JPH01153084A - 新規微生物及びそれを用いるｌ−アミノ酸の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は高フェニルアラニン・トランスアミナーゼ活性
を有する新規微生物及び当該微生物を用いる一般式 （但し、ｎは１又は２を表す。） で示されるし一アミノ酸の製法に関する。

（従来技術） 従来、バラコンカス・デニトリフィカンスがフェニルア
ラニン・トランスアミナーゼ活性を有しテオリ、この微
生物を用いてフェニルピルビン酸とＬ−アスパラギン酸
からし一フェニルアラニンを〔アプライド・バイオケミ
ストリー・アンド・バイオテクノロジー、旦、３６７、
（１９８５）　）　、また、２−オキソ−４−フェニル
酪酸とＬ−アスパラギン酸もしくはＬ−グルタミン酸か
らＬ−２−アミノ−４−フェニル酪酸を酵素的に製造す
る方法が知られている〔特開昭６０−１５６３９４号〕
。しかしながら、上記方法で用いられているパラコッカ
ス・デニトリフィカンスのフェニルアラニン・トランス
アミナーゼ活性は工業的に充分満足し得るほど高いとは
いえないという問題点があった。

（発明の構成及び効果） かかる状況に鑑み、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果
、パラコッカス属に属する微生物の有するフェニルアラ
ニン・トランスアミナーゼ活性を司る染色体フラグメン
トを切り出し、これをプラスミドに組み込んで得られる
ハイブリッドプラスミドをエシェリシア属微生物に移入
することにより、パラコッカス属に属する微生物に比し
て極めて高いフェニルアラニン・トランスアミナーゼ活
性を有する微生物を調製することに成功すると共に、か
くして得られる微生物を用いれば一般式（ｒ）で示され
るＬ−アミノ酸を効率良く製造しうろことを見出し本発
明を完成するに至った。

即ち、本発明はパラコッカス属に属する微生物から採取
したフェニルアラニン・トランスアミナーゼの遺伝情報
を担うデオキシリボ核酸をプラスミドに組み込んだハイ
ブリッドプラスミドをエシェリシア属に属する微生物に
含有せしめた微生物及び該微生物菌体、その培養物もし
くは該菌体の　−処理物を、アミノ供与体の存在下に、
−最大（但し、ｎは１又は２を表す。） で示されるオキソ酸化合物又はその塩に作用させること
からなる前記−最大（１）で示されるし一アミノ酸の製
法に関する。

〔本発明微生物の調製法〕

（染色体ＤＮＡの調製） 本発明においてフェニルアラニン・トランスアミナーゼ
の遺伝情報を担うデオキシリボ核酸（以下、染色体ＤＮ
Ａと称する）の供給源となる微生物としては、パラコッ
カス属に属しフェニルアラニン・トランスアミナーゼ活
性を有するものであればいかなる微生物であってもよく
、例えば、パラコッカス・デニトリフィカンスＩＰ０１
２４４２等を用いることができる。

上記の如き微生物から採取される染色体ＤＮＡを組み込
むプラスミドとしてはエシェリシア属に属する微生物中
において複製可能なプラスミドであれば特に限定されな
いが例えばｐＬＧ３３９　Ｃジーン、１８．３３５．（
１９Ｂ２）、ＡＴＣＣ３７１３１）　、ｐＵＣ１８　（
ジーン、韮１０３（１９８５）、ＡＴＣＣ３７２５３）
等を用いることができる。

また、染色体ＤＮＡをプラスミドに組み込んだハイブリ
ッドプラスミドを含有せしめる宿主としてはエシェリシ
ア属に属し形質転換可能な微生物であればよく、例えば
エシェリシア・コリＨ８１０１株〔ジャーナル・オブ・
モレキユラー・バイオロジー、４１．４５９（１９６９
）、ＡＴＣＣ３３６９４）　、エシェリシア・コリＪＭ
１０５株〔蛋白質・核酸・酵素、旦２９４　（１９８１
）　）を好適に用いることができる。

本発明に係る微生物を調製するに際しては、まずフェニ
ルアラニン・トランスアミナーゼ活性を有するパラコッ
カス属に属する微生物より染色体ＤＮＡを採取する。染
色体ＤＮＡの採取は前記した如きパラコッカス属に属す
る微生物の菌体をリゾチーム処理、界面活性剤（ＳＤＳ
、ザルコシル（Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム
）等〕で処理した後、除蛋白し、次いでエタノール沈澱
せしめる常法〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイ
オロジー、ユ、２０８．　（１９６１）　、ビオキミヵ
・ビオフィジ力・アクタ、７２．６１９（１９６３））
により容易に実施できる。

（ハイブリッドプラスミドの調製） かくして得られた染色体ＤＮＡとプラスミドとの連結は
、制限エンドヌクレアーゼ（例えば、５ａｕ３ＡＩ、　
ＢａｍＨＩ、　Ｈｉｎｄ　ｍ、　５ａｌＩ＋　ＥｃｏＲ
Ｖ、　ＥｃｏＲＩ等）を用いて染色体及びプラスミドの
ＤＮＡ鎖を切断した後、リガーゼ（例えば、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼ、大腸菌ＤＮＡリガーゼ等）で処理するが、或
いはその切断末端によってはターミナルトランスフェラ
ーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ等で処理して平滑末端化した
後、リガーゼを作用させてＤＮＡ鎖を結合する等の常法
〔メソソズ・イン・エンザイモロジー、旦４Ｈ１９７９
）　、遺伝子操作実験法、１３５頁（高木康敬著、講談
社すイエンティフィク（１９８０））　）により実施す
ることができる。

（形質転換株の調製） ハイブリッドプラスミドによる形質転換方法は、例えば
低温下で塩化カルシウム含有溶液で宿主微生物細胞を処
理して菌膜の透過性を増大させ、ハイブリッドプラスミ
ドＤＮＡを宿主微生物中にとり込ませる方法〔ジャーナ
゛ル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、皿、　１５
９（１９７０）　、ジャーナ７Ｌ／　・、ｔブ・ハタテ
リオロジー、１１９．１０７２（１９７４）　）等を採
用することができる。

かくして得られた形質転換株のうち、フェニルアラニン
・トランスアミナーゼの遺伝情報を担うハイブリッドプ
ラスミドが移入された菌株の選択はフェニルアラニン・
トランスアミナーゼ活性が上昇した菌株を釣り菌・分離
することにより実施　　　゛できる。また、形質転換に
際しハイブリッドプラスミドを各種の変異を有する変異
株に移入して目的とするハイブリッドプラスミドを予め
選択することもできる。かかる選択に利用し得る変異株
としては、例えばエシェリシア属に属する微生物であっ
てアスパラギン酸トランスアミナーゼ及び芳香族アミノ
酸トランスアミナーゼの同時欠損株があげられ、目的と
するハイブリッドプラスミドを含有する菌株はＬ−フェ
ニルアラニンの、要求性が相補される菌株として選択で
きる。

かくすることにより本発明に係る微生物、即ち、パラコ
ッカス属に属する微生物から採取したフェニルアラニン
・トランスアミナーゼの遺伝情報を担うデオキシリボ核
酸をプラスミドに組み込んだハイブリッドプラスミドを
エシェリシア属に属する微生物に含有せしめた微生物を
得ることができる。

か（して得られる微生物の具体例としては、例えばエシ
ェリシア・コリＰＡ５０１株があげられる。

この微生物は、パラコッカス・デニトリフィカンスに比
べて約８倍高いフェニルアラニン・トランスアミナーゼ
活性を有する。

〔Ｌ−フェニルアラニンおよびＬ−２−アミノ−４−フ
ェニル酪酸の製造〕 本発明に係る微生物は前記の如（パラコッカス属に属す
る微生物に比べて顕著に優れたフェニルアラニン・トラ
ンスアミナーゼ活性を有しているので、該微生物の培養
液、該培養液から採取した菌体もしくは該菌体の処理物
をアミノ供与体の存在下にオキソ酸化合物（■）（即ち
、フェニルピルビン酸又は２−オキソ−４−フェニル酪
酸）に作用させることによりＬ−アミノ酸（１）（即ち
、Ｌ−フェニルアラニン又はＬ−２−アミノ−４−フェ
ニル酪酸）を効率良く製造することができる。

本発明に係る微生物を培養する社際しては炭素源、窒素
源、有機栄養源、無機塩類などを含む通常の栄養培地が
使用できる。　培養は常法により行うことができ、例え
ば培地のｐＨを５．０〜９．０に調整し、微生物を接種
したのち、１０〜４５℃、好ましくは２８〜３７℃で好
気的に培養すればよい。

酵素反応に際しては、上記の如くして得られる培養液の
他に該培養液から採取した菌体、該菌体の処理物をも用
いることができ、ここに菌体の処理物としては、例えば
洗浄菌体、乾燥菌体、菌体磨砕物、菌体の自己消化物、
菌体の超音波処理物、菌体抽出物があげられる。

基質たるオキソ酸化合物（■）、即ち、フェニルピルビ
ン酸又は２−オキソ−４−フェニル酪酸は遊離の形でも
塩の形でも反応系に供することができる。また、アミノ
供与体としては、例えばＬ−アスパラギン酸又はＬ−グ
ルタミン酸を好適に使用するとかでき、これらはオキソ
酸化合物（■）１モルに対して１〜３モル、とりわけ１
．３〜１．５モル使用するのが好ましい。

酵素反応はトランスアミナーゼの安定性を考慮して４０
℃未満で行うのが好ましいが、とりわけ２８〜３７℃で
実施するのが好ましく、また、そのｐｉは７〜９となる
よう調整するのが好ましい。

また、上記酵素反応に際しては、臭化セチルトリメチル
アンモニウム、臭化セチルピリジニウム等の平面活性剤
を反応液中に０．００１−０．１％程度になるよう添加
してお（ことにより酵素反応を促進させることができる
。

本酵素反応は反応時間を適当に調整することにより反応
進行率を１００％にまで高めることができる。

かくして反応液中に蓄積した目的アミノ酸の分離精製は
、通常のイオン交換樹脂法やその他の公知方法を単独で
、或いは組合わせて容易に行うことができる。

以上の如く、本発明にかかる微生物は従来知られている
パラコッカス属微生物の有するフェニルアラニン・トラ
ンスアミナーゼ活性より格段に高いフェニルアラニン・
トランスアミナーゼ活性を有し、かかる高フェニルアラ
ニン・トランスアミナーゼ活性の微生物を用いることに
より工業的に極めて有利に目的とするＬ−アミノ酸（即
ち、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−２−アミノ−４−フェ
ニル酪酸）を製造することができる。

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。

尚、実施例中のフェニルアラニン・トランスアミナーゼ
活性は０．２Ｍフェニルピルビン酸す）　ＩＪウムと０
．３Ｍ　Ｌ−アスパラギン酸（ｐＨ８，０，０，１ａ＋
Ｍピリドキサールリン酸、０．０１χ臭化セチルトリメ
チルアンモニウム含有）と菌体又は菌体処理物とを接触
させ、３０℃で１０〜３０分間反応後反応液中のし一フ
ェニルアラニンを逆相クロマトグラフィーによって分離
後オルトフタールアルデヒドを用いて誘導体化し、蛍光
を測定することにより定量した。

実施例　１ （エシェリシア・コリＰＡ５０１株の調製）（１）　　
色　ＤＮＡの音　櫨 パラコツカス・デニトリフィカンスＩＰ０１２４４２株
を１．２２のＬ−プロス（ペプトン１χ、酵母エキス０
．５χ、塩化ナトリウム０．５χ、ＰＨ７，０）に接種
し、３０℃で８時間振盪培養し対数増殖期後期の菌体を
遠心分離により集める。この菌体をリゾチーム処理、ザ
ルコシル処理して溶菌し、フェノール処理により除蛋白
したのちエタノール処理して染色体ＤＮＡを沈澱させる
ことにより染色体ＤＮＡ７．４ｍｇを得る。

（２）ブースミドＤＮＡのｆ′ エシェリシア・コリに−１２１８１０１株にｐＬＧ３３
９を含有させた菌株を８００ｄのし一プロスに接種して
３７℃で１６時間振盪培養した後、遠心分離して菌体を
集める。次いで、該菌体を′リゾチーム処理、ＳＤＳ処
理により溶菌させ、最終濃度がＩＭになるように塩化ナ
トリウムを加えた後、１００．０００　Ｘｇ　、　３０
分間の遠心分離する。上清を採取し、フェノール−クロ
ロホルム処理した後、エタノールを加えＤＮＡを遠心分
離（１ｏｏｏｏｘ　ｇ、１０分間）により集める。沈澱
したＤＮＡを１０ｍＭ　）リス塩酸−１ｄＥＤＴＡ　（
ｐＨ７，５）に溶解し、塩化セシウム・エチジウムブロ
マイド平衡密度勾配遠心法（２０００００ｘ　ｇ、１６
時間）によりプラスミドＤＮＡを分離精製する。かくし
てｐＬＧ３３９プラスミドＤＮＡ１．Ｏａ＋ｇを得る。

（３）”　　　ＤＮＡの５ａｕ３Ａ１　　　の礼上記（
１）で得た染色体ＤＮＡ２００μｇに制限エンドヌクレ
アーゼ５ａｕ３ＡＩを通常の条件で作用させＤＮＡ鎖を
部分切断する。このＤＮＡ断片を０．７χアガロースゲ
ル電気泳動によって分離し、５〜１０ｋｂの大きさの断
片５μｇを得る。

（４）ブースミドＤＮＡの 上記（２）で得たプラスミドＤＮＡｌ０μｇに制限エン
ドヌクレアーゼＢａｍＨＩを通常の条件で作用させＤＮ
Ａ鎖を完全に切断し、６．２Ｋｂの大きさの断片を得る
。

上記（３）で得た染色体ＤＮＡの５ａｕ３ＡＩ断片２μ
ｇ及び（４）で得たプラスミドＤＮＡのＢａ＋ｗ旧断片
２μｇを混合しＴ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼ３単
位を通常の条件下で作用させてＤＮＡ鎖を連結させるこ
とによりハイブリッドプラスミド（ｐＰＡＰｌ）　ＤＮ
Ａを得る。

エシェリシア・コリＤＧ３０株〔アスパラギン酸トラン
スアミナーゼおよび芳香族アミノ酸トランスアミナーゼ
の欠損株、ジャーナル・オブ・バクテＩＪ　、ｔ　Ｏシ
ー、１３０　４４１（１９７７））をＬ−ブロス３０１
ｄに接種し、３７℃で振盪培養しその対数増殖期の中期
まで生育せしめた菌体を集菌する。ついで、該菌体を氷
冷した０、１Ｍ塩化マグネシウム溶液１５Ｍ１にけん濁
したのち集菌し、氷冷した０、　１Ｍ塩化カルシウム溶
液１５ａ１にけん濁する。０℃で２０分間放置したのち
集菌し、氷冷した０、　１Ｍ塩化カルシウム溶液３−に
けん濁する。この細胞けん濁液に（５）で得たハイブリ
ッドプラスミド（ｐＰＡＰＩ）　ＤＮＡ溶液を加えて６
０分間氷冷したのち、３７℃で３分間熱処理することに
よって該ＤＮＡを細胞内にとりこませる。次いで、この
けん濁液にＬ−ブロス１５−を加え３７℃で２時間振盪
培養した後、集菌し、生理食塩水１５−で２度洗浄する
。次いで、菌体を生理食塩水１５Ｍ１にけん濁し、該け
ん濁液を０．５〜１−ずつ最少寒天培地（カナマイシン
３０μｇ／−含有）に塗布し、３７℃で２日間培養する
。生じたコロニーのうち、フェニルアラニン・トランス
アミナーゼ活性を有するものをハイブリッドプラスミド
（ｐＰＡＰＩ）　ＤＮＡによる形質転換株として得る。

かくして得られた形質転換株をＬ−ブロス１１に接種し
、３７℃で１８時間培養する。培養液を遠心分離して菌
体を集め、該菌体（湿重量２０ｇ）を（２）と同様に処
理してハイブリッドプラスミド（ｐＰＡＰＩ）ＤＮＡ０
．１ｍｇを得る。

エシェリシア・コリに−１２Ｊ？１１０５株にｐＵＣ１
Ｂプラスミドを含有させた菌株をＬ−ブロスＢで培養し
たのち（２）と同様にして０．８■ｇのｐＵＣ１８プラ
スミドＤＮＡを得る。該ＤＮＡ１μｇに制限エンドヌク
レアーゼＳｅａ　Ｉと５ａｌＩを、またハイブリッドプ
ラスミド（ｐｐＡｐｌ）　ＤＮＡ　１μｇ５に制限エン
ドヌクレアーゼｔ！ｃｏＲＶと５ａｌｌを通常の条件で
作用させてプラスミドＤＮＡを切断し６５℃、１０分間
の熱処理後、両反応液を混合しＴ４ＤＮＡリガーゼ２単
位を通常の条件下で作用させてＤＮＡを連結させること
によりハイブリッドプラスミド（ｐ　ＰＡＰＩ４２）Ｄ
ＮＡを得る。このＤＮＡ溶液でエシェリシア・３９０８
１０１株を（６）−（ａ）のエシェリシア・コリＤＧ３
０株の形質転換と同様の条件で形質転換し、アンピシリ
ン１００μｇ／−を含むし一ブロス寒天培地を用いて生
育する菌株を採取する。かくしてフェニルアラニン・ト
ランスアミナーゼの遺伝子を有するハイブリッドプラス
ミド（ｐＰＡＰ１４２）を含み高フェニルアラニン・ト
ランスアミナーゼ活性を有する形質転換株エシェリシア
・コリＰＡ５０１株を得る。

上記で得られたエシェリシア・コリＰ＾５０１株とパラ
コツカス・デニトリフィカンスＩＰＯ１２４４２株のフ
ェニルアラニン・トランスアミナーゼ活性を測定した。

その結果は下記第１表に示す通りであ＊）フェニルアラ
ニン量として表示した。

上記第１表から本発明の微生物エシェリシア・コリＰ＾
５０１株はパラコッカス・デニトリフィカンスＩＰ０１
２４４２株に比べ約８倍のフェニルアラニン・トランス
アミナーゼ活性を有することが明らかである。

実施例２ （Ｌ−フェニルアラニンの製造） 乳Ｉ！１χ、ブドウ＄１０．０２χ、Ｌ−グルタミン酸
ナトリウム０．５χ、コーンスチープリカ−２χ、ミー
ス）Ｎ２χリン酸第１カリウム０．３χ、リン酸第２カ
リウム０．７χ、硫酸アンモニウム０．１χ、硫酸マグ
ネシウム・７水和物０．０２５χ、カラリン０．０３χ
、アンピシリン２００μｇ／−を含む培地（ｐＨ７，０
）５００−にエシェリシア・コリＰ＾５０１株を植菌し
、３７℃で２０時間培養する。集菌洗浄後、菌体を２．
５１の水にけん濁しフェニルピルビン酸ナトリウム４０
８．６ｇ、　Ｌ−アスパラギン酸３４６．７ｇおよび臭
化セチルトリメチルアンモニウム２５０ｍｇを添加後、
アンモニウム水でｐｕｅ、ｏとして、更に３０℃で７２
時間静置して酵素反応を行う。反応液に水５１、酢酸３
２０ｉ、活性炭１００ｇを添加後、濾過、濃縮し、析出
晶を濾過することによりＬ−フェニルアラニンの粗結晶
２５９．８ｇを得る。次いで該粗結晶を水から再結晶す
ることによりＬ−フェニルアラニン２１３．４ｇを得る
。

実施例３ （Ｌ−２−アミノ−４−フェニル酪酸の製造）乳Ｉ！ｌ
χ、ブドウ糖０．２χ、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム０
．５χ、コーンスチープリカ−２χ、ミーストＮ２χリ
ン酸第１カリウム０．３χ、リン酸第２カリウム０．７
χ、硫酸アンモニウム０．１χ、硫酸マグネシウム・７
水和物０．０２５χ、カラリン０．０３χ、アンピシリ
ン２００μｇ／ｄを含む培地（ｐＨ７，０）１１にエシ
ェリシア・コリＰＡ５０１株を植菌し、３７℃で２０時
間培養する。この培養液に２−オキソ−４−フェニル酪
酸４００ｇ５Ｌ−グルタミン酸３２０ｇおよび臭化セチ
ルトリメチルアンモニウム２５０１ｍｇを添加後、アン
モニウム水でｐｔｔｓ、ｏとして、更に３０℃で４８時
間静置して酵素反応を行う。反応液に水５１酢酸３２０
−１活性炭１００ｇを添加後、濾過、濃縮し、析出晶を
濾過することによりＬ−２−アミノ−４−フェニル酪酸
の粗結晶３２０ｇを得る。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）パラコッカス属に属する微生物から採取したフェ
   ニルアラニン・トランスアミナーゼの遺伝情報を担うデ
   オキシリボ核酸をプラスミドに組み込んだハイブリッド
   プラスミドをエシェリシア属に属する微生物に含有せし
   めた微生物。
2. （２）プラスミドがｐＬＧ３３９である特許請求の範囲
   第１項記載の微生物。
3. （３）プラスミドがｐＵＣ１８である特許請求の範囲第
   １項記載の微生物。
4. （４）パラコッカス属に属する微生物から採取したフェ
   ニルアラニン・トランスアミナーゼの遺伝情報を担うデ
   オキシリボ核酸をプラスミドに組み込んだハイブリッド
   プラスミドをエシェリシア属に属する微生物に含有せし
   めた微生物菌体、その培養物もしくは該菌体の処理物を
   、アミノ供与体の存在下に、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼（II） （但し、ｎは１又は２を表す。） で示されるオキソ酸化合物又はその塩に作用させること
   を特徴とする一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （但し、ｎは前記と同一意味を有する。） で示されるＬ−アミノ酸の製法。
5. （５）アミノ供与体がＬ−アスパラギン酸又はＬ−グル
   タミン酸である特許請求の範囲第４項記載の製法。