JPH059063B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はＬ−プロリンの製法に関する。 Ｌ−プロリンは医薬、飼料添加物として有用な
アミノ酸であり、種々の微生物を用いて発酵法に
より生産されている。 しかしながらセラチア属に属する微生物はＬ−
プロリン分解酵素能が強く、かつＬ−プロリン生
合成が代謝調節をうけるため通常Ｌ−プロリンを
生成蓄積しない。本発明者らは先にかかるセラチ
ア属微生物を変異誘導して得られるＬ−プロリン
分解酵素欠損性でかつプロリンアナローグ及び／
又はプリンアナローグに耐性な変異株、或いはＬ
−プロリン分解酵素欠損性でかつ高浸透圧下にプ
ロリンアナローグに耐性な変異株が優れたＬ−プ
ロリン生産能を有することを見出し、Ｌ−プロリ
ンの製法として特許出願を行なつた（特開昭58−
60995号及び特願昭57−107941号）。 本発明者らはより優れたＬ−プロリン生産能を
有する微生物を取得すべく更に研究を重ねた結果
上記の微生物の有するグルタメートキナーゼ及び
グルタメート・ホスフエートリダクターゼの遺伝
情報を担う染色体DNAまたはグルタメートキナ
ーゼ、グルタメート・ホスフエートリダクターゼ
及びピロリン・５・カルボキシレートリダクター
ゼの遺伝情報を担う染色体DNAを切り出し、ベ
クターpKP1154またはpACYC177に組み込んだ
のち、セラチア マルセツセンスに移入すること
により、Ｌ−プロリンを極めて効率よく生産する
微生物を得ることに成功すると共に、該微生物を
用いることによりＬ−プロリンを工業的有利に製
造し得ることを見出し本発明を完成するに至つ
た。 即ち、本発明はＬ−プロリン分解酵素欠損性で
かつプロリンアナローグ及び／又はプリンアナロ
ーグに耐性なＬ−プロリン生産能を有するセラチ
ア マルセツセンス或いはＬ−プロリン分解酵素
欠損性でかつ高浸透圧下にプロリンアナローグ耐
性なＬ−プロリン生産能を有するセラチア マル
セツセンスから採取した、グルタメートキナーゼ
及びグルタメート・ホスフエートリダクターゼの
遺伝情報を担う染色体DNAまたはグルタメート
キナーゼ、グルタメート・ホスフエートリダクタ
ーゼ及びピロリン・５・カルボキシレートリダク
ターゼの遺伝情報を担う染色体DNAをベクター
pKP1154またはpAYC177に組み込んだハイブリ
ツドプラスミドを、セラチア マルセツセンスに
含有せしめた微生物を培地で培養して、培地中に
Ｌ−プロリンを生成蓄積せしめ、これを採取する
Ｌ−プロリンの製法である。 〔発明の微生物の調製〕 （染色体DNAおよびその調製） 本発明で用いる染色体DNAとはグルタミン酸
からプロリンを合成する酵素、即ち、グルタメー
トキナーゼ、グルタメート・ホスフエートリダク
ターゼおよびピロリン・５・カルボキシレートリ
ダクターゼのそれぞれの遺伝情報を担うデオキシ
リボ核酸の１部又は全部を含有するものを云い、
とりわけグルタメートキナーゼの遺伝情報を担う
DNA（以下、pro Ｂと称する）、グルタメート・
ホスフエートリダクターゼの遺伝情報を担う
DNA（以下、pro Ａと称する）およびピロリ
ン・５・カルボキシレートリダクターゼの遺伝情
報を担うDNA（以下、pro Ｃと称する）を含む
染色体DNA、あるいはpro Ｂおよびpro Ａを含
む染色体DNAが好ましい。又、pro Ｂは上記の
いずれの染色体DNAに含まれる場合もフイード
バツク調節から解除されている変異型であるのが
とりわけ好ましい。 かかる染色体DNAの供給源となる微生物とし
ては、Ｌ−プロリン分解酵素欠損性でかつプロリ
ンアナローグ及び／又はプリンアナローグに耐性
なセラチア マルセツセンス、Ｌ−プロリン分解
酵素欠損性でかつ高浸透圧下にプロリンアナロー
グ耐性なセラチア マルセツセンス等を好適に用
いることができる。かかる微生物の具体例として
は例えばセラチア マルセツセンスDTr−12（微
工研条寄第171号）（Ｌ−プロリンオキシダーゼ欠
損性でかつ３，４−デヒドロ−DL−プロリンお
よびＬ−チアゾリジン−４−カルボン酸に耐性な
変異株）、セラチア マルセツセンスOAr−80
（微工研条寄第173号）（Ｌ−プロリンオキシダー
ゼ欠損性でかつ高濃度の塩化ナトリウム存在下で
Ｌ−アゼチジン−２−カルボン酸に耐性な変異
株）等をあげることができる。これらの微生物か
ら染色体DNAを採取する方法としては例えば微
生物の菌体をリゾチーム処理、界面活性剤
〔SDS、ザルコシル（Ｎ−ラウロイルサルコシン
酸ナトリウム）等〕で処理したのち、除蛋白しつ
いでエタノール沈殿せしめる常法〔J.Mol.Biol.，
３，208，（191）、Biochem.Biophys.Acta.，72，
619（1963）〕により容易に実施できる。 （ベクタープラスミドDNAおよびその調製〕 上記の如くして得られる染色体DNAを組み込
むベクタープラスミドとしては、pACYC177〔J.
Bacteriol.134，1141（1978）〕、pKP1154〔Ｆプラ
スミドのEcoRIf5断片Proc.Nat.Acad.Sci.，73，
64，（1976）から複製開始点を含むＢ，Ｃ，A2断
片を切り出し、これにアンピシリン耐性、クロラ
ムフエニコール耐性、スペクチノマイシン耐性、
ストレプトマイシン耐性遺伝子を結合たプラスミ
ド〕を含むミニＦ等を用いることができ、これら
のプラスミドはいつたんセラチア マルセツセン
スに移入したのち、常法により抽出したものを用
いればより好ましい結果が得られる。 （ハイブリツドプラスミドの調製） 上記で得られた染色体DNAとベクタープラス
ミドDNAからハイブリツドプラスミドを調製す
るには制限エンドヌクレアーゼ（例えばHind，
Pst，BamH等）を用いて染色体DNAとプ
ラスミドDNA鎖を切断したのち、リガーゼ（例
えば、T40DNAリガーゼ、大腸菌DNAリガーゼ
等）で処理するか、或いはその切断末端によつて
はターミナルトランスフエラーゼ、DNAポリメ
ラーゼ等で処理したのちリガーゼを作用させて
DNA鎖を結合する等の常法〔Methods in
Enzymology，68，41（1979）、遺伝子操作実験法
（高木康敬編著、講談社サイエンテイフイツク）
135〜159頁〕により実施することができる。 かくして得られたハイブリツドプラスミドはそ
のまま形質転換に用いることもでき、又ハイブリ
ツドプラスミドを各種の変更を有する変異株に移
入して目的とするハイブリツドプラスミドを保持
する菌株を予め選択したのち該菌株からハイブリ
ツドプラスミドを常法により抽出しこれを宿主微
生物に移入することもでき、かかる方法によると
きは形質転換株の選択が容易であり好ましい。か
かる目的に用いる変異株としては例えばセラチア
属、エリエリシア属に属する微生物でつてプロリ
ン生産能を有しない微生物であるか、アンピシリ
ン感受性、カナマイシン感受性等の変異の一部又
は全部を有する変異株があげられる。 （宿主微生物） ハイブリツドプラスミドを含有せしめる宿主微
生物としてはセラチア マルセツセンスに属し、
形質転換可能な微生物であればよく、例えばセラ
チア・マルセツセンスの野生株の他、前記染色体
DNAの供給源として用いた微生物を好適に用い
ることができる。 （ハイブリツドプラスミドによる形質転換） 形質転換方法は例えば低温下に宿主微生物細胞
を塩化カルシウム溶液で処理し、菌体の膜透過性
を増大させ、ハイブリツドDNAを宿主微生物中
にとり込ませる方法〔J.Mol，Biol.53，159
（1970）〕等の常法を採用することができる。 かくして得られた形質転換法のうち、目的とす
るハイブリツドプラスミドを含有する菌株の選択
は生育したコロニーのちプロリン分泌能を有すを
菌株を釣菌・分離することにより実施できる。 かくすることにより本発明に係る微生物、即
ち、Ｌ−プロリン分解酵素欠損性でかつプロリン
アナローグ及び／又はプリンアナローグに耐性な
Ｌ−プロリン生産能を有するセラチア マルセツ
センス或いはＬ−プロリン分解酵素欠損性でかつ
高浸透圧下にプロリンアナローグ耐性なＬ−プロ
リン生産能を有するセラチア マルセツセンスか
ら採取した、グルタメートキナーゼ及びグルタメ
ート・ホスフエートリダクターゼの遺伝情報を担
う染色体DNAまたはグルタメートキナーゼ、グ
ルタメート・ホスフエートリダクターゼ及びピロ
リン・５・カルボキシレートリダクターゼの遺伝
情報を担う染色体DNAをベクターpKP1154また
はpACYC177に組み込んだハイブリツドプラス
ミドを、セラチア マルセツセンスに含有せしめ
た微生物を得ることができる。 かかる微生物として具体的には例えばセラチア
マルセツセンスTA5006（微工研条寄第649号）、
セラチア マルセツセンスTA5007（微工研条寄
第650号）、セラチア マルセツセンスTA5008
（微工研条寄第651号）、セラチア マルセツセン
スTA5009（微工研条寄第652号）等があげらる。 〔Ｌ−プロリンの製法〕 本発明において使用するＬ−プロリン生産用培
地としては、炭素源としてブドウ糖、シヨ糖、糖
蜜の如き糖類、コハク酸、クエン酸、フマール酸
の如き有機酸、グリセロールの如き糖アルコール
類等を10〜20％、窒素源としてフマール酸アンモ
ニウム、コハク酸アンモニウムの如き有機アンモ
ニウム塩、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム
の如き無機アンモニウム塩や尿素等を１〜５％、
有機栄養物としてコーンステイープリカー、ペプ
トン、酵母エキス等を０〜１％の範囲でそれぞれ
適当量含有し、他に無機物としてリン酸カリウ
ム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄を少量加えた
培地が好適に使用できる。 これらの他に培地のPHを６〜８に保つために炭
酸カルシウム・アンモニア、クエン酸などを必要
に応じて添加してもよい。更に、このような培地
にＬ−プロリン生合成の前物質となるようＬ−グ
ルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸などを適宜添加
した培地も好適に使用できる。 本発明によれば、上記培地に本発明の微生物を
接種し、25〜40℃にて振とうあるいは通気かく拌
の如き好気的条件下で２〜６日間培養することに
よつて培地中にＬ−プロリンを著量蓄積せしめる
ことができる。生成したＬ−プロリンは培養終了
後菌体その他の不溶物を除去したのち、例えばイ
オン交換樹脂に吸着せしめ、アンモニア水で溶離
し、これを濃縮・結晶化するなどの通常の分離精
製操作によつて容易に採取することができる。 以下、実施例および参考例をあげて本発明を説
明するが、実施例中Ｌ−プロリンの確認はペーパ
ークロマトグラムのニンヒドリン反応及びイサチ
ン反応によつて行ない、その定量はロイコノスト
ツク・メゼンテロイデスＰ−60によるバイオアツ
セイによつて行つた。 実施例 １ (1) 染色体DNAの調製 セラチア マルセツセンスOAr−80（微工研条
寄第173号）を１のＬ−プロス（ペプトン１％、
酵母エキス0.5％、塩化ナトリウム0.5％、PH7.2）
に接種し、30℃で４時間振とう培養し対数増殖期
の菌体を遠心分離により集めた。この菌体をリゾ
チーム処理、SDS処理して溶菌し、フエノール処
理により除蛋白したのちエタノール処理して染色
体DNAを沈殿させた。ついでRN ase（最終濃度
10μg／ml）を加え、37℃で１時間処理して染色
体DNAを精製することにより染色体DNA8.6mg
を得た。 (2) ベクタープラスミドDNAの調製 セラチア マルセツセンスSr41の野生株8000
を文献〔Molec.Gen.Genet.，124，197（1973）〕
記載方法に準じて変異誘起処理し、細胞外ヌクレ
アーゼ欠性、制限エンドヌクレアーゼ欠損性の変
異株を調製する。ついでこの変異株をＮ−メチル
−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンで変異
誘導処理し、アンピシリン5μg／mlを含むＬ−プ
ロス寒天培地にプレートあたり約100コロニーが
生じるように塗布した。30℃で１日培養したのち
生じたコロニーについてアンピシリン感受性を調
べ、親株に比べてアンピシリン感受性の高い株を
選択することにより細胞外ヌクレアーゼ欠損性、
制限エンドヌクレアーゼ欠損性かつアンピシリン
感受性の変異株を得た。ついでこれをＬ−プロス
50mlに接種し０℃で振とう培養して対数増殖期ま
で生育せしめた菌体を集菌し、氷冷した0.1M塩
化カルシウム−0.5Mシヨ糖溶液25mlにけん濁し
た。０℃で30分間放置したのち集菌し、氷冷した
0.1M塩化カルシウム−0.5Mシヨ糖溶液５mlにけ
ん濁した。この細胞けん濁液0.2mlにエシエリシ
ア・コリＫ−12から採取したプラスミドpKP−
1154のDNA1μgを加え、０℃で１時間放置した。
42℃で２分間処理したのち、Ｌ−プロス２mlを加
え30℃で90分培養した。の培養液0.4mlをアンピ
シリン50μg／mlを含むＬ−プロス寒天培地に塗
布し、30℃で１日培養した。生じたコロニーを釣
菌分離することによりpKP1154を含有するセラ
チア マルセツセンスを得た。 かくして得られたセラチア マルセツセンスを
４のＬ−プロスに接種して30℃で18時間振とう
培養した後、菌体を遠心分離により集めた。つい
で得られた菌体をリゾチーム処理、SDS処理して
溶菌させた後、最終1Mとなるように塩化ナトリ
ウムを加えて100000×ｇ、30分の遠心分離を行な
つた。ついで上清を採取しフエノール処理した後
エタノールを加え遠心分離してDNAを沈殿させ
た。沈殿したDNAを10mMトリス塩酸−1mM
EDTA溶液（PH7.5）に溶解し、塩化セシウム・
エチジウムプロマイド平衡密度公配遠心法により
分離精製することにより0.2mgのpKP1154プラス
ミドDNAを得た。 (3) ハイブリツドプラスミドの調製 前記(1)で得た染色体DNA6μg、上記(2)で得た
ベクタープラスミドDNA1μgの各々に制限エン
ドヌクレアーゼBamHを通常の条件で作用さ
せDNA鎖を完全に切断した。65℃、10分間の熱
処理後、両反応液を混合しT4フアージ由来の
DNAリガーゼを通常の条件下で作用させてDNT
錯を連結させた。 (4) ハイブリツドプラスミドの選択 (a) グルタメート・ホスフエートリダクターゼ欠
損性かつ制限エンドヌクレアーゼ欠損性のエシ
エリシア・コリHB101（ATCC33694）をＬ−
プロス50mlに接種し、７℃で振とう培養しその
対数増殖期の中期まで生育せしめた菌体を集菌
した。ついで氷冷した0.1M塩化マグネシウム
溶液50mlにけん濁したのち集菌し、氷冷した
0.1M塩化カルシウム溶液25mlにけん濁した。
０℃で30分間放置したのち集菌し、氷冷した
0.1M塩化カルシウム溶液５mlにけん濁した。
この細胞けん濁液に(3)で得たDNA溶液を加え
て30分間氷冷した後、42℃で２分間熱処理する
ことによりDNAを細胞内にとりこませた。つ
いでこのけん濁液にＬ−プロス50mlを加え37℃
で１時間振とう培養して遠心分離し、菌を生理
食塩水５mlにけん濁した。このけん濁液の少量
を培地（グルコース0.5％、リン酸第二カリウ
ム0.7％、リン酸第一カリウム0.2％、硫酸アン
モニウム0.1％、硫酸マグネシウム・７水和物
0.01％、クエン酸ナトリウム0.05％、Ｌ−グル
タミン酸ナトリウム0.01M，Ｌ−ロイシン
0.001M，Ｌ−メチオニン0.001M，Ｌ−リジン
0.001M、チアミン0.0005％、アンピシリン
20μg／ml、寒天1.5％）に塗布し、37℃で３〜
４日間培養した。生じたコロニーを釣菌分離し
プロリン生成能を有する株を得た。この株から
前記(2)と同様にしてハイブリツドプラスミドを
精製分離した。 (b) 前記(2)と同様して得たセラチア マルセツセ
ンスの細胞外ヌクレアーゼ欠損性、制限エンド
ヌクレアーゼ欠損性で、かつアンピシリン感受
性変異株に上記(a)で得られたPNAを(a)と同様
に処理してとり込ませる。ついでアンピシリン
50μg／mlを含むＬ−プロス寒天培地（寒天1.5
％に塗布し、30℃で24時間培養した。生じたコ
ロニーを釣菌分離しプロリン生成能を有する菌
株を選択し、得られる菌株から前記(2)と同様に
してハイブリツドプラスミドDNA，TA506を
精製分離した。 (5) 形質転換株の調製 上記で得られたハイブリツドプラスミドDNA
とセラチア マルセツセンスDTr−12（微工研条
寄第1731号）とを上記(4)(a)と同様に処理して形質
転換株を調製し、アンピシリン500μg／mlを含む
Ｌ−ブロス寒天培地で培養することにより目的と
する形質転換株セラチア マルセツセンス
TA5006（（微工研菌寄第7363号）を得た。 又、ハイブリツドプラスミドDNApTA506と
セラチア マルセツセンスOAr−80（微工研条寄
第173号）とを上記と同に処理して形質転換株を
調製することにより目的とする形質転換株セラチ
ア マルセツセンスTA5007（微工研菌寄7364号）
を得た。 上記の微生物の含有するハイブリツドプラスミ
ドDNA pTA506にPro Ｂ及びPro Ａが組み込
まれていることを確認するため、TA5006及び
TA5007の微生物よりハイブリツドプラスミド
DNAを抽出・分離した。ついでこのハイブリツ
ドプラスミドを前記(4)(a)と同様にしてエシエリシ
ア・コリHB101にとり込ませた。その結果、得
られた形質転換株はプロリン生成能を有し、
TA5006及びTA5007の各微生物に含まれるハイ
ブリツドプラスミドにはPro Ｂ，Pro Ａが組み
込まれていることが確認された。 実施例 ２ (1) ハイブリツドプラスミドの調製 (a) 実施例１−(1)と同様にして得た染色体
DNA6μg及び実施例１−(2)と同様にして得た
ベクタープラスミドpACYC177DNA1μgの
各々に制限エンドヌクレアーゼPstを通の条
件で作用させDNA鎖を完全に切断した。65℃、
10分間の熱処理後、両反応液を混合しT4フア
ージ由来のDNAリガーゼを通常の条件下で作
用させてDNA鎖を連結させた。 (b) エシエリシア・コリC600（ATCC33525）を
Ｎ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグア
ニジンで変異誘導処理し、プロリン要求性変異
株を取得した。ついでこのプロリン要求性変異
株のうち、ピロリン・５・カルボキシレートリ
ダクターゼ活性を持たない株を選択した。 (c) 上記(a)で得られたハイブリツドプラスミド
DNAを上記(b)で得られたピロリン・５・カル
ボキシレートリダクターゼ欠損性変異株とを実
施例１−(4)と同様にして塩化カルシウム処理し
てハイブリツドプラスミドDNAを細胞内にと
り込ませた。培地（グルコース0.5％、リン酸
第二カリウム0.7％、リン酸第一カリウム0.2
％、硫酸アンモニウム0.2％、硫酸マグネシウ
ム・７水和物0.01％、クエン酸ナトリウム0.05
％、Ｌ−ロイシン0.001M，Ｌ−スレオニン
0.001M、チアミン0.0005％、寒天1.5％）で選
択した菌株から実施例１−(2)と同様にしてハイ
ブリツドプラスミドDNAを精製分離した。 (d) 実施例１−(2)と同様にして得たセラチアマル
セツセンスの細胞外ヌヌクレアーゼ欠損性、制
限エンドヌクレアーゼ欠損性かつアンピシリン
感受性の変異株に上記(c)で得られたハイブリツ
ドプラスミドDNAをとり込ませ、アンピシリ
ン耐性を有する菌株を得た。この菌株から実施
例１−(2)と同様にしてハイブリツドプラスミド
DNAを分離・精製することによりハイブリツ
ドプラスミドDNApTA507を得た。 (e) 上記(d)で得たpTA507DNA1μg及び実施例１
−(4)(b)で得たpTA506DNA1μgの各々に制限エ
ンドヌクレアーゼHindとEcoRを通常の条
件で作用させDNA鎖を完全に切断した。65℃、
10分間の熱処理後、両反応液を混合しT4フア
ージ由来のDNAリガーゼを通常の条件下で作
用させてDNA鎖を連結させた。 (2) ハイブリツドプラスミドの選択 (a) 上記(1)−(b)と同様にして得られたエシエリシ
ア・コリのピロリン・５・カルボキシレートリ
ダクターゼ欠損性変異株に上記(1)−(e)で得られ
たDNA溶液をとり込ませ、前記(1)−(c)の培地
にアンピシリン20μg／mlを加えた培地で生じ
たコロニーのうちプロリン生成能を有する株を
得た。この菌株から実施例１−(2)と同様にして
ハイブリツドプラスミドDNAを分離精製した。 (b) 実施例１−(2)と同様にして得たセラチア マ
ルセツセンスの細胞外ヌクレアーゼ欠損性、制
限エンドヌクレアーゼ欠損性かつアンピシリン
感受性の変異株に上記(a)で得られたDNAをと
り込ませ、得られる菌株から実施例１−(2)と同
様にしてハイブリツドプラスミド
DNApTA508を精製分離した。 (3) 形質転換株の調製 (a) 上記で得られたハイブリツドプラスミド
DNApTA508をセラチア マルセツセンス
DTr−12（微工研条寄第171号）により込ませ、
アンピシリン500μg／mlを含有するＬ−ブロス
寒天培地で培養することにより目的とする形質
転換株TA5008（微工研菌寄第7365号）を得た。 又、ハイブリツドプラスミドDNA pTA508
とセラチア マルセツセンスOAr−80（微工研
条寄第173号）とを上記と同様に処理すること
により形質転換株セラチア マルセツセンス
TA5009（微工研菌寄第7366号）を得た。 上記の微生物の含有するハイブリツドプラス
ミドDNApTA508のProB，ProA及びProCが
組み込まれていることを確認するため、
TA5008及びTA5009の微生物よりハイブリツ
ドプラスミドDNAを抽出・分離した。ついで
このハイブリツドプラスミドDNAをピロリ
ン・５・カルボキシレートリダクターゼ欠損性
変異株とエシエリシア・コリHB101にとり込
させた。その結果、得られた形質転換株はいず
れもプロリン生成能を有し、TA5008及び
TA5009の各微生物に含まれるハイブリツドプ
ラスミドにはProB，ProA，ProC、が組み込
まれていることが確認された。 実施例 ３ 実施例１及び２で得た本発明の微生物セラチア
マルセツセンスTA5006およびTA5008をアン
ピシリン500μg／mlを含むＬ−プロス培地で30℃
で一培養した後、発酵培地〔シヨ糖18％、尿素
2.5％、第二リン酸カリウム0.1％、硫酸マグネシ
ウム・７水和物0.05％、硫酸第一鉄・７水和物
0.0002％、コーンステイープリカー0.3％、炭酸
カルシウム３％を蒸留水にとかした溶液15mlを
500ml容振とうコルベンに注入し加熱滅菌したも
の（但し、シヨ糖は別途滅菌後、培地に添加）
（PH0.7）〕に一白金耳植菌した。又、対照微生物
としてセラチア マルセツセンスDTr−12（微工
研条寄171号）をブイヨン斜面培地で30℃、１夜
培養したのち上記と同じ発酵培地に一白金耳植菌
した。ついでそれぞれの菌体を30℃、140回転／
分、振幅７cmの条件で72時間培養したとき、培地
中のＬ−プロリン生成量は下記第１表の通りであ
つた。 【表】 実施例 ４ 実施例１及び２で得た本発明の微生物セラチア
マルセツセンスTA5006及びTA5009をアンピ
シリン500μg／mlを含有するＬ−プロス培地で一
培養した後、発酵培地〔シヨ糖25％、尿素2.8％、
第二リン酸カリウム0.1％、硫酸マグネシウム・
７水和物0.05％、硫酸第１鉄・７水和物0.0002
％、コーンステイープリカー0.5％、炭酸カルシ
ウム３％を蒸留水にとかした溶液15mlを500ml容
振とうコルベンに注入し加熱滅菌したもの（但
し、シヨ糖は別途滅菌後、培地に添加）（PH0.7）〕
に一白金耳植菌した。又、対照微生物としてセラ
チア マルセツセンスOAr−80をブイヨン斜面
培地で30℃、１夜培養した後、上記と同じ発酵培
地に一白金耳植菌した。ついでそれぞれの菌体を
30℃、140回転／分、振幅７cmの条件で120時間培
養したとき、培地中のＬ−プロリン生成量は下記
第２表の通りであつた。 【表】 実施例 ５ 実施例４で得られたTA5007の微生物の培養液
１を集めて熱処理した後、ろ過して不溶物を除
去した。ついでろ液を陽イオン交換樹脂アンバー
ライトIR−120B（H⁺）円充填したカラムに導通
した。水洗後吸着したＬ−プロリンを５％アンモ
ニア水で溶出し溶出液を減圧濃縮した。濃縮液を
冷却し析出晶をろ取することによりＬ−プロリン
56.8gを得た。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ Ｌ−プロリン分解酵素欠損性でかつプロリン
   アナローグ及び／又はプリンアナローグに耐性な
   Ｌ−プロリン生産能を有するセラチア マルセツ
   センス或いはＬ−プロリン分解酵素欠損性でかつ
   高浸透圧下にプロリンアナローグ耐性なＬ−プロ
   リン生産能を有するセラチア マルセツセンスか
   ら採取した、グルタメートキナーゼ及びグルタメ
   ート・ホスフエートリダクターゼの遺伝情報を担
   う染色体DNAまたはグルタメートキナーゼ、グ
   ルタメート・ホスフエートリダクターゼ及びピロ
   リン・５・カルボキシレートリダクターゼの遺伝
   情報を担う染色体DNAをベクターpKP1154また
   はpACYC177に組み込んだハイブリツドプラス
   ミドを、セラチア マルセツセンスに含有せしめ
   た微生物を培地で培養して、培地中にＬ−プロリ
   ンを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴
   とするＬ−プロリンの製法。