JPS60133883A - 新規微生物及びそれを用いるｌ−アスパラギン酸の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はＬ−アスパラギン酸の製法に関し、更に詳しく
は高アスパルターゼ活性を符するニジエリシア＠に属す
る微生物を用いてＬ−アスパラキン酸を製造する方法に
関する。 従来、ニジエリシア・コリがアスパルターセ活性を有し
ており、この微生物を用いて７マール酸アンモニウム（
又はフマール酸とγノモニウム塩Ｊカ）らＬ−アスパラ
ギン１拶を酵素的に製造する方法が知られているＣ　Ｂ
ｕ、Ｌｌ、Ａｇｒ、　Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ。 Ｊａｐａｎ、　２４１．２９６　（１９６０）　、Ａｐ
ｐｌ、　Ｍｉｃｏｂｉｏｌ、、２７，８８６＋１９７４
）、特公昭５４−１２５５３号、特公昭５７−１８８６
７号」。しかしながら上記方法で用いられているエシエ
リシア・コリのアスパルターゼ活性は工業的に充分調定
し得るほど高いとは云えないという問題があった。加え
てアスパルターゼ活性を仔するニジエリシア・」りがグ
ルコースの如・き資比さγしやすい炭素源の存在下ＶＣ
おいては他の炭素源利用に関与する酵素の生成が抑制さ
れるという、所謂カタボライト抑制をうけることＣＢｉ
ｏｃｈｅｍ、Ｊ、　、　３６−６１９　（１９４２）　
Ｊからニジエリシア・コリを培養するに際しグルコース
等の資化されやすい炭素源を培地に加えるとアスパルタ
ーゼ活性が充分に上昇せず、従ってＬ−アスパラギン酸
の生成」が減少するという問題もあった。 Ｄ）かる状況に鑑み本究明者らは税、α研究を重ねた結
果、エシヱ１１シア属に４し、アスパルターゼ活性をイ
ーする親株に較べて極めて高い゛ｒスパルタタ 一ゼ活曲を有し、１Ｊ）つ刀ニボライト抑制をうけない
新規微生物の取得に成功すると共に、該微生物を用いる
ことにより工業的に珂利ｆｌ　Ｌ−アスパラギン酸の裂
Ｇ法を確立するに至った。 即ち１本発明はエソエリシア属に属する微生物から採取
したアスパルターゼの遺伝情報を担うデオキシリボ核酸
とベクタープラスミドとからなるハイブリッドプラスミ
ドを、ニジエリシア属微生物から誘導さｎ、かっＬ−ア
スパラギン酸を唯一の窒素源参弗会箒とする培地で良好
に生育する高アスパルターゼ活性を有する変異株に含有
せしめた微生物及び該微生物菌体、その培養物もしくは
該菌体の処理物をフマール酸とアンモニアに作用させる
ことを特徴とするＬ−アスパラギン酸の製法である。 〔本発明微生物の調製」 （染色体ＤＮＡの調製〕 本発明においてアスパルターゼの遺伝情報を担うデオキ
シリボ核酸（以下・染色体ＤＮＡと称する）の供給源と
なる微生物としてはニジエリシア属に属しアスパルター
ゼ活性を有するものであればいかなる微生物であっても
よく０例えばニジエリシア・コリに−１２ＭＭ２９４（
ＡＴ　ＣＣ３３６２５）、ｘシｘ＋ＪシＴ−コリに一１
２０６００ｒ−ｍ−（ＡＴＣＣ３３５２５）　、ニジエ
リシア・コリ（ＡＴＣＣ］１３０３）等を好適に用いる
ことができる。こｎらの微生物から染色体ＤＮＡを採取
する方法としては例えば微生物の菌体をリゾチーム処理
、界面活性剤［：ＳＤＳ、ザルコシル（Ｎ−ラウロイル
サルコシン酸ナトリウム）等」で処理したのち、除蛋白
しついでエタノール沈殿せしめる常法［Ｊ、Ｍｏｌ、　
Ｂｉｏｌ、　、　３，２０８１（１９６］　１　、　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、’Ａｃｔａ、　、　
７２．６１９　（生物中において瑛製可能なプラスミド
であれば特に限定されないが例えはＰ　ＳＣｌ　Ｏ１Ｃ
Ｐｒｏｃ。 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　＝　７０，
３２４０　（１９７３）Ｊもしくはｐ　ＢＨ３２２［Ｇ
ｅｎｅｏ、　２　、９５（１９７５）Ｊ、或いはｐ　Ｂ
　Ｒ３２５ＣＧｅｎｅ、　。 ４．１２１（１９７Ｂ）Ｊ、ｐＡｃＹｃ１７７Ｃｊ、　
Ｂａａｔｅｒｉｏｌ、　、　１３４．１１４１（１９７
８）　Ｊ、　ｐＡｃ　ＹＣｌ　３４［Ｊ、Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ、、、　１３４．１１４１（１９７８）Ｊ等を用
いることができる。 （ハイブリッドプラスミドの調装） 上記で得らちだ染色体Ｄ　Ｎ　Ａとベクタープラスミド
ＤＮＡからハイブリッドプラスミドを調装するには制限
エンドヌクレアーゼ（例えばＨｉ　ｍ　ｄ　ｌ［。 は二重切断したのち、リガーゼ（例えは、Ｔ４ＤＮ　Ａ
　ＩＪガーゼ、大腸［Ｄ　Ｎ　Ａ　ＩＪガーゼ等）で処
理するか、或いはその切断末端によってはターミナルト
ランスフェラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ等で処理したの
ちりガーゼを作用させてＤＮＡ鎖を結合する等の常法（
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　＊　５
８．４１（１９７９）、遺伝子操作実験法（制木康かく
して得らｒしたハイブリッドプラスミドはそのゴま形質
転換に用いることもでき、あるいは得られたハイブリッ
ドプラスミドを常法により各種の変異株に移入して目的
とするアスパルターゼの染色体Ｄ　Ｎ　Ａを含有するノ
・イブリ・ノドプラスミドを予め選択してもよい。かか
る選択に川Ｇ）得る変異株としては例えばニジエリシア
株に属する微生物であってアスパルターゼ欠損性変異株
があげられ、グルタミン酸゛を唯一の炭素源として生育
しくする菌株として選択できる。又９本発明においては
上記で得られたノ・イブリッドプラスミドをエシエリシ
γ属微生物に含有せしｙ）だ微生物、例えはニジエリシ
ア・コリＴＡ５００３　（微工研閑寄第７０９１号）、
ニジエリシア・コリＴＡ５００４Ｆ微工研菌寄ＮＳ　７
０９２号〕からアスパルターゼの遺伝情報を担うノーイ
ブリッドプラスミドをとり出し用いることもできる。上
記いず２ｔの場合もノーイブリッドプラスミドのとり出
しはｃ　１ｅａｒｅｄ　１．ｙｓａｔｅ法〔遺伝子操作
実験法１２５頁（高木康敬祠著。 ｒ溝ｍ＆　ｔ１廿イエンテイフイック、１９８０）Ｊ、
ＣＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃ１ｒｉｎｇ＋　Ｐ、８６　［
↑／ａｎｉａｔｉｓ　ａｔ　ａｌ、。 ｅｄ、、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ　、　ｌ　９８２）」あるいはＢｉ
ｒｎｂｏｉｍ　、！：　Ｄｏｌｙの方法〔Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　、　７　、１５１３　（１
９７９Ｕ等によって実施することがＣきる。 （１ｄ主微生物Ｂよびその調装〕 宿主微生物としてはエシヱリシア属に属し・−

【スパル
ターゼ活性を有する微生物力）ら誘導され。 ハ）つし−アスパラギン酸を唯一の窒素源とする１、培
地で良好に生育する高アスパルターゼ活性を（Ｔする変
異株であｒＬばよく、ひっ）る微生物としては例えはニ
ジエリノア・コリＥ　Ａ　Ｐ　ｃ　−２８（＠、工（Ｊ
ｆ条寄第３８８号〕、エンエリシア・コリＥＡ　Ｐｃ−
１１０（微工研条寄第３８９号〕、ニジエリシア・コリ
ＥＡＰｃ−１３０（微工研条寄第３９０号）等があげら
れる。 これらの微生物の―’Ｉｎは具体的には凋えは変異ＬＡ
起処理方法として１１−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジン処理、紫外線照射等の方法を採用する
ことができる。 変異処理菌の培ｄに際し用いらｉＬる培地中のＬ−アス
パラギン酸は培地中濃度として約０．００５〜５％であ
るのが適当である。又Ｌ−アスパラギン酸を１准−の窒
素源とする場合には炭素源とじてグルコース、シュクロ
ース等を用いることができ、その濃度は例えはグルコー
スであれは約０．１〜１０％が適当である。更に、培地
にはｉｆｉ　、＠の栄が培地に用いられる各種塩類、微
肴元素等を添加することもできる。 培養方法は常法でよく特に限定されないか具体的にその
１例を示せば、フラスコに変異処理菌を１ｉｉＩ閑後、
−七ノ来度（例えば希釈率００５〜０．５／時）で培地
を注入しつつ、培養液を人き取りその条件下で速く生育
する菌体を濃縮分、、；Ｗする。所謂連続培還法〔「細
菌、ファージ実験法」（たん白乞 質核酸酵素別ｉｌｌ　）　３５頁’（１９７２）　３拍
好適に採用することができる。ついで該培養液を連続培
１’ｔ＝法で用いた培地組成に３いてＬ−アスパラギン
酸を約０．１〜５％にした培地平板で生育した太きμコ
ロニーを採取することにより前記の叩き品アン色 スハルターゼ十性を何する微生物を得ることかできる。 （形質転換株の調製］ 上記の如くして得られたアスパルターゼの染色体ＤＮＡ
を含有するハイブリッドプラスミドと直上微生物から形
質転換株を調製する方法としては例えば低温下で塩化カ
ルシウム溶液で処理し菌体膜の透過匹を増大させ、ノ＼
イブリ１．ドＤＮＡを名主微生物中にとり込下せる方法
ＣＪ、　１ＭｏＪ、、　Ｂｉｏｌ、＋５３．１５９（１
９７０）、遺伝子ｉ１’ｉ作実論法。 １６０頁（高本康敬編著、講談社音トイエンティフィッ
ク＋　１９８０　）　、　１Ｊｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ
ｏｎｉｒｇ　Ｐ、　２４９　（１４ａｎｉａｔｉ：　θ
ｔ　ａｎ、、　ｅｄ、、　Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉｎＢ　Ｈ
ａｒｂ０ｒＬ＋＋ｂｏｒａｔｏｒｙ　−１９８２）　Ｊ
等の渭法を採用することができる。 かくしてｆｌられた形質転換株のうち・アスパルターゼ
の遺伝ｂ’ｆｖｌを担うハイブリッドプラスミドが移入
された菌株の選択はテトラサイタリン又はアンピシリン
を含有する平板培地に生育炉るコロニーを釣菌１号、４
することによって実施することができる。 かくすることによって本発明に係る微生物、即ちニジエ
リシア！萬に属する微生物から採取したアスパルターゼ
の遺伝情報を担うＤＮＡとベクタープラスミドとからな
るハイブリッドプラスミドを、ニジニリンγ属微生物か
ら誘導さね、かつＬ−アスパラギン酸を唯一の窒素源と
する培地で良好に生育する高アスパルターゼ活性を有す
る変異株に含有せしめた微生物をｉ８ることかできる。 かかる微生物としてはｑ体的には例えばニジエリシア・
コＩＩ　Ｔ　Ａ　５００５　（微工研閑寄ｉ＜　７３１
３号〕があげられる。こｎらの微生物は親株に比べて約
３３倍の高いアスパルターゼ活性を俳する。 〔Ｌ−アスパラギン酸の製造Ｊ 本発明に係る微生物は＠記の如く親株に較べて顕著に優
ｎたアスパルターゼ活性を有しているので、該微生物を
用いてフマール酸とアンモニアからＬ−アスパラギン酸
を好適に製造することができる。 即ち、本発明に係る微生物の培昇液、該培養液から採取
した菌体もしくは該菌体の処理物をフマール峻とアンモ
ニアに作用させることによりＬ−アスパラギン酸を製造
することができる。 本発明に係る微生物を培養するに際しては炭素源、窒素
源、有機栄養源・無機塩類などを含む通常の栄養培地が
使用できる。培養は濱法により行なうことができ・例え
ば培地のｐＨを５．０〜９．０に調整し、微生物を培種
したのち１０〜４５℃、好ましくは２８〜３７℃で吐気
的に培養すればよい。又、上記培地においてＬ−アスパ
ラギン酸を炭素源、窒素源として用いることができその
際の添加量は約０．１〜５幅であるのが適当である。 酵素反応に際しては上記の如くして得られる培養液のほ
かに該培養液から採取した菌体、該菌体の処理物をも用
いることができ、ここに菌体の処理物としては例えば洗
浄菌体、乾煽菌体、菌体磨砕物、菌体の自己消化物、菌
体の超音波処理物、菌体抽出物又はこわらをゲル抱括法
や吸着法等のそれ自体公知の固定化方法により固定化し
たものがあげられる。固定化したものの具体例としては
菌体等を例えばポリアクリルアミドゲル、含疏多糖類ケ
ル（カラギーナン、７丁＝セレラン等）、コラーゲンゲ
ル、アルギン酸ゲル、ポリビニルアルコールゲル、寒天
ゲルで固定化したものがあげられ、ポリアクリルアミド
ゲルによる場合は例えば特公昭５３−１８３１号記載の
方法により・又・含硫多塘類による・９合は例えは特開
昭５３−６４８３号記４−１！の方法により固定化する
ことができる０コラーゲンゲル、アルギン酸ゲル、ポリ
ビニルアルコールゲン、寒天ゲル等による場合も１例え
ば特開昭５１−１４４７８０号、特開昭４９−３０５８
２号、特開昭４９−８０２８５号、特開昭５　］　−］
　３３４８４号記載の方法に従って固定化することがで
きる。 基質たるフマール酸とアンモニアは種々の形で反応系に
供給することができ２例えはフマール酸アンモニウム塩
として供給してもよく、更にはフマール酸もしくはその
塩と無銭アンモニウム塩として供給してもよい。 フマール酸塩としては例えはフマール酸ナトリンモニウ
ム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム又はこれら
の混合物を好適に用いることができろ。 フマール酸もしくはその塩と無１幾了ンモニウト塩を用
いる場合には、これら２成汁のモル比は１：１６５〜１
：２の間にあるのが適当である。 酵素反応は約５〜５０℃の広い温度範囲で実施すること
ができるが微生物の酵素の安定性を考慮して２０〜４５
℃で実施するのが好ましい。又。 酵素反応に際してそのｐＨは６〜１０となるよう実施す
るのが好ましい。尚、上記酵素反応に際してはカルシウ
ム、マグネシウム、マンガン、ストロンチウム等の２価
金属イオンを添加するのが好ましい。これらの２価金属
イオンの濃度は０．１〜１０ミリモル程度でよく、これ
により酵素の安定性を高めることかできる。 反応は微生物菌体を用いる場合にはバッチ法で実施する
のか好ましく、培養後集菌した微生物菌体を前記した如
き基質溶液にけん濁しかく拌することによってＬ−アス
パラギン酸が生成する。又、固定化微生物を用いる場合
の反応は固定化微生物が水に不溶性であるため、バッチ
法によるのみ１１らず、カラム法によって連続的に実施
ｆることもできる。例えば固定化微生物をカラムに充填
し、このカラムに基質溶液を適当な速度で流下ずれば、
Ｌ−アスパラギン酸のみを含む流出液が得らｎる。まフ
こバッチ法による場合は基質溶液に固定化微生物をけん
濁させ、かく拌することによってＬ−アスパラギン酸が
生成する。この場合には反ることができる。上記反応を
実施するにあたっては反応進行率は微生物の量、温度１
反応時間、基質の流速〔特に線速度〕その他により影響
される。 へ 例えば、カラー＋法による場合は使用する固定化微生物
のｆｆｉに従い基質溶液の流下速度を、またパッチ法に
よる場合はその反応時間を適当に調整することにより反
応進行率を１００％にょで品める至適条件を見出すこと
も容易である。 かくして反応液中に生成蓄積したＬ−アスパラギン酸の
分離精製は、ｕ’ｆ３常のイオン交換樹脂法やその他の
公知方法を組合せて容易に行なうことができる。 以」ニの如き本発明方法は従来Ｌ−アスパラギン酸の製
造に用いられたエシエＩＪシア属微生物に較べてアスパ
ルターゼ活性か格段ンこ高いニジエリア属微生物を用い
るため極めて１団収率かつ短時間でフマール酸とアンモ
ニアからＬ−アスパラギン酸を製造することができる。 又１本発明に係る微生物ンこついてはカタボライト抑制
が解除されていることからグルコースの如き資化さｉｔ
、易い炭素源が存在してもアスパルターゼ活性は低下し
ないという特徴をも併せ有する。従って本発明方法に係
る微生物を培呑するに酪しては炭素源が何であるかに左
右されることｆｌく高アスパルターゼ活四を発現させる
ことができ、Ｌ−アスパラギン酸を旨収率で製造するこ
とができるものである。 以下、不発明を≠≠甲甲寅実施例より更に詳細に説明す
る。 尚・哄令申秦逢実施例中のアスパルターゼ活性は１．０
Ｍフマール酸アンモニウム（ｐＨｓ、５ｉ　、　ｌ　ｍ
Ｍ塩化マグネシウム含有〕と菌体又は菌体処理物とを接
触させ、３７℃で１５分間もしくは１時間反応後１反応
液中のＬ−アスパラギン酸をロイコ／ストック・メセン
テロイデスＰ６Ｑ’を用いる／′ｔイオアッセイ法（Ｊ
、　Ｒｌａｌ、　Ｃｈｅｍ、　１７２　ｓ　１５　（１
９４８）Ｊにより測定して行なった。 実施例　】 （１）　ハイブリッドプラスミドの調製参考例１で得た
ニジエリシア・コリＴＡ５００４（微工研菌寄第７０９
２号〕をグルコース０．２鴨を含むＬ−ブロス（ペプト
ン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム０．５％
、ｐＨ７，０）８００−に接種して３７℃で７時間振と
う培養した後・菌体を遠心分離して集菌した。ついで該
菌体をリゾチーム処理、ＳＯ３処理により浴閑させ・最
終ｌ　Ｍ　［ｆｌるように塩化ナトリウムを加えた後、
１００．０ＯＯＸＩ、３０分間の遠心分浦を行なった。 上清を採取し、フェノール・グロロホルム処理した後、
エタノールを加えＤＮＡを遠心分離により集めた。沈殿
したＤＮＡをｌ　ＱｍＭ　）　ｌ］ス塩０−１ｍＭＥ　
Ｄ　Ｔ　Ａ　（ｐＨ７，５）に溶解し、塩化セシウム・
エチジウムブロマイド平衡密度勾配遠心法によりプラス
ミドＤＮＡを分離精つした。かくすることによりハイブ
リッドプラスミドｐＴＡ５０４をｏ、　ｓ　ｑ得た。 （２）　ハイブリッドプラスミドによる形質転換参考例
２で得たニジエリシア俸コリＥＡＰ（１−１１０（微工
研条寄第３８９号）をグルコース０゜２％を含むＬ−ブ
ロス３０ｒｎ！、に接種し、３７℃で振とう培養しその
対数増殖明の中期まで生育せしめた菌体を集菌した。つ
いで氷冷した０、１Ｍ塩化マグネシウムｍ液１５ｒｎｌ
にけん濁したのち集菌し、水冷したＯ、１Ｍ塩塩化カル
シウム液液１５．ｎｌけん濁した。０℃で２０分間放置
したのち集菌し。 氷冷した０、１Ｍ塩化カルシウム溶液３−にけん尚した
。この細胞けん迩液に（１）で得たＤＮＡ溶液を加えて
６０分間水冷したのち、３７℃で３分間加理 熱処存することによってＤ　Ｎ　Ａを細胞内にとりこま
せた。ついてこのけん副液にクルコース０．２％を含む
Ｌ−ブロス１５ｒｎｔを加え３７℃で２時間振とう培養
した後、　Ｏ，１〜０．５ｄずつアンビシリン２５μＶ
ｍｌを含むＬ−ブロスの寒天平板培地上に塗布して、３
７℃で１夜培養した。生じたコロニーを釣菌、５１する
ことによって高アスパルターゼ活性を有するニジエリシ
ア・コリ’Ｌ’Ａ３０Ｑ５（微工研菌寄第７３１３号）
を得た。 上記で得られたニジエリシア・コリＴＡ５００５と宿主
微生物ニジエリシア・コリＥＡＰｃ−１１０及びその原
株たるニジエリシア・コリＡＴＣ０１１３０３のアスパ
ルターゼ活性を測定した。 その結果は下記第１表に示す通りである。 第　１　表 上記第１表から本発明のニジエリシア・コリＴＡ５００
５は原株たるニジエリシア・コリｇＡＰＱ−１１０に比
べ約４培、−＄ニジエリシア・コリＡＴＣＣ１１３０３
に比べ約３３培のアスパルターゼ活性を有することが明
らかである。 実施例　２ フマール酸アンモニウム３％、第１リン酸カリウム０．
２％、硫酸マグネシウム・７水和物０．０５％、コーン
スチーブリ力−４％、ミースト２％を含ｔＪ　培地（ρ
１４７．０　）　５００ｎ／にニジエリシア・コリＴＡ
５００５を植菌し、３７℃で２４時間培養した。この培
養液のｐＨをアンモニア水でｐ）１８．５とし、７ヤー
ル酸アンモニウム６５グおよびトリトンＸ−１００５０
０■を添加してさらに３７℃で３時間静置して酵素反応
を行なった。反応終了液をろ過・濃縮したのちｐＨ２，
８に調整し析出晶をろ取することによりＬ−アスパラギ
ン酸の粗結晶を得た。ついで該粗結晶を水から再結晶す
ることによりＬ−アスパラギンｅ４７．５Ｖを得た。 実施例　３ （１）　フマール酸アンモニウム３　＜　、第Ｊリン酸
ｉｙ　＋）　ラムＯ，２％　＊硫酸マグネシウム・７７
ＪＣ（（’Ｊ　物０゜０５％、コーンスチープリヵー４
％、ミースト２％を含む培地（ｐＨ７，０）にニジエリ
シア・コリＴＡ５００５を植菌し、３７℃で２４時時間
表ぅ培養した。この培養液から遠心分離により集菌した
菌体を生理食塩水１６−にけん濁し、あら力）しめ４０
℃に保温した３、２％ゲニューゲルＷ　Ｇ　７Ｊ（溶１
夜窃 ６４−を加え４０℃の温尋沖で混合した。この混合物を
ｌ　Ｍフマール酸アンモニウム水ｍ　液（ｐｌｌ　Ｂ。 ”１ｍＭ塩化マグネシウム含有〕中にＭ−Ｆすることに
より球状ゲル（直径３　ｔｒｒｍ　）のアスパルターゼ
活性を有する固定化ニジエリシア・コリ６ｏ７（湿潤量
〕を得た。この固定化菌体１ｖのアスパルターゼ活性は
３．２　ｍ−ｍｏ　ｌθａ／ｈｒであった。 （２）　上記（１）で得らｎた固定化ニジエリシア、コ
リ６０ｇを外套管付カラム（４ｃｎａＸ８ｍＪに充填し
、３７℃にて２４時間インキュベートすることにより活
性化（アスパルターゼ活性５９　Ｑ　Ｑ　ｍ　ｍｏｌｅ
ｓΔｒｒ　）　＆　、同温度にて１Ｍフマール酸アンモ
ニウム溶液（ｐＨ１８，５，１ｍＭ塩化マグネシウム含
有〕１０００ｒｒｌ！、を７５　ｗｌＡｒの流速で流下
した。流出液をｐＨ２，８とすることにより結晶を析出
させた。析出品をろ取することによりＬ−アスパラギン
酸１３０゜２７を得た。 実施例　４ （１）　エシエ男シア・コリＴＡ５００５の［１体８り
を生理食塩水５ｍｌにけん１罰し、これにあら７Ｊ）し
め４０℃に保温した２、２％ゲニューゲルＷＧ水シ容液
（１％ローカストビーンガム含有）８０−を加えて混合
した。この混合液を冷却してゲル化させ、更に２％塩化
カリウム水溶液２５−を静かに加え３０分間静置した。 得られたゲルを１辺３ｍｍの立方体に成型し２％塩化カ
リウム水溶液で洗浄した。得らｌ″したゲル８９７を冷
エタノール１０Ｏ−に浸漬し、これにグルタルアルデヒ
ドを最終濃度０．４９％になるよう加え・水冷下に１５
分間静１ユした。ついでゲルをろ取し２％塩化カリウム
水溶液で洗浄した後、活性化ｒること足よりアスパルタ
ーゼ活性を有する固定化ニジエリシア・コリ８６ノ（湿
潤！　、９０．０　ｍｍｏｌｅｓ／ｈｒ４ｇ９体〕を得
た。 （２）　上記（１）で得られた固定化ニジエリシア・コ
リ１１グを外套管付カラム（１，６ｃｍＸ１２０）に充
ＥＬ、、３７°Ｃにて１Ｍフマール酸アンモニウム水溶
液＜　１）Ｈ８，５、１ｍＭ塩化マグネシウム含有）を
７　ｍ１ｊｈｒの流速で昼夜連続して導通し経時的にア
スパルターゼ活性を測定した。その結東２０日間経過後
もな８活性の低−ドは殆ど認めらＴＬなＬ）った。 実施例　５ ニジエリシア・コリＴＡ５００５の菌体１０　Ｆを０．
０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，５３５０−にけん濁し９
Ｋｃで１５分間音波処理を行なった。ついで該けん濁液
を遠心分離し得らｎる上澄液４０ｙｄを弱塩基性イオン
交換樹脂デュオライト−Ａｙ（米国・ダイアモンドシャ
ムロツタ社製）、６０−を充填したカラムＫ　３０　ｍ
１Ａｒで室温下に導通した。次に０、１　Ｍ　ＩＪ　ン
酸緩衝液（ｐ１４８．５　）　３００ｒｎｌ（！：０．
４％グルタルアルデヒド３００．／を含む溶液で３０分
間架橋しグルタルアルデヒドを充分洗浄して固定化酵素
を調製した。この固定化酵素を５ｏ−容Ｈのカラムに充
填し、ＩＭフマール酸アンモニウム（ｐＨ８，５、Ｉ　
ｎ＋Ｍ塩化マグネシウム含有）５００ｍ！。 を３７．５　ｍ１ＡＬｒの流速で導通した。流出液を合
しｐＨ２，８とすることによりＬ−アスパラギン酸５７
７を得る。 実施例　６ ニジエリシア・コリＴＡ’５００５を用いて実施例５と
同様にして得らゎた上澄液を硫安か画（３０〜５０％飽
和）し得ｌらｎた沈殿を水５−に溶解した。この溶液を
水に対して１夜透析し透析内液を酵素液（アスパルター
ゼ標品）とした。つぃでを２％塩化カリウム水溶液中に
ｍＦすることにより球状ゲル（直径約３ｔｔｎ）を得た
。得られた固定化アスパルターゼの活性は５６　ｒｒＬ
、ｍｐｌ　ｅ　８／ｈｒ／　９　Ｔ！　ｉｂった。 参考例１ （ニジエリシア・コリＴＡ５００４の、Ｊ］Ｗ）（１）
染色体ＤＮＡの調装 ニジエリシア・コリに一１２ＭＭ２９４株を１゜２／の
グルコース０．２％を含むＬ−ブロス（ペプトン１％、
酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム０゜５ｃｆ６．ｐ
Ｈ７，０）Ｋ接１ｆｌＬ、３７℃で８時間振トウ培養し
対数増殖期後期の菌体を遠心分離により集めた。この菌
体をリゾチーム処理・ザルコシル処理して溶菌し、フェ
ノール処理により除蛋白したのちエタノール処理して染
色体ＤＮＡを沈殿させた。ついで常法により染色体ＤＮ
Ａを抽出精製すニジエリシア・コリに一１２Ｇ６ＱＱｒ
−ｍ株にＰＳＣｌｏｌを含有させた菌株［：　ＰｒＩｏ
ａ、　Ｎａｔｌ。 Ａｏａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、、　７’Ｑ　Ｉ３２４０　
（１９７３）　Ｊを８００−のグルコース０．２％を陰
むＬ−ブロスに接［ｉして３７℃で７時間振と−Ｎｍ　
Ｒｌた溪−凸体を遠心分離して集菌【７た。ついで該菌
体をリゾチーム処理・ＳＤＳ処理により溶菌させ、最終
１Ｍになるように塩化ナトリウムを加えた後・１００、
ＵＱＯｘｌ、３０分間の遠心分離を行なった。 上清を採取し・フェノール・クロロホルム処Ａした後、
エタノールを加えＤＮＡを遠心分離により集めた。沈殿
したＤ　Ｎ　Ａを１０ｍＭト１Ｊス塩酸−１＋ｎＭＥＤ
ＴＡ（ｐＨ７，５）に溶解し、塩化セシウム・工壬ジウ
ムブロマイド平衡密度勾配遠心法によりプラスミドＤＮ
Ａを分離精製した。ハ）＜シて１．０”ｌ＆のｐｓｃ］
０１７’うＸミ）’ＤＮＡを得た。 （３）　ハイブリッドプラスミドの調製上記（１）で碍
た染色体ＤＮＡ　１０／ｚ９１２１で得たプラスミドＤ
ＮＡＺβ、の各々に制限エンドヌクレアーゼｇｃｏＲＩ
とＸｈｏ　Ｉを同時にｊｆｆｌ常の条件で作用させＤＮ
Ａ鎖を完全に切断した。６５℃、１０分間の熱処理後１
両反応液を混合しＴ４ファージ由来のＤ　Ｎ　Ａ　Ｉ７
ガーゼをｄ濱の条件下で作用させてＤＮＡ鎖を連結させ
た。 （４）　ハイブリッドプラスミドによる形質転換（ａｌ
ニジエリシア・コリに一１２０６ＱＱｒ−ｎａ−をＮ−
）／チルーＮ′−二トローＮ−ニトロソグアニジンで変
異誘導処理し・Ｌ−グルタミン酸３ＱｍＭを炭素源とす
る最小寒天培地（リン酸第二カリウム０．７％、リン酸
第−カリウム０．３％、硫酸アンモニウム０．１　ｆｏ
、硫酸マグネシウム・７水和物ｏ、　。 １％・寒天１．５％〕に塗布した。３７℃で２日ＦＷ培
養したのち、生じたコロニーのうち大きなコロニーを釣
菌分離しＴＫ（３株を得た。ついでこのＴＫＧ株をＮ〜
メチル−Ｎ′−二トローＮ−ニトロソグアニジンで変異
誘導処理し、　０．２　’ＩＬのグルコースを含むＬ−
ブロス寒天培地に平板あたり約１００個のコロニーが生
じるようにゆ布した。生じたコロニーのうちＬ−グルタ
ミン酸３ＱｍＭを炭素源として含む最小培地上で、３７
℃で２日間培養しても生育しない株を選択（レプリカ法
〕した。かくして得られた株からアスパルターゼ活性を
欠損したＴＫ２３７株を得た。 得られたＴＫ２３７をグルコース０．２％を含むＬ−ブ
ロス３０記に接種、し、３７℃で振とう培養しその対数
増殖部器中期まで生育せしめた菌体を集菌した。ついで
水冷した０、１Ｍ塩化マグネシウム溶液１５−にけん濁
したのち集菌し、水冷した０、１Ｍ塩化カルシウム溶液
１５．ｎｌにけん濁した。 ０℃で２０分間放置したのち集菌し、水冷した０゜１Ｍ
塩化カルシウム溶液３−にけん濁した。このａｎ胞けん
濁液に（３）で得たＤＮＡ溶液を加えて６０力間水冷し
たのち、３７℃で３分間熱処理することによってＤＮＡ
を細胞内にとりこませた。ついでこのけん濁液にグルコ
ース０．２％を含むＬ−ブロス１５−を加え３７℃で２
時間振とう培養した後、集菌し、生理食塩水１５’ｍ７
にりんｍＢした。再度集菌し、生理食塩水１５ｒｎｌに
けん濁したのち集菌した。ついで生理食塩水１５．、／
にけん濁し、該けん濁液を０．５〜１−ずつＬ−グルタ
ミン酸３０ＴＩＭを炭素源とする寒天培地（テトラサイ
クリン５１１！ｌ／ｍ！含有〕に塗布し、３７℃で７日
間培養した。 生じたコロニーのうち、’Ｉ’に６株よりアスパルター
ゼ活性の高いものをハイブリッドプラスミドＤ　Ｎ　Ａ
による形質転換株として得た。かくして得られた形質転
換株をＬ−ブロス１１で培養したのち（２）と同様にし
てハイブリッドプラスミドＤＮＡを採取した。 （１，）　（＠らＪ’したハイブリッドプラスミドＤＮ
ＡとＴＫＧ株とを上記（ａｌと同様に処理して形質転換
株を調製し、グルコース０．２％、テトラサイクリン５
β／ｍｉを含むＬ−ブロス寒天培地上に塗布して３７℃
で１夜培養することによりアスパルターゼの遺伝子を有
するハイブリッドプラスミドＤＮＡ（ｐＴＡ５０３）を
含み高アスパルターゼ活性を有する形質転換株エシエリ
シ了・コリＴＡ５００３（微工研菌寄第７０９１号〕を
得た。 ＋！１ＪｌＰＢＲ３２２をベクターとするハイブリッド
プラスミドの調Δ ｌａ）前記（２）においてプラスミドｐｓ　ｃｌａｌに
代えてｐＢＲ３２２を用い、以下同様にして処理するこ
とによりｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡ１．０ｑを得た
。他方、上記＋４−１−　（ｂｌで得たエシエリシする
ことによりハイブリッドプラスミドＤＮＡｐＴＡ５Ｑ３
　０．６”ｒを得た。 ［ｂｌ上Ｂ己（ａｌで？尋たｐＢＲ３，２２１５／４と
ｐＴＡ５０３（７）ＤＮＡ１５＃に各々制限エンドヌク
レアーゼＢａｍＨＩとＳａｌ　ｉを同時に通常の条件で
作用させて両プラスミドＤＮＡ鎖を切断した。６５℃。 １０分間の熱処理後１両反応液を混合しＴ４ＤＮＡ　Ｉ
Ｊガーゼを通常の条件下で作用させてＤＮＡ鎖を連結さ
せた。 ν （０）エシェリソア・コリＴ　Ｋ　；２３７を上記（２
＋　−（会）で得たＤＮＡ溶液で形質転換し＋　１’４
られる菌株をグルコース０１冫 ■・−ブロス寒天培地で３７℃．４８時間培養したのら
・１」ｑ記（２）と同様に処理することによりハイブン
ドスクレアーゼｐｉｃｏＲ　■　を通常の活性でｒＦ用
させてプラスミドＤＮＡ鎖を切断した。６５℃，１０分
間の熱処理後・Ｔ４ＤＮＡｊＪガーゼを通常の４＋＋〃
←ｒ−＋り〃ーｆηー１冒ー宣上イｎλ１烏ｔ１１ｔ−
旨ｌ−２１−シ−りｔ６１　ｐ　Ｂ　Ｒ３２２をベクタ
ーとするハイブリッドプラスミドによる形質転換 辱られたハイブリッドプラスミドＤＮＡとＴＫ２３７を
前記（４）と同様にして形質転換し、グルコース０．２
％、アンピシリン５０μＺ／、ｄを含むＬ−ブロス寒天
培地を用いて生育する菌株を採取し高アスパルターゼ活
匹を有する微生物を選択することによりアスパルターゼ
の遺伝子を有するハイブリッドプラスミド（ｐＴＡ５０
４）を含む形質転換株ニジエリシア・コリＴ　Ａ　５０
０４　（微工研菌寄第７０９２号）を得た。 参考例　２ 〔ニジエリシア・コリｇＡｐｃ−１１０の調製〕グルコ
ース３．ロ ウム０．０１５％．リン酸第１カリウム０．３％．リン
酸第２カリウム０．７％．硫酸マグネシウム・７水和物
ｏ．ｏｉ＜からなる培地５　０　ｍｌを含む５０，、／
一 容ベルコ肚製スピナーフラスコ；ニジエリシア・コリＡ
ＴＣＣ：１１３０３のＮ−メチル−Ｎ−二トローＮー二
トロングアニジン処理菌を５×１０１０個植菌し．希釈
率０．１／時．３０’ＣでｌｏＩＢ間連続培養した。次
いで培養液を生理食塩水で１０’〜１０’倍に稀釈した
のち．前記培地組成においてＬ−アスパラギン酸ナトリ
ウムを０．　５％とし更に寒天１。 ５幅を加んた平板培地に塗布した。１〜２日間で出現し
た大コロニーを釣菌することによりニジエリシア・コ１
１　Ｅ　Ａ　Ｐ　ｃ　−　１　１　０　（微工研条寄第
３８　９　号　〕　を　？尋　ゾこ　。 自発手続補正書 昭和．ｓ７年γ月２−１日 」 １、事件の表示 鍋侘徴主町及び゛〈れ乞用・・る 事件との関係　特許出願人 大阪Ｉｆｆ大阪市東区通修町３丁目２１番地（〒５４１
）（２９５）１１辺製薬株式会社 代表者松原一部 ４、代理人 大阪府大阪市淀川区加島３丁目１６番８９号（〒５３２
）・・１ 一，：，：に ｊ ５、補正により増加する発明の数 ） 補　正　の　内　容 １、明細箸第４頁２行目の 「核酸」　の後に 「（以下，ＤＮＡと称する）」　を挿入する。 ２、同第４頁下から７行目の ［デオキシリボ核酸」　を 「ＤＮＡ」　に訂正する。 ３、同第５頁下から４行目の ｒ（１９７５）Ｊ　を ｒ　（１９７７）Ｊ　に訂正する。 ４、同第６頁５行目の 「Ｈｌｍｄ　ＴＩＥ　Ｊ　’ｅ ［Ｈｌｎｄ　Ｉ［　Ｊ　に訂正する。 ５、同第１０頁１４行目の ［ハイブリッド］　を 「ハイブリッドプラスミド」　に訂正する。 ６、同第１２２頁４行目 「培種」　を 「接種」　に訂ｉＥする。 ７、同第１３頁６行目の 「アルコールゲル」　を 「アルコールゲル」　に訂正する。 ８、同第２７頁５行目と下から５行目の「最小」　を 「最少」　に打面する。 ９、同第：（０頁１Ｏ行目の ｒ　＋２ｌ−Ｆｂｌ　Ｊ　を ｒ　（ｂ）　ｊ　に訂正する。 １０、同第３０頁１３行目の 「プロス」　を 「ブロス」　に訂正する。 １１、同第３０頁下から４行目の 「常体」　を 「条件」　に訂正する。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）　ニジエリシアｌｊＱ　ｋこ属する微生物力）ら
   採取したアスパルターゼの遺伝情報を担うデオキシリボ
   核酸とベクタープラスミドとからなるハイブリッドプラ
   スミドを、エンエリシア属微生物から誘導さｎ、かつＬ
   −アスパラキン酸を唯一の窒素源トする培地で良好に生
   育する高アスパルターゼ活性を有する変異株に含有亡し
   めた微生物。
2. （２）　ニジエリシア＠に属する微生物から採取したア
   スパルターゼの遺伝情報を担うデオキシリボ核酸とベク
   ターシラスミドと１Ｊ）らなるノＸイブリ・ノドプラス
   ミドを、ニジエリシア属微生物から誘導さ几・かつＬ−
   アスパラギン酸を唯一の窒素源とする培地で良好に主音
   する高アスパルターゼ活性？−宮−？　ｚ　ｍｃ　（１
   １Ｌｂ　！ｆｆ　’４１５ＪＪ−１払ｆ−２ｋ　／ｋ　
   ルー＋ｔｌｉ　／太　、ツメ培養物もしくは該菌体の処
   理物をフマール酸とアンモニアに作用させることを特徴
   とするＬ−アスパラギン酸の製法。 ＋３１　フマール酸とアンモニアをフマール酸アンモニ
   ウムとして供給する特許請求の範囲第２項記載の製法。