、例えば、大腸菌（Ｅ、　
ｃｏｌｉ）　Ｋ　−１２株（，４ＴＣＣ１５１５３゜Ａ
ＴＣＣｅ２３５８９．ＡＴＣＣｅ２３５９０）等からそ
れ自体公知の方法で、例えばＩ）、　Ｇｕｅｒｒｙ。

Ｄ、　Ｌ、Ｌｅｌｌｌａｎｃ　、　Ｓ、　Ｉ？ｃＬｌｋ
ｏｗ　；　／　、　Ｂａｃｔ　＋ｙ１１６．１０６４（
１９７３）等の文献に記載の方法でＦ因子シラスミドを
取り出し、それ７５＝ら宙ＩＪ限酵素ｂ”　ｃ　ｏ　Ｒ
Ｉを用いて分子量が約９．１ｋｂ（１）ηＬｉｎ１　Ｆ
断片金切り出すことにより調製することができる。

このようにして調製でれたｍ１ｎｉＦ断片は、上記トリ
シトファンオペロンを含む遺伝子画分の切り出しに用い
たと同じ制限酵素で処理した後、上記で調製したトリプ
トファンオペロンを含む遺伝子画分と一緒にし、リガー
ゼ、例えばＴ４ファージ由来のりガーゼ等を作用させて
結合式せることにより、目的とするグラスミドｐＭＴＹ
−１が得られる。

なお、プラスミドｐＭＴＹ−１の具体的調製法について
は後記参考例１に詳細に説明でれている。

このようにして調製されるプラスミドは、コピー数は少
ないが、宿主の細胞分裂に際して娘細胞に正確に受け継
がれ、脱落することが少ないという優れた特性を有する
。

従って、このグラスミドをトリプトファ／の製造におい
て工業的に応用する罠際して、該グラスミドで宿主が形
質転換でれる。この形質転換に利用できる宿主菌として
は、例えば、大腸菌、殊にトリゾトファ／要求性変異株
としたものが特に好ましいものである。

これら宿主菌に対する上記のプラスミドの導入はそれ自
体公知の方法、例えばＭ、　Ｍａｎｄｅ　Ｌ　、　Ａ　
。

１１ｉｇａ；Ｊ、　Ｍａｔ、　Ｂｉｏｌ、５３．１５９
　（１９７０）等の文献に記載の方法で行なうことがで
きる。

以上に述べた菌株全前述した如き天然培地で培養するに
際し、本発明の方法は、培地にインドールアクリル酸又
はその塩（塩としては例えば、インドールアクＩＪ　／
Ｌ−酸のＮα塩、Ｋ塩、ＮＪ１４塩等が挙げられる）を
少なくとも２５μり／　ｍｅの最Ｒａ度が達成されるよ
うな量で絵肌することを本質的特徴とするものである。

この特定の高濃度のインドールアクリル酸又はその塩の
添加により、トリプトファンリプレッサーが不活化ぜれ
てトリプトファンブロモ−ター及びオ被レータ−が抑制
解除状態となり、該菌株はトリプトノア／シンターゼを
高生産性でもって生成すると考えられる。

しかして、インドールアクリルａ又はその塩の添加量は
、培地に対する添加量が最終的に２５μ２／ｄ以上とな
るような割合で添加量れる。添加量の上限は特に制限は
ないが、培地に対する溶解度以上に加えても無意味であ
り、一般には５００μｆ　／　ｙｌ以下とすることがで
きる。好適な添加量範囲は用いる菌株等にもよるが、通
常８０〜２００μｆ　／　ｍｅであり、特に９０〜１５
０μｆ　／　ｍｅの範囲が好ましい。インドールアクリ
ル は上記量を一度に添加してもよく、或いは場合によって
は数回に分けて添加してもよい。

また、インドールアクリル酸又はその塩の添カロ時期は
、菌体の充分に増殖し終るまで、すなわち対数増殖期の
末期までであり、その間でおればいつの時点で冷加して
もほぼ同じトリットファンシンターゼの増収効果が達成
でれることが判明した。

しかして、インドールアクリル酸又はその塩は培養の初
期（開始時）に添加してもよく、或いは菌体の対数増殖
期の終る直前に添加してもよく、或いはまに１上記の期
間中数回に分けて添加してもよい。いずれにしても、対
数増殖期の末期における培地に対するインドールアクリ
ル酸又はその塩の添加量の合計が最終的に２５μｒ　／
　ｍｅ培地以上となるようにすべきである。

前記菌株の培養は、上記のようにしてインドールアクリ
ル酸又はその塩を添加することを除けば、それ自体公知
の方法で行なうことができる。例えば、培養は、振盪培
養成いは通気攪拌深部培養などの好気的条件下に行うこ
とができる。培養温度は一般に２０〜５０℃の範囲とす
ることができ、培地のｐＨは中性または微アルカリ性附
近、通常ｐｌＪ６〜８の範囲に維持することが望ましい
。培養は閑体内にトリプトファンシンターゼが充分に蓄
積するまで行なうことができ、培養期間は通常４〜４８
時間程度で充分である。

以上に述べた本発明の培養法により、菌体中におけるト
リシトファンシンターゼの含有量が高い菌体を高収量で
取得することができ、単位培地当りのトリプト７ア／シ
ンターゼの生産量は、インドールアクリル酸又はその塩
を添加せずに培養を行なった場合の約２〜ｌＯ倍にする
ことが可能である。

しかして、本発明の方法によれば、トリシトファンシン
ターゼを工業的に安価に且つ太斂に提供することを可能
にするものであり、インドールとＬ−又はＤＬ−セリン
とからのＬ−トリグトファ７の工業的生産に太いに貢献
するものである。

本発明の方法により得られる菌体をＬ−トリプトファン
の生産に利用するに除して、該菌体は培養物から分離し
た後そのまま使用することもできるが、普通一般に行な
われるように超音波破砕処理等の破イメト処理を行なっ
た後に使用してもよく、或いはまた、該破砕処理物をで
らに水等で抽出した抽出物、又は該抽出物を芒らに硫安
等で処理して酵素成分裟沈殿嘔せた粗精製物の形で使用
することもでき、ざらに、該菌体又はこれら処理物は必
要により固定化して用いることもできる。

このようにして調製される菌体又はその処理物は、イン
ドールとＬ−又はＤＬ−セリンとの反応の触媒として使
用される。該菌体又はその処理（物の存在下でのインド
ールとＬ−又はＤＩ、−七リンとの反応は、通常のｔｇ
素反応と同様に、例えば０、１Ｍリン配緩価液（ｐツノ
７、０〜９０）あるいは水（ｐＨ７、０〜９．０）等の
溶媒中で、約２０〜約５０°Ｃ１好ましくは約３０〜約
４０℃の温度で通常約ｌθ〜約７２時間行なわれる。

インドールとＬ−又はＤＬ−セリンの反応時の使用量に
は特に制限はないが、一般にはそ牙ｔぞれを０．１〜２
０％（　ｗ　ｔ　／嘗ｏ１）の製置範囲で使用するのが
適当である。また、該菌体又はその処理物の使用量も特
に制限はれるものではないが、一般に１〜ＩＯ係（ｗｔ
ｌτｏｌ）の濃度で使用することができる。

上記のような培養方法によって得られた菌体又はその処
理物を用いてインドールとＬ−１又はＤＬ−セリンを反
応せしめて得られる、反応液中に生成したＬ−トリプト
ファンの分離・精製は、イオン交換樹脂、活性炭等によ
る吸着、脱着処理等の公知の方法により行うことができ
る。

次に実施例及び参考例により本発明をざらに説明する。

（／ｆｌ　ｍ１ｎｉＦ画分の調製 大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）　Ｋ　−１２菌株（ＡＴＣ
Ｃ１５１５３）を１ｔのＬ培地（Ｂａｃｔｏトリプトン
ｔｏｒ、酵旬エキス５２、ＮａＣ１５ｆ、クルコース］
？、水ｘｔ；ｐＨｒ、ｚ）に接種し、約３７℃で約４時
間振盪培養した後、菌体を集め、リリチウム処理を行な
い且つドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を添加して溶
菌させた。この溶菌液を３２．０ＯＯＸりで４０分間遠
心分附処３：！Ｉ！　Ｌ、上清を分画し、次いで塩化セ
シウムーエチヅウムプロマイド平衡密度勾配遠心分離処
坤ケ行なった後、透析処理により、Ｆ因子プラスミドを
含む溶液を分取した。この溶液にエタノール沈殿を行な
い、最終的に約２０μ２０１１因子プラスミドを採取し
た。

次に、ｍ１ｎｉＦ画分の調製に際して、上記のＦ因子プ
ラスミドを５μグとり、制限酵素であるＥｃｏＲＩを３
７℃、１時間作用させて該ｐ”因子プラスミドＤＮＡ鎖
を切断し、約９．　Ｌ　ｋ　ｂのｍ１ｎｉＦ断片を含む
ＤＮＡ溶液を調製した。

（ｌ力　ファージφ５ｏｐｔの調製 大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）Ｋ　−１２株（ＩＦＯ３３０
１）を１ｏｏ−のＬ培地（組成は前記と同じ）に接種し
、３７℃で約４時間振盪した培養物の０．２　ｍｌ！と
、ファーゾφｓｏ　（ｔｒｃｃ１１４５６・α−Ｂｌ）
水溶液（１０５ケ／　ｍｅ　）の０．　ｌ　ｒｒｔとを
、Ｌ培地軟寒天（Ｌ培地」−寒天法）中に混合したのち
、Ｌ培地寒天プレート上にＭ層する。該グレートを３７
℃にて約５時間培養するとゾラーク（溶Ｗ４斑）を生じ
、嘔らに２〜３日間３７°Ｃにて培養を継続すると、グ
ラーク中にファーソφ８０溶原菌の生育コロニーを生ず
る。該溶ＩＪＡ菌をＬ培地にて３７℃で４時間培養後、
上記と同じＬ培地寒天プレート上に塗抹したのち、紫外
線照射（４００〜８００ｅｒσ８／町２．１０〜２０秒
）による溶原ファージの誘発によりファージφ８０ｐｔ
　（）リプトファンオベロンを含むファーゾＤＮＡ）を
調製する。

（Ｃ）トリプトファンオペロン画分の調製大腸菌（Ｅ、
　ｃｏｌｉ）Ｋ−Ｌ　２株（ＩＦＯ３３ｏｌ）を１ｔの
Ｌ培地（組成は前記と同じ）に接種し、約３７℃で約３
時間振盪培養し、対数増殖期に２５俸（ｗ／ｖ）グルコ
ース溶液１０ｒｎＬと上記で調製したファーヅφ８ｏｐ
ｔ溶液をｌ□ＩＩケ／Ｈの濃度で添加しくｍｏｉ　２．
０　＞　、５時間振盪を継続後常法通りクロロホルムの
添加により、ンアーソφ５ｏｐｔを大量に調製した［７
’、　ｆｉｉａｎｉａｔ、ｉ８．　Ｅ。

Ｆ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　：Ｊｉｏ
Ｌｅｃｒｂｌσγｃｌｏｎｉｎｇ　”　（１９８２）　
９．７６〜８０　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏ
ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ参照〕。

次に取得したファーヅφ８０ｐｔ溶氾−をトリス緩衝液
（ｐＪｉ７．８）にて透析後、フェノール法により、Ｄ
ＮＡ抽出法〔上記”Ｍｏ１ｅｃｔｃｌａ、ｒ　Ｃ１ｏｎ
−ｉｎｇ″ｐ、８５径照〕にＬ　ツ’Ｔ−７７’）　Ｄ
　ＮＡ　全抽出精製し、これに制限酵素Ｈａｍｌｌｌを
与え３０℃で３０分間反応式せ、トリゾトファンオペロ
ンを含む遺伝子画分を得た。

（０トリプトファンオペロン画分とｍ１ｎｉＦ画分の結
合 前記（→で得たｍ１ｎｉＦ画分に制限酵素Ｈａｍｌｌｌ
を３０℃にて３０分間反応式せ、次いで、６０°Ｃで５
分間熱処理して１３ａｍｌｌｌを失活嘔せた後、前記０
で得たトリットファンオペロン画分を添加混合し、／Ｉ
ＴＰ（アデノクントリホスフェート）及びジチオスレイ
トールを加え、てらに１４フアーソ由来のＤＮＡリガー
ゼ（ＤＮＡ結合作用を有する；宝酒造■製１−Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼ」）を添加した後、１２℃で１７時間反応を
行なった。次いで６０℃で５分間熱処理して、ＤＮＡ＋
）ガーゼを失活ぢせた後、エタノール沈殿法にて、プラ
スミドｐＭＴＹ−１を採取した。

得られたプラスミドｐＭＴＹ−１の分子量を、アカ゛ロ
ース・グル電気泳動、法により測定した。使用したアガ
ロース・ケ゛ル電気泳動装置は、マリンル産業（財）製
フラットアガロースゲル電気泳動装置ＫＳ−８４２２Ｆ
ＡＥ型であり、電気泳動条件は、０６％寒天ケ゛ルを作
製し、緩衝液（０，０４ＭＴｒｉｓ、００４Ｍ酢酸ソー
ダ、ｏ、ｏ□ＢＡＤ’　ＥＤＴＡ、酢酸でｐ　ＪＩ　Ｌ
Ｌ　３に調整）中に製限酵素（ＥｃｏＲＩＸＢａｍｌｉ
Ｉ又はＩＩ　ｉｎｄ　ｎｌ　）　ｆ用いてプラスミドｐ
ＭＴＹ−１を分解ぜせたＩ）ＮＡ断片の混合物を入れ、
８０Ｖ、４〜５時間電気泳動させた。

泳動後、寒天ケ゛ルを取り出し、エチジウムブロマイド
にて染色後、２５４ｎｍＵＶ光で照射してＤＮＡの移動
位置を検出し、分子基既知のＤＮＡ断片（λＤＮＡを１
ｌｓｎｄ■で分解して得られたＤＩＶ、４：和光紬薬工
業■製［λＤＮ　Ａ　−１１ｉｎｄ　Ｉｌｌｄｉｇｔｔ
ｓｔｓ　Ｊ）との比較により分子量を決定した。

参考例２ニブ２スミドｐＭ’ＴＹ−１による大腸菌に一
１２系変異株の形質転換 （湧　宿主菌の準備 大腸−（Ｅ、　、ｃｏ　ｌ　ｉ　）Ｋ−１２株（ＩＦ０
３３０１）から常法に従い、ＮＴＧ（７ｖ−メチル−Ｎ
′−ニトロ−Ｎ−ニトロングアニソン）処理によってト
リットファン要求性変異株を調製した［　Ｅ、　Ａ。

Ａｄｇｔｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｌｙｅｍ
、　ＢｉｏｐｌＬｙｓ。

Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、、１８，７８８（１９６５）参照〕
。

すなわち、上記Ｅ、　ｃｏＬｉ　Ｋ　−１２株をＬ培地
にて対数増殖中期まで培養し、遠心分離により集菌して
菌株をＴｒｉｓ−マレイン酸緩衝液（ｐＨ６，０）ｖｃ
　ｗ　ｒａした後、ｌ　００　ｆｉｆ／ｒｄ　〜２００
μ’　／　ｍｅのＮＴＧを添加し、１５〜３０分間処」
−１，１！する。該処理物を同じ緩衝液にて洗浄後、Ｌ
培地に添加し、３７℃にて振盪培養を行ない。該培養物
は常法に従い、ペニシリン濃縮法およびレグリカ法を併
用してトリットファン要求性変異株を単離した。

（旬　形質転換 上記（イ）で得た大腸菌ｘ−１２系昧（トリプトファン
要求性変異株）を、前記参考例１で用いたと同じＬ培地
ｌＯｍｅに接種し、３７°Ｃにて振盪培養を行ない、対
数増殖中期もしくは、後期まで生育ぢせた後遠心分離に
て集菌し、これを０℃の氷冷下に０．　ｌ　Ｍ　Ｍ　ｇ
Ｃ１２及び０．　Ｉ　Ｍ　ＣａＣ１２の水溶液に懸濁さ
せてＤＮＡ受容状態菌（コンビ−テント菌）を調製した
。これに前記参考例１で得たプラスミドｐＭＴＹ−１を
加え、０℃の水冷下に４０分間反応はせ、次いで４０℃
にて３分間加温処理した後、再度０°Ｃの氷冷下にて２
時間反応させた。

次にＬ培地に上記処理菌体を接種し、３７℃にて１時間
３０分振盪培養後、遠心分離にて集菌し、菌体を洗さｐ
後、最少培地（Ｄａｖｉｓ培地：　ｇＪｊ　Ｐ　Ｃ’４
７７、人１１２ｐｏ４２　ｆ、Ｍｇ５Ｏ，・７１７２０
０．　Ｉ　ｆ。

（Ｎ〃４）２５０４１　？、グルコース２９、純水ｌｌ
）にて調製した平板培地に塗抹し、３７℃にて培養し、
生育したコロニーを再び同培地上で純化した′後、形質
転換株（Ｔ、、要求性の消失、すなわちゾ之スミド上の
トリプトファンオペロンにより生合成可能となり、最少
培地上にて生育可能となつ　゛た菌株）を得た。この形
質転換株は茨城県筑波郡谷田部町東１丁目１番３号の工
業技術院微生物工業技術研死所に、昭和５８年７月６日
刊で受託番号：微工研菌寄第７１３９号にて寄託されて
いる。

参考例３：形質転換株の安定性 前述のＬ培地１００ｍ１を５００Ｆｎｌ容三角フラスコ
に分注し、１２０℃で１５分間滅菌処珪したものに、参
考例２で得た形質転換株を植菌し、３７℃にて２４時間
振盪培養を行なった後、同様にして調製したＬ培地に２
　ｔｎｌ植継し、同じく３７℃にて２４時間振盪培養を
行ない、この操作を縁返し実施してｉｔｓ回の培養を行
なった。

各培養終了時（２４時間培養時）に基１３菌し、菌体を
洗＃後、前記最少培地にＬ−）リゾトファン２　Ｑ　ｍ
ｙ　／　Ｌを添加して調製した平板培地に一定量塗抹し
、３７℃にて１８培表しだ。生育コロニー２００ケ（無
差別述択）をし、トリプトファンを含まない最少培地に
植菌し、３ｑ”ｃにて２日間培養後、再度同様の最少培
地に植菌し、生育コロニーをカウントする。

この結果、トリプトファン添加培地に生育したコロニー
はすべてトリグトファ／を含捷ない最少培地にも生育す
ること、すなわち該シラスミドの高度な安矩性を確認し
た。

なお、形質転換株中のグラスミド存在のＩ（（Ｍ認試験
として、形質転換株のアクリジンオレンジ処理法により
、Ｔｒ、要求性株が出現し、また、前記の５ＤＳ−リゾ
チーム法及び塩化センウムーエチヅウムプロマイド法に
より、プラスミド羅６台を併行して行ない、グラスミド
の分子量に変化の無いことを確認した。

実施例１ 下記の組成 Ｈａｃｔｏ　）リプトン　１０重量部 酵母エキス　５１ グルコース　ｌｚ ＮαＣ１５ｉｒ 純水　１０００　＃ ｐ　ｉｔ　７．２ のＬ培地ｒ容址５−直径１８ｍの試験管に分注し１２０
℃で１５分間殺菌した培地に、前記参考例２で創製した
形質転換株（ｒＥｚ＜ｈｒ　ｐ−ｔ　１３９　）を１白
金耳量植苗し、３７℃で１８時間振盪培養した。

次に、上記と同じ組成のＬ培地１００ｍ１を容蓋５００
１の振盪フラスコに入れ１００℃で１５分間殺菌した培
養液に上記の前培誉物２ｍｅを植菌し、同時にインドー
ルアクリル酸を下記８１１表に示す蓋添加した後、３７
℃で７時間振盪培養した。

培養終了後、遠心分離によって集菌し、該菌体を、Ｙａ
ｎｏ　ｆ　ｓｋｙらの方法［ＪｆｅｔｌＬｏｄ　ｉｎ　
ｌｉ’ｎｚｙ−ｍｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ、ｓ、７９４　、
（１９６２）参照〕に準じて、ｏ、２ｙ（湿菌体）はか
りとり、１００飢Ｊｆトリス（ヒドロキシメチルアミノ
メタン）緩衝液ｐｊ１７．８に府濁し、超音波処理によ
り菌体を破壊した。この溶液を１２００　Ｏｒ　ｐ　ｍ
で４０分間遠心分離を行ない、上清を粗酵素液とした。

反応液組成としては、インドール０．４μｍｏｌｅ、Ｉ
）Ｌ−セリン８０μｍａｔｅ、塩化ナトリウム１８０ｐ
ｍｏｌｅ、ピリドキサール５す７　ｎ’＜　０．　（＋
　３１ｔ　ｔａｏｌ　ｅ、トリス（ヒドロキシメチルア
ミノメタン）１００ｐｍｏｌｅ、組醇素Ｍ、０．ｔ　ｍ
ｅ、純水と１ＮＵＸｒＱを加えて全容１　、Ｉ！　（ｐ
　１１７．８　）にしたものを使用する。

反応は３７℃で２０分間行ない、２Ｎ水酸化ナトリウム
で反応を停止でせる。その後、トルエン４ゴを加え残存
インドールを抽出し、そのｌ−を呈色液（ｐ−ジメチル
ベンズアルデヒド３．６％（ｗ／τ）、２Ｎ塩酸１，８
優（ν／τ）、エタノール溶液）１．５屑ｌとエタノー
ル３ｍｅを加え、攪拌後４０分間放置しＡｓ　５４０　
ｎｍで比色定量をする。

同方法によりインドールの検禁線をめ、それによりトリ
ットファンシンターゼ含有量をめた。

得られた結果を、インドールアクリル酸無添加の時のト
リシトファンシンターゼの含有量を１とした相対含有量
として下記第１表に示す。

第１表 実施例２ 前記実施例１と同様にして前培養物性２　ｒｒｕ！、を
植菌した振盪フラスコ６個準備し、各フラスコ全３７℃
で７時間振盪培養する。一方、各フラスコに培養開始か
ら下記第２表に示す時間後にインドールアクリル酸１０
０μ２／ゴずつ飽加し、インドールアクリル酸の添加時
期とトリットファンシンターゼ含有量の１係を調べた。

結果をＴ’Ａピ第２表に示す。

なお、添加時期を決めるに際して、用いた菌株の生育曲
線をめた。すなわち、Ｌ培地ｆ　５　ｍｌ直径１８＋ｍ
の試験管に分注し、１２０℃で１５分間殺菌した培地に
上記培養物２ｍｅを植菌し経時的にサンプリングし、比
濁法（ＵＤ６１０　）により菌体量を測定した。得られ
た結果を第４図に示す。

第　２　表 実施例３ 下記第３衣に示す各種組成の培地を用いる以外実施例１
と同様にして培養を行ない、下記第４表に示す結果を得
た。ただし、インドールアクリル酸は本培養開始時にそ
れぞれ２０．２５．３０．５０及び１００μｆ　／　７
の濃度で添加した。

第３表 ＊　窒素原子型針に換算した培地Ｍ増基準の百分率１４
”Ｊｃ　）リゾトファンシンターゼの相対含有量前記実
施例２で得られた菌体各２００〜全秤量し、下記の成分
を下記の濃度で含有する反応水溶液に懸濁し全容を１０
ｍｅとした後、３７°Ｃで２時間反応させた。

反応液組成： インドール　０．１係 Ｌ−セリ／　１％ ピリドキサール５Ｐ　０．０１％ ｐ　１１　７．９ 反応終了後、高速液体クロマトグラフィーにより反応液
中のｌ、ｐｌ）ブトファンを冗ｋＪした。その結果を下
記第５表に示す。

第　５　表

【図面の簡単な説明】

第１図は前記実施例で用いた菌株の生育曲線である。 ”′″Ａ　Ｅ９″″“°″Ｉｅ＆６１″（代理　人　弁
理士　小田島　平　吉　（同　弁理士柴坂久良Ｃ 同　弁理士　江　角　洋　治だ （○１ 第１図 ）６１（一 時　間　（峙） 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、ＣＩ、’　識別記号　庁内整理番号に　１２
　Ｒ１：１９）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　エシェリヒア属に属するトリプトファンリプレッ
   サ一対応遺伝子（ＴｒｐＲ）保持菌株を、有機窒素源を
   窒素原子重量に換算して少なくとも０　”　１重量％含
   有する栄養培地で培養するに際して、遅くとも該菌株の
   対数増殖期の末期までに該培地にインドールアクリル酸
   又はその塩を少なくとも２５μｆ　／　ｍｅの最終濃度
   で添加して培養を行ない菌体中のトリプトファンシンタ
   ーゼの含有量が増大した上記菌株を取得することを特徴
   するエシェリヒア属に属するＴ　ｒｐＲ保持菌株の培養
   方法。 ２　該ＴｒｐＲ保持菌株が、トリプトファンプロモータ
   ー及びオペレーター領域とトリブトファンシンターゼ対
   応遺伝子を少なくとももつシラスミドを含有するエシェ
   リヒア属に属す／、５７”　ｒ　ｐ　Ｒロンをもつシラ
   スミドを含有するエシェリヒア属に属するＴｒ、Ｒ保持
   菌株である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、該Ｔｒ、Ｒ保持菌株がトリプトファンリプレッサ一
   対応遺伝子（Ｔｒ、／？）を染色体上及び／又はゲラス
   ミｌ°中にもつエシェリヒア属に属するＴ　ｒ、Ｒ保持
   菌株である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５　該有様窒素源がペプトン力１、肉エキス、酵母エキ
   ス、麦芽エキス、コーンステイープリカー及びカザミノ
   酸から選ばれる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６、　インドールアクリル酸又はその塩を８０〜２００
   μｆ／Ｗｆ、の最終濃度で添加する特許請求の範囲第１
   項記載の方法。