JP2722504B2

JP2722504B2 - 新規微生物及びそれを用いるｄ−ビオチンの製法

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Publication number: JP2722504B2
Application number: JP17613288A
Authority: JP
Inventors: 三郎小松原; 謙司大森; 祐二今井; 直樹櫻井
Original assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Current assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Priority date: 1988-07-14
Filing date: 1988-07-14
Publication date: 1998-03-04
Anticipated expiration: 2013-03-04
Also published as: JPH0227980A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は新規微生物及びそれを用いるｄ−ビオチンの
製法に関する。

（従来技術）ｄ−ビオチンはヒトや動物にとって不可欠なビタミン
であり、医薬品原料或いは飼料添加物として重要なもの
である。

従来、炭素源や窒素源を含む通常の発酵培地を用い
て、発酵法によりｄ−ビオチンを生産する方法として
は、ストレプトマイセス属、ミクロモノスポラ属の微生
物を用いる方法（特公昭41−21756）が知られており、
また遺伝子組み換え技術を利用した方法としてはエシェ
リシア属の微生物を用いる方法（特開昭61−202686、同
62−155081）が知られている。

（発明の構成及び効果）本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、全く意外にも、
セラチア属の微生物を変異誘導してアクチチアジン酸や
５−（２−チエニル）−ｎ−吉草酸等のビオチン構造類
似物質に対する耐性を付与することによりｄ−ビオチン
の生産能が顕著に増強されること、及びこの変異株から
ｄ−ビオチン生成蓄積を司る染色体デオキシリボ核酸
（以下、DNAと略称する）断片を切り出し、これをベク
ター・プラスミド組み込んだ後、得られる組換えプラス
ミトをｄ−ビオチン生成蓄積能を有するセラチア属微生
物に移入することにより、ｄ−ビオチン生産能を極めて
顕著に増大させうること、並びに該微生物を用いること
によりｄ−ビオチンを工業的に有利に製造し得ることを
見出し、本発明を完成するに至った。

即ち、かかる知見に基づく本発明は、（ｉ）ビオチン構造類似物質に耐性を有し、ｄ−ビオチ
ン生成蓄積能を有するセラチア・マルセッセンスである
微生物、（ii）ｄ−ビオチン生成蓄積能を有するセラチア属に属
する微生物から採取したｄ−ビオチン生成蓄積を司るデ
オキシリボ核酸をベクター・プラスミドpLG339に組み込
んだ組換えプラスミドを、ビオチン構造類似物質に耐性
を有するセラチア・マルセッセンスに含有せしめた微生
物であり、ｄ−ビオチン生成蓄積を司るデオキシリボ核酸が、ピ
メロイル−補酵素Ａの合成を触媒する酵素、７−ケト−
８−アミノペラルゴン酸・シンターゼ、7,8−ジアミノ
ペラルゴン酸・アミノトランスフェラーゼ、デチオビオ
チン・シンテターゼ及びビオチン・シンテターゼの遺伝
情報を担うデオキシリボ核酸である微生物、及び（iii）上記（ｉ）又は（ii）記載の微生物を培地で培
養することにより、培地中にｄ−ビオチンを生成蓄積せ
しめ、これを採取することを特徴とするｄ−ビオチンの
製法、である。

（１）ｄ−ビオチン生成蓄積能を有するセラチア属微生
物の変異株の調製本発明の変異株を調製するための親株としてはセラチ
ア属（バージーズ・マニュアル・オブ・システマティッ
ク・バクテリオロジー、第１巻477頁1984年）の微生
物、特にセラチア・マルセッセンスに属する微生物が使
用される。その菌株は、微生物菌株保存機関から分譲さ
れる既知の菌株であっても自然界から新たに分離される
菌株であってもよく、例えばセラチア・マルセッセンス
Sr41（微工研条寄第487号）等があげられる。更に、野
生株から突然変異によって誘導される各種アミノ酸要求
株、各種核酸要求株或いはビオチン要求株を除く各種ビ
タミン要求株などの変異株であってもよい。このような
菌株の具体例としては、セラチア・マルセッセンスSr41
のイソロイシン要求株Ｄ−60〔ジャーナル・オブ・ジネ
ラル・マイクロバイオロジー、119、51（1980）〕等が
挙げられる。

かかる新株にビオチン構造類似化合物に対する耐性を
付与することによってｄ−ビオチン生成蓄積能の高い変
異株を取得することができる。例えば野生株であるセラ
チア・マルセッセンスSr41を用いる場合、該菌株の細胞
を通常の突然変異誘起操作で処理した後、アクチチアジ
ン酸（以下、ACMと略称する）。５−（２−チエニル）
−ｎ−吉草酸、α−デヒドロビオチンなどのビオチン構
造類似物質0.1〜10mg/ml含有の最少寒天平板培地、例え
ば、デービスとミンジオリの最少培地〔ジャーナル・オ
ブ・バクテリオロジー、60,17（1950）〕或いはその炭
素源を各種の糖類、有機酸類、又はアミノ酸類に変えた
培地に27〜37℃で２〜７日間培養し、生じた大きなコロ
ニーを釣菌分離することによってビオチン構造類似物質
耐性株を取得する。次に、ｄ−ビオチン要求性のセラチ
ア属或いはエシュリシア属の変異株を指示菌とするハロ
ー法〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、79,754
（1960）〕に従ってこれらの耐性株のｄ−ビオチン分泌
性を調べ、ハローを形成する菌株、即ちｄ−ビオチン生
成蓄積能の増大した菌株を選択する。より具体的に説明
すれば、セラチア・マルセッセンスSr41の細胞をエーデ
ルバーグらの方法〔バイオケミカル・アンド・バイオフ
ィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ、18、788
（1965）〕によってＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジン100μg/mlで30分間処理したのち、dl
−ACM0.5mg/ml含有の最少寒天平板培地（フマル酸アン
モニウム0.5％，硫黄アンモニウム0.1％，リン酸二カリ
ウム0.7％，リン酸一カリウム0.3％、硫黄マグネシウム
７水和物0.01％、寒天1.5％）に塗布する。次に30℃で
４日間培養し、生じた大きなコロニーを釣菌分離すれば
ACM耐性株を取得できる。このような耐性株の中から、
ｄ−ビオチン要求株を指示菌とするハロー法によりｄ−
ビオチン分泌能を有する菌株を選択することによって、
セラチア・マルセッセンスのｄ−ビオチン生成蓄積能を
有する変異株を取得できる。また、上記のようなACM0.5
mg/ml耐性でｄ−ビオチン生成蓄積能を有する変異株の
細胞を上記と同様に変異誘起処理し、例えば2mg/mlACM
含有の最少寒天平板培地に塗布、同様の操作を行った
後、得られるACM耐性株についてハロー法を行い、新株
よりも顕著に大きいハローを形成する菌株を選択するこ
とにより、ｄ−ビオチン生成蓄積能が増大したACM耐性
株を取得することができる。なお、このようなビオチン
構造類似物質耐性株の分離に際して複数の構造類似物
質、例えばACMと５−（２−チエニル）−ｎ−吉草酸の
両方を添加した最少寒天平板培地を用いることもでき
る。

上記の如くして得られる変異株としては、例えば本発
明の実施例１で調製されるセラチア・マルセッセンスSB
303（微工研菌寄第10119号）又はセラチア・マルセッセ
ンスSB411が挙げられる。

（２）ｄ−ビオチン生成蓄積能を有する組換えプラスミ
ドの作製染色体DNAの調製本発明においてｄ−ビオチン生合成を司る染色体DNA
とは、微生物においてビオチン合成に係わる酵素のう
ち、ピメロイル−補酵素Ａの合成を触媒する酵素、７−
ケト−８−アミノペラルゴン酸・シンターゼ、7,8−ジ
アミノベラルゴン酸・アミノトランスフェラーゼ、デチ
オビオチン・シンテターゼ及びビオチン・シンテターゼ
の遺伝情報を担うDNAの全部もしくは一部を含有するも
のを云う。上記の酵素は、エシェリシア・コリＫ−12に
おいては、bic C、bio F、bio A、bio D及びbio Bと名
づけられた５つの遺伝子によって規定される酵素に相当
する。通常、これらの酵素はｄ−ビオチンによる強いフ
ィードバックを抑制を受けているが、本発明に用いるｄ
−ビオチン合成を司る染色体DNAはフィードバック抑制
から解除された変異型であることが望ましい。かかる染
色体DNAの供与微生物としては、セラチア属に属し、ｄ
−ビオチン生成能を有する微生物であれば、いかなる菌
株でも良く、例えば前記のセラチア・マルセッセンスSr
41やフィードバック抑制の解除された変異株であるセラ
チア・マルセッセンスSB303及びセラチア・マルセッセ
ンスSB411等があげられる。これらの微生物から染色体D
NAを採取するには、例えば微生物菌体をリゾチーム処
理、界面活性剤（ラウリル硫酸ナトリウム、ザルコシル
（Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリムウム）等）で処
理した後、除蛋白し、エタノールで沈澱せしめる常法
〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、
３、208（1961）；ビオキミカ・エト・ビオフィジカ・
アクタ、72,619（1963）〕により容易に実施することが
できる。

上記の如くして得られる染色体DNAはそのまま、或い
はビオチン合成に不要な部分を削除した後、組換えDNA
の調製に用いることができる。

ベクター・プラスミドDNAの調製上記の如き染色体DNAを組み込むベクター・プラスミ
ドとしてはセラチア属に属する微生物の細胞に移入で
き、かつ移入細胞中で複製可能なプラスミドであれば特
に限定されないが、例えばpSC101〔プロシーディングス
・オブ・ナショナル・アマデミー・オブ・サイエンス
USA、70,3240（1973）〕、pLG339〔ジーン、18,332（19
82）〕、pBR322〔ジーン、２、95（1977）〕、pBR325
〔ジーン、４、121（1978）〕,pACYC177〔ジャーナル・
オブ・バクテリオロジー、134、1141（1978）〕及びpKP
T1124〔ジャーナル・オブ・バイオテクノロジー、３、4
7（1985）〕等、コピー数、プロモータ及び／又は薬剤
耐性マーカーの異なる種々のベクター・プラスミドを用
いることができる。上記のプラスミドはこれらを保持す
るエシェリシア・コリの菌体からクリヤード・ライセイ
ト法〔遺伝子操作実験法125頁（高木康敬著，講談社、1
980年）；モレキュラー・クローニング、86頁（マニア
ティスら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー、1982年）〕などの常法によって調製することが
できる。

組換えプラスミドDNAの調製上記で得られる染色体DNAとベクター・プラスミドDNA
とからの組換えプラスミドの調製は、制限エンドヌクレ
アーゼ（例えばEcoR I、Hind III、BamH I、Sal I等）
を用いて染色体DNA鎖とプラスミドDNA鎖を切断した後、
DNAリガーゼ（例えばT4DNAリガーゼや大腸菌DNAリガー
ゼ等）で処理するか、或いはその切断末端によってはタ
ーミナルトランスフェラーゼやDNAポリメラーゼ等で処
理した後、DNAリガーゼを作用させてDNA鎖を結合する等
の常法〔メソッズ・イン・エンザイモロジー、68、41
（1979）；遺伝子操作実験法、135頁（高木康敬著，講
談社、1980年）〕により実施することができる。

ｄ−ビオチン生成蓄積能を有する組換えプラスミドの
選択とそのDNAの調製ｄ−ビオチン生成蓄積能を有する組換えプラスミドの
選択は、上記で得られる組換えプラスミドDNAを用い
て、制限エンドヌクレアーゼ欠損性でかつｄ−ビオチン
要求性のエシェリシア・コリの変異株〔例えば、エシェ
リシア・コリx1776株（ATCC 31244、モレキュラー・ク
ローニング・オブ・リコンビナントDNA、248頁、スコッ
トとウェーナー編、アカデミック・プレス、1977年）
等〕の細胞を形質転換し、次いで、得られる形質転換処
理細胞を、上記エシェリシア・コリの変異株が生育可能
な培地からｄ−ビオチンを除去した寒天平板培地に塗布
した後、27〜37℃で２〜４日間培養し、得られるコロニ
ーを釣菌分離することにより実施することができる。こ
の際、形質転換は、例えば低温下で細胞を塩化カルシウ
ム溶液で処理して宿主細胞の膜透過性を増大させ、組換
えプラスミドDNAを宿主細胞中に取り込ませる方法〔ジ
ャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、53、15
9（1970〕により行うことができる。

上記の如くして得られる形質転換株の細胞からの組換
えプラスミドDNAの調製は、例えば該形質転換から迅速
法〔モレキュラー・クローニング、365頁（マニアティ
スら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー、1982年）〕で抽出したプラスミドDNAにより、ｄ−
ビオチン要求性のエシェリシア・コリの変異株の細胞を
形質転換して得られる菌株がｄ−ビオチン非要求性であ
ることを確認した後、上記形質転換株からクリヤード・
ライセント法によりプラスミドDNAを抽出することによ
り実施することができる。かくして、セラチア・マルセ
ッセンスのｄ−ビオチン生成蓄積能を有する染色体DNA
断片がベクター・プラスミドDNAに挿入されている組換
えプラスミドDNAが得られる。

（３）ｄ−ビオチン生成蓄積能を有する組換えプラスミ
ドを保持するセラチア・マルセッセンスのｄ−ビオチン
生産菌株の取得本発明の微生物、即ちｄ−ビオチン生成蓄積能を有す
るセラチア属微生物から採取したｄ−ビオチン生成蓄積
能を司る染色体DNA断片を組み込んだ組換えプラスミド
をセラチア続に属する微生物に含有せしめた微生物は、
例えば次の如くして調製することができる。

まず、前記（２）で得られるｄ−ビオチン生成蓄積能
を有する組換えプラスミドDNAを、例えばセラチア・マ
ルセッセンスの制限エンドヌクレアーセ欠損株｛例えば
セラチア・マルセッセンスSr41のTT392株〔ジャーナル
・オブ・バクテリオロジー、161、１（1985）〕等｝の
細胞にタカギとキスミの方法〔ジャーナル・オブ・バク
テリオロジー、161、１（1985）〕により取り込ませ、
形質転換株を得る。この形質転換株を培養した後、得ら
れる細胞からクリヤード・ライセント法によりプラスミ
ドDNAを単離生成する。かくして得られるｄ−ビオチン
精製蓄積能を有する組換えプラスミドDNAはセラチア・
マルセッセンスの修飾系によって修飾されたものであ
る。次いで、上記組換えプラスミドDNAを宿主菌株の細
胞にタカギとキスミの方法により導入し、薬剤耐性のコ
ロニーを釣菌分離することにより形質転換株を得る。こ
の宿主菌株としては、セラチア属に属する微生物であれ
ば、野生株又は変異株のいずれでもよいが、特にｄ−ビ
オチン生成蓄積能のより高い菌株が好適に用いられる。

かくすることにより本発明の微生物、即ちｄ−ビオチ
ン生成蓄積能を有するセラチア属微生物から採取したｄ
−ビオチン生成蓄積能を司る染色体DNA断片を組み込ん
だ組換えプラスミドをセラチア属に属する微生物に含有
せしめた微生物を得ることができる。かかる微生物とし
ては、例えばセラチア・マルセッセンスTA5021、TA502
2、TA5023（微工研条寄第4101号）及びTA5024等があげ
られる。

上記組換え菌株のうち、TA5021とTA5022はセラチア・
マルセッセンスSr41にpBR322又はpLG339をベクターとす
るｄ−ビオチン生成蓄積能を有する組換えプラスミドを
含有せしめた微生物であり、TA5023とTA5024はセラチア
・マルセッセンスのSB303株とSB411株のそれぞれにpLG3
39をベクターとするｄ−ビオチン生成蓄積能を有する組
換えプラスミドを含有させた微生物であり、いずれの菌
株もセラチア・マルセッセンスSr41の形態的特徴を有す
るものである。

（４）ｄ−ビオチンの製造かくして得られた微生物を培地で培養し、培地中に生
成蓄積せしめたｄ−ビオチンを採取することによりｄ−
ビオチンを製造することができる。

本発明において使用されるｄ−ビオチン生産用培地と
しては、炭素源としてブドウ糖、蔗糖、糖蜜の如き糖
類、フマル酸やクエン酸の如き有機酸またはグリセロー
ルの如きアルコール類等を10〜20％、窒素源として酢酸
アンモニウムの如き有機アンモニウム塩、硫酸アンモニ
ウムや塩化アンモニウムの如き無機アンモニウム塩又は
尿素を１〜２％さらに有機栄養物としてコーン・スティ
ープ・リカー、ペプトン、酵母エキス、カゼイン加水分
解物質等を０〜１％の範囲でそれぞれ適当量含有する培
地を好適に用いることができる。これらの他にリン酸カ
リウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、モリブデン酸
ナトリウム等を少量加え、更に培地のpHを６〜８に保つ
ため炭酸カルシウムを、或いは必要に応じてアンモニア
等を添加してもよい。

本発明によれば、上記培地に本発明の微生物を接種
し、25℃〜37℃にて振盪培養あるいは通気撹拌の如き好
気的条件下で２〜７日間培養することによって培地中に
ｄ−ビオチンを著量蓄積せしめることができる。

生成したｄ−ビオチンの精製は、培養終了後、菌体そ
の他の不溶物を除去し、次いで、公知の方法、例えば特
公昭42−8918に記載の方法に従って実施することができ
る。即ち、菌体を除去した溶液中のｄ−ビオチンを活性
炭に吸着し、アンモニア含有エタノールの如き溶媒で溶
出した後、濃縮し、次いで陰イオン交換樹脂に供するこ
とにより実施することができる。

以下、実施例をあげて本発明を説明するが、実施例中
ｄ−ビオチンの定量はラクトバチラス・プランタラムに
よる微生物定量法〔生化学実験講座、第13巻355頁（能
勢善嗣ら編，東京化学同人（1975年））〕により行っ
た。また、デチオビオチン・シンテターゼ活性はクレル
とエイセンバーグの方法〔ザ・ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリー、245、6558（1970）〕に記
載の方法により測定した。

実施例１（ACM耐性株の取得）（１）ACM低濃度耐性株の取得セラチア・マルセッセンスSr41（微工研条寄第487
号）の細胞をエーデルバーグらの方法により変異誘起処
理し、栄養培地（グルコース0.5％、ペプトン1.0％、肉
エキス0.3％、酵母エキス1.0％、塩化ナトリウム0.5
％）で１時間培養する。この培養液を遠心分離し、得ら
れる細胞を生理食塩水で遠心分離法によって３回洗浄す
る。この細胞を生理食塩水に懸濁し、dl−ACM0.5mg/ml
を含む最少寒天培地（フマル酸アンモニウム0.5％、リ
ン酸一カリウム0.3％、リン酸二カリウム0.7％、硫酸マ
グネシウム７水和物0.01％、寒天1.5％）に１平板当り
１〜10×10⁵個の細胞を塗布する。30℃で３〜５日間培
養した後、生じた大きなコロニーを釣菌分離することに
よりACM耐性株を得る。次いで、セラチア・マルセッセ
ンスSr41のｄ−ビオチン要求株を指示菌とするハロー法
により、該ACM耐性株のｄ−ビオチン分泌性を調べ、大
きなハローを形成する菌株の一株としてセラチア・マル
セッセンスSB303（微工研菌寄第10119号）を得る。

なお、本菌株のデチオビオチン・シンテターゼ活性を
調べたところ、新株であるセラチア・マルセッセンスSr
41の10倍高い活性を示したことから、本菌株のｄ−ビオ
チンによるフィードバック抑制は解除されていることが
わかった。

（２）ACM高濃度耐性株の取得 dl−ACM2.0mg/mlを含む最少寒天培地にセラチア・マ
ルセッセンスSB303の細胞を１平板当たり１〜10×10⁵個
塗布し、30℃で５〜７日間培養する。生じた大きなコロ
ニーを釣菌分離することにより、ACM高濃度耐性株を得
る。この高濃度耐性株について上記（１）に記載と同様
のハロー法により、ｄ−ビオチン分泌性を調べ、新株に
比べ顕著に大きなハローを形成するACM耐性株の一株と
してセラチア・マルセッセンスSB411を得る。

なお、本菌株はSB303の２倍のデチオビオチン・シン
テターゼ活性を示した。

実施例２（pBR322をベクターとしｄ−ビオチン生成蓄積能を有す
る組換えプラスミドの作製）（１）染色体DNAの調製実施例１−（１）で得たセラチア・マルセッセンスSB
303をＬ−ブロス（ペプトン１％、酵母エキス0.5％、塩
化ナトリウム0.5％、pH7.0）1.0に接種し、30℃で４
時間振とう培養し、対数増殖期の菌体を遠心分離により
集める。この菌体をリゾチーム処理後、ラウリル硫酸ナ
トリウムで処理することにより溶菌し、フェノール処理
により除蛋白する。次いでエタノール処理して染色体DN
Aを沈澱させ、この沈澱にリボ核酸分解酵素（RNase、最
終濃度10μg/ml）を加え、37℃で１時間処理することに
より精製染色体DNA7.0mgを得る。

（２）ベクター・プラスミドDNAの調製ベクター・プラスミドpBR322（ATCC 37017）を保持す
るエシェリシア・コリＫ−12のC600r^-m^-株（ATCC 3352
5）を0.2％グルコースを含有するＬ−ブロス7800mlに接
種し、37℃で16時間振とう培養した後、菌体を遠心分離
により集める。得られる菌体をリゾチーム処理及びラウ
リル硫酸ナトリウムで処理して溶菌した後、最終濃度が
1Mとなるように塩化ナトリウムを加えて遠心分離（100,
000×ｇ、30分間）する。上清を採取しフェノール処理
した後、エタノールを加え、遠心分離する。沈澱を10mM
トリス塩酸−1mMエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム
（pH7.5）水溶液に溶解し、塩化セシウム−エチジウム
ブロマイド平衡密度勾配遠心法（200,000×g,16時間）
によりプラスミドDNAを分離精製する。かくしてベクタ
ー・プラスミドpBR322のDNA0.5mgを得る。

（３）組換えプラスミドDNAの調製前記（１）で得た染色体DNA20μｇに制限エンドヌク
レアーゼHind IIIとEcoR Iと同時に通常の条件で作用さ
せDNA鎖を部分的に切断する。また、上記（１）で得た
ベクター・プラスミドDNA7μｇにHind IIIとEcoR Iを同
時に通常の条件で作用させDNA鎖を完全に切断する。両
者を65℃、10分間の熱処理後、混合しT4ファージ由来の
DNAリガーゼ通常の条件で作用させDNA鎖を連結すること
により組換えプラスミドDNAを得る。

（４）ｄ−ビオチン生成蓄積能を有する組換えプラスミ
ドの選択とそのDNAの調製制限エンドヌクレアーゼ欠損性でかつビオチン・オペ
ロン（bioABFCD）を欠失しているエシェリシア・コリx1
776株（ATCC 31244）をx1776株用栄養培地〔バクトトリ
プトン2.5％、酵母エキス0.75％、トリス−塩酸（pH7.
5）2mM、塩化マグネシウム0.5mM、ジアミノピメリン酸
0.01％、チミジン0.004％、グルコース0.5％〕15mlに接
種、37℃で振とう培養する、対数増殖期の中間まで増殖
せしめた菌体を遠心分離により集菌する。該菌体を氷冷
した0.1M塩化マグネシウム溶液15mlに懸濁した後、集菌
し、氷冷した0.1M塩化カルシウム溶液3mlに懸濁する。
この細胞懸濁液に上記（３）で得られる組換えプラスミ
ドDNAを加えて30分間氷冷した後、42℃で２分間熱処理
することにより該DNAを細胞内に取り込ませる。次い
で、この懸濁液にx1776株用栄養培地15mlを加え、37℃
で１時間振とう培養した後、集菌し、生理食塩水15mlで
３回洗浄する。該菌体を生理食塩水15mlに懸濁し、この
懸濁液0.1〜0.5mlをアンピシリン50μg/mlとdl−デチオ
ピオチン0.1μg/mlとを含有するx1776株用最少寒天培地
（グルコース0.5％、硫酸アンモニウム0.1％、リン酸二
カリウム0.7％、リン酸一カリウム0.3％、硫酸マグネシ
ウム７水和物0.01％、ジアミノピメリン酸0.01％、チミ
ジン0.004％、カゼイン加水分解物0.2％、寒天1.5％）
に塗布し、37℃で２日間培養する、生じたコロニーを釣
菌分離し、ハロー法によりｄ−ビオチン分泌能を有する
形質転換株を選択した。かくして得られる菌株をx1776
株用栄養培地１に接種し、前記（２）と同様にしてプ
ラスミドDNAを抽出精製し、360μｇの組換えプラスミド
pBM201のDNAを得る。この組換えプラスミドDNAは全鎖長
約11.3kbであり、約7kbのDNA断片が挿入されていた。

なお、該プラスミドDNAを用いてエシェリシア・コリx
1776株の細胞を形質転換してx1776株用栄養寒天培地で
アンピシリン耐性の再形質転換株10株を選択し、これら
菌株について、x1776株用最少寒天培地での生育を調べ
たところ、すべての菌株は、７−ケト−８−アミノペラ
ルゴン酸、7,8−ジアミノペラルゴン酸或いはデチオビ
オチンを添加した場合には生育を示し、それらを添加し
ない場合には生育を示さなかった。また、これら10株は
すべてｄ−ビオチン分泌能を示した。従って、本プラス
ミドはｄ−ビオチン生成蓄積能を有する組換えプラスミ
ドであり、かつその挿入DNAには、エシェリシア・コリ
Ｋ−12のビオチン・オペロンに相当する遺伝子群がコー
ドされているものと考えられる。

実施例３（pLG339をベクターとしｄ−ビオチン生成蓄積能を有す
る組換えプラスミドの作製）（１）ベクター・プラスミドDNAの調製エシェリシア・コリＫ−12のC600r^-m^-株にベクター・
プラスミドpLG339（ATCC 37131）を含有させた菌株〔ジ
ーン、18、335（1982）〕を用いて、実施例２−（２）
に記載した方法と同様の方法によってベクター・プラス
ミドpLG339のDNA0.3mgを得る。

（２）組換えプラスミドDNAの調製実施例２−（４）で得られるｄ−ビオチン生成蓄積能
を有する組換えプラスミドpBM201のDNA2μｇに制限エン
ダヌクレアーゼEcoR IとHind IIIを同時に通常の条件で
作用させ、DNA鎖を完全分解する。また上記（１）で得
たベクター・プラスミドpLG339のDNA1μｇを通常の条件
で、まずEcoR Iを用いて完全分解し、次にHind IIIを用
いて部分分解する。両反応液を65℃、10分間の熱処理
後、混合し、該混合物にT4ファージ由来のDNAリガーゼ
を通常の条件で作用させ、DNA鎖を連結することにより
組換えプラスミドを得る。

（３）pLG339をベクターとしｄ−ビオチン生成蓄積能を
有する組換えプラスミドの選択とそのDNAの調製エシェリシア・コリx1776株を、実施例２−（４）に
記載した方法により培養し、菌体を得た後、実施例２−
（４）記載と同様の方法により前記（２）で得た組換え
プラスミドDNAを細胞内に取り込ませる。次いで、実施
例２−（４）と同様の方法で調製した細胞懸濁液0.1〜
0.5mlを硫酸カナマイシン10μg/mlとdl−デチオピオチ
ン0.2μg/ml含有のx1776株用最少寒天培地に塗布し、37
℃で２日間培養する。生じたコロニーを釣菌分離し、ハ
ロー法によりｄ−ビオチン分泌能を有する形質転換法を
得る。該形質転換株から、実施例２−（２）記載の方法
に従って、プラスミドDNAを抽出精製し、組換えプラス
ミドpLGM201のDNA175μｇを得る。

実施例４（ｄ−ビオチン生成蓄積能を有する組換えプラスミドを
保持するセラチア・マルセッセンスのｄ−ビオチン生産
菌株の取得）（１）セラチア・マルセッセンスSr41で修飾された組換
えプラスミドDNAの調製細胞外ヌクレアーゼ欠損性でかつ制限エンドヌクレア
ーゼ欠損性のセラチア・マルセッセンスSr41のTT392株
を宿主に用い、実施例２−（４）で得られる組換えプラ
スミドpBM201のDNAと実施例３−（３）で得られる組換
えプラスミドpLGM201のDNAをタカギとキスミの方法によ
りTT392株の細胞に取り込ませ、それぞれの形質転換株
を得る。次に、各々の形質転換株をグルコース0.2％含
有のＬ−ブロス１に接種し、30℃、16時間振盪培養し
た後集菌し、実施例２−（２）と同様に処理することに
よってセラチア・マルセッセンスSr41によって修飾され
たpBM201とpLGM201のDNAを各々250μｇと150μｇを得
る。

（２）セラチア・マルセッセンスSr41を宿主とする形質
転換株の取得前記（１）で得られるpBM201のDNAとセラチア・マル
セッセンスSr41とを用い、タカギとキスミの方法により
アンピシリン耐性で形質転換株セラチア・マルセッセン
スTA5021を得る。この形質転換株の含有するプラスミド
DNAが実施例２−（４）で得られるpBM201DNAと同一であ
ることを制限エンドヌクレアーゼの切断部位を利用する
方法で確認した。

また、前記（１）で得たpLGM201のDNAとセラチア・マ
ルセッセンスSr41とを用い、上記と同様の方法により、
カナマイシン耐性でセラチア・マルセッセンスTA5022を
得る。

なお、この形質転換株TA5022の含有するプラスミドDN
AはpLGM201DNAと同一であることを制限エンドヌクレア
ーゼの切断部位を利用する方法で確認した。

（３）セラチア・マルセッセンスSB303を宿主とする形
質転換株の取得上記（１）で得られるpLGM201のDNAと実施例１の
（１）で得られるセラチア・マルセッセンスSB303とを
用い、前記（２）と同様にカナマイシン耐性で形質転換
株セラチア・マルセッセンスTA5023（微工研条寄第4101
号）を得る。

なお、この形質転換株TA5023の含有するプラスミドDN
AはpLGM201DNAと同一であることを制限エンドヌクレア
ーゼを切断部位を利用する方法で確認した。

（４）セラチア・マルセッセンスSB411株を宿主とする
形質転換株の取得上記（１）で得られるpLGM201のDNAと実施例１の
（２）で得られるセラチア・マルセッセンスSB411株と
を用い、上記（２）と同様にカナマイシン耐性で形質転
換株セラチア・マルセッセンスTA5024を得る。

なお、この形質転換株TA5024の含有するプラスミドDN
AはpLGM201DNAと同一であることを制限エンドヌクレア
ーゼの切断部位を利用する方法で確認した。

実施例５（セラチア・マルセッセンスのACM耐性株及び組換えプ
ラスミド保持菌株によるｄ−ビオチンの製造）実施例１で得られるセラチア・マルセッセンスのSB30
3とSB411及び実施例４で得られるセラチア・マルセッセ
ンスのTA5021、TA5022、TA5023とTA5024並びに対照株と
してセラチア・マルセッセンスSR41をそれぞれアンピシ
リン500μｇもしくは硫酸カナマイシン100μg/ml含有の
Ｌ−ブロス、或いはそれらを含有しないＬブロス斜面培
地で一夜培養した後、発酵培地〔ショ糖10％，尿素1.0
％，リン酸二カリウム0.1％，硫酸マグネシウム７水和
物0.1％，硫酸第一鉄７水和物0.01％及び炭酸カルシウ
ム１％を含む溶液15mlを500ml容振盪フラスコに注入
し、滅菌したもの（ただし、ショ糖は別途加熱滅菌後添
加した。pH7.0）〕にそれぞれ一白金耳植菌する。つい
で30℃で往復振盪培養（振幅7cm,120回転／分）する。9
6時間後の培地中のｄ−ビオチンの生成蓄積量は下記第
１表の通りである。

実施例６（ジャーファーメンターにおけるｄ−ビオチンの製造）実施例４で得たセラチア・マルセッセンスTA5024を硫
酸カナマイシン100μg/ml含有のＬブロス寒天斜面培地
で一夜培養した後、硫酸カナマイシン100μg/ml含有の
前培養培地〔ショ糖10％、尿素1.0％、リン酸二カリウ
ム0.1％、硫酸マグネシウム７水和物0.1％、硫黄第一鉄
７水和物0.001％、コーン・スティーブ・リカー0.6％及
び炭酸カルシウム１％を含む溶液15mlを500ml容振盪フ
ラスコに注入し、滅菌したもの（pH7.0）〕に一白金耳
植菌する。30℃で24時間振盪培養し、かくして得られる
前培養液40mlを発酵培地〔ショ糖15％、尿素1.5％、リ
ン酸二カリウム0.1％、硫酸マグネシウム７水和物0.1
％、硫酸第一鉄７水和物0.01％、コーン・スティーブ・
リカー0.6％、酵母エキス0.1％及び炭酸カルシウム１％
（pH7.0）〕1.2に接種し、2.4容ジャーファーメン
ターで30℃、通気量0.6／分、撹拌（750回転／分）下
で培養し、20時間後にＬ−アラニン、Ｌ−システイン塩
酸塩、Ｌ−メチオニンを各々最終濃度0.06％となるよう
に添加する。培養開始72時間後にｄ−ビオチン190mg/
を含む培養液を得る、該培養液10を集めて加熱滅菌処
理した後、濾過して不溶物を除去する。次に、活性炭に
吸着、洗浄した後、吸着物をアンモニア含有の50％エタ
ノール（pH9.0）で溶出し、減圧濃縮する。残渣を水に
溶解した後、アンモニア水でpH8に調整し、この水溶液
をダウエックス１×２（ギ酸型）を充填したカラムに通
液する、該カラムを水洗後、0.01Mギ酸で溶出する。ｄ
−ビオチン含有画分を集めて濃縮した後、pH3.5に調整
し、一夜冷却放置する。生じた結晶をろ取し、乾燥後、
水から再結晶することによりｄ−ビオチン0.95gを得
る。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図はそれぞれpBM201プラスミドDNA及びp
LGM201プラスミドDNAの制限エンドヌクレアーゼ切断地
図を示し、第３図はpBM201プラスミドDNA及びpLGM201プ
ラスミドDNAの構築を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｒ 1:425）

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ビオチン構造類似物質に耐性を有し、ｄ−
ビオチン生成蓄積能を有するセラチア・マルセッセンス
である微生物。
【請求項２】ビオチン構造類似物質がアクチチアジン酸
又は５−（２−チエニル）−ｎ−吉草酸である請求項１
記載の微生物。
【請求項３】ｄ−ビオチン生成蓄積能を有するセラチア
属に属する微生物から採取したｄ−ビオチン生成蓄積を
司るデオキシリボ核酸をベクター・プラスミドpLG339に
組み込んだ組換えプラスミドを、ビオチン構造類似物質
に耐性を有するセラチア・マルセッセンスに含有せしめ
た微生物であり、ｄ−ビオチン生成蓄積を司るデオキシリボ核酸が、ピメ
ロイル−補酵素Ａの合成を触媒する酵素、７−ケト−８
−アミノペラルゴン酸・シンターゼ、7,8−ジアミノペ
ラルゴン酸・アミノトランスフェラーゼ、デチオビオチ
ン・シンテターゼ及びビオチン・シンテターゼの遺伝情
報を担うデオキシリボ核酸である微生物。
【請求項４】請求項１、２又は３記載の微生物を培地で
培養することにより、培地中にｄ−ビオチンを生成蓄積
せしめ、これを採取することを特徴とするｄ−ビオチン
の製法。