JPH0787778B2 - 新規微生物及びそれを用いるｌ−アミノ酸の製法 - Google Patents
新規微生物及びそれを用いるｌ−アミノ酸の製法Info
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- JPH0787778B2 JPH0787778B2 JP62313505A JP31350587A JPH0787778B2 JP H0787778 B2 JPH0787778 B2 JP H0787778B2 JP 62313505 A JP62313505 A JP 62313505A JP 31350587 A JP31350587 A JP 31350587A JP H0787778 B2 JPH0787778 B2 JP H0787778B2
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- dna
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は高フェニルアラニン・トランスアミナーゼ活性
を有する新規微生物及び当該微生物を用いる一般式 （但し、ｎは１又は２を表す。） で示されるＬ−アミノ酸の製法に関する。
を有する新規微生物及び当該微生物を用いる一般式 （但し、ｎは１又は２を表す。） で示されるＬ−アミノ酸の製法に関する。
（従来技術） 従来、パラコッカス・デニトリフィカンスがフェニルア
ラニン・トランスアミナーゼ活性を有しており、この微
生物を用いてフェニルピルビン酸とＬ−アスパラギン酸
からＬ−フェニルアラニンを〔アプライド・バイオケミ
ストリー・アンド・バイオテクノロジー、11,367,（198
5）〕、また、２−オキソ−４−フェニル酪酸とＬ−ア
スパラギン酸もしくはＬ−グルタミン酸からＬ−２−ア
ミノ−４−フェニル酪酸を酵素的に製造する方法が知ら
れている〔特開昭60-156394号〕。しかしながら、上記
方法で用いられているパラコッカス・デニトリフィカン
スのフェニルアラニン・トランスアミナーゼ活性は工業
的に充分満足し得るほど高いとはいえないという問題点
があった。
ラニン・トランスアミナーゼ活性を有しており、この微
生物を用いてフェニルピルビン酸とＬ−アスパラギン酸
からＬ−フェニルアラニンを〔アプライド・バイオケミ
ストリー・アンド・バイオテクノロジー、11,367,（198
5）〕、また、２−オキソ−４−フェニル酪酸とＬ−ア
スパラギン酸もしくはＬ−グルタミン酸からＬ−２−ア
ミノ−４−フェニル酪酸を酵素的に製造する方法が知ら
れている〔特開昭60-156394号〕。しかしながら、上記
方法で用いられているパラコッカス・デニトリフィカン
スのフェニルアラニン・トランスアミナーゼ活性は工業
的に充分満足し得るほど高いとはいえないという問題点
があった。
（発明の構成及び効果） かかる状況に鑑み、本発明者らは鋭意研究を重ねた結
果、パラコッカス属に属する微生物の有するフェニルア
ラニン・トランスアミナーゼ活性を司る染色体フラグメ
ントを切り出し、これをプラスミドに組み込んで得られ
るハイブリッドプラスミドをエシェリシア属微生物に移
入することにより、パラコッカス属に属する微生物に比
して極めて高いフェニルアラニン・トランスアミナーゼ
活性を有する微生物を調製することに成功すると共に、
かくして得られる微生物を用いれば一般式（Ｉ）で示さ
れるＬ−アミノ酸を効率良く製造しうることを見出し本
発明を完成するに至った。
果、パラコッカス属に属する微生物の有するフェニルア
ラニン・トランスアミナーゼ活性を司る染色体フラグメ
ントを切り出し、これをプラスミドに組み込んで得られ
るハイブリッドプラスミドをエシェリシア属微生物に移
入することにより、パラコッカス属に属する微生物に比
して極めて高いフェニルアラニン・トランスアミナーゼ
活性を有する微生物を調製することに成功すると共に、
かくして得られる微生物を用いれば一般式（Ｉ）で示さ
れるＬ−アミノ酸を効率良く製造しうることを見出し本
発明を完成するに至った。
即ち、本発明はパラコッカス属に属する微生物から採取
したフェニルアラニン・トランスアミナーゼの遺伝情報
を担うデオキシリボ核酸をプラスミドに組み込んだハイ
ブリッドプラスミドであって、アスパラギン酸トランス
アミナーゼ及び芳香族アミノ酸トランスアミナーゼの同
時欠損変異を有し該変異にもとづいてフェニルアラニン
要求性を示すエシェリシア・コリに含有せしめた場合
に、該フェニルアラニン要求性を相補し得るハイブリッ
ドプラスミドをエシェリシア・コリに含有せしめた微生
物及び該微生物菌体、その培養物もしくは該菌体の処理
物を、アミノ供与体の存在下に、一般式 （但し、ｎは１又は２を表す。） で示されるオキソ酸化合物又はその塩に作用させること
からなる前記一般式（Ｉ）で示されるＬ−アミノ酸の製
法に関する。
したフェニルアラニン・トランスアミナーゼの遺伝情報
を担うデオキシリボ核酸をプラスミドに組み込んだハイ
ブリッドプラスミドであって、アスパラギン酸トランス
アミナーゼ及び芳香族アミノ酸トランスアミナーゼの同
時欠損変異を有し該変異にもとづいてフェニルアラニン
要求性を示すエシェリシア・コリに含有せしめた場合
に、該フェニルアラニン要求性を相補し得るハイブリッ
ドプラスミドをエシェリシア・コリに含有せしめた微生
物及び該微生物菌体、その培養物もしくは該菌体の処理
物を、アミノ供与体の存在下に、一般式 （但し、ｎは１又は２を表す。） で示されるオキソ酸化合物又はその塩に作用させること
からなる前記一般式（Ｉ）で示されるＬ−アミノ酸の製
法に関する。
（染色体DNAの調製） 本発明においてフェニルアラニン・トランスアミナーゼ
の遺伝情報を担うデオキシリボ核酸（以下、染色体DNA
と称する）の供給源となる微生物としては、パラコッカ
ス属に属しフェニルアラニン・トランスアミナーゼ活性
を有するものであればいかなる微生物であってもよく、
例えば、パラコッカス・デニトリフィカンスIFO12442等
を用いることができる。
の遺伝情報を担うデオキシリボ核酸（以下、染色体DNA
と称する）の供給源となる微生物としては、パラコッカ
ス属に属しフェニルアラニン・トランスアミナーゼ活性
を有するものであればいかなる微生物であってもよく、
例えば、パラコッカス・デニトリフィカンスIFO12442等
を用いることができる。
上記の如き微生物から採取される染色体DNAを組み込む
プラスミドとしてはエシェリシア属に属する微生物中に
おいて複製可能なプラスミドであれば特に限定されない
が例えばpLG339〔ジーン、18,335,（1982）、ATCC3713
1〕、pUC18〔ジーン、33,103（1985）、ATCC37253〕等
を用いることができる。
プラスミドとしてはエシェリシア属に属する微生物中に
おいて複製可能なプラスミドであれば特に限定されない
が例えばpLG339〔ジーン、18,335,（1982）、ATCC3713
1〕、pUC18〔ジーン、33,103（1985）、ATCC37253〕等
を用いることができる。
また、染色体DNAをプラスミドに組み込んだハイブリッ
ドプラスミドを含有せしめる宿主としてはエシェリシア
属に属し形質転換可能な微生物であればよく、例えばエ
シェリシア・コリHB101株〔ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー、41,459（1969）,ATCC33694〕、
エシェリシア・コリJM105株（蛋白質・核酸・酵素、29,
294（1981）〕を好適に用いることができる。
ドプラスミドを含有せしめる宿主としてはエシェリシア
属に属し形質転換可能な微生物であればよく、例えばエ
シェリシア・コリHB101株〔ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー、41,459（1969）,ATCC33694〕、
エシェリシア・コリJM105株（蛋白質・核酸・酵素、29,
294（1981）〕を好適に用いることができる。
本発明に係る微生物を調製するに際しては、まずフェニ
ルアラニン・トランスアミナーゼ活性を有するパラコッ
カス属に属する微生物より染色体DNAを採取する。染色
体DNAの採取は前記した如きパラコッカス属に属する微
生物の菌体をリゾチームより処理、界面活性剤〔SDS,ザ
ルコシル（Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム）
等〕で処理した後、除蛋白し、次いでエタノール沈澱せ
しめる常法〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ
ロジー、3,208,（1961），ビオキミカ・ビオフィジカ・
アクタ、72,619（1963）〕により容易に実施できる。
ルアラニン・トランスアミナーゼ活性を有するパラコッ
カス属に属する微生物より染色体DNAを採取する。染色
体DNAの採取は前記した如きパラコッカス属に属する微
生物の菌体をリゾチームより処理、界面活性剤〔SDS,ザ
ルコシル（Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム）
等〕で処理した後、除蛋白し、次いでエタノール沈澱せ
しめる常法〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ
ロジー、3,208,（1961），ビオキミカ・ビオフィジカ・
アクタ、72,619（1963）〕により容易に実施できる。
（ハイブリッドプラスミドの調製） かくして得られた染色体DNAとプラスミドとの連結は、
制限エンドヌクレアーゼ（例えば、Sau3AI,BamHI,Hind
III,SalI,EcoRV,EcoRI等）を用いて染色体及びプラスミ
ドのDNA鎖を切断した後、リガーゼ（例えば、T4DNAリガ
ーゼ、大腸菌NDAリガーゼ等）で処理するか、或いはそ
の切断末端によってはターミナルトランスフェラーゼ、
DNAポリメラーゼ等で処理して平滑末端化した後、リガ
ーゼを作用させてDNA鎖を結合する等の常法〔メソッズ
・イン・エンザイモロジー、68,41（1979）、遺伝子操
作実験法、135頁（高木康敬著、講談社サイエンティフ
ィク（1980））〕により実施することができる。
制限エンドヌクレアーゼ（例えば、Sau3AI,BamHI,Hind
III,SalI,EcoRV,EcoRI等）を用いて染色体及びプラスミ
ドのDNA鎖を切断した後、リガーゼ（例えば、T4DNAリガ
ーゼ、大腸菌NDAリガーゼ等）で処理するか、或いはそ
の切断末端によってはターミナルトランスフェラーゼ、
DNAポリメラーゼ等で処理して平滑末端化した後、リガ
ーゼを作用させてDNA鎖を結合する等の常法〔メソッズ
・イン・エンザイモロジー、68,41（1979）、遺伝子操
作実験法、135頁（高木康敬著、講談社サイエンティフ
ィク（1980））〕により実施することができる。
（形質転換株の調製） ハイブリッドプラスミドによる形質転換方法は、例えば
低温下で塩化カルシウム含有溶液で宿主微生物細胞を処
理して菌膜の透過性を増大させ、ハイブリッドプラスミ
ドDNAを宿主微生物中にとり込ませる方法〔ジャーナル
・オブ・モレキュラー・バイオロジー、53,159（197
0）、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、119,1072
（1974）〕等を採用することができる。
低温下で塩化カルシウム含有溶液で宿主微生物細胞を処
理して菌膜の透過性を増大させ、ハイブリッドプラスミ
ドDNAを宿主微生物中にとり込ませる方法〔ジャーナル
・オブ・モレキュラー・バイオロジー、53,159（197
0）、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、119,1072
（1974）〕等を採用することができる。
かくして得られた形質転換株のうち、フェニルアラニン
・トランスアミナーゼの遺伝情報を担うハイブリッドプ
ラスミドが移入された菌株の選択はフェニルアラニン・
トランスアミナーゼ活性が上昇した菌株を釣り菌・分離
することにより実施できる。また、形質転換に際しハイ
ブリッドプラスミドを各種の変異を有する変異株に移入
して目的とするハイブリッドプラスミドを予め選択する
こともできる。かかる選択に利用し得る変異株として
は、例えばエシェリシア属に属する微生物であってアス
パラギン酸トランスアミナーゼ及び芳香族アミノ酸トラ
ンスアミナーゼの同時欠損変異を有し該変異にもとづい
てフェニルアラニン要求性を示す菌株（例えばエシェリ
シア・コリDG30株〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジ
ー、130:441-444（1997）〕）を用いることができ、目
的とするハイブリッドプラスミドを含有する菌株はＬ−
フェニルアラニンの要求性が相補された菌株として選択
できる。
・トランスアミナーゼの遺伝情報を担うハイブリッドプ
ラスミドが移入された菌株の選択はフェニルアラニン・
トランスアミナーゼ活性が上昇した菌株を釣り菌・分離
することにより実施できる。また、形質転換に際しハイ
ブリッドプラスミドを各種の変異を有する変異株に移入
して目的とするハイブリッドプラスミドを予め選択する
こともできる。かかる選択に利用し得る変異株として
は、例えばエシェリシア属に属する微生物であってアス
パラギン酸トランスアミナーゼ及び芳香族アミノ酸トラ
ンスアミナーゼの同時欠損変異を有し該変異にもとづい
てフェニルアラニン要求性を示す菌株（例えばエシェリ
シア・コリDG30株〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジ
ー、130:441-444（1997）〕）を用いることができ、目
的とするハイブリッドプラスミドを含有する菌株はＬ−
フェニルアラニンの要求性が相補された菌株として選択
できる。
かくすることにより本発明に係る微生物、即ち、パラコ
ッカス属に属する微生物から採取したフェニルアラニン
・トランスアミナーゼの遺伝情報を担うデオキシリボ核
酸をプラスミドに組み込んだハイブリッドプラスミドを
エシェリシア属に属する微生物に含有せしめた微生物を
得ることができる。
ッカス属に属する微生物から採取したフェニルアラニン
・トランスアミナーゼの遺伝情報を担うデオキシリボ核
酸をプラスミドに組み込んだハイブリッドプラスミドを
エシェリシア属に属する微生物に含有せしめた微生物を
得ることができる。
かくして得られる微生物の具体例としては、例えばエシ
ェリシア・コリPA501株があげられる。この微生物は、
パラコッカス・デニトリフィカンスに比べて約８倍高い
フェニルアラニン・トランスアミナーゼ活性を有する。
ェリシア・コリPA501株があげられる。この微生物は、
パラコッカス・デニトリフィカンスに比べて約８倍高い
フェニルアラニン・トランスアミナーゼ活性を有する。
〔Ｌ−フェニルアラニンおよびＬ−２−アミノ−４−フ
ェニル酪酸の製造〕 本発明に係る微生物は前記の如くパラコッカス属に属す
る微生物に比べて顕著に優れたフェニルアラニン・トラ
ンスアミナーゼ活性を有しているので、該微生物の培養
液、該培養液から採取した菌体もしくは該菌体の処理物
をアミノ供与体の存在下にオキソ酸化合物（II）（即
ち、フェニルピルビン酸又は２−オキソ−４−フェニル
酪酸）に作用させることによりＬ−アミノ酸（Ｉ）（即
ち、Ｌ−フェニルアラニン又はＬ−２−アミノ−４−フ
ェニル酪酸）を効率良く製造することができる。
ェニル酪酸の製造〕 本発明に係る微生物は前記の如くパラコッカス属に属す
る微生物に比べて顕著に優れたフェニルアラニン・トラ
ンスアミナーゼ活性を有しているので、該微生物の培養
液、該培養液から採取した菌体もしくは該菌体の処理物
をアミノ供与体の存在下にオキソ酸化合物（II）（即
ち、フェニルピルビン酸又は２−オキソ−４−フェニル
酪酸）に作用させることによりＬ−アミノ酸（Ｉ）（即
ち、Ｌ−フェニルアラニン又はＬ−２−アミノ−４−フ
ェニル酪酸）を効率良く製造することができる。
本発明に係る微生物を培養するに際しては炭素源、窒素
源、有機栄養源、無機塩類などを含む通常の栄養培地が
使用できる。培養は常法により行うことができ、例えば
培地のpHを5.0〜9.0に調整し、微生物を接種したのち、
10〜45℃、好ましくは28〜37℃で好気的に培養すればよ
い。
源、有機栄養源、無機塩類などを含む通常の栄養培地が
使用できる。培養は常法により行うことができ、例えば
培地のpHを5.0〜9.0に調整し、微生物を接種したのち、
10〜45℃、好ましくは28〜37℃で好気的に培養すればよ
い。
酵素反応に際しては、上記の如くして得られる培養液の
他に該培養液から採取した菌体、該菌体の処理物をも用
いることができ、ここに菌体の処理物としては、例えば
洗浄菌体、乾燥菌体、菌体磨砕物、菌体の自己消化物、
菌体の超音波処理物、菌体抽出物があげられる。
他に該培養液から採取した菌体、該菌体の処理物をも用
いることができ、ここに菌体の処理物としては、例えば
洗浄菌体、乾燥菌体、菌体磨砕物、菌体の自己消化物、
菌体の超音波処理物、菌体抽出物があげられる。
基質たるオキソ酸化合物（II）、即ち、フェニルピルビ
ン酸又は２−オキソ−４−フェニル酪酸は遊離の形でも
塩の形でも反応系に供することができる。また、アミノ
供与体としては、例えばＬ−アスパラギン酸又はＬ−グ
ルタミン酸を好適に使用することができ、これらはオキ
ソ酸化合物（II）１モルに対して１〜３モル、とりわけ
1.3〜1.5モル使用するのが好ましい。
ン酸又は２−オキソ−４−フェニル酪酸は遊離の形でも
塩の形でも反応系に供することができる。また、アミノ
供与体としては、例えばＬ−アスパラギン酸又はＬ−グ
ルタミン酸を好適に使用することができ、これらはオキ
ソ酸化合物（II）１モルに対して１〜３モル、とりわけ
1.3〜1.5モル使用するのが好ましい。
酵素反応はトランスアミナーゼの安定性を考慮して40℃
未満で行うのが好ましいが、とりわけ28〜37℃で実施す
るのが好ましく、また、そのpHは７〜９となるよう調整
するのが好ましい。また、上記酵素反応に際しては、臭
化セチルトリメチルアンモニウム、臭化セチルピリジニ
ウム等の界面活性剤を反応液中に0.001〜0.1％程度にな
るよう添加しておくことにより酵素反応を促進させるこ
とができる。
未満で行うのが好ましいが、とりわけ28〜37℃で実施す
るのが好ましく、また、そのpHは７〜９となるよう調整
するのが好ましい。また、上記酵素反応に際しては、臭
化セチルトリメチルアンモニウム、臭化セチルピリジニ
ウム等の界面活性剤を反応液中に0.001〜0.1％程度にな
るよう添加しておくことにより酵素反応を促進させるこ
とができる。
本酵素反応は反応時間を適当に調整することにより反応
進行率を100％にまで高めることができる。
進行率を100％にまで高めることができる。
かくして反応液中に蓄積した目的アミノ酸の分離精製
は、通常のイオン交換樹脂法やその他の公知方法を単独
で、或いは組合わせて容易に行うことができる。
は、通常のイオン交換樹脂法やその他の公知方法を単独
で、或いは組合わせて容易に行うことができる。
以上の如く、本発明にかかる微生物は従来知られている
パラコッカス属微生物の有するフェニルアラニン・トラ
ンスアミナーゼ活性より格段に高いフェニルアラニン・
トランスアミナーゼ活性を有し、かかる高フェニルアラ
ニン・トランスアミナーゼ活性の微生物を用いることに
より工業的に極めて有利に目的とするＬ−アミノ酸（即
ち、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−２−アミノ−４−フェ
ニル酪酸）を製造することができる。
パラコッカス属微生物の有するフェニルアラニン・トラ
ンスアミナーゼ活性より格段に高いフェニルアラニン・
トランスアミナーゼ活性を有し、かかる高フェニルアラ
ニン・トランスアミナーゼ活性の微生物を用いることに
より工業的に極めて有利に目的とするＬ−アミノ酸（即
ち、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−２−アミノ−４−フェ
ニル酪酸）を製造することができる。
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
尚、実施例中のフェニルアラニン・トランスアミナーゼ
活性は0.2Mフェニルピルビン酸ナトリウムと0.3ML−ア
スパラギン酸（pH8.0,0.1mMピリドキサールリン酸、0.0
1％臭化セチルトリメチルアンモニウム含有）と菌体又
は菌体処理物とを接触させ、30℃で10〜30分間反応後反
応液中のＬ−フェニルアラニンを逆相クロマトグラフィ
ーによって分離後オルトフタールアルデヒドを用いて誘
導体化し、蛍光を測定することにより定量した。
活性は0.2Mフェニルピルビン酸ナトリウムと0.3ML−ア
スパラギン酸（pH8.0,0.1mMピリドキサールリン酸、0.0
1％臭化セチルトリメチルアンモニウム含有）と菌体又
は菌体処理物とを接触させ、30℃で10〜30分間反応後反
応液中のＬ−フェニルアラニンを逆相クロマトグラフィ
ーによって分離後オルトフタールアルデヒドを用いて誘
導体化し、蛍光を測定することにより定量した。
実施例１ （エシェリシア・コリPA501株の調製） （１）染色体DNAの調製 パラコッカス・デニトリフィカンスIFO 12442株を1.2l
のＬ−ブロス（ペプトン１％、酵母エキス0.5％、塩化
ナトリウム0.5％、pH7.0）に接種し、30℃で８時間振盪
培養し対数増殖期後期の菌体を遠心分離により集める。
この菌体をリゾチーム処理、ザルコシル処理して溶菌
し、フェノール処理により除蛋白したのちエタノール処
理して染色体DNAを沈澱させることにより染色体DNA7.4m
gを得る。
のＬ−ブロス（ペプトン１％、酵母エキス0.5％、塩化
ナトリウム0.5％、pH7.0）に接種し、30℃で８時間振盪
培養し対数増殖期後期の菌体を遠心分離により集める。
この菌体をリゾチーム処理、ザルコシル処理して溶菌
し、フェノール処理により除蛋白したのちエタノール処
理して染色体DNAを沈澱させることにより染色体DNA7.4m
gを得る。
（２）プラスミドDNAの調製 エシェリシア・コリK-12 HB101株にpLG339を含有させた
菌株を800mlのＬ−ブロスに接種して37℃で16時間振盪
培養した後、遠心分離して菌体を集める。次いで、該菌
体をリゾチーム処理、SDS処理により溶菌させ、最終濃
度が1Mになるように塩化ナトリウムを加えた後、100,00
0×ｇ、30分間の遠心分離する。上清を採取し、フェノ
ール−クロロホルム処理した後、エタノールを加えDNA
を遠心分離（10000×ｇ、10分間）により集める。沈澱
したDNAを10mMトリス塩酸−1mMEDTA（pH7.5）に溶解
し、塩化セシウム・エチジウムブロマイド平衡密度勾配
遠心法（200000×ｇ、16時間）によりプラスミドDNAを
分離精製する。かくしてpLG339プラスミドDNA1.0mgを得
る。
菌株を800mlのＬ−ブロスに接種して37℃で16時間振盪
培養した後、遠心分離して菌体を集める。次いで、該菌
体をリゾチーム処理、SDS処理により溶菌させ、最終濃
度が1Mになるように塩化ナトリウムを加えた後、100,00
0×ｇ、30分間の遠心分離する。上清を採取し、フェノ
ール−クロロホルム処理した後、エタノールを加えDNA
を遠心分離（10000×ｇ、10分間）により集める。沈澱
したDNAを10mMトリス塩酸−1mMEDTA（pH7.5）に溶解
し、塩化セシウム・エチジウムブロマイド平衡密度勾配
遠心法（200000×ｇ、16時間）によりプラスミドDNAを
分離精製する。かくしてpLG339プラスミドDNA1.0mgを得
る。
（３）染色体DNAのSau3AI断片の調製 上記（１）で得た染色体DNA200μｇに制限エンドヌクレ
アーゼSau3AIを通常の条件で作用させDNA鎖を部分切断
する。このDNA断片を0.7％アガロースゲル電気泳動によ
って分離し、５〜10kbの大きさの断片５μｇを得る。
アーゼSau3AIを通常の条件で作用させDNA鎖を部分切断
する。このDNA断片を0.7％アガロースゲル電気泳動によ
って分離し、５〜10kbの大きさの断片５μｇを得る。
（４）プラスミドDNAの切断 上記（２）で得たプラスミドDNA10μｇに制限エンドヌ
クレアーゼBamHIを通常の条件で作用させDNA鎖を完全に
切断し、6.2Kbの大きさの断片を得る。
クレアーゼBamHIを通常の条件で作用させDNA鎖を完全に
切断し、6.2Kbの大きさの断片を得る。
（５）ハイブリッドプラスミド（pPAP1）DNAの調製 上記（３）で得た染色体DNAのSau3AI断片２μｇ及び
（４）で得たプラスミドDNAのBamHI断片２μｇを混合し
T4ファージ由来のDNAリガーゼ３単位を通常の条件下で
作用させてDNA鎖を連結させることによりハイブリッド
プラスミド（pPAP1）DNAを得る。
（４）で得たプラスミドDNAのBamHI断片２μｇを混合し
T4ファージ由来のDNAリガーゼ３単位を通常の条件下で
作用させてDNA鎖を連結させることによりハイブリッド
プラスミド（pPAP1）DNAを得る。
（６）ハイブリッドプラスミド（pPAP142）DNAによるエ
シェリシア・コリHB101株の形質転換 （ａ）ハイブリッドプラスミド（pPAP1）DNAの調製 エシェリア・コリDG30株〔アスパラギン酸トランスアミ
ナーゼおよび芳香族アミノ酸トランスアミナーゼの欠損
株、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、130441（19
77）〕をＬ−ブロス30mlに接種し、37℃で振盪培養しそ
の対数増殖期の中期まで生育せしめた菌体を集菌する。
ついで、該菌体を氷冷した0.1M塩化マグネシウム溶液15
mlにけん濁したのち集菌し、氷冷した0.1M塩化カルシウ
ム溶液15mlにけん濁する。０℃で20分間放置したのち集
菌し、氷冷した0.1M塩化カルシウム溶液3mlにけん濁す
る。この細胞けん濁液に（５）で得たハイブリッドプラ
スミド（pPAP1）DNA溶液を加えて60分間氷冷したのち、
37℃で３分間熱処理することによって該DNAを細胞内に
とりこませる。次いで、このけん濁液にＬ−ブロス15ml
を加え37℃で２時間振盪培養した後、集菌し、生理食塩
水15mlで２度洗浄する。次いで、菌体を生理食塩水15ml
にけん濁し、該けん濁液を0.5〜1mlずつ最少寒天培地
（カナマイシン30μg/ml、Ｌ−プロリン125μg/ml、Ｌ
−ヒスチジン50μg/ml、Ｌ−アルギニン75μg/ml、Ｌ−
スレオニン50μg/ml、Ｌ−イソロイシン50μg/ml、グリ
シル−Ｌ−バリン50μg/ml、Ｌ−ロイシン50μg/ml、Ｌ
−アスパラギン酸500μg/ml、パントテン酸カルシウム2
0μg/ml、チアミンHCL10μg/ml含有）に塗布し、37℃で
２日間培養する。生じたコロニーのうち、フェニルアラ
ニン・トランスアミナーゼ活性を有するものをハイブリ
ッドプラスミド（pPAP1）DNAによる形質転換株として得
る。かくして得られた形質転換株をＬ−ブロス１に接
種し、37℃で18時間培養する。培養液を遠心分離して菌
体を集め、該菌体（湿重量20g）を（２）と同様に処理
してハイブリッドプラスミド（pPAP1）DNA0.1mgを得
る。
シェリシア・コリHB101株の形質転換 （ａ）ハイブリッドプラスミド（pPAP1）DNAの調製 エシェリア・コリDG30株〔アスパラギン酸トランスアミ
ナーゼおよび芳香族アミノ酸トランスアミナーゼの欠損
株、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、130441（19
77）〕をＬ−ブロス30mlに接種し、37℃で振盪培養しそ
の対数増殖期の中期まで生育せしめた菌体を集菌する。
ついで、該菌体を氷冷した0.1M塩化マグネシウム溶液15
mlにけん濁したのち集菌し、氷冷した0.1M塩化カルシウ
ム溶液15mlにけん濁する。０℃で20分間放置したのち集
菌し、氷冷した0.1M塩化カルシウム溶液3mlにけん濁す
る。この細胞けん濁液に（５）で得たハイブリッドプラ
スミド（pPAP1）DNA溶液を加えて60分間氷冷したのち、
37℃で３分間熱処理することによって該DNAを細胞内に
とりこませる。次いで、このけん濁液にＬ−ブロス15ml
を加え37℃で２時間振盪培養した後、集菌し、生理食塩
水15mlで２度洗浄する。次いで、菌体を生理食塩水15ml
にけん濁し、該けん濁液を0.5〜1mlずつ最少寒天培地
（カナマイシン30μg/ml、Ｌ−プロリン125μg/ml、Ｌ
−ヒスチジン50μg/ml、Ｌ−アルギニン75μg/ml、Ｌ−
スレオニン50μg/ml、Ｌ−イソロイシン50μg/ml、グリ
シル−Ｌ−バリン50μg/ml、Ｌ−ロイシン50μg/ml、Ｌ
−アスパラギン酸500μg/ml、パントテン酸カルシウム2
0μg/ml、チアミンHCL10μg/ml含有）に塗布し、37℃で
２日間培養する。生じたコロニーのうち、フェニルアラ
ニン・トランスアミナーゼ活性を有するものをハイブリ
ッドプラスミド（pPAP1）DNAによる形質転換株として得
る。かくして得られた形質転換株をＬ−ブロス１に接
種し、37℃で18時間培養する。培養液を遠心分離して菌
体を集め、該菌体（湿重量20g）を（２）と同様に処理
してハイブリッドプラスミド（pPAP1）DNA0.1mgを得
る。
（ｂ）ハイブリッドプラスミド（pPAP142）DNAの調製及
びエシェリシア・コリHB101株の形質転換 エシェリシア・コリK-12 JM105株にpUC18プラスミドを
含有させた菌株をＬ−ブロス１で培養したのち（２）
と同様にして0.8mgのpUC18プラスミドDNAを得る。該DNA
1μｇに制限エンドヌクレアーゼSma IとSalIを、またハ
イブリッドプラスミド（pPAP1）DNA1μｇに制限エンド
ヌクレアーゼEcoRVとSalIを通常の条件で作用させてプ
ラスミドDNAを切断し65℃、10分間の熱処理後、両反応
液を混合しT4DNAリガーゼ２単位を通常の条件下で作用
させてDNAを連結させることによりハイブリッドプラス
ミド（pPAP142）DNAを得る。このDNA溶液でエシェリシ
ア・コリHB101株を（６）‐（ａ）のエシェリシア・コ
リDG30株の形質転換と同様の条件で形質転換し、アンピ
シリン100μg/mlを含むＬ−ブロス寒天培地を用いて生
育する菌株を採取する。かくしてフェニルアラニン・ト
ランスアミナーゼの遺伝子を有するハイブリッドプラス
ミド（pPAP142）を含み高フェニルアラニン・トランス
アミナーゼ活性を有する形質転換株エシェリシア・コリ
PA501株を得る。
びエシェリシア・コリHB101株の形質転換 エシェリシア・コリK-12 JM105株にpUC18プラスミドを
含有させた菌株をＬ−ブロス１で培養したのち（２）
と同様にして0.8mgのpUC18プラスミドDNAを得る。該DNA
1μｇに制限エンドヌクレアーゼSma IとSalIを、またハ
イブリッドプラスミド（pPAP1）DNA1μｇに制限エンド
ヌクレアーゼEcoRVとSalIを通常の条件で作用させてプ
ラスミドDNAを切断し65℃、10分間の熱処理後、両反応
液を混合しT4DNAリガーゼ２単位を通常の条件下で作用
させてDNAを連結させることによりハイブリッドプラス
ミド（pPAP142）DNAを得る。このDNA溶液でエシェリシ
ア・コリHB101株を（６）‐（ａ）のエシェリシア・コ
リDG30株の形質転換と同様の条件で形質転換し、アンピ
シリン100μg/mlを含むＬ−ブロス寒天培地を用いて生
育する菌株を採取する。かくしてフェニルアラニン・ト
ランスアミナーゼの遺伝子を有するハイブリッドプラス
ミド（pPAP142）を含み高フェニルアラニン・トランス
アミナーゼ活性を有する形質転換株エシェリシア・コリ
PA501株を得る。
上記で得られたエシェリシア・コリPA501株とパラコッ
カス・デニトリフィカンスIFO 12442株のフェニルアラ
ニン・トランスアミナーゼ活性を測定した。その結果は
下記第１表に示す通りである。
カス・デニトリフィカンスIFO 12442株のフェニルアラ
ニン・トランスアミナーゼ活性を測定した。その結果は
下記第１表に示す通りである。
上記第１表から本発明の微生物エシェリシア・コリPA50
1株はパラコッカス・デニトリフィカンスIFO 12442株に
比べ約８倍のフェニルアラニン・トランスアミナーゼ活
性を有することが明らかである。
1株はパラコッカス・デニトリフィカンスIFO 12442株に
比べ約８倍のフェニルアラニン・トランスアミナーゼ活
性を有することが明らかである。
実施例２ （Ｌ−フェニルアラニンの製造） 乳糖１％、ブドウ糖0.02％、Ｌ−グルタミン酸ナトリウ
ム0.5％、コーンスチープリカー２％、ミーストN2％リ
ン酸第１カリウム0.3％、リン酸第２カリウム0.7％、硫
酸アンモニウム0.1％、硫酸マグネシウム・７水和物0.0
25％、カラリン0.03％、アンピシリン200μg/mlを含む
培地（pH7.0）500mlにエシェリシア・コリPA501株を植
菌し、37℃で20時間培養する。集菌洗浄後、菌体を2.5l
の水にけん濁しフェニルピルビン酸ナトリウム408.6g、
Ｌ−アスパラギン酸346.7gおよび臭化セチルトリメチル
アンモニウム250mgを添加後、アンモニウム水でpH8.0と
して、更に30℃で72時間静置して酵素反応を行う。反応
液に水5l、酢酸320ml、活性炭100gを添加後、濾過、濃
縮し、析出晶を濾過することによりＬ−フェニルアラニ
ンの粗結晶259.8gを得る。次いで該粗結晶を水から再結
晶することによりＬ−フェニルアラニン213.4gを得る。
ム0.5％、コーンスチープリカー２％、ミーストN2％リ
ン酸第１カリウム0.3％、リン酸第２カリウム0.7％、硫
酸アンモニウム0.1％、硫酸マグネシウム・７水和物0.0
25％、カラリン0.03％、アンピシリン200μg/mlを含む
培地（pH7.0）500mlにエシェリシア・コリPA501株を植
菌し、37℃で20時間培養する。集菌洗浄後、菌体を2.5l
の水にけん濁しフェニルピルビン酸ナトリウム408.6g、
Ｌ−アスパラギン酸346.7gおよび臭化セチルトリメチル
アンモニウム250mgを添加後、アンモニウム水でpH8.0と
して、更に30℃で72時間静置して酵素反応を行う。反応
液に水5l、酢酸320ml、活性炭100gを添加後、濾過、濃
縮し、析出晶を濾過することによりＬ−フェニルアラニ
ンの粗結晶259.8gを得る。次いで該粗結晶を水から再結
晶することによりＬ−フェニルアラニン213.4gを得る。
実施例３ （Ｌ−２−アミノ−４−フェニル酪酸の製造） 乳糖１％、ブドウ糖0.2％、Ｌ−グルタミン酸ナトリウ
ム0.5％、コーンスチープリカー２％、ミーストN2％リ
ン酸第１カリウム0.3％、リン酸第２カリウム0.7％、硫
酸アンモニウム0.1％、硫酸マグネシウム・７水和物0.0
25％、カラリン0.03％、アンピシリン200μg/mlを含む
培地（pH7.0）１にエシェリシア・コリPA501株を植菌
し、37℃で20時間培養する。この培養液に２−オキソ−
４−フェニル酪酸400g、Ｌ−グルタミン酸320gおよび臭
化セチルトリメチルアンモニウム250mgを添加後、アン
モニウム水でpH8.0として、更に30℃で48時間静置して
酵素反応を行う。反応液に水5l、酢酸320ml、活性炭100
gを添加後、濾過、濃縮し、析出晶を濾過することによ
りＬ−２−アミノ−４−フェニル酪酸の粗結晶320gを得
る。
ム0.5％、コーンスチープリカー２％、ミーストN2％リ
ン酸第１カリウム0.3％、リン酸第２カリウム0.7％、硫
酸アンモニウム0.1％、硫酸マグネシウム・７水和物0.0
25％、カラリン0.03％、アンピシリン200μg/mlを含む
培地（pH7.0）１にエシェリシア・コリPA501株を植菌
し、37℃で20時間培養する。この培養液に２−オキソ−
４−フェニル酪酸400g、Ｌ−グルタミン酸320gおよび臭
化セチルトリメチルアンモニウム250mgを添加後、アン
モニウム水でpH8.0として、更に30℃で48時間静置して
酵素反応を行う。反応液に水5l、酢酸320ml、活性炭100
gを添加後、濾過、濃縮し、析出晶を濾過することによ
りＬ−２−アミノ−４−フェニル酪酸の粗結晶320gを得
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ 2121−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:01）
Claims (1)
- 【請求項１】パラコッカス・デニトリフィカンスの染色
体由来のDNAを制限酵素Sau3AIで消化して得られるフェ
ニルアラニン・トランスアミナーゼの遺伝情報を担うデ
オキシリボ核酸をプラスミドpLG339の制限酵素BamHI切
断部位に組み込んでなるものであって、アスパラギン酸
トランスアミナーゼ及び芳香族アミノ酸トランスアミナ
ーゼの同時欠損変異を有し該変異にもとづいてフェニル
アラニン要求性を示すエシェリシア・コリに含有せしめ
た場合に、該フェニルアラニン要求性を相補し得るハイ
ブリッドプラスミドか、あるいは、該ハイブリッドプラ
スミドを更に制限酵素EcoRVおよびSalIで消化して得ら
れるフェニルアラニン・トランスアミナーゼの遺伝情報
を担うデオキシリボ核酸をプラスミドpUC18の制限酵素S
maIおよびSalI切断部位に組み込んでなるハイブリッド
プラスミドをエシェリシア・コリに含有せしめた微生
物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62313505A JPH0787778B2 (ja) | 1987-12-10 | 1987-12-10 | 新規微生物及びそれを用いるｌ−アミノ酸の製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62313505A JPH0787778B2 (ja) | 1987-12-10 | 1987-12-10 | 新規微生物及びそれを用いるｌ−アミノ酸の製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01153084A JPH01153084A (ja) | 1989-06-15 |
| JPH0787778B2 true JPH0787778B2 (ja) | 1995-09-27 |
Family
ID=18042117
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62313505A Expired - Lifetime JPH0787778B2 (ja) | 1987-12-10 | 1987-12-10 | 新規微生物及びそれを用いるｌ−アミノ酸の製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0787778B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5169780A (en) * | 1989-06-22 | 1992-12-08 | Celgene Corporation | Enantiomeric enrichment and stereoselective synthesis of chiral amines |
| EP1818411A1 (en) | 2006-02-13 | 2007-08-15 | Lonza AG | Process for the preparation of optically active chiral amines |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60156394A (ja) * | 1984-01-26 | 1985-08-16 | Tanabe Seiyaku Co Ltd | Ｌ−２−アミノ−４−フエニル酪酸の製法 |
-
1987
- 1987-12-10 JP JP62313505A patent/JPH0787778B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60156394A (ja) * | 1984-01-26 | 1985-08-16 | Tanabe Seiyaku Co Ltd | Ｌ−２−アミノ−４−フエニル酪酸の製法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01153084A (ja) | 1989-06-15 |
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