JPS62107788A - 新規プラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はトリプトファンシンターゼの生合成ヲ司る遺伝
子を含むＤＮＡ断片を含有する新規なプラスミドに関し
、更に詳しくは、コピー数が多く、宿主内での安定保持
性に優れており、細胞増殖に際して脱落することなく親
細胞から娘細胞に確実に受は継がれる、トリプトファン
シンターセノ生合成を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片とし
て、少なくともｔｒｐ　　Ａ及びｔｒｐ　Ｂ並びにこれ
らの両遺伝子を発現させうるプロモーター機能をもつＤ
ＮＡ断片を含むＤＮＡ断片を含有するプラスミドに関す
る。

本発明者らは先に、トリプトファンオペロン中のトリプ
トファンターゼの生合成を司る遺伝子であるｔｒｐ　Ａ
及びｔｒｐ　Ｂ断片に、これら両遺伝子を発現させうる
プロモーター機能をもつＤＮＡ断片及びさらにこのプロ
モーター機能を制御しうるオペレーター機能をもつＤＮ
Ａ断片と、Ｆ因子プラスミド由来のプラスミドの増殖制
御分配系を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片と、ｃｏｌＥＩ
系シラスビシラスミド由来ミドの自律増殖能を司る遺伝
子を含むＤＮＡ断片とを組合わせた新規なプラスミドｐ
ＭＴＹ、−５を造成し提案した（特願昭６０−７４５０
号明細書参照）。

このプラスミドｐＭＴＹ−５を保持するエシエリヒア・
コリ、例えばエシエリヒア・コリに−１２ＹＫ２ＤＤ９
（ＦＥＲＭ　　Ｐ−，７９５７）を用いれば、発酵法に
よる場合のみならず、上記微生物菌体又はその絡理物を
用いてインドールとＤＬ−セリン又はＬ−セリンとを酵
素法により反・応させることによってトリプトファンを
比較的効率よく製造することが可能となる。

本発明者らは、上記プラスミドｐＭＴＹ−５を分子生物
学的にさらに改良することによって、トリプトファンの
発酵法又は酵素法による生産性をさらに一層向上させる
べく鏡意研究を行なった結果、今回、プラスミドｐＭＴ
Ｙ−５の構成遺伝子成分の配向性を変えることにより、
トリプロ７アンシンターゼの発現効率が著るしく向上す
ることを思い出し、本発明を完成した。

子を発現させうるプロモーター機能をもつＤＮＡ断片及
びこのプロモーター機能を制御しうるオペレーター機能
をもつＤＮＡ断片からなるトリプトファンシンターゼの
生合成を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片と、 （ｂ）下因子プラスミド由来の増殖制御分配系を司る遺
伝子を含むｍ１ｎｉ−Ｆ断片と、（ｃ）　　プラスミド
７３ＢＲ３２２由来の自律増殖。

能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片 とからなり、トリプロファンシンターゼの生合成を司る
遺伝子を含むＤＮＡ断片（σ）中のプロモーターからの
転写の方向と、ｍ１ｎｉ　−Ｆ断片（ｂ）中の遺伝子の
プロモーターからの転写の方向と、プラスミドｐＢＲ３
２２由来のＤＮＡ断片（ｃ）中の薬剤耐性遺伝子のプロ
モーターからの転写の方向が同一方向であシ、且つトリ
プトファンの生合成を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片（α
）がプラスミドｐＢＲ３２２由来の自律増殖能を司る遺
伝子を含むＤＮＡ断片（ｃ）の上流に位置することを特
徴とするエシエリヒア・コリの細胞内で自律増殖可能な
プラスミドが提供される。

本発明のプラスミドを構成する「トリプトファンシンタ
ーゼの生合成を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片」　（以下
「Ｔ断片」と略称することがある）とは、インドールと
Ｌ−又はＤＬ−セリンからＬ−トリソトファンの生合成
を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片を意味し、本発明では、
Ｔ断片として、殊に、トリプトファンオペロン中のトリ
プトファンシンターゼの生合成を司る遺伝子であるｔｒ
ｐＡ及びｔｒｐ　Ｂに、これら両遺伝子を発現させうる
プロモーター機能をもつＤＮＡ断片（以下「トリプトフ
ァンプロモーター」ということがある）及びさらにこの
ブロモ−ター機能を制限しうるオペレーター機能をもつ
ＤＮＡ断片（以下「トリプトファンオペレーター」とい
うことがある）を結合したＤＮＡ断片を使用するもので
ある。かかるＪ゛ＴＴ断片ては天川的には大腸菌由来の
ものが好適に使用される。このＴ断片の供給源としては
特に制限はないが、エシエリヒア・コリＡＴＣＣ２５２
８２、エシエリヒア・コリＡＴＣＣ２５４３７、エシエ
リヒア・コリＡＴＣＣ２５４６１等が有利に使用される
。

これら供給源微生物から本発明の目的に適うｔｒｐ　Ａ
及びｔｒｐ　Ｓ断片とトリプトファンプロモーター及び
トリプトファンオペレーターとが結合したＤＮＡ断片を
調製するだめの基本操作としては、染色体遺伝子中にト
リプトファンオペロンをもつ大腸菌にファーゾφ８０を
感染させた後誘発し、ファージＤＮＡ中にトリプトファ
ンオペロンを取り込んだファーゾを大量に調製する。次
にファーゾＤＮＡを抽出し、制限酵素Ｂαｍ１ｌｌ。

ＥｃｏＲＩ等を用いてトリプトファンオペロンＤ　Ｎ　
Ａ断片を切り出し、このＤＮＡ断片をさらに制限酵素１
１ｉｎｃ　ｆｌで部分切断を行い、ｔｒｐ　ＡＰｒｗ　
ＩＩで処理すると、プロモーター及びオペレーターを含
むＤＮＡ断片が得られる。得られ勺両ＤＮＡ断片をＤＮ
Ａ連結酵素で結合させることにより、ｔｒｐ　Ａ及びｔ
ｒｐ　Ｓ断片とトリプトファンプロモーター及びトリプ
トファンオペレーターとが結合したＤＮＡ断片を調製す
ることができる。

含む１）ＮＡＡ断片組合わせる点に１つの特徴を有する
。Ｆ因子プラスミドは例えば「蛋白質、核酸酵素」第２
７巻第１号（１９８２）の９８頁の図１の遺伝子地図及
びＥｃｏＲＩによる物理的地図に示される如き構造をも
つ、分子量が９４．５ｋｂ（ｂ２１０’　ダルトン）の
既知のプラスミドであり、大腸菌などの腸内細菌中に通
常細胞染色体当り１〜２個のコピー数で存在し、このプ
ムスミドは細胞分裂後にそれぞれの娘細胞中に正確に伝
達されるような機構を備えている（このように、コピー
数を低いレベルに保ちつつ、正確に宿主の増殖とペース
を合わせて増やす仕組みをｓｔｒｉｎ−ｇｅｎｔな増殖
の制御と呼んでいる）。Ｆ因子プラスミドにおけるこの
ようなｓｔｒｉｎｇｅｎｔな増殖の制御機能が、ｍ１ｎ
ｉ−Ｆと呼ばれる分子量が９．１ｋｂの自律増殖できる
細片に担われていることも既に究明されており、このｍ
１ｎｉ−ＦがＦ因子プラスミドより制御酵素ＥｃｏＲＩ
により切り出し可能であることも知られている。

本発明はこのｍ１ｎｉ−Ｐ’に担われている増殖制御分
配系を利用するものであり、しかして「Ｆ因子プラスミ
ド由来の増殖制御分配系を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片
」（以下「Ｆ断片」と略称することがある）とは、上述
したようなｐ゛因子プラスミドを娘細胞に正確ＶＣ遺伝
する機構を備えた遺伝子画分を意味し、そのようなＦ断
片として本発明では約９．１　ｋ　ｂの分子量を有する
ｍ１ｎｉ−１”断片それ自体を使用する。

さらに、本発明において上記Ｔ断片及びＦ断片と組合わ
せて使用される「プラスミドｐＢＲ３２２由来の自律増
殖を司る遺伝子を含むＤ　Ｎ　Ａ断片」（以下「Ｓ断片
」と略称することがある）は、コピー数が１細胞染色体
当υ２０〜５０個であるＣａｌ、ｌ！？１系プラスミド
の自律増殖を司る遺伝子及び薬剤耐性遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片の代表的なものであり、約４．５ｋｂの長さを有
する。

本発明により提供されるプラスミドは、以上に述べたＩ
“断片、Ｆ断片及びＳ断片の６つの必須のＤ　Ａ’　Ａ
断片を有する限り、池の遺伝情報を担うらに含みうるが
、１つの典型的な具体例はＴ断片、Ｆ断片及びＳ断片の
３つのＤＮＡ断片から実質的になり、Ｔ断片中のプロモ
ーターからの転写の方向とＦ断片（ｍｉｎｉ　−Ｆ断片
）中の遺伝子のプロモーターからの転写の方向と、Ｓ断
片中の薬剤耐性（通常、アンピシリン：’ｆｉｔ性）遺
伝子のプロモーターからの転写の方向が同一方向であり
、社つＴ断片がＳ断片の上流に位置する、分子量が約９
．０メガダルトン（約１３．６ｋｂ）のプラスミドで、
本発明者らが［７°ラスミドｐＭＴＹ−１３Ｊと命名し
たものである。なお、本明細書において、プラスミドの
分子量はアがロースグル電気泳動法により測定した値で
ある。

以下、このプラスミドｐＭＴＹ−Ｅ３についてさらに詳
細に説明する。

プラスミドｐＭｒ（−Ｂの下記の制限酵孟の感受性（認
識部位の数）及び該制限酵素による分解断片の長ｊ”　
（ｋ　ｂ　）は下記の表に示すとおシである。

ＥｃｏＲＩ　　　　　２　　　　１０．７．２．９Ｂａ
ｒＪ１１　　　　２　　　　　　ｑ、７．３．９Ｓαｌ
ｌ　　　　　３　　　　　１０．６．２．９．０．１ Ｐｓｔｌ　　　　　５　　　　　５．９．４．０．１．
８．１．５． ０．４ Ａｖａｌ　　　　　　　　１　　　　　　　　１３．６
以上に述べた如き特性をもつ本発明のプラスミドｐＭＴ
Ｙ−１３は次のようにして製造することができる。

プラスミドｐＭＴＹ−１３を調製するための詳細な方法
は後記実施例１で述べるが、基本操作としては、特願昭
６０−７４５０号明細書に開示されているエシエリヒア
・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｈｓαｃｏｌｉ）Ｋ１２　　Ｙ
Ｋ２００９（Ｉ’ＥＲＭ　　Ｐ−７９５７）の培養菌体
から常法〔ティ・マニアテイス、イー・エフ・フリッノ
、サムプルツク：「モレキュラー・クローニングＪ　（
Ｔ　、Ｍａｎｉａ−ｔｉｓ、Ｅ、Ｆ、Ｆｒイｔｓｃｈ、
Ｓａｍｂｒｏｏｋ：’　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃ１
ｏ　１Ｌｉｎｇ　　”　　）　　（１９８２３ら実質的
になるが、これらの断片の配列は上記ｐＴＭＹ−ｆ３と
は異なる）を抽出し、制限酵素、ＥｃｏＲＩを用いてト
リプトファンシンターゼの生合成を司る遺伝子断片を一
旦切シ出した後、Ｔ４ファーソ由来のＴ４ＤＮＡリガー
ゼで再結合させることにより、プラスミドｐＭＴＹ−５
に対し約１０％の割合でプラスミドｐＭＴＹ−Ｆ３を取
得することができる。

このようにして調製される本発明のプラスミドは、ｐＭ
ＴＹ−５と同様にコピー数が多く、宿主の細胞分裂に際
して娘細胞に受は継がれる際に脱落することが少なく安
定であるという優れた特性を有する。

従って、本発明のプラスミドはトリプトファンの製造に
おいて工業的に応用することが大いに期待される。トリ
ット７アンの製造に際しては、本発明のプラスミドで宿
主が形質転換される。この形質転換に利用できる宿主菌
としては、エシェリヒア属に属する微生物、特にエシエ
リヒア・コリに一１２系微生物が好ましく、更に、宿主
菌をトリグトファナーゼ欠損変異株としたものが特に好
ましい。

また、これら宿主菌に対する本発明のプラスミドの導入
はそれ自体公知の方法、例えばエム・マンデル、エイ・
ヒガ：ソヤーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
Ｊ　　（Ｍ、Ｍａｎｄｅｌ、Ａ。

Ｈｉｇａ　　：　　／、Ｎｏｔ、Ｒｉａｌ、）５３．１
５９（１９７０）等の文献に記載の方法で行なうことが
できる。

このようにして形質転換された宿主菌はそれ自体公知の
方法で培養することにより、トリプトファンシンターゼ
を菌体内に充分に生産蓄積させた後、インドールとＬ−
又はＤＬ−セリンとからＬ−トリプトファ／を製造する
際の酵素反応に利用することができる。

形質転換された宿主菌の培養はそれ自体既知の方法で行
うことができ、例えば、培地としては通常の微生物の培
養に用いられると同様の炭素源、無機塩等を含む天然又
は合成培地を使用することができる。

しかして炭素源としては、例えばグルコース、グリセロ
ール、フラクトース、シュクロース、抛Ｖ等の種々の炭
水化物が使用でき、また、窒素６９としでは、例えばト
リプトン、酵母エキス、コー〈は窒素源と共に炭素源に
もなり得る。無機塩としては、例えばリン酸第−水素カ
リウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸マグネシウム、
塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、塩化カルシウム、塩化マ
ンガン等が使用できる。

また、培地には微生物の生育に有用な他の栄養素（例え
ばビタミン類、アミノ酸類など）を添加してもよい。

さらに、培地にはインドールアクリル酸又はその４を添
加することができ、これによりトリブトファンシンター
ゼの産生量を著るしく向上させることができ１１．るこ
とか判明した。インドールアクリル酸又はその塩は培養
の当初に添加してもよく、或いは培養の途中で添加して
もよい。途中で添加する場合には、遅くとも微生物の対
数増殖期の末期までに添加することが望ましい。添加は
一回に行なってもよく、或いは複数回に分けて又は連続
的に行なうこともできる。

インドールアクリル酸又はその塩の添加量は厳密には制
限されるものではないが、一般には、培地に対し罵少な
くとも２５μｇ／−の最終濃度になるように添加するこ
とができ、好ましくは８０〜４００μｍ１／ｒｄの範囲
、さらに好ましくは１００〜２００μＩ　／　ｍｌの範
囲の最終濃度となるように添加するのが有利である。

なお、インドールアクリル酸の塩としては、例えばイン
ドールアクリル酸ナトリウムのようなインドールアクリ
ル酸のアルカリ金属塩等が挙げられる。

ここで「最終濃度」とは、培養終了時までに培地に添加
したインドールアクリル酸又はその塩の合計濃度のこと
である。

さらに、本発明の方法では、炭素源の少なくとも一部と
してグルコースを使用することが望ましく、その使用量
は一般に、インドールアクリル酸又はその塩に対して、
１０〜６００倍モル、好ましくは５０〜４００倍モル、
さらに好ましくは１００〜３００倍モルの範囲が適当で
ある。

培養時間は微生物の種類、他の培養条件等により異なる
が、インドールアクリル酸又はその塩を培養の当初に添
加して培養を行なう場合には、通常、約１〜約１２０時
間程度とすることができ、また、インドールアクリル酸
又はその塩を培養の途中で添加して培養する場合も同様
である。

また、培養温度は通常約２０〜約５０℃の範囲とするこ
とができ、培地のｐＨは一般に５〜９の範囲、好ましく
は約６〜約８の範囲に調節するのが好適である。

さらに、培養は振盪又は通気攪拌等の好気的条件下に行
なうのが好ましい。

培養された微生物菌体を該酵素反応に利用する場合、該
菌体はそのままで使用することができるが、該菌体を超
音波処理等で破砕した破砕物、又はその破砕物をさらに
水等で抽出した抽出物、或いは該抽出物をさらに硫安等
で処理して酵素成分を沈殿させた粗精製物の形で使用す
ることもでき、ざらに、該菌体又はこれら処理物は必要
により固定化して用いることもできる。

該菌体又はその処理物の存在下でのインドールとＬ−又
はＤＬ−セリンとの反応は、通常の酵素反応と同様に例
えば０．１　、Ｍ　＋）ン酸緩衝液（ｐＨ７，０〜９０
）あるいは水（ｐ＃７．０〜９．０）等の溶媒中で、約
２０〜約５０℃、好ましくは約６０〜約４０℃の温度で
通常約０．１〜約７２時間行なわれる。

インドールとＬ−又１ｄＤＬ−セリンの反応時の使用量
には特に制限は々いが、一般にはそれぞれ（、・を０．
０１〜２０％（ｗｔ／ｖｏｌ）の濃度範囲で使用するの
が適当である。また、該菌体又はその処理物の使用量も
特に制限されるものではないが、一般に０．１〜１０％
（ｗ　ｔ　／　ｖ　ｏ　ｌ　）の濃度で使用することが
できる。

反応後の反応液からのＬ　−）　１．１ブトフアンの分
離、精製は、それ自体既知の方法、例えば、イオン交換
樹脂、活性炭等による吸着、脱着処理等の方法で行なう
ことができる。

以上述べた酵素方法によれば、本発明により提供される
プラスミド、例えばプラスミドｐＭＴＹ−８で形質転換
されたエシェリヒア属に属する微生物の培養物又はその
処理法の存在下に、インドー−ルとＬ−又はＩ）　Ｌ−
セリンとを反応させてＬ−トリプトファンを製造するに
際し、トリプトファンの生産速度を著しく高めることが
でき、工業上極めて有利である。

また、本発明のプラスミドで形質転換した宿主菌はＬ−
）リゾトファンの発酵法による生産にも利用することが
できる。すなわち、本発明のプラスミドで形質転換した
宿主菌を培地で培養すれば、培地中にＬ　−）　ＩＪプ
トフサンが生産蓄積し、これを採取することによシＬ−
トリグト７アンを製造することができる。

上記培養は前述したと同様の培地を用い且つ前記と同様
の培養条件を用いて行なうことができる。

この発酵法の場合には、さらにまた、培地に、Ｌ−トリ
プトファンの前、駆物質としてインドール又はアントラ
ニル酸もしくはその塩（塩としてはインドールアクリル
酸の堝について上記したと同様のものが使用できる）を
適宜添加することができる。また、ｐＭＴＹ−１３を保
持する形質転換株エシエリヒア・コリに−１２ＹＫ２０
１４ではインドールを添加することがそれぞれ好ましく
、その添加に際して、前述のインドールアクリル酸又は
その塩におけると同様、培養の当初に行なってもよく、
或いは培養の途中で行なってもよい。培養の途中で行な
う場合には、遅くとも微生物の対数増殖期の末期までに
添加することが望ましく、添加は一回に行なってもよく
、或いは複数回に分けて又は連範的に行なってもよい。

インドール又はアントラニル酸もしくはその塩の添加量
も厳密に制限されるものではないが、例えば炭素源とし
てグルコースを用いる場合グルコースに対して、０．０
０５〜１倍モル、好ましくは０．０１〜０．５倍モルの
範囲の量で添加するのが有利である。

以上に述べた培養条件下に培養することによって得られ
る培養物からのＬ−ト’）ブトファンの回収は、それ自
体既知の方法により行なうことができ、例えば、イオン
交換樹脂、活性炭等を用いての吸着処理により行々うこ
とができる。

以上に述べた本発明の方法によれば、Ｌ−ト’）ブト７
アンを極めて効率よく生産することができ、工業上非常
に有利である。

次に実施例によって本発明をさらに具体的に説明する。

実施例　１：　プラスミドｐＭＴＹ−８の調製（Ａ）　
　プラスミドｐＡｆＴＹ−５の調製り培地（トリプトン
１０ｇ、酵母エキス５ｙ、ＮαＣ１５ｇ、蒸留水１００
０−；７７Ｈニア、２）の１００ｄを容［５００ｍの三
角のフラスコに分注し、１２０℃で１５分間滅蔚処理し
た。この培地にエシエリヒア・コリｆ１２ＹＫ２００９
　Ｃｍ工研寄第７．９５７号（ＦＥＲＮ　　Ｐ−７９５
７）：特願昭６０−７４５０号参照〕を植菌し、５７℃
萌、 で１５時間培養を行った後、この培養２０　ｍｌを採り
、新たに上記培地１００−に接種し、再度６７℃で５時
間培養を行った。

培養終了後、この培養液全量を遠心分雛（８０００ｘＪ
、１５分間、４℃）して集暗し、リゾチウム処理を行な
い且つドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を添加して溶
菌させた。この溶菌液を３２，０００Ｘ、９で４０分間
遠心分離処理し、上清を分画し、次いで塩化セシウムー
エチソウムプロマイド平衡密度勾配遠心分離処理を行な
った後、透析処理により、プラスミドｐＭＴＹ−５を含
む溶液を分取した。この溶液にエタノール沈殿を行ない
、最終的に約１００μｙのプラスミドｐＭＴＹ−３を採
取した。

前記（／Ｉ）で調製したプラスミドｐ１υＴＹ−６を５
μｙと））、制限酵素であるＥｃｏＲＩを５７０Ｇ１１
時間作用させて該プラスミドｐＭＴＹ−５Ｄ　ＭＡ鎖を
切断させ、次いで、６０°Ｃで５分間熱処理してＥｃｏ
ＲＩを失活させた後、該処理液にＡＴＰ（アデノシント
リホスフェート）及びソチオスレイトールを加え、さら
にＴ４ファーノ由来のＤＮＡりが−ゼ〔全酒造■製〕を
添加し７１２″後、１２℃で１７時間反応を行なった。

次いで６０℃で５分間熱処理して、ＤＮＡ＋）ガーゼを
失活させた後、この反応液を用いてエシエリヒア・コリ
に一１２系株（トリプトファン要求性変異株、ＡＴＣＣ
２３７１８）を常法に従い形質転換し、形質転換株（Ｔ
ｒｐ要求性の消失：すなわちプラスミド上のｔｒｐＡ及
びｔｒｐＢ遺伝子によりトリプトファン生合成可能とな
か、最少培地（Ｋ２Ｂ　Ｐ　０４７５１、Ｋ１１２Ｐ０
，２１１．ＭｇＳＯ４・７　Ｂ、００．１．！ｉ’、Ｉ
、ＮＨ，）、ＳＯ４１Ｆ、りｋ　：ｆｆ　−、（２，９
、純粋１１）上にて生育可能となった菌株〕を得た。

この菌株を常法ｉ／ｃ従い液体培養し、培養液より添付
の第１図に示す制限酵素地図をもつプラスミドｐＡｆＴ
Ｙ−８を分離＃を製した。

このプラスミドｐＭＴＹ−ｆ３を保持する形質転換株は
、エシエリヒア・コリに１２ＹＫ２０１４として、茨城
県筑波郡谷田部町東１丁目１番３号の工業技術院微生物
工業技術研究所に、昭和６０年７月５日付で受託番号：
微工研４第８５２８号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−８５２Ｂ）に
て寄託されている。

実流例　２：　トリプトファンシンターゼ活性の測定 最少培地１００−を５０〇−容三角フラスコに分注し、
１２０℃で１５分間滅菌処理したものに、実施例１で得
た形質転換株を植菌し、３７°Ｃにて１日振盪培養後、
同様にして調製したインドールアクリル酸を１００μｙ
／−の濃度で含有するＬ培地に２０℃接種し、同じく６
７°Ｃにて６時間振盪培養した。該培養液を遠心分離す
ることにより菌体を集菌し、１００ｍＭト＋）ス緩衝液
＜ｐｌｉ７、８　）　５０−にて洗浄し、再び遠心分離
を行い集菌後、湿菌体を２００〜採取し１　ｍｌの１０
０ｍ＆トリス緩衝液１ｐＨ７，８）に懸濁し超音波処理
を行なった。処理後の菌体破砕物を適当に１００ｍＭ）
　１，１ス緩衝液で希釈して、常法〔０，Ｈ。

Ｓｍ１ｔん　ａｎｄ　　Ｃ，Ｙａｎｏｆｓｋｙ　　：　
　Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　”　
、Ａｃａｄｅｍｉｃ、Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ　　（１９６２
）、ｖｏｌ　　５、ｐ７９４〜８０６〕に従い酵素反応
を行なった。その結果本発明のプラスミドｐＭＴＹ−８
を保持する大腸菌＜ＦＥＲＮ　　Ｐ−８５２８）を１月
いた場合、約３　Ｑ　Ｑ　ｕｎｉｔｓ　　（１ｕｎｉｔ
ｒ＝Ｑ、１μｍｏｌｅ　　Ｔｒｐ／ｌｒｑ　ｐｒｏｔｅ
ｉｎ／２０ｍ１ｔｒで示す）の活性値を示しだ。また、
対照としてプラスミドｐＭＴｙ−６を用いて上記方法で
活性を調べたところ約２５０　ｕｎｉｔｓの活性値を示
した。

実施例　６ 最小培地１００−を５００ｄ用三角フラスコに分注し、
１２０℃で１５分間滅菌処理したものに前記実施例１で
得た形質転換株ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉαｃｏｌｉＫ−１
２ＹＫ２０１４（ＦＥＲＭ　　Ｐ−８３２８）を植菌し
６７℃にて１日振盪培＃後、同様にして調製したＬ培地
５０−を容三角フラスコに分注し、１２０℃で１５分間
滅菌処理したものに２は接種し、同じく３７℃にて５時
間振盪培養した。遠心分離を用いて菌体を回収し、これ
をインドール２．５７ｊ、ＤＬ−セリ／１０．０ｇおＪ
：びピリドキサールリン酸０．５　ｔｍｉ、を含む１Ｑ
ＱｍＪｆトリス緩衝液（ｐＨ７，８３５０ゴに懸濁し振
盪しながら５７°Ｃ１２４時間反応を行なった。反応終
了物を水で１０倍に希釈したのち遠心分離により得た上
澄液について高速液体クロマトグラフィーで生成したＬ
−トリプトファンの分析を行なったところ、４．０η／
ｍｌの生成が認められた。

反応終了後５０−の１０倍希釈液５００−をアンモニア
型強酸性イオン交換樹脂（ダイヤイオンＳＫ−ＩＢ、三
菱化成製）のカラムを通してＬ−トリクトファンの粗結
晶を析出させたのち、これをアセトンで洗浄し乾燥して
Ｌ−）リプトファンの結晶を１．４Ｉ得た。

実施例　４ 最小培地１００−を５００　ｍｌ容三角フラスコに分注
し、１２０°Ｃで１５分間滅減処理したものに形質転換
株Ｅｓｃｈｉ１ｂｉｈｉａ　　ｃｏｌｊ　Ｋ−１２ＹＫ
２０１４（ＦＥＲＭ　　Ｐ−８５２８）を植菌し、５７
°Ｃにて１日振盪培養後、インドールアクリル酸を１０
０μｍ７ｍ１の濃度で含有するＬ培地の５０−に実施例
５と同様、前培養物の２−を接種し、６７℃にて５時間
振盪培養した。遠心分離にて菌体を回収した。のち、実
施例６と同様の操作にて反応を行い、生成したＬ　−１
−リプトファンの分析を行ったところ、７η／−の生成
が認められた。

反応終了液５０−から実施例３と同様の操作にてＬ　−
）　ＩＪデトファンを精製回収したところ、結晶として
２．５１のＬ−トリプトファンを得た。

実施例　５ 前記実施例１に記載したと同じ組成のＬ培地１０ｒｎｌ
を大型試験管（２００Ｘ２４φ）に分注し、１２０℃で
１５分間政醒処理した後、エシェリヒア・コヌに−１２
ＹＫ２０１４＜ＦＥＲ，Ｉｆ　　Ｐ−８３２８＞を偵菌
し、６７°Ｃで１６時間振盪培養し、それを前項％物と
した。かくして得られた前培養物２−を、インドールア
クリル酸１００μｙ／−及びインドール０．５〜／ゴを
含む下記組成物の培地Ａ（５００＊容三角フラスコに１
００ｄ分注）にＶ、菌し、６７℃で４８時間振盪培養を
行った。

培地Ａの組成 ＮノＩ、Ｃ１Ａ＆ ＫＩｉＰＯ５９ Ｎｃｔ　２ＨＰＯ，、１２１１，０１！ｌＭｇ５Ｏ，−
７１１，ＯＯ，５、！ｉ’ＣａＣ１，・２１１，０　　
　　　　１５＊アザミノ酸　　　　　　　　　　　　５
９酵母エキス　　　　　　　　　　　５ｙグルゴース　
　　　　　　　　　　３０ｇＣαＣ０８（別殺菌）　　
　　　２０ｇ水　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　１１７）　Ｉｆ　　　　　　　　　　　　　　　
　７．０培養終了後、遠心分離により菌体を除去し、上
澄液中のＬ　−）　ＩＪブトファンを高速液体クロマト
グラフィー（高車製作所−ＬＣ−５Ａ）により定量した
ところ、１２０キ／ｌの生成が認められた。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐ、４１ＴＹ−８の制限酵素地図で
ある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）ｔｒｐＡ、ｔｒｉｐＢ並びにこれら両遺伝子
   を発現させうるプロモーター機 能をもつＤＮＡ断片及びこのプロモー ター機能を制御しうるオペレーター機 能をもつＤＮＡ断片からなるトリプト ファンシンターゼの生合成を司る遺伝 子を含むＤＮＡ断片と、 （ｂ）下因子プラスミド由来の増殖制御分配系を司る遺
   伝子を含むｍｉｎｉ−Ｆ断 片と、 （ｃ）プラスミドｐＢＲ３２２由来の自律増殖能を司る
   遺伝子を含むＤＮＡ断片 とからなり、トリプトファンシンターゼの生合成を司る
   遺伝子を含むＤＮＡ断片（ａ）中のプロモーターからの
   転写の方向と、ｍｉｎｉ−Ｆ断片（ｂ）中の遺伝子のプ
   ロモーターからの転写の方向と、プラスミドｐＢＲ３２
   ２由来のＤＮＡ断片（ｃ）中の薬剤耐性遺伝子のプロモ
   ーターからの転写の方向が同一方向であり、且つトリプ
   トファンの生合成を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片（ａ）
   がプラスミドｐＢＲ３２２由来の自律増殖能を司る遺伝
   子を含むＤＮＡ断片（ｃ）の上流に位置することを特徴
   とするエシエリヒア・コリの細胞内で自律増殖可能なプ
   ラスミド。 ２、分子量が約９．０メガダルトンであり、そして制御
   酵素ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩに対する切断
   部位がそれぞれ２ヶ所、２ヶ所及び３ヶ所であり且つ制
   限酵素ＢａｍＨＩによる各切断断片の分子量が約６．４
   メガダルトン及び約２．６メガダルトンであることを特
   徴とするプラスミドｐＭＴＹ−８である特許請求の範囲
   第１項記載のプラスミド。 ３、プラスミドｐＭＴＹ−８で形質転換されたエシエリ
   ヒア・コリＫ−１２系微生離。 ４、エシエリヒア・コリＫ−１２系微生物がトリプトフ
   ァン要求性変異株である特許請求の範囲第３項記載の微
   生物。 ５、エシエリヒア・コリＫ−１２系微生物がＬ−トリプ
   トファンの分解活性を発現しない菌株である特許請求の
   範囲第３項又は第４項記載の微生物。